RESUMEN 1ER AÑO-MEDICINA (9)

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ESPECTROSCOPIA RAMAN
Raman descubrió que la λ visible de una pequeña fracción de la radiación dispersada por ciertas moléculas difiere de la del haz incidente y, además, que los desplazamientos de la λ dependen de la estructura química de las moléculas causantes de la dispersión.
Muy relacionada con IR, mide energía dispersada debido a Energías Vibracionales de la molécula.
Fenómeno
Una fuente de luz monocromática visible o infrarroja intensa (láser incidente) al chocar con la molécula, una mínima cantidad se dispersa. Esta molécula actúa como un emisor, que emitirá la misma λ incidente (99,999%), pero además también emitirá otras 2 λ (0,001%), una de mayor frecuencia (mayor energía, menor λ) y otra de menor frecuencia (menor energía, mayor λ).
Características
· Técnica analítica usada en química y física para estudiar modos energéticos de baja frecuencia como los vibracionales y rotacionales.
· Se fundamenta en la dispersión inelástica, o dispersión Raman, que se produce cuando un láser de luz visible o IR cercano monocromático atraviesa una solución.
· Similitudes entre espectros Raman y espectros IR.
· Diferencias entre las clases de grupos que son activos en uno u otro para hacer que sean técnicas complementarias y no competitivas
Espectros Raman
· Se obtienen al irradiar una muestra con una fuente potente de rayos láser de radiación monocromática Vis o IR.
· Se registra el espectro de la radiación dispersada a un cierto ángulo, casi siempre 90°.
Inconveniente: que la molécula se excite y emita fluorescencia y enmascare el espectro Raman. Para evitarla, las λexcitación se eliminan de una banda de absorción del analito.
Las intensidades de las líneas Raman son, cuando mucho, un 0,001% de la intensidad de la fuente, debido a esto es más difícil detectar y medir las bandas Raman que las bandas en el IR. La radiación Raman se da en el visible e IR cercano, para las cuales hay detectores muy sensibles.
Ventajas: el H2O es un solvente muy útil. Las señales están en la región Vis o IR cercano, entonces se pueden utilizar celdas de vidrio o de cuarzo, evitando el inconveniente de trabajar con ventanas de NaCl u otros materiales inestables en la atmosfera (como en IR).
Proceso No Cuantizado
Se hace incidir una λ con una determinada Energía (hνex) a una molécula en estado electrónico fundamental (que puede estar en cualquiera de los estados vibracionales, rotacionales), pero esta energía radiante no alcanza para realizar una transición electrónica al estado electrónico excitado más bajo, debido a esto, la molécula queda en un estado intermedio, llamado estado virtual (nivel energético j). 
La energía de la molécula puede tomar cualquiera de los valores infinitos o estados virtuales entre el estado fundamental y el primer estado electrónico excitado.
· Difusión de Stokes
Una molécula en el nivel vibracional fundamental (v=0) absorbe un fotón de energía hνex y relajarse emitiendo un fotón de Energía = h (νex-νv). Así la radiación difundida es de frecuencia más baja que la radiación de excitación (mayor λ o menor E)
· Difusión anti-Stokes
Las moléculas en un estado vibracionalmente excitado (v=1) pueden difundir radiación inelástica y producir una señal Raman de energía = h (νex+νv). La radiación difundida de una frecuencia más alta que la radiación de la fuente (menor λ o mayor E).
La única diferencia entre ambas difusiones inelásticas es la suma o resta de la Energía correspondiente a al salto vibracional desde ν0 a ν1 (Es lo que se grafica o marca en el espectro, el hνv)
 
Intensidad de las Líneas Stokes y Anti-Stokes
Es apreciable que los picos Stockes son más intensos que los anti-Stockes, es por eso que se en Espectroscopia Raman se utilizan los primeros. Aunque, donde la fluorescencia es un inconveniente, se utilizan los picos anti-Stockes ya que estos no se ven enmascarados por la fluorescencia. La razón de esto reside en que los picos Stockes tienen mayor probabilidad de que se produzcan, ya que las moléculas a temperatura ambiente se encuentran en estado electrónico fundamental 0 y estado vibracional 0, que se justifica con la ecuación del Boltzmann.
Espectro del CCl4, excitado con láser (λexc=488 nm)
La diferencia de frecuencia entre la luz dispersada e incidente es independiente de la λexcitación. Si se excita con luz verde (514,5 nm) o azul (488,0 nm), se obtendrá una línea Raman exactamente a la misma diferencia de n° de onda (ν en cm-1). Se grafica Δλ= (λexc – λem) (cm-1)
La intensidad o potencia de una banda Raman depende de:
· Polarizabilidad de la molécula: Deformación de la nube electrónica que rodea a la molécula.
· Intensidad de la fuente: La potencia de la emisión Raman aumenta con la cuarta potencia de la frecuencia de la fuente. Pocas veces se aprovecha esta ventaja por la probabilidad de que la radiación UV origine una fotodescomposición del analito (P=K ν4)
· Concentración del grupo activo: intensidades Raman directamente proporcionales a la [especie activa].
Diferencia entre IR y Raman
Dependen de los mismos modos vibracionales, pero son procesos diferentes desde el punto de vista mecánico.
· La absorción en IR requiere un cambio en el momento dipolar o en la distribución de carga durante la vibración. Sólo así la radiación de la misma frecuencia puede interactuar con la molécula e impulsarla a un estado vibracional excitado.
· La difusión necesita una distorsión momentánea de los e- distribuidos alrededor de un enlace de la molécula (polarizabilidad del enlace) seguida por la reemisión de la radiación cuando el enlace vuelve a su estado normal. En esta forma distorsionada, la molécula está temporalmente polarizada, es decir, produce de manera momentánea un dipolo inducido que desaparece cuando hay relajación y reemisión.
Ejemplos:
· Molécula homonuclear (N2, Cl2, H2)
No tiene momento dipolar ni en la posición de equilibrio, ni cuando la vibración de tensión hace que cambie la distancia entre los 2 núcleos. Por consiguiente, no existe absorción de la radiación IR. Pero, la polarizabilidad del enlace entre los 2 átomos de estas moléculas varía periódicamente en fase con las vibraciones de tensión y llega al máximo cuando la separación es máxima, y al mínimo cuando el acercamiento es el mayor posible. Un cambio de polarizabilidad cualitativamente se puede visualizar como un cambio en la nube electrónica.
· Moléculas con un centro de simetría (CO2, H2C2)
No existe relación entre la actividad en IR y en Raman. Esto se conoce como: PRINCIPIO DE EXCLUSIÓN MUTUA.
· Moléculas sin centro de simetría (H2O, SO2)
Muchos de los modos de vibración pueden ser activos tanto en Raman como en el infrarrojo.
Ausencia de Sobretonos
Los espectros Raman son más sencillos que los IR, son raros los sobretonos y bandas de combinación:
· La energía para una transición desde el nivel de energía 1 al 2 o desde el nivel 2 al 3 debería ser idéntica a la de la transición del nivel 0 al 1. Según, la teoría cuántica establece que las únicas transiciones que pueden tener lugar son aquellas en las que el número cuántico vibracional cambia en una unidad; es decir, la denominada regla de selección establece que: ν ± 1. Pero, la oscilación anarmónica causa desviaciones a números cuánticos más altos, E se hace menor, y la regla de selección no se cumple. Como resultado, se observan transiciones más débiles, que corresponden a ν ± 2 o ν ± 3. Las frecuencias de dichas transiciones de sobretono son aproximadamente del doble o triple de la frecuencia fundamental, y las intensidades son menores que la de la fundamental.
Gráfico IR – Raman
Partes de los espectros Raman e IR son complementarias, y c/u se asocia con un conjunto distinto de modos de vibración dentro de una molécula. Como se grafica el desplazamiento de la frecuencia de Raman Δλ= (λexc – λem) (cm-1) y la frecuencia de absorción en el IR, entonces las frecuencias donde se encuentran los picos son coincidentes. Todo esto contribuye a la identificación de las sustancias. 
Información del Espectro Raman
La información que provee es:
·Frecuencia
· Intensidad
· Relación de despolarización: Proporcionan una variable útil para determinar las estructuras moleculares. Es importante diferenciar entre:
· POLARIZABILIDAD: propiedad molecular relacionada con la capacidad de deformación de un enlace.
· POLARIZACIÓN: propiedad del haz de radiación y describe el plano en el que vibra la radiación.
Relación de despolarización “p”: Cuando se obtienen los espectros Raman mediante radiación polarizada en un plano o cuando se utiliza un láser, se observa que la radiación dispersada está polarizada en distintas direcciones, que depende del tipo de vibración responsable de la difusión.
· La radiación procedente de una fuente láser está polarizada en el plano yz. Parte de la radiación dispersada resultante está polarizada paralelamente al haz original, es decir, en el plano xz; la intensidad de esta radiación se simboliza por el subíndice ||. El resto del haz dispersado está polarizado en el plano xy, perpendicular a la polarización del haz original; la intensidad de esta radiación, polarizada perpendicularmente, se indica con el subíndice ⊥. Experimentalmente, “p” se obtiene insertando una lámina Polaroid u otro polarizador entre la muestra y el monocromador.
Volviendo al ejemplo de tetracloruro de carbono, la banda a 459 cm-1 proviene de una vibración simétrica “de respiración” p= 0.005, y las bandas a 218 y 314 cm-1, provienen de vibraciones no simétricas, p es de casi 0.75.
INSTRUMENTACIÓN
	Fuentes: Se necesita una fuente de alta intensidad
Laser: La intensidad de la dispersión Raman varia con la 4ta potencia de la frecuencia, las fuentes de ion argón y criptón (emiten en la región azul y verde del espectro) tienen esta ventaja sobre las otras fuentes LASER (De Diodos, Helio-Neón, Nd-YAG).
Muestra
Sistema de iluminación de la muestra: La manipulación de muestras más sencilla que en IR; se puede usar vidrio para ventanas, lentes y otros componentes ópticos, en lugar de haluros cristalinos (NaCl) frágiles y menos estables. La fuente láser se puede enfocar con facilidad sobre una zona pequeña de la muestra y la radiación emitida también se puede enfocar de manera eficaz sobre la rendija de entrada o salida de un espectrómetro. El resultado es que se pueden examinar muestras muy pequeñas.
Muestra Gaseosa: contenidos en recipientes de vidrio (1-2 cm diámetro; 1 mm espesor). También se puede introducir el gas en tubos capilares pequeños y luego sellarlos. En el caso de dispersores débiles se puede utilizar un aparato externo de pasos múltiples con espejos. La difusión Raman resultante es perpendicular al tubo de la muestra y al haz laser de excitación se enfoca luego en la rendija de entrada del espectrómetro mediante una lente potente.
Muestras Liquidas: contenidos en ampollas, tubos de vidrio o capilares sellados (0.5-0.1 mm diámetro; 1 mm largo; VM del orden de los nL).
Muestras Sólidas
· Se llena una pequeña cavidad o un capilar con la muestra finamente pulverizada. Por lo general, los polímeros se pueden examinar sin tratamiento previo de la muestra.
· se utilizan pastillas de KBr similares a las que se usan en la espectroscopia en el infrarrojo. La mezcla con KBr tiene la aptitud de reducir la descomposición de la muestra producida por el calentamiento local
Microsondas Raman
Las sondas de fibra óptica son útiles en lugares alejados del sitio donde se halla la muestra, es decir, la radiación puede transmitirse a través de una distancia considerable (100 m o más) sin que haya pérdida de energía radiante (ambientes hostiles: reactores peligrosos o sales fundidas; muestras biológicas: tejidos o paredes de arterias; muestras ambientales: agua subterránea o de mar). Pueden ser Fibras de Excitación (dirige el haz de excitación hacia la muestra) y Fibra de Emisión (dirige el haz dispersado hacia el monocromador).
	Monocromadores
De alta calidad para seleccionar la λ de las líneas Raman, débiles, de la intensa radiación difundida de Rayleigh. Se utilizan filtros de interferencia holográficos, llamados filtros de ranura o de muesca, y las redes holográficas, desplazando a los monocromadores múltiples. 
	Transductores
· Fototubo multiplicador Hasta comienzos de los 80
· Diodos:
· Dispositivo de acoplamiento de carga (DAC)
· Dispositivos de transferencia de carga
· Dispositivos de inyección de carga
· Actualmente: transformada de Fourier. Los transductores son de germanio enfriados o dispositivos de acoplamiento de carga.
Espectrómetros Raman de Transformada de Fourier
· Equipados con:
· interferómetro de Michelson
· rayo láser Nd-YAG de onda continua (granate de aluminio e itrio impurificado con iones de neodimio)
· Dispositivos fotoconductores (In-GaAs y Ge)
· λincidente = 1064 nm: elimina virtualmente la fluorescencia o la fotodescomposición de las muestras
· Desventaja: H2O absorbe en la región de 1000 nm, puede anular la ventaja del instrumento de ser capaz de usar soluciones acuosas.
· La señal de salida del interferómetro se filtra rigurosamente para eliminar la radiación laser parasita y la difusión de Rayleigh. Después de atravesar los filtros, la radiación se enfoca sobre un detector de Ge enfriado (Transductor)
· Transformada de Fourier: algoritmo matemático que convierte una señal captada en el dominio del Tiempo, en una señal en el dominio de la Frecuencia.
· Se mide la intensidad de la luz de muchas en un barrido de tiempo (interferograma)
· Luego se transforman mediante la transformada de Fourier en función de la frecuencia.
· Proporciona mejoras en
· Resolución
· Tiempo de adquisición del espectro
· Razón señal-ruido (S/R)
Aplicaciones
· Identificación de materiales pictóricos: se realiza directamente sobre el material a analizar, no requiere preparación de la muestra, no es destructivo.
· Industria petroquímica: control de calidad en polímeros y emulsiones. Ayuda a resolver problemas de desactivación de catalizadores o su contaminación.
· Biomedicina: en el estudio de proteínas y estructuras polipépticas en su estado fisiológico natural.
· Industria alimentaria: Determina la presencia de macro-componentes tales como proteínas, lípidos, carbohidratos y agua.
· Medio ambiente: Se analizan compuestos orgánicos e inorgánicos en suelos y aguas, para determinar su contaminación por complejos metálicos, fenoles, ácidos poliorgánicos e hidrocarburos.