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TAREA CONTROL DE AGUA 1. Escriba los fundamentos de Agar plate count El Plate Count Agar (Agar para Standard Methods), es un medio utilizado para la enumeración de bacterias aeróbicas en aguas, aguas residuales y alimentos. En el PCA (Plate Count Agar), la Triptona y el Extracto de Levadura suministran las fuentes de nitrógeno y de vitaminas, que requieren para el crecimiento una basta variedad de microorganismos, la glucosa actúa como fuente de energía. Se prepara según la fórmula de la USP y recomendaciones de la APHA (American Public Health Association) La transparencia del medio y el buen tamaño de las colonias al crecer facilitan los recuentos bacterianos.1 COMPOSICIÓN POR LITRO DE MEDIO EN AGUA PURIFICADA ➢ Hidrolizado pancreático de caseína (Triptona) → 5.0 g ➢ Extracto de levadura → 2.5 g ➢ Glucosa → 1.0 g ➢ Agar → 15.0 g ➢ pH : 7,0+/- 0,2 2. Escriba los fundamentos de Caldo Rothe El Caldo Rothe es un medio selectivo para la cuantificación de enterococos mediante la técnica del Número Más Probable (NMP) en agua, productos alimenticios y materiales contaminados por aguas residuales. La presencia de enterococos es un indicador de contaminación fecal en el agua, especialmente cuando ocurrió hace mucho tiempo y las bacterias coliformes menos resistentes, pueden estar ya muertas cuando se lleva a cabo el análisis. ● Polipeptona y Glucosa aportan los elementos nutritivos y energéticos. ● Sodio Azida inhibe el crecimiento de los microorganismos Gram negativos y no afecta el crecimiento de los Enterococos. ● Sodio Cloruro mantiene el nivel salino necesario para el buen crecimiento. Interpretación de los resultados: ❖ Positivo: Turbidez en el medio de cultivo. ❖ Negativo: El medio permanece límpido. El crecimiento en este medio de cultivo brinda un diagnóstico presuntivo, y es necesario realizar pruebas bioquímicas de identificación bacteriana.2 3. Escriba los fundamentos de Agar KF El agar KF utilizado por Kenner en 1960 para el recuento de estreptococos fecales en muestras de agua resultó tener un excelente poder de recuperación en comparación con otros medios utilizados en aquella época. Los autores observaron que el medio permitió una excelente caracterización de los cocos entéricos, así como de los microorganismos con propiedades químicas y bioquímicas y antigénicas similares: Streptococcus bovis y Streptococcus equinus.11 Principios: ● La alta capacidad nutritiva del medio se debe a la presencia de una elevada proporción de poliptona, extracto de levadura y carbohidratos. ● El cloruro de sodio mantiene el equilibrio osmótico. ● La lactosa y la maltosa son fuentes de energía para los microorganismos que pueden utilizarlas. ● La acidificación del medio se manifiesta por el cambio del bromocresol de púrpura a amarillo. ● La azida sódica inhibe el crecimiento de las bacterias Gram negativas contaminantes. ● El TTC añadido justo antes de su uso es un indicador del crecimiento bacteriano. Se reduce a un formazán insoluble dentro de las células. Esta reacción se visualiza por la aparición de colonias de color rojo a granate. 4. Realice el fundamento y procedimientos de la determinación de clostridimetría: Recuento de clostridios sulfito reductores Los procedimientos bacteriológicos de rutina en el análisis de agua incluyen la determinación de clostridios sulfitos reductores.3 Los anaerobios sulfito reductores constituyen un grupo asociado a los Clostridium spp. y como tal se caracterizan por ser organismos Gram positivos, anaerobios, formadores de esporas. Se encuentran en diversas fuentes ambientales, como suelo, sedimentos marinos, vegetación en descomposición, intestino humano y de animales, heces, aguas superficiales, como también en los alimentos, especialmente cuando las condiciones de higiene en la elaboración son deficientes. Son deteriorantes, ya que producen malos olores y, con mucha frecuencia, ennegrecimiento del producto cuando este tiene hierro. Estos microorganismos tienen la capacidad de reducir los sulfitos a sulfuros a partir de aminoácidos y compuestos azufrados. Estas bacterias se han propuesto como indicadores de contaminación de alto riesgo del agua.4 La determinación de éstos se basa en el recuento del número de colonias, con capacidad sulfito-reductora, desarrolladas en un medio específico, incubadas en condiciones anaeróbicas durante un tiempo y a una temperatura determinada. Procedimiento: 1. Agitar la muestra vigorosamente para homogeneizar. 2. A partir de la muestra previamente homogeneizada tomar alícuotas de 10 mL con una pipeta estéril y depositarlas en cada uno de los tubos estériles vacíos. 3. Una vez que estos tubos contienen los 10 mL de agua, mantenerlos en un baño de agua a 80°C durante 5 minutos a efecto de que se destruyan las formas vegetativas y permanezcan solamente las formas esporuladas. 4. Retirar y dejar enfriar los tubos. 5. Tomar los tubos con agar SPS a 50°C, rotularlos convenientemente y proceder a su inoculación profunda, de la siguiente manera: a. Con una pipeta estéril tomar 5 mL de la muestra de agua e introducirla hasta el fondo del tubo que contiene el agar. b. Con mucho cuidado ir depositando el agua a lo largo de todo el tubo desplazando la pipeta al exterior, procurando que el total de la muestra quede en el agar y no se airee. c. Rápidamente pasar el tubo al chorro del agua de la llave para enfriarlo. d. Después añadir una capa de unos 3 mm de espesor de vaselina o parafina estéril para conseguir condiciones de anaerobiosis. e. Este procedimiento se repite con los 3 tubos restantes. NOTA: Si se sospecha que el agua está muy contaminada, se pueden inocular 5 mL de muestra en un tubo y en los restantes, 5 mL de las diluciones 10-1, 10-2 y 10-3. En caso necesario se puede incrementar el grado de dilución. 6. Una vez inoculados todos los tubos, incubar a 37°C durante 24 h. 7. Transcurrido el período de incubación, contar las colonias de color negro que aparezcan en los cuatro tubos inoculados.3 CÁLCULOS Y PRESENTACIÓN DE RESULTADOS: Efectuado el recuento en los tubos correspondientes, el resultado obtenido se calculará de la siguiente manera: ● Si se han sembrado 20 mL de muestra, es decir, 5 mL en cada uno de los cuatro tubos, el resultado es directo. ● En caso de haber realizado diluciones, se aplica la siguiente fórmula: 𝑁ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑒𝑠𝑝𝑜𝑟𝑎𝑠 𝑑𝑒 𝑐𝑙𝑜𝑠𝑡𝑟𝑖𝑑𝑖𝑜𝑠 𝑠𝑢𝑙𝑓𝑖𝑡𝑜 𝑟𝑒𝑑𝑢𝑐𝑡𝑜𝑟𝑒𝑠 20 𝑚𝑙 = 𝑁ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑟𝑒𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑖𝑛𝑜𝑐𝑢𝑙𝑎𝑑𝑎 𝑒𝑛 𝑚𝑙 × 20 Los resultados se expresarán en: Número de esporas de clostridios sulfito-reductores: __/20 mL. 5. Describa los pasos para pruebas confirmatorias de: ● Escherichia Para las pruebas confirmativas se seleccionan las muestras que dieron positivo a la prueba presuntiva. 1. Se utiliza medio de eosina azul de metileno (EMB) para diferenciar Escherichia de bacterias Gram negativas mediante la producción de un brillo metálico verdoso que confirma la presencia de la bacteria indicadora. ❖ La producción de la indicación de color de las colonias se puede observar hasta después de 24 horas de incubación a 37ºC mediante la muestra en asa de los tubos positivos. Figura 1. Cultivo aislado de E. coli mediante la producción de un brillo metálico verdoso en medio EMB. La presencia del indicador Escherichia se confirma por la producción de gas y cambios de color en los medios. Para una confirmación más completa, se puede realizar una diferenciación mediante pruebas de indol, rojo de metilo, Voges-Proskauer y citrato de Simmons (IMViC).5 1. Inocular las muestras bacterianas sospechosas en el caldo de preparado. 2. Incubar a 37ºC durante 24 horas de incubación. 3. Para la prueba de indol, agregar unas gotas de reactivo de indol de Kovacs con la muestra de cultivo incubada. 4. Para la prueba de rojo de metilo, agregue de 6 a 8 gotas de indicador de rojo de metilo al tubo que contiene el caldo incubado de los organismos sospechosos. 5. Para la prueba de Voges-Proskauerse añadieron unas gotas de reactivo de Barritt I y II a los tubos incubados de los tubos sospechosos. 6. Para la prueba de citrato de Simmons, se hacen cultivos inclinados con este agar y se inocula con los organismos de prueba, luego se mantienen en incubación.6 Figura 2. Caracterización bioquímica por pruebas IMViC para aislado de E. coli. ● Klebsiella Las pruebas bioquímicas que se realizan comúnmente en la identificación de las enterobacterias son los métodos IMViC, y la prueba de agar triple azúcar hierro (TSI) para encontrar bacterias que produzcan gases y ácidos. 1. La prueba de indol se realiza con Caldo triptona inoculado con cultivo. Las colonias se incuban a 37°C durante 24 horas y se les administran 1-3 gotas del reactivo de Kovacs. Se mezcla suavemente en intervalos de 10 a 15 minutos. 2. La prueba de RM se realiza con el indicador de pH rojo de metilo que permanece rojo a un pH de 4,4 o inferior. Las colonias se inoculan y se incuban a 37°C durante 24 horas. Luego, se añaden 2-5 gotas del reactivo rojo de metilo. 3. Para la prueba VP, se transfiere aproximadamente 1/3 de cada cultivo a un tubo de ensayo vacío, luego se agregan 6 gotas de reactivo de Barrit. Se incuban todos los tubos durante 24-48 horas a 37°C. 4. Para la prueba de citrato se inoculan inclinaciones de agar citrato de Simmons por medio de una inoculación por punción y estrías. Se incuban a 37°C durante 24 horas.7 Figura 3. Caracterización bioquímica por pruebas IMViC para K. oxytoca. 1. Para la prueba TSI, las colonias se recogieron y se cultivaron en el medio TSI. 2. Se inoculó TSI pinchando a través del centro del medio hasta el fondo del tubo y luego extendiendo sobre la superficie del agar inclinado. 3. Se tapó y se incubó toda la noche a 37°C. Luego se observó la producción inclinada, a tope, de gas y de H2S. ❖ El resultado se considera positivo si el color de los medios va de rojo anaranjado a amarillo. Son resultados negativos si los medios se quedan de color rojo. ❖ La formación de gas se caracteriza por la ruptura del agar provocada por la formación de CO2. ❖ La formación de H2S se indica mediante depósitos negros.8 Resultado: A/A, Gas (+), H2S (-) Figura 4. Caracterización bioquímica por prueba TSI para Klebsiella. ● Citrobacter Para confirmar la presencia de citrobacters, se incubaron las muestras de agua a una temperatura de 37 °C durante 24 horas en un medio selectivo. La siembra de las colonias de Lactosa positiva de Citrobacter freundii, se realiza en agar MacConkey. En un cultivo de 24 horas, en un ambiente anaeróbico y a una temperatura de 37°C. Las colonias típicas de Citrobacter spp. que crecen en agar MacConkey son de color rosa.9 Figura 5. Citrobacter spp. en agar MacConkey. ❖ Citrato: Se cultiva el microorganismo en agar citrato de Simmons. Solo las bacterias capaces de metabolizar el citrato podrán multiplicarse en este medio y liberarán iones amonio lo que, junto con la eliminación del citrato (ácido), generará una fuerte alcalinización del medio que será aparente por un cambio de color del indicador de pH, de verde a azul (positivo). La incubación se realiza a 37 ºC durante 24 a 48 horas. ❖ Rojo de Metilo: Se cultiva Citrobacter spp. en caldo RM-VP (medio de Clark y Lubs) y se incuba a 37 º C durante un periodo 24 a 48 horas. Pasado este tiempo, se pasa a un tubo inclinado y se le añade unas gotas (4 a 5) de solución indicadora de Rojo de Metilo. Se agita ligeramente para homogeneizar y se observa la coloración. Se considera positiva si vira al rojo y negativa si permanece amarillo.10 Figura 6. Test bioquímico e identificación de Citrobacter spp.: Citrato (+) y RM (+). ● Salmonella La resiembra se realizó en dos medios selectivos a partir del cultivo obtenido. Uno de los medios, agar xilosa lisina desoxicolato (agar XLD) y como medio selectivo complementario se eligió un agar cromógeno de Salmonella (Oxoid). Los dos se incubaron a 37 ± 1°C durante 24 ± 3 horas. Después de la incubación se examinan las placas para identificar la presencia de colonias típicas y se procedió a la identificación. Las colonias típicas de Salmonella que crecen en el agar XLD son transparentes de color rojizo con o sin un centro negro y las colonias típicas que crecen en agar cromógeno de Salmonella son de color rosa-rojo. Figura …: Cultivo de Salmonella spp. en Agar cromógeno de Salmonella. Se seleccionaron cinco colonias sospechosas de Salmonella de cada placa y se aislaron en placas de agar nutritivo (plate count agar). Finalmente a partir de una colonia aislada en el agar nutritivo, se realizaron las siguientes pruebas bioquímicas positivas para Salmonella spp.: ● Rojo de metilo: Para realizarla se utilizó el mismo medio de cultivo, el caldo rojo de metilo-Voges-Proskauer. Se suspendió el contenido de un asa de la colonia sospechosa en un tubo estéril que contenía 3 ml de este y se incubó a 37 ± 1 °C durante 24 ± 3 horas. Se realizó la prueba del rojo de metilo, la cual tiene como objetivo determinar si se produce formación de ácidos y para Salmonella debe ser positiva. Para ello se añadió rojo de metilo, un indicador de pH que actúa entre 4,2 (rojo) y 6,3 (amarillo) y se interpretaron inmediatamente los resultados donde se consideró un cambio de color a rojo como prueba positiva. ● Citrato: La prueba del citrato se utiliza para determinar si un microorganismo es capaz de crecer con citrato como única fuente de carbono. Para ello se utiliza el agar Citrato de Simmons, que contiene citrato de sodio, fosfato de amonio y azul de bromotimol como indicador de pH. Para realizarla se sembró la superficie en estría, se incubó a 37 ± 1 °C durante 24 horas y después del periodo de incubación se interpretaron los resultados. Los resultados se consideraron positivos si el medio había virado a color azul, este sería el caso de posible Salmonella, y se consideraron negativos si no había virado.11 Figura…: IMViC Test para Salmonella spp: RM (+) y C (+). ● Shigella El caldo Gram negativo y el caldo selenita cistina son recomendados para inhibir el crecimiento de bacterias Gram positivas y favorecer el crecimiento de bacterias Gram Negativas que metabolizan manitol y triptosa, tales como Salmonella spp., y Shigella spp. El tiempo de incubación en estos caldos es de 16 horas. La temperatura a la cual debe mantenerse el caldo para lograr el máximo crecimiento de las bacterias es de 35 °C, sin embargo, para favorecer el desarrollo de Shigella flexneri, algunos autores sugieren que la temperatura ideal de incubación es de 42 °C. El caldo Gram negativo, según algunos autores, muestra pobres resultados para recuperar y permitir el crecimiento de colonias de Shigella sonnei y S. flexneri estresadas (con soluciones ácidas y picantes). Como medios de cultivos para las distintas especies de Shigella se emplean principalmente Agar Salmonella-Shigella (SS), Agar MacConkey. El primero de ellos es moderadamente selectivo y en él crecen colonias de Shigella incoloras, convexas y de no más de 4 mm de diámetro. Figura 9: Cultivo de bacterias del género Shigella. El Agar MacConkey, por su parte, inhibe el crecimiento de las bacterias Gram positivas y separa las bacterias Gram negativas fermentadoras de las no fermentadoras. En este medio, las colonias de Shigella muestran una apariencia semejante a la obtenida en el agar SS. Otros medios de cultivos empleados para el cultivo de S. flexneri incluyen el agar entérico de Hektoen (HEA por sus siglas en inglés), Agar XLD (Xylose Lysine Deoxycholate agar), Agar DCA (Deoxycholate Citrate agar) y el agar Tergito. (12) ● Proteus Prueba de la Fenilalanina Desaminasa: Se cultiva el microorganismo en agar fenilalanina sembrando la superficie del slant con abundante inóculo e incubando durante 24 horas a.37 ºC. Seguidamente se añade 4-5 gotas de la solución de cloruro férrico al 10% de manera que inunde todo el medio inclinado. La presencia de ácido fenilpirúvico (prueba positiva) se manifiesta por la aparición de un color característico verde oscuro o verde-azulado.Figura 10 : Test de Fenilalanina Desaminasa (+) Prueba de la Ureasa: Esta actividad enzimática es característica de todas las especies de Proteus y se usa sobre todo para diferenciar este género de otras enterobacterias que dan negativo o positivo retardado. Se cultiva el microorganismo en slant en agar urea de Christensen. Este medio se complementa después del autoclavado con 50 ml/l de urea. Ésta será degradada por aquellos microorganismos capaces de producir la enzima ureasa. Esta degradación produce amoniaco que hará variar el color del indicador de amarillo a rojo, poniéndose así de manifiesto la actividad ureasa. (13) Figura 11 : Test de Ureasa para Proteus (+) ● Vibrium Los métodos para la obtención y transporte de las muestras fecales, es aislamiento primario y la identificación presuntiva en agar selectivo se incluyen los Apéndices; los cultivos con sospecha de ser V. cholerae se deben subcultivar en un medio no selectivo, como para la identificación por serología en lámina y pruebas bioquímicas. Las cepas de V. cholerae requieren de 0,5% de NaCl para un crecimiento óptimo en medio de agar; algunas formulaciones comerciales de agar nutriente no contienen sal y no deben utilizarse para el cultivo de V. cholerae. ➔ Prueba de la cuerda: Utiliza crecimiento fresco de un agar no selectivo y es útil para excluir las especies que son Vibrios; la prueba de la cuerda puede desarrollarse en una lámina de vidrio o en una placa plástica de Petri, suspendiendo un crecimiento de agar infusión de corazón durante 18-24 hrs en una gota de solución acuosa de desoxicolato de sodio al 0,5%. Figura 12: Prueba de la cuerda positiva con Vibrio cholerae ➔ Agar hierro de Kliger y agar hierro triple azúcar: Es importante que el agar hierro de Kliger y el agar hierro triple azúcar sean preparados de manera que los tubos tengan un tope profundo y una cuña larga, si el tope no es suficientemente profundo se pueden generar reacciones engañosas en estos medio. Las cuñas de agar AHK o AHTA se inoculan por punción del tope y estriando la superficie del medio, se incuba las cuñas a 35-37°C y se examina durante 18-24 hrs. Los resultados obtenidos indican que Figura 13: Reacciones de aislamientos de Vibrio Cholerae en agar de hierro de Kliger y agar triple azúcar.13 AHK K/A (cuña roja/fondo amarillo), no produce gas, no H2S. AHTA A/A (cuña amarilla/fondo amarillo), no produce gas, no H2S ● Enterobacter Son bacilos Gram negativos, desdoblan los nitratos a nitritos, fermentan glucosa, aerobios facultativos y son Oxidasa (-) y Catalasa (+). Pruebas bioquímicas:16 ➢ LIA: Color lila, no tiene inhibidores, su indicador es púrpura de bromocresol y es sembrado por picadura profunda con aguja y luego por estrías en el pico. ➢ Citrato de Simmons: Este medio permite comprobar la capacidad de la bacteria a utilizar el citrato como fuente exclusiva de carbono. La degradación del citrato conlleva a la alcalinización del medio y del viraje del indicador azul de bromotimol de verde a azul prusia. ➢ Úrea: En este medio se observa la capacidad de la bacteria de degradar la urea por medio de la enzima ureasa formando amoniaco y carbonato de amonio, que alcalinizan el medio. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. FICHA TÉCNICA: 770572 Rev. : Septiembre/2009 Producto: PLATE COUNT AGAR PLACA DE 90 mm USO El Plate Count Agar ( Agar para Standard Methods), es un medio utilizado para la enumeración de bacterias aeróbicas en aguas, aguas residuales y alimentos [Internet]. Unam.mx. [citado el 29 de junio de 2022]. Disponible en: https://amyd.quimica.unam.mx/pluginfile.php/9879/mod_folder/content/0/Agar%20cuenta %20est%C3%A1ndar-Mes%C3%B3filos.pdf?forcedownload=1#:~:text=En%20el%20PC A%20 2. Azida Glucosa Caldo [Internet]. Disponible en: https://www.britanialab.com/back/public/upload/productos/upl_60705df1c048a.pdf 3. Castañeda M. MICROBIOLOGÍA APLICADA-MANUAL DE LABORATORIO [Internet]. Ciudad de México: UAM Azcapotzalco; Disponible en: http://zaloamati.azc.uam.mx/bitstream/handle/11191/1746/Microbiologia_aplicada_manual _de_laboratorio.pdf?sequence=3 4. Gestion. Bacterias productoras de H2S (reductoras de sulfato, reductoras de sulfito, reductoras de azufre, y otras moléculas con azufre) - Cultivo cualitativo y cuantitativo; Identificación molecular (PCR y secuenciación).. - IVAMI [Internet]. Ivami.com. [citado el 29 de junio de 2022]. Disponible en: https://www.ivami.com/es/microbiologia-de-alimentos/5444-bacterias-productoras-de-h2s-r eductoras-de-sulfato-reductoras-de-sultifo-reductoras-de-azufre-y-otras-moleculas-con-azuf re-cultivo-cualitativo-y-cuantitativo-e-identificacion-molecular 5. Seinn Sandar May Phyo, San San Yu & Khin Maung Saing. Bacteriological Examination of Bottled Drinking Water by MPN Method [Internet]. ResearchGate. Elsevier; 2019 [citado el 2 de julio de 2022]. Disponible en: https://www.researchgate.net/publication/335490904_Bacteriological_Examination_of_Bot tled_Drinking_Water_by_MPN_Method 6. Kumar S, Rajasekaran P, N S, J Poorna Chandran. Analysis of Various Water Samples for Enterobacteriaceae by MPN Method [Internet]. ResearchGate; 2013 [citado el 2 de julio de 2022]. Disponible en: https://www.researchgate.net/publication/305723300_Analysis_of_Various_Water_Sample s_for_Enterobacteriaceae_by_MPN_Method 7. Prakash P, K. D. CHECKING THE PURITY OF WATER SAMPLES COLLECTED FROM A RURAL AREA AND ASSURING THE PUBLIC SAFETY BY CREATING AWARENESS TO THE PEOPLE LIVING IN THAT AREA. International Journal of Advanced Research. 2016 Sep 30;4(9):278–93. 8. Saimin J, Hartati H, Purnamasari Y, Mulyawati SA, Tien T, Ayitrina P. Microbiological and Biochemical Contamination Analysis of Refilled Drinking-water in Abeli, Kendari, Southeast Sulawesi. The Indonesian Biomedical Journal [Internet]. 2020 Jun 29 [citado el 2 de julio de 2022];12(2):124–9. 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