Métodos de detección y estrategias de control para infecciones en fermentos lacticos

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Facultad de Ciencias Veterinarias 
 
-UNCPBA- 
 
Métodos de detección y estrategias de control para 
infecciones de bacteriófagos en fermentos lácticos 
utilizados en producción de quesos. 
 
 
Balcabao, Agustina; Michelini, Eduardo; Pena, Miguel Angel; Krüger, 
Alejandra. 
 
 
 
Diciembre, 2018 
 
 
Tandil 
Métodos de detección y estrategias de control para infecciones 
de bacteriófagos en fermentos lácticos utilizados en producción 
de quesos. 
 
 
Tesina de la Orientación de Tecnología de los Alimentos, presentada como parte de los 
requisitos para optar al grado de Veterinario del estudiante: Balcabao, Agustina. 
 
 
 
 
 
Tutor: Vet. Michelini, Eduardo. 
 
 
Director: Dra. Krüger, Alejandra. 
 
 
Codirector: Vet. Pena, Miguel Angel. 
 
 
 
 
 
Evaluador: Dra. Bruschi, Julieta. 
 
 
RESUMEN 
Las bacterias ácido lácticas (BAL) son de gran importancia en elaboración 
de productos lácteos fermentados ya que le confieren sabores y aromas, 
modificación de la textura, y protección contra otros microrganismos 
alterantes. La infección de los cultivos de bacterias lácticas por 
bacteriófagos, entre otros factores, es una importante causa de pérdida en 
la producción de quesos. Por este motivo, y considerando que la zona de la 
Cuenca Mar y Sierras posee una larga trayectoria en la elaboración de 
quesos, el objetivo de este trabajo fue realizar una actualización 
bibliográfica de los métodos de detección de bacteriófagos disponibles y 
posibles estrategias de control de contaminación. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Palabras Claves: Bacterias ácido lácticas, bacteriófagos, métodos de 
detección, estrategias de control. 
 
AGRADECIMIENTOS 
A mis papás, hermanas y mi pareja por la ayuda y contención en todos estos años 
de carrera, sin ellos no hubiera podido realizarla. 
A los amigos que me dio la carrera, por la compañía y los días y noches eternas 
de estudio. 
A mis dos directores de tesina, que me guiaron para que esta parte de la carrera 
me resulte mas sencillo. 
Gracias a todos!! 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Contenido 
1. Introducción ......................................................................................................................... 1 
2. Panorama nacional y local ............................................................................................... 1 
3. Objetivos ............................................................................................................................... 2 
4. Bacterias ácido lácticas ................................................................................................... 2 
4.1. Clasificación de BAL .............................................................................................. 3 
5. Bacteriófagos ...................................................................................................................... 4 
5.1. Clasificación ............................................................................................................. 4 
5.2. Ciclo de vida ............................................................................................................ 6 
5.3. Mecanismos de defensa de las bacterias hacia los fagos. .............................. 9 
6. Fuentes de contaminación. ........................................................................................... 12 
7. Métodos de detección ..................................................................................................... 13 
7.1. Métodos microbiológicos ..................................................................................... 13 
7.1.1. Preparación de la muestra para detección de bacteriófagos ........................ 14 
 7.1.2. Test de actividad ................................................................................................... 14 
 7.1.3. Test Indicador ........................................................................................................ 14 
 7.1.4. Test de Turbidez ................................................................................................... 15 
 7.1.5. Métodos de placa.................................................................................................. 15 
7.2. Métodos instrumentales ....................................................................................... 17 
7.2.1. Medida de impedancia o conductancia. ............................................................ 17 
7.2.2. Microscopía electrónica. ...................................................................................... 17 
7.2.3. Microscopía Epifluorescente. .............................................................................. 18 
7.3. Métodos moleculares ........................................................................................... 18 
7.3.1. PCR (reacción de cadena de polimerasa) ........................................................ 18 
7.3.2. Pruebas inmunológicas ........................................................................................ 20 
7.3.3. Citometría de flujo ................................................................................................. 21 
7.3.4. Hibridación de ADN .............................................................................................. 21 
8. Estrategias de control. .................................................................................................... 21 
8.1. Diseño de la planta, equipamientos y manejo de flujo de aire. ..................... 21 
8.2. Saneamiento de la fábrica ................................................................................... 22 
8.3. Tratamientos térmicos y de presión en la leche y en subproductos. ............ 23 
8.4. Rotación de cultivos ............................................................................................. 24 
CONCLUSIÓN ................................................................................................................................ 25 
BIBLIOGRAFÍA .............................................................................................................................. 26 
 
 
 
1 
 
1. Introducción 
Uno de los objetivos en la producción de quesos es la acidificación de la leche por 
medio de bacterias lácticas que disminuyen el pH para evitar la contaminación 
posterior de microrganismos patógenos y, además aportan por medio de sus 
funciones características determinadas de aroma, sabor y textura según el 
producto que se desea realizar. Pero la actividad de las bacterias lácticas se 
puede ver interrumpida o modificada por diferentes factores, siendo uno de ellos la 
infección con bacteriófagos, que pueden retrasar la actividad de los fermentos o 
hacerlos fallar en su totalidad. Estas fallas pueden generar grandes pérdidas 
económicas en las industrias por la gran cantidad de litros de leche que se pueden 
llegar a perder por acción de los fagos, la cual se la considera la principal causa 
de pérdida en la industria. Si bien las situaciones más problemáticas a menudo no 
llegan a detener por completo la fermentación, pueden afectar la calidad del 
producto, y repercutir en la confianza del cliente en la marca. El descarte de 
productos no satisfactorios también lleva a pérdidas económicas. 
El periodo que abarca la búsqueda de información para realizar la revisión 
bibliográfica abarca desde 2000-2017. 
2. Panorama nacional y local 
En Argentina, un 50% de la leche cruda producida se destina a la elaboración de 
quesos, cuyo consumo ocupa un segundo lugar luego de la leche fluida. A nivel 
mundial, el consumo de quesos es similar que en la Argentina, siendo mayor en 
algunos países desarrollados (OCLA | Observatorio de la cadena Láctea 
Argentina). 
La Cuenca Lechera Mar y Sierras, en Argentina, posee una larga trayectoriaen la 
producción de leche y de quesos. Muchas empresas de la zona de Tandil son de 
tipo tambo-fábrica, es decir que procesan la leche y elaboran quesos en el mismo 
establecimiento. Por medio de consultas a profesionales asociados a varias 
empresas de la zona se ha observado que la mayoría de las mismas no evalúan 
contaminación con fagos (comunicación personal). 
2 
 
3. Objetivos 
Debido a la magnitud del problema de las infecciones de BAL por fagos, y su 
impacto económico, los objetivos de este trabajo fueron: 
 Realizar una revisión de los métodos disponibles actualmente para la 
detección de fagos y, plantear estrategias de control, destacando aquellos 
aplicables a las empresas de la región. 
 
4. Bacterias ácido lácticas 
Las bacterias ácido lácticas (BAL) son un grupo de bacterias que mayormente 
reúnen las siguientes características: producen ácido láctico a partir de la 
degradación de azúcares, son Gram positivas, no esporulan, pueden tener forma 
de cocos o bacilos, generalmente son inmóviles, anaerobias o aerotolerantes, 
tienen un amplio rango de temperatura de crecimiento (10-45ºC), tolerancia a la 
sal, no producen pigmentos, no reducen nitratos, no producen catalasa 
(Hernández Magadán, 2007; Maciel , 2012). Las BAL pueden producir dos tipos de 
fermentaciones según el género bacteriano: homofermentativas, donde se 
degrada la lactosa con formación de ácido láctico; y heterofermentativas que 
además del ácido láctico, forman etanol o ácido acético y dióxido de carbono. 
Las BAL son utilizadas en la industria alimentaria. En los procesos de 
fermentación láctea, la acción de las BAL y sus productos metabólicos determinan 
características organolépticas y la calidad final del producto (Marcó et al., 2012). 
Entre las reacciones de mayor importancia tecnológica se encuentran: 
- metabolismo de los hidratos de carbono: por medio de la glicólisis producen 
ácido láctico, y la consecuente disminución del pH. Las bacterias lácticas 
producen un isómero u otro (D o L) según el género, ya que poseen distintos tipos 
de lactato deshidrogenasa; siendo las del tipo L las más recomendadas, porque 
las D tienen escasa absorción intestinal (Guglielmotti,2003). 
3 
 
- metabolismo de proteínas: en el caso de productos lácticos, utilizan la caseína de 
la leche. Aunque moderada, su actividad proteolítica sobre la caseína les permite 
su desarrollo en el medio, y contribuye a la textura y sabor del producto final 
(Guglielmotti, 2003). 
- producción de compuestos de inhibición: dentro de esta función, está la 
producción de ácido láctico, peróxido de hidrógeno, antibióticos y bacteriocinas. 
Las bacteriocinas son compuestos proteínicos antibacterianos que pueden tener 
función bactericida o bacteriostático y actuar sobre bacterias de la misma especie 
o relacionadas taxonómicamente. Estos compuestos se utilizan como 
conservantes ya que preservan la calidad del producto final por impedir la 
proliferación de flora alterante y patógena, y de esta forma evitar el agregado de 
sustancias químicas (Huertas, 2010). 
4.1. Clasificación de BAL 
El grupo de BAL se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza en 
hábitats rico en azúcares y comprende los siguientes géneros: Aerococcus, 
Lactobacillus, Pediococcus, Carnobacterium, Alloiococcus, Leuconostoc, 
Oenococcus, Enterococcus, Vagococcus, Tetragenococcus, Streptococcus, 
Lactococcus, Bifidobacterium y Propionibacterium. Pero a nivel industrial los 
géneros de importancia son: Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc y 
Streptococcus (Hernández Magadán, 2007). 
En particular, las BAL mayormente utilizadas en los fermentos de la industria 
quesera son los Lactococcus. Los Lactococcus son bacterias en forma de cocos 
que pueden estar aislados, en pares o en cadenas cortas. Son 
homofermentadores, y su crecimiento puede comenzar a los 10ºC pero su 
temperatura óptima es 30ºC, toleran hasta un 4% de NaCl, son débilmente 
proteolíticas. Dentro de este género se encuentran: L. garvie, L. plantarum, L. 
piscium, L. raffinolactis, L. lactis que se pueden aislar de vegetales, piel de 
animales, de la leche y los productos lácteos (Hernández Magadán, 2007). 
4 
 
Algunas cepas de Lactococcus producen bacteriocinas, como la nisina que posee 
un amplio espectro contra bacterias Gram +, inclusive contra ciertas cepas de 
Bacillus y Clostridium impidiendo la germinación de esporas (Guglielmotti, 2003). 
La especie más utilizada en los fermentos lácticos mesófilos es L. lactis que se 
puede subdividir en dos subespecies, L. lactis sp lactis y L. lactis sp cremoris 
(homofermentativos). Las diferencias entre las dos subespecies principalmente 
son que la primera tiene crecimiento en 4% de concentración de sal y la capacidad 
de hidrolizar la arginina (Maciel, 2012), mientras que la segunda no. 
5. Bacteriófagos 
Los bacteriófagos, o fagos, son virus que infectan bacterias. Hay una gran 
variedad de bacteriófagos, ya que son específicos para cada especie hasta incluso 
pueden serlo para cada cepa bacteriana. Presentan una supervivencia a largo 
plazo que les permite mantenerse en un ambiente por décadas si es que no sufren 
daño por diferentes agentes (Guttman et al., 2005). 
La contaminación con fagos puede representar un riesgo importante para 
cualquier proceso que requiere crecimiento bacteriano, como puede ser en la 
industria alimentaria. Las infecciones provenientes por fagos pueden causar una 
disminución en la función de las BAL en las fermentaciones, que comúnmente se 
traduce en una disminución lenta del pH; o causar la muerte del total de las BAL y 
no disminuir el pH en el queso (Samson y Moineau, 2013). 
5.1. Clasificación 
Bradley (1967) propuso una clasificación de los bacteriófagos, basada 
principalmente en características morfológicas, en 6 grupos: 
Grupo A: poseen cabeza hexagonal, cola contráctil y pueden tener estructuras 
adicionales. Su ácido nucleico esta organizado en ADN de doble cadena. 
Grupo B: poseen cabeza hexagonal, cola larga no contráctil y pueden o no tener 
estructuras adicionales. El ácido nucleico es ADN de doble cadena. 
5 
 
Grupo C: poseen cabeza hexagonal y cola corta no contráctil. Poseen ADN de 
doble cadena. 
Grupo D: con cabeza hexagonal que puede presentar capsómeros grandes o 
protuberancias en sus vértices y no poseen cola. Poseen ADN de simple cadena. 
Grupo E: poseen cabeza hexagonal con capsómeros chicos y no poseen cola. 
Poseen ARN simple cadena. 
Grupo F: constituidos por filamento extendido y no poseen estructuras adicionales. 
Poseen ADN de cadena simple (Guglielmotti, 2003). 
Una clasificación posterior de Ackermann y DuBow (1987), reúnió los 3 primeros 
grupos de Bradley, A, B y C en familias Myoviridae, Siphoviridae y Podoviridae, 
respectivamente. Estas tres familias pertenecen al orden Caudovirales (Caudo: del 
Latin cauda, “cola”) (King et al., 2011). 
Los fagos que infectan a las BAL son todos miembros del orden Caudovirales. 
Tienen una cápside proteica compuesta de capsómeros que va a contener el ADN 
y a protegerlo de agentes externos, que puede ser de forma icosaédrica en donde 
el ADN se encuentra condensado o helicoidal con el ADN extendido. Los virus de 
este orden presentan una cola que sirve de adherencia en la célula hospedadora. 
Esta cola se encuentra unida a la cápside a través del cuello; su longitud y 
contractibilidad es la que diferencia a las tres familias: Myoviridae poseen una cola 
contráctil compuesta por vaina y un tubo central, Siphoviridae con cola larga no 
contráctil y Podoviridae con cola corta no contráctil. En el extremo de la cola se 
pueden encontrar estructuras adicionales que complementan la fijación de la cola 
a la bacteria, las cuales pueden ser placas basales, espinas y fibras que otorgan 
estabilidad en el momento de la unión entre fago y bacteria (Ackermann, 2005). 
De los fagos que infectan a los Lactococcus, se puedenencontrar 10 grupos, pero 
los que se encuentran con mayor frecuencia dentro de las fábricas lácteas 
pertenecen a la familia Siphoviridae, por ejemplo 936, c2 y P335 (Murphy et al., 
2017). 
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5.2. Ciclo de vida 
Los fagos pueden dividirse en dos clases según el estilo de vida que adoptan tras 
infectar a la célula hospedadora: virulentos o temperados. 
Los fagos virulentos (o líticos) se multiplican por medio de ciclo lítico y provocan la 
lisis de la célula hospedadora con la posterior liberación de la progenie con 
capacidad de infectar nuevas bacterias. Los fagos temperados son aquellos cuyo 
ADN se va a unir al cromosoma bacteriano y replicarse junto a éste, sin provocar 
la lisis de la bacteria y trasmitiéndose a las células hijas. A esta unión se la conoce 
como lisogenia, siendo el virus un profago y la célula infectada, un lisógeno. En 
determinadas situaciones se puede activar el ciclo lítico (Hernández Magadán, 
2007). Ver figura 1 (Ciclo de vida de un bacteriófago). 
a) Ciclo lítico 
1ª etapa: Adsorción 
La adsorción se produce por medio de las estructuras de fijación como pueden ser 
la cola y sus estructuras adicionales: la placa basal, fibras y espículas, y además 
va a depender de la presencia de adecuados receptores en la superficie celular. 
Usualmente los fagos de Lactococcus utilizan hidratos de carbono de la pared 
celular, como galactosa y ramnosa. Esta etapa tiene dos pasos, una unión 
reversible en la cual el fago es capaz de desprenderse, y una irreversible en la que 
ya no es capaz de desprenderse y continúa con la infección. Por ejemplo, los 
fagos de Lactococcus lactis tipo c2, en la unión irreversible, se anclan a una 
proteína ubicada en la membrana celular llamada proteína de infección por fagos o 
PIP (phage infection protein) (Hernández Magadán, 2007; Maciel, 2012; Murphy 
et al., 2017). 
Algunos fagos, como el 936, necesitan de cationes como Ca2+ y Mg+ para poder 
producir el ingreso del material genético, aunque se ha demostrado que algunos 
fagos P335 pueden cumplir la etapa en la ausencia de estos minerales (Murphy 
et al. 2017). 
7 
 
2ª etapa: Inyección de material genético 
En esta etapa ocurre el traspaso del ADN desde la cápside del fago, pasando por 
su cola, a la célula bacteriana. El proceso de inyección es facilitado por la 
degradación controlada del peptidoglicano, por ejemplo por la lisina que produce 
hidrólisis de la pared celular 
(Guttman et al., 2005). 
3ª etapa: Biosíntesis de material fágico. 
Luego de que el material genético se encuentra en la célula hospedadora, todos 
los mecanismos de la célula bacteriana se detienen y sólo realizan la síntesis de 
todas las estructuras que componen a los fagos. 
Empieza con una transcripción del material genético por medio de ARN 
polimerasa, que permite la replicación de genes tempranos cuyos productos 
inhiben la acción de proteasas de la célula huésped y protegen al ADN fágico. 
Luego se sintetizan genes intermedios que van a generar productos para la 
síntesis del ADN viral. La replicación del ácido nucleico va a dar lugar a una única 
molécula lineal, llamada concatámero, la cual contiene varias copias del ADN 
fágico continuadas una tras otra. 
Y por último, genes tardíos que van a servir para la producción de proteínas 
estructurales de las nuevas cápsides, colas y estructuras adicionales, como así 
también las proteínas para el ensamblaje del fago, y las proteínas que van a 
producir la lisis celular y liberación de los fagos (Guttman et al., 2005; Hernández 
Magadán, 2007). 
4ª etapa: Maduración y empaquetamiento de los fagos. 
El empaquetamiento está mediado por un grupo de proteínas, llamadas 
terminasas que pueden realizar el corte del concatámero de dos formas diferentes. 
Unas se unen al ADN, el cual penetra en la cápside hasta que se llena y es ahí, 
cuando se realiza el corte de la molécula. El otro tipo de terminasas, reconoce los 
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sitios de iniciación y terminación de la molécula, y la corta antes de introducirse en 
la cápside (Hernández Magadán, 2007). 
Para la cola utilizan la proteína principal de la cola (MPT: major tail protein), la cual 
determina la longitud y forma el tubo de la cola; y como conector de cabeza y cola 
una proteína tapón que impide que el ADN que ya está encapsulado se escape 
(Murphy et al. 2017). 
5ª etapa: Lisis celular y liberación de las nuevas partículas virales. 
En esta última etapa del ciclo lítico utilizan la lisina, una enzima que se encarga de 
desintegrar uno de los enlaces de la capa del peptidoglicano, y la holina, una 
proteína que produce poros en la membrana celular para que la lisina pueda 
cumplir su función (Guttman et al., 2005; Murphy et al., 2017). 
El tiempo que tarda el fago entre la infección y la liberación de la nueva progenie 
es conocido como periodo de latencia y puede variar desde 10 a 140 minutos 
dependiendo de factores ambientales como temperatura, pH y la célula 
hospedadora. El número de partículas virales que se liberan al medio por parte de 
la célula bacteriana se conoce como burst size, y puede comprender entre 10 a 
400 nuevos fagos por célula (Hernández Magadán, 2007). 
b) Ciclo lisogénico 
Tras las dos primeras etapas que comparte con el ciclo lítico, absorción e 
inyección del ADN viral, el genoma del fago se une de una forma estable al 
genoma bacteriano por homología de secuencias, conocidas como attP (phage 
attachment site o sitio de unión del fago) y attB (bacterial attachment site o sitio de 
unión de la bacteria), y se puede replicar junto a la bacteria por varias 
generaciones. La unión de estas dos regiones en los genomas es reversible, para 
que en el caso de una inducción ya sea de forma espontánea, o por luz UV o 
agentes como la mitomicina C, el fago pueda establecer el ciclo lítico (Guglielmotti, 
2003; Hernández Magadán, 2007). 
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El balance del estado de lisogenia y ciclo lítico se mantiene por la producción de 
dos tipos de proteínas por parte del fago, una llamada CI que es represora de los 
genes líticos y además, reprime a otros fagos que quieran infectar a la célula 
hospedadora; y la otra proteína Cro que inhibe la producción de CI y estimula la 
expresión de los genes líticos. La relación entre estas proteínas determina que 
siga un ciclo u otro (Hernández Magadán, 2007). 
Dentro de este grupo de fagos se encuentran muy comúnmente los que infectan a 
los Lactococcus y son los que conforman una de las principales fuente de 
infección dentro de los ambientes industriales. 
 
Fig. 1 Ciclo de vida de un bacteriófago. 
5.3. Mecanismos de defensa de las bacterias hacia los fagos. 
No siempre el fago puede entrar a la célula bacteriana y producir la infección, a 
veces, las bacterias poseen ciertos mecanismos que le confieren. Estos sistemas 
de defensa pueden adquirirse de plásmidos de otras bacterias en un proceso de 
conjugación, pero también a través de mutaciones puntuales en el genoma 
10 
 
bacteriano, lo que puede llegar a formar mutantes insensibles a bacteriófagos 
(Forde y Fitzgerald, 1999). 
Para evaluar los mecanismos de defensa en las cepas bacterianas se mide el 
EOP (Efficiency of plating) que se calcula como el título de fagos obtenido con un 
huésped resistente con un determinado mecanismo de defensa dividido por el 
título de fago de un huésped sensible. Un fuerte mecanismo de resistencia tendrá 
un EOP de 107 -109, un intermedio será de 106-104 y un débil será de 103-101 
(Moineau y Lévesque, 2005). 
a) Mecanismos de defensas 
a.1) Interferencia en la adsorción 
Este mecanismo está relacionado con la primera etapa del ciclo de vida, en la cual 
el fago se adhiere a ciertos receptores de la célula hospedadora. En este caso, 
ese paso fracasa por cambios estructurales, falta o enmascaramiento físico de los 
receptores. El único defecto de este mecanismo es que el fago todavía es capaz 
de infectar otras células sensibles y seguirpropagándose (Forde y Fitzgerald, 
1999). 
a.2) Bloqueo de la inyección de ácido desoxirribonucleico (ADN) 
En este caso, se modifica la adsorción irreversible y el fago no puede trasmitir su 
ADN a la bacteria. Por ejemplo, la ausencia de la proteína PIP, que es la que 
necesita el fago c2 para la unión irreversible a la célula y, posterior transferencia 
del ADN (Forde y Fitzgerald, 1999). 
a.3) Sistemas de restricción/ modificación (R/M) 
Cuando el fago puede cumplir con la etapa de adsorción y la inyección del ADN, la 
bacteria puede interrumpir su ciclo por medio de endonucleasas de restricción y 
metilasas de modificación. Las primeras detectan al genoma fágico como extraño 
y lo degradan. Las segundas protegen al ADN bacteriano agregando grupos 
metilos al cromosoma para evitar ser atacado por sus propias endonucleasas. 
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Este tipo de sistema puede ser débil, ya que algunos fagos pueden escapar de la 
acción de las endonucleasas y seguir con su ciclo normalmente (Forde y 
Fitzgerald, 1999). 
a.4) Infección abortiva (abi) 
La célula provoca su lisis para evitar que los nuevos fagos formados, o en proceso 
de formación, puedan infectar nuevas células. Este mecanismo se puede clasificar 
según si actúan previo o luego de la replicación del genoma fágico (Forde y 
Fitzgerald, 1999). 
a.5) Inmunidad lisogénica. 
Cuando se produce un ciclo lisogénico, la célula bacteriana se muestra inmune a 
la infección por parte de una especie de fago similar a su profago. De esta forma, 
no se impide la adsorción ni la inyección del ADN, pero el nuevo genoma se va a 
encontrar aislado en la célula bacteriana sin poder replicarse (Guglielmotti, 2003). 
b) Mecanismos de resistencia de desarrollo genético 
b.1) Técnicas con ADN recombinante 
b.1.1) Resistencia codificada por el origen de replicación del fago (Per): con esta 
técnica se introduce en la célula bacteriana plásmido multicopia conteniendo el 
origen de replicación (ori) del fago. Cuando la célula se infecta, el fago comienza 
su replicación por el ori pero si la célula contiene el Per se replica el plásmido y no 
del fago, disminuyendo la replicación de fago en un cultivo. Es específica para 
cada tipo de fago (Reinheimer, 2005). 
b.1.2) ácido ribonucleico (ARN) antisentido: se introduce en la cepa bacteriana un 
gen fágico clonado en orientación antisentido o inversa. Cuando la célula se 
infecta con el fago, se cree que se forma una molécula entre el ARNm (sense) y el 
ARN complementario (antisense) que es inestable y se degrada. Por lo tanto, no 
se van a producir determinadas proteínas del fago (Reinheimer, 2005). 
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b.1.3) Sistema “suicida”: Es una alternativa de la infección abortiva, que se la 
considera como una “trampa” genética, ya que se incorpora en la célula un 
promotor inducible ante la infección fágica que activa la expresión de un gen letal 
bacteriano, llevando a la muerte celular y destrucción del fago que la infectó 
(Reinheimer, 2005). 
c) Desarrollo de mutantes resistentes a bacteriófagos 
Este tipo de bacterias se desarrolla luego de una alta exposición a fagos. Cuando 
dentro de un cultivo no hay desarrollo de placa, se considera que las bacterias 
inhibieron la adsorción del fago por una mutación en el cromosoma que codifica 
para el receptor del fago. La obtención de estos BIM es un proceso simple, pero 
por mutaciones en el cromosoma pueden desencadenar en la pérdida de 
funciones principales de las bacterias lácticas y en un retardo en la producción de 
ácido láctico (Moineau y Lévesque, 2005). 
6. Fuentes de contaminación. 
Los ingredientes que entran a la fábrica pueden ser una primera fuente de 
contaminación, como por ejemplo la leche cruda que puede contener una 
concentración de 101-104 fagos/ml (Marcó et al., 2012). Se presume que los fagos 
que se encuentran en la leche cruda provienen de la alimentación del animal, por 
ejemplo ensilados que contengan cepas silvestres de Lactococcus lactis y que 
pueden estar infectadas por fagos. Si la materia prima no es tratada térmicamente, 
y en el momento de la producción los fagos se encuentran con cepas sensibles, la 
concentración de fagos puede llegar a aumentar hasta 109 fagos/ml en suero o 
gramo de producto y 108 UFP/m3 en el aire (Madera et al., 2004; Marcó et al., 
2012). 
Otro punto a tener en cuenta son los equipos y superficies de trabajo dentro de las 
fábricas, que pueden contener fagos si los procedimientos de limpieza no son los 
adecuados, como por ejemplo: pisos, paredes, manijas de puertas, oficinas, 
laboratorios (Marcó et al., 2012; Samson y Moineau, 2013). 
13 
 
Una tercera fuente de fagos, puede ser el aire que circula en la fábrica que puede 
llegar a tener títulos de 105 UFP/m3, el cual puede trasmitirse de un área a otra, 
aumentando cuando hay equipos de trabajo y procesamientos que generan 
aerosoles. También, el movimiento de equipos y de personal entre un área 
contaminada con estos aerosoles puede contribuir a la contaminación de otras 
áreas (Moineau y Lévesque, 2005; Samson y Moineau, 2013) 
Se ha demostrado que muchas BAL pueden contener profagos. Entonces, si se 
utilizan cultivos iniciadores o starters que contienen cepas lisógenas, distintas 
situaciones de estrés durante el procesamiento pueden activar la inducción de los 
fagos. Este tipo de fuente de fago no es común, pero es un importante factor de 
riesgo que debe considerarse como fuente de contaminación. Dentro de este 
grupo, hay que tener en cuenta a los fagos tipo P335 (Samson y Moineau, 2013). 
7. Métodos de detección 
Para la selección de adecuados métodos detección se debe tener en cuenta que 
posean ciertas características (Samson y Moineau, 2013): 
 Sensibles para detectar bajos niveles de fagos. 
 Rápidos para poder actuar velozmente y establecer procesos de control. 
 Aplicables a alimentos. 
 Fáciles de realizar por el personal. 
 Económicos. 
 
7.1. Métodos microbiológicos 
Los métodos microbiológicos se basan en ensayos de inhibición de las BAL 
componentes del iniciador/starter. Estos métodos informan sobre la sensibilidad de 
un cultivo pero no distinguen especie de fagos ni determinan su cantidad. Es 
importante tener en cuenta que los cultivos comerciales pueden tener mezclas de 
cepas, y si algunas son sensibles pero otras resistentes pueden dificultar la 
interpretación de los resultados de las pruebas. En caso de que sólo se cuente 
con los cultivos comerciales se puede realizar el cultivo, aislamiento y purificación 
14 
 
de las cepas previo a la realización de los ensayos. Estos métodos son los más 
tradicionales y tienen la ventaja de que son sencillos, fáciles de aplicar en 
laboratorios con mínimo equipamiento. Como desventaja, generalmente son poco 
sensibles para cultivos multicepas como se mencionó anteriormente (Quiberoni y 
Reinheimer, 2007). 
7.1.1. Preparación de la muestra para detección de bacteriófagos 
Se debe hacer un ajuste del pH a 4,5-4,7 de la leche para precipitar la caseína, y 
luego centrifugar para eliminar precipitado y células bacterianas. Se toma el 
sobrenadante y se filtra a través de una membrana estéril que tiene un diámetro 
de poro < 0,45 µm y se almacena en un envase estéril, obteniendo así un filtrado 
libre de células (FLC). Para diferenciar si la inhibición es debida a fagos y no a 
otros agentes como los antimicrobianos, una parte del FLC se somete a un 
proceso térmico de 15 minutos a 90 ºC, el cual va a eliminar a los bacteriófagos 
pero no a los inhibidores (Capra y Guglielmotti, 2015). 
7.1.2. Test de actividad 
Este método permite identificar si una muestra contiene compuestos que inhiben 
el desarrollo bacteriano a través de la detección de la producción de ácido láctico. 
Se evalúa la inhibición de las BAL al exponerlas al FLC sospechoso en 
comparación con un control libre de la muestra. 
La muestra se considera positiva o sospechosa, si la producción de ácido lácticose reduce en comparación con el control. Es el método más sencillo dentro de los 
microbiológicos pero es poco sensible en cultivos mixtos (Quineroni y Reinheimer, 
2007). 
7.1.3. Test Indicador 
Es una modificación del Test de Actividad que incluye el agregado de un indicador, 
como por ejemplo azul de metileno o purpura de bromocresol. De esta forma, la 
reducción de producción de ácido láctico, por lo tanto el retraso en la disminución 
15 
 
del pH, se observa por un retraso en el cambio de color de la muestra (Quiberoni y 
Reinheimer, 2007; Marcó et al., 2012). 
 
 
 
 
7.1.4. Test de Turbidez 
En este caso, se realiza el cultivo de las BAL en dos tubos con un medio líquido, y 
uno de ellos, además, tiene la muestra de FLC. Se observa, a simple vista o por 
lecturas de densidad óptica, si se produce clarificación (lisis) del cultivo en 
presencia de la muestra en comparación con el control (Capra y Guglielmotti, 
2015) 
A diferencia del Test de Actividad, se puede obtener mayor sensibilidad si se 
realiza un enriquecimiento de fagos con varios subcultivos. Como desventajas se 
pueden mencionar el tiempo de procesamiento prolongado y la necesidad de 
confirmación por placas de lisis (Magadán et al. 2009). 
7.1.5. Métodos de placa 
Los métodos de placa, ya sea el de doble capa agarizada o el spot test poseen 
como ventajas el requerimiento de materiales y equipamientos simples, su 
sensibilidad (limite de detección bajo) y especificidad (si se realiza un aislamiento 
previo de las cepas de cultivo). Y como desventajas, se debe contar con una 
célula hospedadora sensible, no se detectan fagos que no produzcan placas de 
lisis visibles, el tiempo de incubación es largo lo cual dificulta la toma de 
decisiones (Samson y Moineau, 2013). 
a) Método de doble capa agarizada. 
A 
1 
2 
 
Fig.2 Test Indicador: A) mezcla de 
cultivo con el FLC. Posibles 
resultados: 1) Producción de ácido 
láctico y disminución de pH. 2) 
Retraso en cambio de color por 
disminución en la actividad del 
cultivo. 
 
16 
 
Este método permite la cuantificación de bacteriófagos por medio de la 
enumeración de unidades formadoras de placas (UFP), se realiza una mezcla de 
cultivo, FLC y agar semiblando y se depositan en una placa que ya contiene una 
capa agar (de allí el nombre de doble capa agarizada). Se lleva a incubación con 
tiempo y temperatura determinada para la especie bacteriana que se esté 
trabajando. Luego de la incubación, se observan zonas de aclaramiento, llamadas 
placas de lisis o calvas. Se realiza un conteo visual de placas de lisis y se 
determina UFP/ml en el FLC (Quiberoni y Reinheimer, 2007). 
Distintos factores como concentración de agar, espesor del agar, pH, 
concentración de Ca2+ y actividad de la cepa hospedadora pueden modificar el 
recuento de placas de lisis (Quiberoni y Reinheimer, 2007). 
 
b) Spot test 
Este ensayo permite detectar la presencia o ausencia de bacteriófagos. En este 
ensayo, el cultivo elegido es mezclado con agar semiblando y se distribuye en una 
placa de Petri conteniendo una capa de agar. Luego de la solidificación se añaden 
gotas de FLC. Las placas son incubadas para permitir el crecimiento de las 
bacterias que se observa por la formación de un tapiz turbio y confluente. Si la 
muestra contiene fagos se observan zonas claras en el tapiz por la lisis de las 
células en la zona de las gotas. Para diferenciar las placas de fagos de manchas 
uniformes claras que pueden ser de otros agentes inhibidores (antibióticos, 
desinfectantes o bacteriocinas) se procede a realizar diluciones del FLC. A medida 
Fig 3. Ejemplo de resultado de 
método de doble capa agarizada 
17 
 
que aumenta el título de dilución, los agentes inhibidores tienden a disminuir 
(Magadán et al., 2009). 
Se puede realizar una variación de esta prueba para la identificación de cepas 
lisogénicas. Se tratan los cultivos con agentes inductores como mitomicina C o luz 
UV y se evalúan los sobrenadantes con el mismo procedimiento explicado 
anteriormente. Una dificultad de esta metodología es encontrar una cepa 
indicadora (Magadán et al., 2009). 
7.2. Métodos instrumentales 
Estos métodos permiten reducir el tiempo de análisis y aumentar el número de 
muestras. Como desventaja requieren instrumental específico y personal 
capacitado (Capra y Guglielmotti, 2015). 
7.2.1. Medida de impedancia o conductancia. 
Es una evolución de los métodos anteriormente nombrados, ya que se mide el 
crecimiento del cultivo por un cambio de impedancia o conductancia del cultivo en 
leche en comparación con un control libre de muestra. También se puede utilizar 
en cepas lisogénicas tratadas previamente con mitomicina C o luz ultravioleta 
(UV). Como ventaja permite detectar fallas en los starters en 2-2,5 h dando lugar a 
la rápida toma de decisiones (Magadán et al. 2009). 
7.2.2. Microscopía electrónica. 
Se utiliza principalmente como fines de investigación por ejemplo cuando se 
quiere monitorear fagos en procesos de fermentación con cepas bacterianas no 
definidas. 
Para la observación, se utiliza la tinción negativa con acetato de uranilo de una 
muestra de fagos que debe contener aproximadamente 107 UFP/ml. Este límite 
marca una limitación de la prueba, ya que se debe hacer concentraciones de la 
muestra para poder obtener títulos más bajos lo que eleva el costo y el tiempo del 
análisis (Quiberoni, A. 2007) 
 
18 
 
7.2.3. Microscopía Epifluorescente. 
Es una alternativa de la microscopía electrónica que utiliza un indicador de 
componente fluorescente. Demostró tener mayor precisión que la microscopía 
electrónica y la citometría de flujo para las partículas de virus. El componente 
fluorescente se excita con una longitud de onda de luz específica y emite una luz, 
la cual da una partícula brillante más grande que el tamaño real del virus, lo que 
permite el conteo de partículas fágicas, pero el defecto es que no distingue 
partículas infecciosas de no infecciosas (Ortmann y Suttle 2009). 
Además de otras desventajas nombradas anteriormente de la técnica de 
microscopia electrónica dentro de las industrias es que requiere equipamiento 
costoso y personal altamente especializado para la utilización (Samson y Moineau 
2013). 
7.3. Métodos moleculares 
Los métodos moleculares se destacan por la detección de partes de la partícula 
fágica, ya sea su ADN o las proteínas de su cápside. La principal ventaja es la 
rapidez de los resultados, y la desventaja es que no diferencian partículas viables 
de las que están en estado inactivo (Magadán et al., 2009). 
7.3.1. PCR (reacción de cadena de polimerasa) 
La reacción en cadena de polimerasa (PCR) es una reacción enzimática in vitro 
que permite la amplificación de una secuencia específica de ADN. Se realizan 
varios ciclos compuestos de tres etapas: desnaturalización (se separan las 
cadenas de ADN), hibridación (se unen los primers a secuencias complementarias 
en el ADN) y extensión (síntesis de ADN a partir de los primers por actividad de la 
ADN polimerasa). Si la región específica de ADN se encontraba en la muestra, se 
obtendrá como resultado miles de copias al final de las reacciones, que se 
denominan amplímeros o amplicones. Si la muestra no contenía la región de ADN 
específica, no se obtendrán amplicones. En la denominada PCR tradicional, los 
amplicones se evidencian por medio de electroforesis en gel de agarosa con 
19 
 
agregado de alguna sustancia que se intercala entre las bases de ADN y 
fluorescen al iluminarse con luz UV (Magadán et al., 2009; Tamay de Dios et al., 
2013). 
Esta técnica ha sido adaptada para la detección en muestras de leche y en suero 
de queso con un límite de detección de 103-104 UFP/ml que es más bajo que el 
umbral de amenaza (105 UFP/ml) (Magadán et al. 2009). 
Estas técnica presenta ventajas, como son la detección e identificación de 
distintos fagos, así como la rapidez de los resultados(3-4hs) y el análisis 
simultáneo de gran cantidad de muestras. 
Como desventajas, este método no permite identificar si los fagos detectados son 
viables o no, se requiere conocer la secuencia de ADN de fagos que se buscan, 
se necesita de equipamiento especial y personal entrenado para realizar la prueba 
(Quiberoni, A. y Reinheimer, J. 2007). 
La presencia en la leche de inhibidores de la PCR, por ejemplo iones Ca++ de la 
leche podrían competir con Mg+ (cofactor de la ADN polimerasa), proteínas, grasa 
etc, podrían resultar en falsos negativos. Es por esto que comúnmente se utilizan 
muestras de suero (Río et al., 2012). 
 
Fig.4. Esquema de pasos para la detección de fagos por PCR 
Muestra de 
suero 
20 
 
Además de la PCR tradicional ya mencionada, se han desarrollado otras variantes 
como la PCR múltiple y la PCR en tiempo real. 
a) PCR múltiple. 
La PCR múltiple permite detectar y amplificar varios bacteriófagos en una misma 
muestra en una sola reacción (Samson y Moineau 2013). Como ejemplo, Labrie y 
Moineau (2000) diseñaron una PCR múltiple para detección en muestras de suero 
de los tres grupos diferentes de fagos (936, c2 y P335) que afectan en mayor 
porcentaje a Lactococcus lactis. Este método tiene un límite de detección de 104 a 
107 UFP/ml, aunque se puede mejorar la sensibilidad con un paso previo de 
concentración. 
b) PCR en tiempo real (qPCR) 
La PCR en tiempo real está basada en la PCR tradicional pero con algunas 
modificaciones que permite la detección de la amplificación a medida que va 
transcurriendo (de allí su nombre en tiempo real) y la cuantificación de las copias 
iniciales, por lo que también suele denominarse PCR cuantitativa. Una de las 
variantes de esta técnica utiliza, además de primers, sondas específicas lo que 
permite la realización de varias PCR en un mismo termociclado, y por lo tanto la 
detección simultánea de distintos fagos (Río et al., 2012). 
7.3.2. Pruebas inmunológicas 
Dentro de este grupo, se considera a la prueba de ensayo por inmunoabsorción 
ligado a enzimas (ELISA) como de elección. Se utiliza una mezcla de anticuerpos 
dirigidos, por ejemplo, contra proteínas estructurales principales. Según el diseño, 
pude permitir la detección de varios tipos de fagos en un solo ensayo (Magadán et 
al. 2009). 
Una de las ventajas es la rapidez del resultado (4-5hs), pero sus grandes 
desventajas son el costo de los reactivos a utilizar, por lo cual no tiene gran 
difusión entre las industrias, y la baja sensibilidad (detecta aprox. 107UFP/ml) 
(Magadán et al. 2009). 
21 
 
7.3.3. Citometría de flujo 
El método se basa en pasar una suspensión de células alineadas por delante de 
un haz de láser focalizado. El impacto del láser con la célula produce una señal 
que es recogida por distintos detectores que convierten cada señal en una señal 
electrónica que es digitalizada para permitir la medida de varios parámetros. 
En un ensayo de Michelsen et al (2007) se hizo una modificación de la técnica y 
se observó que era una buena herramienta para detectar Lactococcus en los 
primeros estadios de la infección. Además, se pudo detectar células de paredes 
celulares de baja densidad, una de las consecuencias de la lisina que utilizan los 
fagos para degradar la pared bacteriana, teñidas con diferentes sustancias como 
por ejemplo mitramicina y bromuro de etidio. 
Esta técnica permite la rápida detección de bacterias infectadas con fagos, sin 
especificar a qué grupo pertenecen; y además, se puede realizar en tiempo real, 
para poder tomar decisiones. Otra ventaja que debe ser considerada, es que esta 
técnica puede ser realizada en cultivos mixtos. 
7.3.4. Hibridación de ADN 
El uso de dot blot DNA- hibridization para la detección de fagos en suero de queso 
y leche ha demostrado buen límite de detección (105 – 107 UFP/ml) y posibilidad 
de procesamiento de varias muestras simultáneamente. Sin embargo, se requiere 
mucho tiempo de procesamiento y personal capacitado, por lo cual se utiliza más 
para investigación que para la caracterización de fagos en la industria (Magadán 
et al., 2009). 
8. Estrategias de control. 
8.1. Diseño de la planta, equipamientos y manejo de flujo de aire. 
Como se mencionó anteriormente, existen distintas fuentes de contaminación, 
entre ellas la leche cruda. Por tal motivo se deben establecer puntos distantes 
entre la zona de descarga de la leche cruda y donde se realiza la producción, para 
evitar la generación de aerosoles que pudieran contener fagos en el momento de 
22 
 
descarga. Además, si se dispone de un tanque de recuperación de suero éste 
debe estar en una sala alejada de la zona de producción, sobretodo de las tinas 
queseras (Marcó et al., 2012) 
Se debe tener en cuenta el manejo del flujo de aire, utilizando preferentemente 
sistemas de presión positiva y filtros. Los filtros deben ubicarse lo más lejos 
posible de la zona de los tanques de leche y de suero. Periódicamente, se debe 
realizar una limpieza y evaluación de eficiencia de los filtros, ya que los fagos 
pueden quedar adheridos a partículas de polvo (Marcó et al., 2012). 
Los equipos y el equipamiento deben ser preferentemente de acero inoxidable que 
soporte una limpieza estricta antes y después del trabajo, y con desinfectantes 
fuertes. Los tanques o tinas donde se realice la fermentación deben ser cerrados 
y, periódicamente buscar la presencia de grietas (Marcó et al., 2012). 
8.2. Saneamiento de la fábrica 
Es importante el uso de desinfectantes que posean una actividad antimicrobiana 
rápida, de fácil aplicación, que no produzcan ningún impacto en el producto final, 
que su degradación final forme compuestos inocuos y, preferentemente, que sean 
de bajo costo. Los desinfectantes deben eliminarse completamente una vez que 
actuaron, ya que pueden afectar el crecimiento de las BAL e inhibir la producción 
de acido láctico. Además, hay que tener en cuenta que se realice una desinfección 
adecuada en zonas de difícil acceso como codos de tuberías, rincones para que 
no queden fagos viables (Marcó et al., 2012). 
Se han propuesto distintos desinfectantes para uso en industrias de productos 
lácteos. En un estudio de Suarez (2002), el desinfectante con mejor actividad fue 
el ácido paracético al 0,15%, que demostró rápida acción (exposición de 5 
minutos) y e inactivación de altos títulos de fagos (106 UFP/ml). Se considera que 
la exposición del fago al ácido modifica su estructura y altera su ADN. 
Otro tipo de desinfectante que se utiliza es el hipoclorito de sodio, que mostró ser 
eficiente para algunos fagos a concentraciones de 100 ppm, pero para otras 
23 
 
especies se necesitaron 200-300 ppm. También el etanol a concentraciones del 
100-75% demostró cierta eficiencia en la destrucción de fagos pero no en su 
totalidad, mientras que el isopropanol con una concentración del 100% no 
demostró ninguna eficiencia en la inactivación de fagos de Lactococcus (Suarez y 
Reinheimer 2002). 
8.3. Tratamientos térmicos y de presión en la leche y en subproductos. 
Comúnmente la leche sufre un proceso de pasteurización para eliminar patógenos 
y reducir la carga microbiana que produciría deterioro en el producto final. Para 
este tratamiento se tienen en cuenta dos tipos de temperatura y tiempos distintos, 
la pasteurización LTLT (low temperature, long time) que es a 63 ºC por 30 
minutos, y HTST (high temperature, short time) a 72 ºC por 15 segundos. Para los 
fagos del grupo P335, el tipo de pasteurización LTLT no deja fagos viables; el 
grupo de fago c2 es inhibido con la pasteurización HTST. Pero los fagos del grupo 
936 son inactivados a 90 ºC por 5-15 minutos, lo cual no se podría realizar en 
leche sin perder componentes intrínsecos y cambiar características esenciales y, 
en conclusión, quedan algunos fagos viables en la leche pasteurizada y, también 
se los encuentra en el suero. Se demostró que la eliminación delos fagos no sigue 
una cinética de primer orden, sino que hasta el 90% de los fagos son eliminados 
rápidamente y el resto decrece lentamente, lo cual puede deberse a los fagos que 
presentan resistencia (Suarez y Reinheimer, 2002; Madera et al., 2004; Marcó et 
al., 2012). 
También se recomienda realizarle un proceso térmico al suero antes de reciclarlo, 
para reducir problemas de recontaminación, pero se debe tener en cuenta que se 
pueden afectar las proteínas del suero (Marcó et al., 2012). 
En cuanto a los tratamientos de presión, la homogenización a alta presión da 
como resultado la pérdida de integridad de la cápside con pérdida de ADN o una 
disociación de cabeza-cola. La inactivación de los fagos es proporcional a la 
presión que se utiliza y el número de veces que el fluido a alta presión puede 
pasar por el sistema. Se observó que los fagos 936, c2 y P335 son todos 
24 
 
susceptibles a este método, presentando más susceptibilidad los c2 por el tipo de 
cabeza mas alargada (Murphy et al., 2017). 
8.4. Rotación de cultivos 
Las empresas que generan fermentos comerciales utilizan estrategias de 
resistencia de las bacterias para el desarrollo de productos. A partir de cultivos con 
resistencia a fagos, se puede establecer en la industria un programa de rotación 
de cultivos, con la utilización de determinados fermentos por cierta cantidad de 
días, y cuando se observa una alteración en el proceso de fermentación, se 
cambia por otro tipo de fermento que comparta las características tecnológicas 
para no modificar el producto final. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
25 
 
 
 
CONCLUSIÓN 
Existe una variedad de métodos para la detección de fagos en la industria 
quesera, aunque no todos son aplicables en todas las escalas de producción, e 
incluso algunos de ellos solo pueden ser utilizados con fines de investigación 
(microscopia electrónica y epifluorescente). Considerando la rapidez requerida 
para los tiempos de producción y rentabilidad económica, la PCR es uno de los 
métodos ideales para la detección de fagos. Sin embargo, es una prueba costosa 
por su equipamiento e insumos, por lo que no es considerada para industrias 
queseras, por lo que queda limitada a un fin de investigacion. 
Los métodos microbiológicos, por otro lado, requieren menor costo económico, 
son más fáciles de realizar ya que no se necesitan grandes equipamientos y 
pueden aplicarse en industrias queseras. 
Distintas estrategias como higiene, tratamientos térmicos y rotación de cultivos, si 
bien no garantizan la eliminación de la totalidad de los fagos, pueden producir una 
disminución considerable y son aplicables en las industrias de las distintas 
escalas. Si bien en muchos casos la estructura edilicia ya está establecida y no es 
fácilmente modificable, se pueden realizar algunas modificaciones, como por 
ejemplo la instalación de filtros que limpien el aire. 
En conclusión, y considerando las características de varios establecimientos de 
tipo tambo-fábrica, se destaca la necesidad de incentivar el uso de la combinacion 
de estrategias para evitar la propagación de fagos, y asesorar sobre métodos 
disponibles para control de contaminaciones para implementación o derivación a 
servicios externos. 
 
 
26 
 
 
 
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