Laboratorio Química Analítica II [UAM]

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Manual de prácticas
de química analítica II
José Ramón Verde Calvo • Ma. de Lourdes Escamilla Hurtado
Alberto Reyes Dorantes • Frida Malpica Sánchez
Casa abierta al tiempo
UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA
UNIDAD IZTAPALAPA
DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
Ramón Verde Calvo es egresado
de la Facultad de Química de la
UNAM, en donde obtuvo su título
de químico farmacéutico biólogo,
tecnólogo en alimentos. Poste-
riormente realizó sus estudios de
maestría en la Facultad de Ciencias
de la UNAM. Actualmente trabaja
en la UAM-Iztapalapa en el grupo de Enología y Ali-
mentos Fermentados, en donde lleva a cabo investiga-
ciones sobre el cambio en el color del vino tinto du-
rante el añejamiento.
María de Lourdes Escamilla Hur-
tado realizó sus estudios de licen-
ciatura en la Facultad de Química
de la UNAM, obteniendo el título
de química farmacéutica bióloga,
orientación en Tecnología de Ali-
mentos. Posteriormente obtuvo su
grado de maestría en la Universi-
dad de Hiroshima, Japón, en el área de Tecnología de
Fermentaciones. Posteriormente se ha desarrollado
profesionalmente como profesora-investigadora en la
Universidad Autónoma Metropolitana, Unidad Iztapa-
lapa, desde 1982, dirigiendo proyectos sobre fermen-
taciones lácticas en alimentos indígenas tradicionales,
producción de aromas por fermentación y enología, de
los cuales surgieron diversas publicaciones nacionales
e internacionales. También ha ejercido la docencia, tanto
en la UAM-Iztapalapa como en la Facultad de Química
de la UNAM, formando recursos humanos en los cam-
pos de microbiología y biotecnología alimentaria.
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Manual de prácticas de
química analítica II
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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA
Dr. José Luis Gázquez Mateos
Rector General
Lic. Edmundo Jacobo Molina
Secretario General
UNIDAD IZTAPALAPA
Dr. Luis Mier y Terán Casanueva
Rector
Dr. Eduardo Carrillo Hoyo
Secretario
Dr. José Luis Arredondo Figueroa
Director de la División de Ciencias Biológicas y de la Salud
Dr. Gerardo Saucedo
Jefe del Departamento de Biotecnología
Ma. del Rosario Hoyos Alea
Jefa de la Sección de Producción Editorial
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Manual de prácticas de
química analítica II
José Ramón Verde Calvo
Ma. de Lourdes Escamilla Hurtado
Alberto Reyes Dorantes
Frida Malpica Sánchez
guc i
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Cuidado de la edición y corrección de estilo:
Ma. Guadalupe Olvera Arellano
Primera impresión: 1999
© UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA
UNIDAD IZTAPALAPA
Av. Michoacán y La Purísima
Iztapalapa, 09340, México, D.F.
ISBN: 970-654-363-5
Impreso y hecho en México / Printed in México
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índice
Presentación 9
Capítulo 1. CROMATOGRAFÍA DE GASES 11
Práctica 1. Análisis cualitativo de cromatografía
de gases (dos columnas) 33
Práctica 2. Factor de respuesta en cromatografía de gases 37
Bibliografía 40
Capítulo 2. CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE
ALTA RESOLUCIÓN 43
Práctica 3. Cuantificación de una muestra problema de anisaldehído
(método del patrón interno) 63
Práctica 4. Separación y cuantificación de una muestra de antocianinas
(método del patrón externo) 69
Bibliografía 74
Capítulo 3. ESPECTROFOTOMETRÍ A 75
I. VISIBLE ULTRAVIOLETA 77
Práctica 5. Desarrollo de un método espectrofotométrico 85
Práctica 6. Determinación por espectrofotometría de la
concentración de cobalto y níquel en una mezcla 91
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II. TURBIDIMETRÍA 95
Práctica 7. Cuantificaciónturbidimétrica de sulfates 97
Bibliografía 101
Capítulo 4-MÉTODOS ELECTROQUÍMICOS 103
Práctica 8. Determinación potenciométnca de constantes
de ionización 113
Práctica 9, Titulación potenciométnca del ferrocianuro con ceno 117
Bibliografía 125
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Presentación
El presente manual tiene como meta apoyar de la manera más amplia el curso
teórico-práctico de Química Analítica II, materia que se imparte en el sexto
trimestre de las carreras de ingeniería en alimentos e ingeniería bioquímica in-
dustrial. El material está elaborado pensando en el sistema trimestral de la
Universidad Autónoma Metropolitana, hecho que no restringe que cual-
quier curso de química analítica impartido en otra escuela pueda utilizar este
material.
En el manual se abordan temas como: cromatografía de gases y de líquidos
de alta resolución, espectrofotometría y potenciometría. Cada capítulo está
estructurado con una introducción (los fundamentos teóricos necesarios para
comprender los temas incluidos en la parte práctica), y presenta la descripción
de los aparatos a utilizar, así como la forma correcta de operarlos.
El texto se compone de nueve prácticas, estructuradas con objetivos, intro-
ducción, material y reactivos, normas y reglas de seguridad, técnicas, tratamiento
de datos experimentales, cuestionario y bibliografía. Esta última se presenta al
final de cada capítulo e incluye textos de autores reconocidos, así como revistas
con artículos actualizados de apoyo a los experimentos.
Para la obtención de mejores resultados, se recomienda relacionar am-
pliamente los conceptos teóricos con las actividades experimentales.
Los autores
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Capítulo 1
CROMATOGRAFÍA DE GASES
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Introducción
Este capítulo tiene como objetivo mostrar al alumno los fundamentos prácticos
de la cromatografía de gases: cómo funciona un cromatógrafo con detector de
conductividad térmica y cómo se obtiene e interpreta el cromatograma, in-
cluyendo una explicación sobre los cálculos para cuantificar muestras a partir
de compuestos puros.
La cromatografía de gases es la técnica más utilizada entre los métodos
instrumentales de separación, ya que identifica de manera sencilla y rápida el
número de componentes de una mezcla. El único requisito para su imple-
mentación es que las sustancias a separar sean estables a la temperatura ne-
cesaria para mantenerlas en estado gaseoso (Ewing, 1979).
Clasificación de la cromatografía
Por sus características analíticas la cromatografía puede ser:
a) Cromatografía cualitativa, que consiste solamente en la separación
de los componentes de una mezcla.
b) Cromatografía cuantitativa o analítica, que permite identificar y
cuantificar cada uno de los componentes de la mezcla.
De acuerdo con la naturaleza de la fase estacionaria, la cromatografía de
gases se divide en dos:
a) Cromatografía gas sólido (CGS), también conocida como croma-
tografía de adsorción, en donde la fase estacionaria cuenta con un
material sólido como el sílice granular, la alúmina o el carbón. El soluto
se adsorbe en la superficie de las partículas sólidas. Las separaciones se
llevan a cabo sobre adsorbentes, debido a que se crea un equilibrio
entre el adsorbente y las moléculas de la fase móvil. Si las moléculas de
un componente están estrechamente ligadas al adsorbente, la sustancia
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no correrá por la columna ya que es retenida fuertemente por ésta. Si las
moléculas tienen una baja atracción por el adsorbente, tenderán a moverse
con rapidez junto con la fase móvil (figura 1.1).
Soluto absorbido en la
superficie de la fase
estacionaria
Figura 1.1 Cromatografía de adsorción.
La tabla siguiente muestra algunos ejemplos de columnas capilares comer-
ciales, utilizadas en cromatografía gas sólido, mencionando su aplicación
y la temperatura máxima de trabajo.
Tabla 1.1 Columnas capilares comerciales.
Columna
H P S o M
Poraplot Q
Poraplot U
Temperatura
Máxima
200 °C
250 °C
190°C
Aplicación
Hidrocarburos, gas natural
Alcoholes volátiles en
agua,gases
Compuestos volátiles polares,
aldehidos
HP Hewlett Packard
Columnas capilares, soporte; A12O3
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Cromatografía de gases
b) Cromatografía gas líquido (CGL) o cromatografía de reparto, en
donde la fase estacionaria es una capa delgada de un líquido no volátil,
colocada sobre un soporte sólido (figura 1.2).
La fase estacionaria forma una película delgada en la superficie de un
soporte sólido. El soluto se equilibra entre este líquido estacionario y
una fase móvil gaseosa. La cromatografía de reparto o de partición
presenta grandes ventajas, comparada con la cromatografía de adsorción:
es mucho más reproducible y, gracias a que el coeficiente de partición
se hace constante en un margen más amplio de concentraciones, permite
que las bandas sean más definidas y mucho más simétricas.
Soluto disuelto en la fase
líquida que recubre la
superficie del soporte
sólido
Figura 1.2 Cromatografía de reparto.
El soporte sólido ideal no debe tener efecto en el proceso
cromatográfico, sólo debe servir como matriz mecánica para la fase
líquida. El soporte más común es la tierra de diatomeas, también conocida
como kieselguhr, material muy poroso que contiene muchos grupos
oxidrilo libres en su superficie.
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Componentes importantes de un cromatógrafo de gases
Uno de los puntos más importantes a considerar en la cromatografía de gases,
es el grado de separación que puede lograrse entre diferentes componentes en
una columna dada. Son varios los factores que pueden influir en la separación
deseada: dimensiones de la columna, temperatura, velocidad de flujo del gas
acarreador, volumen de la muestra y caída de presión en la columna.
Existen dos diferentes tipos de columnas: las empacadas y las capilares.
En las primeras el soporte se encuentra empacado en tubos de acero inoxidable
o vidrio, que comúnmente tienen un diámetro de 3 a 6 mm y de uno a cinco
metros de longitud. Las columnas con mayor diámetro son utilizadas en trabajos
de preparación para obtener una mayor cantidad de compuestos separados.
En las columnas capilares la longitud es mucho mayor, pudiendo llegar hasta
100 metros con un diámetro de 0.1 a 0.3 mm. Estas últimas se caracterizan por
tener un mayor número de platos teóricos, lo que implica mejor resolución,
menor tiempo de análisis y una mayor sensibilidad, aunque la cantidad de
muestra por correr debe ser menor (Harris, 1992).
Se pueden emplear muy diversos soportes sólidos y fases líquidas esta-
cionarias. La elección depende básicamente de la naturaleza de los compuestos
que se desean separar (tabla 1.2). La literatura informa acerca de gran cantidad
de soportes sólidos que han resultado satisfactorios, y de un número aun mayor
de líquidos para la fase estacionaria. El líquido estacionario debe producir un
reparto diferencial de los diversos componentes de la mezcla de ensayo, y
poseer suficiente poder de disolución sobre los componentes en estado vapor.
Por supuesto, el líquido estacionario no ha de ser volátil a las temperaturas de
trabajo, pues de otra manera se evaporaría abandonando la columna. Si se
tiene interés por profundizar en este tema, se pueden consultar los trabajos de
Bens (1961), donde describe algunas propiedades y características de los
soportes ordinarios. Rohrschneider (1971) reportó una clasificación de las fases
líquidas en función de su polaridad, y propuso una escala de 0 a 100 en la que
el escualeno es tomado como cero y el oxidipropionitrilo como cien.
La temperatura necesaria para efectuar la separación de una mezcla está
determinada por dos factores: el grado de separación que se considere suficiente
y el tiempo razonable para el análisis. En general, cuanto más baja es la tem-
peratura mayor es la separación de los componentes, y mayor también el tiempo
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Cromatografía de gases
de retención de estos últimos en la columna. Rowan (1961), al igual que Desty
(1965) y muchos otros autores (Meloan, 1973), analizan el efecto de la
temperatura en la cromatografía de gases.
La velocidad de flujo del gas portador varía con cada análisis y puede cambiar
para diferentes tipos de compuestos por analizar. Tal velocidad influye en la
cuantificación de la altura equivalente de un plato teórico (AEPT). Para las
columnas empacadas de 0.63 cm de diámetro, se recomiendan flujos de 40 a
100 ml/min, que deberán regularse con una precisión mayor de 1 ml/min.
Los gases portadoresque se utilizan con más frecuencia son: nitrógeno,
helio, argón y dióxido de carbono. Su elección se basa, al menos en parte, en
el factor económico, pero un criterio más importante es el tipo de detector
empleado. Para un detector de conductividad térmica, los gases adecuados
son: nitrógeno, hidrógeno, argón y helio. El hidrógeno presenta altos valores de
conductividad térmica, factor muy importante en la detección de compuestos,
pero debido a su explosividad no es recomendable para la docencia. El helio
también tiene un alto valor de conductividad térmica, pero es un recurso no
renovable y de costo elevado. En cambio, el nitrógeno se utiliza ampliamente
por ser barato e inocuo, a pesar de no tener un valor alto de conductividad
térmica.
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Tabla 1.2 Fases estacionarias líquidas de uso común en
cromatografía de gases.
Nombre
Comercial
Escualeno
Apienzon L
SE-30
OV-1
UCW-982
DC-200
OV-101
SP-2100
SE-52 0 SE-54
Dexsii 300
OV-17
OV-25
OV-210
Carbowax20M
Carbowax20M
TPA
Carbowax1500
SilariOC
Descripción
Escualeno
Apienzon L
100% goma de silicona
100% goma de silicona
goma del 99% metil, 1% vinil
100% de metil silicona líquida
100% de metil silicona líquida
100% de metil silicona líquida
fenilo al 5%
Metil carbonato de silicona
Metil fenil silicona al 50%
Metil fenil silicona al 75%
3,3,3-trifluoropropilo al 50%
polietilen glicol
polietilen glicol modificado
con ácido tereftálico
polietilen glicol
Cianopropil silicona al 100%
Polaridad*
I
I
I
I
II
II
II
II
II
II
II
III
III
IV
IV
IV
IV
Temperatura
Iíquido/°C
20/100
50/300
50/300
50/300
0/300
0/250
0/350
0/350
50/300
50/450
0/375
0/350
0/275
60/225
60/250
40/200
0/250
* I a IV de menor a mayor polaridad.
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Cromatografía de gases
La muestra líquida se introduce en el cromatógrafo inyectándola con una
jeringa a través de un septo de goma, la temperatura vaporiza la muestra y el
gas acarreador lo lleva a lo largo de la columna. Las columnas analíticas requieren
de 0.1 a 10 jal de muestra líquida, mientras que las columnas para trabajo
preparativo llegan a utilizar de 20 a 1000 jil. Las muestras gaseosas requieren
de jeringas con cierre hermético o válvulas de muestreo de gases. Para el trabajo
analítico se utilizan volúmenes de 0.5 a 10 mi de gas, y para el análisis preparativo
los volúmenes pueden aumentar hasta un litro (Harris, 1992).
Detector de conductividad térmica. La capacidad de enfriamiento de un
gas está basada en la facilidad que tiene para transferir el calor que absorbe,
cualidad representada por su valor de conductividad térmica. Entre más grande
sea el valor, la capacidad para transmitir el calor será mejor. Por lo tanto, si se
suministra una cantidad constante de energía eléctrica al filamento del detector,
su temperatura estará en función de la conductividad térmica del gas acarreador.
Con un gas puro, la temperatura del filamento es constante, pero al presentarse
cambios en la composición del gas, la temperatura varía y se modifica la
resistencia eléctrica. Por lo tanto, los filamentos deben ser resistentes a los
cambios de temperatura y a la corrosión química. Para su fabricación se emplea
generalmente platino, tungsteno y níquel.
Los factores que afectan la sensibilidad de los filamentos son: su geometría,
la corriente que pasa a través de los mismos, su resistencia y el valor de la con-
ductividad térmica del gas. La tabla 1.3 muestra la conductividad térmica de
los gases y de algunos compuestos utilizados en cromatografía.
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Tabla 1.3 Conductividad térmica.
sustancia
Nitrógeno
Helio
Argón
co2
Hidrógeno
Oxígeno
CO
Metano
Propano
n-Butano
Étanol
Acetona
Cloroformo
ct*
5.81
34.80
3.98
13.52
41.60
5.89
5.63
7.21
3.58
3.22
3.50
2.37
1.58
* unidades de la conductividad térmica cal cnrr2 seg^2/°C crrr1
Cálculos en cromatografía
Con los datos de un cromatograma es posible realizar una serie de cálculos
sencillos para conocer parámetros como la eficiencia de la columna, además,
si aplicamos técnicas de estándares se puede conocer también la concentración
de muestras problema. A continuación se desarrollan los cálculos más comunes
y útiles en cromatografía.
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Cromatografía de gases
Número de platos teóricos en una columna (n)
Un plato teórico es el lugar donde se lleva a cabo el equilibrio de distribución
de la muestra entre la fase móvil y la fase estacionaria. A mayor número de
platos teóricos, la separación en la columna es mejor.
w= 16
n - número de platos teóricos
t̂ = tiempo que transcurre desde la inyección hasta el centro del pico del
componente
Aw=ancho del pico del componente
tĵ y Aw se expresan en las mismas unidades (tiempo, volumen, distancia, etc.)
Altura equivalente de un plato teórico (AEPT)
Un plato teórico puede considerarse la longitud de columna necesaria para
establecer un equilibrio de distribución entre la fase estacionaria del soluto y la
fase móvil.
AEPT = ^
AEPT = altura equivalente de un plato teórico
L = longitud de la columna
n = número de platos teóricos
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Cálculo del área de un pico con forma de triángulo
Las curvas o picos en un cromatograma generalmente presentan una forma
gaussiana. Un método sencillo para calcular el área bajo la curva es transformarla
en un triángulo, extrapolando la tangente en los puntos de inflexión hacia la
línea de referencia, como lo indica la figura 1.3.
Respuesta
del.
detector
t = 0
inyección
tr o vr
Punto de inflexión
(parte más j
inclinada de la /
curva) /
tiempo o volumen
Figura 1.3 Cromatograma ideal
Fórmula para calcular el área de un triángulo:
A b*h
A
A = área
h = altura
b = longitud de la base
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Cromatografía de gases
Cálculo de la resolución
Mide la separación entre componentes. La figura 1.4 indica la manera de medir
los parámetros:
ECUACIÓN DE RESOLUCIÓN
Figura 1.4 Resolución entre dos picos cromatográficos.
V -V
V 2 V \
R 1/2 (Wx + W2)
Vx = distancia desde la aplicación hasta el centro del pico 1
V2 = distancia desde la aplicación hasta el centro del pico 2
FPj y fP2 = ancho de los picos 1 y 2
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Análisis cuantitativo
Existen diversos métodos para el cálculo de concentraciones enun sistema
cromatográfico. Los hay sencillos, pero poco confiables, pues no utilizan ninguna
sustancia de referencia, y los hay más elaborados con un mayor grado de
confiabilidad. Estos métodos son:
1. Normalización
2. Calibración absoluta
3. Estándar interno
4. Estándar externo
Normalización o porcentaje por áreas
Con base en el cromatograma de una mezcla separada, es posible determinar
la concentración de cada uno de sus componentes por el área bajo la curva.
Primero hay que medir las áreas individuales de cada pico, sumarlas y, con
base en el total, sacar el porcentaje de cada componente. Este porcentaje es
proporcional a la concentración del componente en la mezcla, siempre y cuando
la conductividad térmica de los componentes sea la misma, o muy parecida, y
que la respuesta del detector de conductividad térmica también sea igual para
todos los componentes. Como esto no es posible en la mayoría de los casos,
se requiere utilizar otros métodos más exactos.
Calibración absoluta
Consiste en inyectar en la columna una cantidad conocida de sustancia pura
para medir el área del pico resultante. Enseguida, bajo las mismas condiciones
de corrimiento cromatográfico, se mide el área del pico que resulte de la sustancia
en la mezcla desconocida.
Finalmente, estableciendo una proporción, se puede encontrar la con-
centración de la sustancia desconocida.
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Cromatografía de gases
Estándar interno
Este método se puede utilizar de dos formas, para calcular un factor de respuesta
o elaborando una curva estándar para encontrar la concentración de una muestra
problema. El estándar o patrón interno es aquella sustancia que se inyecta
junto con la o las muestras problema en un cromatógrafo. Las condiciones que
esta sustancia debe cumplir son (León, 1982):
• No debe formar parte de la muestra que se desea analizar.
• Tener similitud con los componentes del problema.
• Proporcionar por sí sola y junto con la muestra problema, picos bien resueltos
y de buena forma.
• Eluir en un tiempo cercano al de los componentes del problema.
• No debe reaccionar con los componentes de la muestra.
a) Factor de respuesta El método se basa en calcular el factor de respuesta
para cada sustancia analizada, ya que los detectores no responden de la
misma manera a todos los solutos. La técnica no es muy complicada y
consiste en medir el área bajo los picos de cada compuesto, en relación
con el área de los picos de un patrón interno. El factor de respuesta está
definido por la relación:
[P] \Ap
[S] = concentración del soluto (cualquier unidad de masa/volumen)
[P] = concentración del patrón (cualquier unidad de masa/volumen)
As = Área del soluto
Ap = Área del patrón
Este factor de respuesta se puede utilizar tanto con el método de
normalización como con el del patrón interno.
b) Estándar interno con elaboración de curva estándar. En este caso
también se requiere de la adición de un compuesto de concentración
conocida. Se utilizan mezclas conocidas del patrón (P) y del soluto o
analito (S) para construir una curva patrón, como en la figura 1.5. Si una
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Manual de prácticas de química analítica II
cantidad conocida de patrón se agrega a una muestra problema, la curva
de calibración puede utilizarse para hallar la concentración del soluto.
Cuando se use un estándar interno es recomendable que la curva de
calibración se elabore cuando menos con tres puntos. Las unidades de
concentración pueden ser moles/litro, g/1, mg/1, porcentuales, etc.
hs
~hp
[S] = concentración del soluto hs = altura del soluto
[P] = concentración del patrón hp = altura del patrón
Figura 1.5 Curva para estándares internos.
Estándar externo
Esta técnica es menos complicada que el estándar interno, pero requiere de
mayor cuidado durante las separaciones cromatográficas. Las curvas de
calibración con patrones puros son elaboradas con base en varias concen-
traciones. Es importante cuidar que los volúmenes de inyección sean los mismos
que para los compuestos de interés. Se construye una gráfica de área o altura,
en función de la concentración, la cual puede estar en cualquier unidad de
masa/volumen, ya sea molaridad, % p/v, o también puede utilizarse el % p/p.
La concentración del compuesto desconocido se interpola en el gráfico, con
base en el dato de área o altura del pico correspondiente (figura 1.6).
Área
o
altura
Concentración
Figura 1.6 Curva para estándares externos.
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Cromatografía de gases
Operación del cromatógrafo
Gow-Mac modelo 69-350
Descripción
Todos los controles de operación del modelo 69-350 están localizados en la
parte frontal del aparato (figura 1.7).
11
Figura 1.7 Cromatógrafo de gases Gow-Mac.
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Manual de prácticas de química analítica II
1. Puerto de inyección para la columna "A"
2. Control de ajuste del flujo de la columna "A"
3. Control de temperatura del puerto de inyección
4. Control de temperatura del detector
5. Control de temperatura de la columna
6. Sistema analógico de medición
7. Selector de medición
8. Control de encendido del cromatógrafo
9. Control de cambio de polaridad
10. Control de encendido del detector
11. Control de ajuste del cero
12. Control de atenuación
13. Control de la corriente del detector
14. Control de ajuste de flujo de la columna "B"
15. Puerto de inyección para la columna "B"
16. Tapa del horno del cromatógrafo
Uso del cromatógrafo
1. Verifique que todos los controles estén apagados y siga las instrucciones,
en función de los parámetros a utilizar en cada una de las prácticas de
cromatografía de gases.
2. Abra la llave del tanque que contiene el gas acarreador y verifique que la
presión se encuentre entre 500 y 2 300 lb/in2, en caso de ser menor a
500 lb/in2, repórtelo al profesor.
3. La presión de entrada del gas al cromatógrafo debe ser de 30 lb/in2.
Mida la velocidad del flujo de salida de las columnas utilizando un
flujómetro de burbuja que tenga una disolución de jabón al 3 %.
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Cromatografía de gases
Flujo del gas del
cromatógrafo
u
Marcas de
calibración
_ Disolución
jabonosa
PERA
Burbuja
Figura 1.8 Medidor de flujo.
La metodología es la siguiente: conecte la manguera del flujómetro a la
salida de la columna donde se quiere ajustar el flujo. Presione ligeramente
el bulbo lleno de disolución jabonosa, para formar las burbujas que serán
arrastradas por el gas. Mida el tiempo en segundos, desde la marca
cero hasta la diez del aparato y calcule el flujo utilizando la siguiente
ecuación:
Flujo =
600
tseg
Con base en el resultado y utilizando el control correspondiente (columna
"A" o "B") ajuste el flujo requerido.
4. Ajuste los controles de temperatura y de inyección (tanto de la columna
como del detector). Fije la corriente de este último.
5. Verifique que el registrador tenga papel y tinta para un buen funciona-
miento, enciéndalo y seleccione la velocidad de corrimiento.Para su buen funcionamiento el cromatógrafo requiere aproximada-
mente de 2 horas para que se estabilice la línea base. Durante este tiempo
se puede preparar la muestra, limpiar la jeringa y ajustar el cero.
6. Ajuste del cero: el atenuador del cromatógrafo debe marcar infinito
(número 12 de la figura 1.7). Con el control de cero del graficador,
coloque la plumilla donde desee la línea base. Ponga el control de la
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Manual de prácticas de química analítica II
atenuación del cromatógrafo en la posición 1. Coloque el atenuador en
la posición 256 y el cero con el control del cromatógrafo.
7. Inyección de la muestra. Se debe tener cuidado al introducir la j eringa,
si ésta es de una capacidad de 5 o 10 |il, tanto el émbolo como la aguja
son muy delgadas y se doblan fácilmente. Debe colocarse la jeringa en
posición perpendicular con respecto al cromatógrafo e introducirla en el
puerto de inyección de la columna. Efectuar la inyección con fuerza,
para asegurar que la muestra entre en la columna.
Con el fin de evitar contaminaciones, se debe enjuagar la jeringa
cuando menos cinco veces con el disolvente adecuado. Debe limpiarse
inmediatamente después de usarla, para prevenir que la muestra se seque
y queden residuos en la jeringa o el émbolo.
8. Si los picos de la muestra se salen de escala, incremente la atenuación y
corra nuevamente su sistema.
9. Una vez terminado el trabajo cromatografía) disminuyalas temperaturas
de la columna, inyector y detector, y apague la corriente de este último.
Cuide que el flujo del gas continúe hasta que la temperatura de la columna
descienda hasta 50 °C o menos. Cierre él paso del gas acarreador y
limpie lajeringa.
Precauciones en el manejo del detector de conductividad térmica
a) Para evitar que se queme el filamento del detector, verifique que el gas
acarreador fluya a través del cromatógrafo, antes de encender el
detector.
b) Apagar la corriente del filamento, antes de abrir el sistema, para evitar
que éste se oxide.
c) La velocidad de flujo del gas portador debe permanecer constante.
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Cromatografía de gases
Metodología para las prácticas de química analítica II
1. Los alumnos deben cubrir totalmente las nueve prácticas de este manual.
2. Cada alumno debe elaborar una bitácora, en la cual, además de anotar
todas las observaciones de la práctica en cuestión, realizará las siguientes
actividades:
• Dibuj ar un diagrama de bloques de la práctica que se va a realizar.
• Anotar las propiedades físicas, químicas y tóxicas de cada uno de los
reactivos mencionados en el protocolo de la práctica (investigados
previamente en la biblioteca).
• Realizar los cálculos necesarios para la preparación de las disoluciones
mencionadas en la práctica, tomando como base 100 mi de disolución.
Prevención de accidentes en el trabajo
con sustancias químicas*
1. Al manipular sustancias corrosivas será obligatorio el uso de equipo
personal de protección.
2. La transferencia de líquidos, especialmente los corrosivos o tóxicos,
debe hacerse con ayuda de pipeta y propipeta. Queda estrictamente
prohibido usar las pipetas succionando con la boca.
3. Al poner en contacto sustancias que reaccionan violentamente o al
calentar líquidos en tubos de ensayo o frascos, la cara deberá apartarse
para que no sea alcanzada por posibles proyecciones. Se deben usar
anteojos protectores o careta de plástico.
4. Nunca vierta agua sobre ácido sulfúrico concentrado.
5. Todas las operaciones con sustancias volátiles deberán hacerse en la
campana de extracción.
6. Queda estrictamente prohibido probar cualquier sustancia química.
7. Las sustancias susceptibles de generar peróxidos (THF, éter, etc.) deberán
ser verificadas periódicamente.
* Las normas de seguridad indicadas en esta parte fueron extraídas del Instructivo sobre
el funcionamiento interno y operativo para regular el uso de los servicios e instalaciones
de los laboratorios de docencia de la UAM, aprobado por el Consejo Académico en su
sesión 133.
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Práctica 1
Análisis cualitativo de cromatografía de gases
(dos columnas)
Introducción
Objetivo
Conocer y utilizar la cromatografía de gases es hoy en día un aspecto primor-
dial, tanto en la industria como en el campo científico. La elaboración de
productos alimenticios o farmacéuticos necesita de un buen control de calidad,
y muchas de las técnicas utilizadas para esto requieren de la precisión del análisis
cromatográfico.
Uno de los primeros problemas en cromatografía es la selección de la fase
estacionaria o tipo de columna a utilizar. Existe una gran variedad de fases
líquidas disponibles para la cromatografía de reparto gas-líquido. Para resolver
este problema es necesario considerar que un soporte polar retendrá más
fuertemente un soluto polar y que, por lo tanto, las sustancias menos polares
saldrán con mayor rapidez de la columna, presentando tiempos de retención
más cortos.
En esta práctica se corrobora tal criterio, ya que son separados compuestos
de diferente polaridad corriéndolos en una columna polar como la Carbowax
20 M. Posteriormente se efectúa la misma separación, pero utilizando la columna
DC-200 no polar.
El alumno aprenderá a utilizar el cromatógrafo de gases Gow-Mac, modelo
69-350, para el análisis cualitativo de mezclas y observará la diferencia de
separar una misma muestra en dos columnas de diferente polaridad.
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Manual de prácticas de química analítica Ií
Materiales y reactivos
• Cromatógrafo de gases
• Medidor de fluj o de burbuj a
• Cronómetro
• Jeringa para cromatografía de gases de 50 mi
• 5 tubos de ensayo de 10 x 150 mm con tapón de baquelita
• 5 vasos de precipitados de 50 mi
5 pipetas volumétricas de 1 mi
Propipeta
• n-pentano
Tetrahidrofurano
• 2-butanona
• n-propanol
En la parte teórica de este capítulo se encuentran las instrucciones de ope-
ración del cromatógrafo Gow-Mac, modelo 69-350 (p. 27).
Normas de seguridad
Maneje los disolventes con cuidado en un lugar ventilado, utilice
propipetas para hacer la mezcla. Asegúrese de que no haya mecheros
prendidos y coloque letreros para indicar que está trabajando con
disolventes.
Cuando trabaje con el cromatógrafo, asegúrese de que se encuentre
presente el profesor del laboratorio, quien le ayudará y brindará asesoría
sobre el buen manejo del equipo.
Procedimiento
1. Mezcle un mililitro de cada uno de los siguientes disolventes: n-heptano,
tetrahidrofurano, 2-butanona y n-propanol. Guarde la mezcla en un re-
cipiente cerrado.
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Análisis cualitativo de cromatografía de gases
2. Las condiciones del cromatógrafo deben ser las siguientes:
Temperatura de lacolumna
Flujo del gas
Corriente del detector
130°C
80 ml/min.
200 mA (si el gas es helio)
100 mA (si el gas es nitrógeno)
3. Tome en cuenta que el equipo requiere al menos de tres horas de ca-
lentamiento previo, con el fin de estabilizar la temperatura de la columna,
el flujo del gas acarreador y la corriente del detector, y para que todo
esto se refleje en una línea base estable.
4. Verifique el flujo del gas en las dos columnas, utilice un medidor de
burbuja como se indica en la figura 1.8.
5. Trabaje primero con la columna de Carbowax. Fije el atenuador en 4 y
ponga a funcionar el graficador a una velocidad de 2.5 cm/min.
6. Con una jeringa de 50 fil, mida 3 \ú de n-heptano y adicione otros 10 |Lil
de aire. Inyéctelos en la columna y enjuague la jeringa.
7. Marque el punto de inyección en la carta, así como la información
relacionada con la muestra inyectada.
8. El primer pico que debe eluir es el pico de aire, seguido por el pico del
n-heptano.
9. Repita los pasos 5 y 6 con los otros tres componentes y, por último,
inyecte la mezcla de los disolventes.
10. Baj o las mismas condiciones de trabaj o, repita todo el proceso utilizando
la columna DC-200. Cambie la polaridad del sistema para que los picos
salgan en el mismo sentido que con la columna polar.
Tratamiento de datos experimentales
• Mida y tabule todos los tiempos y volúmenes de retención de todas las
corridas.
• Con la ayuda de los tiempos de retención de las sustancias puras,
identifique los componentes de la mezcla en los cromatogramas de las
dos columnas.
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Manual de prácticas de química analítica II
Cuestionario
i.
2.
3.
Calcule el número de platos teóricos "n" y AEPT para cada columna,
utilizando los datos del n-heptano.
Calcule el porcentaje de cada componente de las mezclas, utilizando el
método de normalización (por áreas).
¿En qué se basa la cromatografía de gases?
¿Cómo puede medirse la eficiencia de una columna?
¿Qué se entiende por cromatografía líquido-líquido y cromatografía gas-
líquido?
¿Qué ventajas tiene la programación de temperatura en la cromatografía
de gases? ¿Se puede hacer esta programación en un cromatógrafo de
gases con detector de conductividad térmica? Justifique su respuesta.
Explique cuáles son las ventajas y desventajas de las columnas capilares
y las columnas empacadas.
Con base en los siguientes datos, obtenidos con el empleo de una columna
de ftalato de dodecilo, realice los ejercicios que se piden.
Compuesto
Acetona
Butanona
3-pentanona
Acetilcetona
Vr(ml)
21.5
58.0
145.0
400.0
a) Calcular el número de platos teóricos "n" y AEPT para cada compuesto.
b) Calcular el porcentaje de cada componente, utilizando el método de
normalización.
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Práctica 2
Factor de respuesta en cromatografía de gases
Introducción
El uso de estándares internos es necesario en el análisis cuantitativo. La
sensibilidad de los detectores de conductividad térmica difiere de un compuesto
a otro, ya que depende de la conductividad térmica del analito. A menor
conductividad térmica, mayor es la respuesta para una cantidad dada de
compuesto. Por lo tanto, debe medirse un factor de respuesta empírico para
cada sustancia que se somete a un análisis cuantitativo. El factor de respuesta
F está definido por la relación:
[P] \ApJ
Objetivo
El alumno efectuará el análisis de cromatografía de gases para conocer el
factor de respuesta con el n-heptano, empleando como estándar interno al
n-pentano.
Materiales y reactivos
• Cromatógrafo de gases
• Medidor de fluj o de burbuj a
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Manual de prácticas de química analítica II
Cronómetro
Jeringa para cromatografía de gases de 50 mi
2 tubos de ensayo de 10 x 150 mm con tapón de baquelita
2 vasos de precipitados de 50 mi
2 pipetas volumétricas de 1 mi
Propipeta
n-pentano
n-butano
Normas de seguridad
Procedimiento
Los compuestos a trabajar son muy volátiles y flamables, trabaje en un
área ventilada y lejos de fuentes de calor. Tome en cuenta las reglas de
seguridad de la práctica 1.
1. Prepare en tubo de ensayo una disolución estándar, mezclando un mililitro
de n-heptano con otro de n-pentano.
2. Ajuste las condiciones del cromatógrafo con base en los siguientes datos:
Columna
Gas acarreador
Flujo del gas
Temperatura
Atenuación
Corriente del detector
Velocidad de la carta
DC-200
Helio
60 ml/min.
90 °C
4
200 mA
2.5 cm/min.
3. Verifique que la línea base se encuentre estable.
4. Inyecte 3 (il de la disolución estándar, repita por triplicado.
5. Solicite al profesor la muestra problema e inyecte 3 \ú9 repita por
triplicado.
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Factor de respuesta en cromatografía de gases
Tratamiento de datos experimentales
Cuestionario
Mida y tabule todos los tiempos y volúmenes de retención de todas las
corridas.
Con base en las áreas y concentraciones de la disolución patrón, calcular
el factor de respuesta para el n-heptano, utilizando el n-pentano como
estándar interno.
Calcular la concentración del n-heptano en la muestra problema, utilizando
el factor de respuesta y las áreas del segundo grupo de cromatogramas.
1. Explicar qué se entiende por factor de respuesta.
2. Esta técnica para el cálculo del factor ¿se puede utilizar con otros
detectores como el de ionización de flama o el de captura de electrones?
3. ¿Cómo se seleccionan las temperaturas para el inyector, la columna y el
detector?
4. Problema: Para la cuantificación de una muestra comercial del
antimicrobiano metil parabeno, se utilizó la técnica del factor de respuesta
usando el propil parabeno como estándar interno. Se corrieron las mues-
tras en un cromatógrafo con detector de ionización de flama, columna
capilar BP5 con película de 0.5 |Lim, temperatura inicial de 160 °C y un
gradiente de 15 °C/min. La temperatura final fue de 280 °C. Para el
cálculo del factor se utilizaron 0.98 mmol de metil parabeno y 0.75 mmol
de propil parabeno. Se obtuvieron las siguientes alturas respectivas: 180
y 165 mm.
Una segunda corrida cromatográfica es utilizada para cuantificar la
muestra comercial. Se mezcla el problema con 1.2 mmol de propil
parabeno. Las alturas resultantes fueron 150 mm para el metil y 160 mm
para el propil parabeno. Calcular la concentración del metil parabeno
en la muestra comercial.
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Bibliografía
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Brewer, S. 1987. Solución de problemas de química analítica. Ed. Limusa,
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Giddins, J. C. y R. A. Keller (eds.). 1965. Advances in Chromatography.
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Harris, D. C. 1992. Análisis químico cuantitativo. Grupo Editorial
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Capítulo 2
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA
DE ALTA RESOLUCIÓN
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Introducción
La cromatografía de líquidos de alta resolución en los pasados diez años ha
incrementado su importancia en muchas de las áreas del análisis, tanto a nivel
investigación como a nivel industrial. Muchas de las técnicas de control de ca-
lidad de fármacos, alimentos, aditivos y contaminantes ya se están efectuando
conHPLC.
Hace más de 80 años que se conoce la cromatografía de líquidos, pero sólo
a partir de 1967 los avances tecnológicos permitieron desarrollar un proceso
cromatográfico para trabajar con altas presiones. Este proceso de ninguna
manera sustituye a la cromatografía de gases, sólo es un complemento para el
análisis de componentes que no toleran una fase móvil gaseosa o temperaturas
muy elevadas. De hecho, presenta las siguientes ventajas frente a la cromatografía
de gases:
• Tiene una difusión mínima en la fase móvil, debido a la rapidez del análisis.
• No tiene efectos negativos por calor, ya que generalmente se realiza a
temperatura ambiente o ayudado por un calentador de columnas a
temperaturas menores de 100 °C.
• La muestra no se destruye, por lo que se puede recuperar para un uso
posterior.
La cromatografía de líquidos es una técnica de separación que utiliza una
fase móvil líquida, es ideal para la separación de macromoléculas de interés
biológico y de compuestos iónicos, ya que no depende de la volatilidad o es-
tabilidad térmica de los componentes. Se puede utilizar para separar proteínas,
aminoácidos, lípidos, ácidos nucleicos. Otras aplicaciones industriales son el
análisis de pesticidas, aceites, polímeros, antioxidantes, análisis de agua,
contaminantes, sabores, colorantes, etc. La cromatografía de líquidos se basa
en la solubilidad de los compuestos: hay que escoger el disolvente o la mezcla
de disolventes apropiados para llevar a la muestra a través del sistema, también
hay que tomar en cuenta que los compuestos se adsorben en menor o mayor
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Manual de prácticas de química analítica II
medida en la fase estacionaria y que gracias a las altas presiones con las que se
mueve la fase móvil, se puede obtener una rápida separación de los componentes
de una mezcla.
La cromatografía de líquidos se puede clasificar en cuatro tipos, dependiendo
de su uso:
Cromatografía de líquido-sólido
En este caso, la separación depende de la afinidad de la muestra hacia la fase
sólida o líquida. Si la muestra es muy afín a la fase estacionaria (compuesta por
partículas sólidas pequeñas) el tiempo de retención será mayor. El solvente
utilizado se conoce como eluyente y también influye de manera importante en
la separación: si la muestra es más afín a la fase líquida, los tiempos de retención
serán más cortos. La tabla 2.1 muestra una lista de disolventes según su
capacidad para eluir solutos.
La selección de la fase móvil influye directamente en la separación de las
muestras. Los solventes pueden ser de naturaleza orgánica o acuosa. Existen
muchas características que debe tener una buena fase móvil, entre las más
importantes se encuentran: no alterar la columna ni su naturaleza, disolver la
muestra, ser de baja viscosidad y, una vez terminada la separación, debe permitir
la recuperación del soluto de manera simple (Watty, 1989).
En la cromatografía líquido-sólido existen dos subdivisiones que están en
función de su conformación: la fase normal y la fase inversa.
Para l^fase normal se requiere de una fase estacionaria polar, por lo tanto,
la fase móvil debe ser no polar. Los empaques que se pueden utilizar en fase
normal son diol, sílica y amino, entre otros.
En \difase inversa se necesita un empaque no polar y una fase móvil po-
lar. Los empaques más comunes para la fase reversa son: ODS (C18), octyl,
dimetil, etc.
Otra variación de este tipo de cromatografía se conoce como fase ligada
(bondedphase), que consiste en enlazar con el soporte de sílica compuestos
que aumenten su carácter no polar (C2, C6, C8, Clg). En función del tamaño de
la cadena de hidrocarburos que se haya unido, los tiempos de retención de los
solutos que eluyan en estas columnas, tenderán a aumentar, pues se retendrán
más fuertemente.
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Cromatografía líquida de alta resolución
Tabla 2.1 Lista de disolventes.
Disolvente
Ácido acético
Acetona
Acetonitrilo
Benceno
N-butanol
Tetracloruro de carbono
Cloroformo
Ciclohexano
1,2-dicloroetano
Cloruro de metileno
Dimetil sulfóxido
Dioxano
Acetato de etilo
Etanol
Dietiléter
Heptano
Hexano
Metanol
Pentano
N-propanol
Iso-propanol
Tetrahidrofurano
Tolueno
Tricloroetileno
Agua
Xileno
índice de
polaridad
0.62
5.10
5.80
2.70
3.90
1.60
4.10
0.20
3.50
3.10
7.20
4.80
4.40
6.20
2.80
0.00
0.00
5.10
0.00
4.00
3.90
4.00
2.40
1.00
9.00
2.50
Longitud de
onda de corte nm
230
330
190
280
215
263
245
200
225
235
268
215
260
210
220
200
200
205
200
210
210
215
285
273
200
290
Solubilidad en
agua % p/p
100
100
100
0.18
7.81
0.08
0.815
0.01
0.81
1.6
100
100
8.7
100
6.89
0.0003
0.001
100
0.004
100
100
100
0.051
0.11
100
0.018
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Cromatografía de intercambio iónico
Consiste en cambiar iones de la fase estacionaria por iones que se encuen-
tran disueltos en la fase móvil. Aniones comoel sulfito -SO3~ o cationes
[N-(CH3*)3
+] se unen covalentemente con la fase estacionaria: los iones de
soluto, de carga opuesta a los de la fase estacionaria, son atraídos por fuerzas
electrostáticas (la fase móvil es un líquido, figura 2.1). Se puede efectuar
cromatografía de intercambio iónico no solamente en HPLC, sino también en
capa fina, en columna y en papel impregnado de resina. En este método la se-
paración depende de las variables: fuerza iónica, capacidad de carga de la
columna y del pH durante el proceso de separación. El procedimiento deriva
de la cromatografía de líquido-sólido, y se utiliza en la separación de aminoáci-
dos, en análisis de trazas, en la separación de metales por formación de
complejos, etc.
Las resinas utilizadas en las columnas pueden estar o no polimerizadas. En el
mercado existen resinas intercambiadoras catiónicas, tipo ácido fuerte o débil,
e intercambiadores amónicos tipo base fuerte o débil. También hay geles de
intercambio iónico, que se utilizan para separar moléculas pequeñas con pesos
moleculares menores a 500. La tabla 2.2 muestra ejemplos de columnas de
intercambio iónico comerciales, mencionando el tipo de iones que puede retener,
el pH de trabajo y la presión máxima a la que pueden ser utilizadas.
Aniones móviles
mantenidos cerca de
los cationes unidos
covalentemente a la
fase estacionaria
Figura 2.1 Cromatografía de intercambio iónico (resina de intercambio
aniónico, sólo los aniones pueden ser atraídos hacia ella).
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Cromatografía líquida de alta resolución
Tabla 2.2 Columnas para HPLC de intercambio iónico.
Columna
Syn Chropac SAX
Fuertemente aniónica
Syn Chropac WAX
Débilmente aniónica
Syn Chropac SCX
Fuertemente catiónica
TSKcatiónica
Soporte
Sílica
Sílica
Sílica
Resina
pH
2 a 8
2 a 8
2 a 8
2a12
Presión máx.
5 000 psi
5 000 psi
5 000 psi
200 psi
Cromatografía de exclusión molecular
Con este método las moléculas se separan por su tamaño y conformación: si el
peso molecular les permite adentrarse en la red del gel y/o si la molécula es
globular, la retención será mayor, comparada con una molécula de peso supe-
rior al de la capacidad del gel o con una molécula de conformación irregular
(figura 2.2). Las aplicaciones de esta técnica son amplias, ya que permite separar
muestras con pesos moleculares entre 700 y más de 150 millones, particular-
mente aquellas de interés bioquímico. También es muy utilizada para la
separación de polímeros (tabla 2.3). Los soportes utilizados pueden ser de gel
de sílice unido a compuestos que aumentan su carácter hidrofílico, como las
columnas Biosep-SEC-S; o pueden ser polímeros como los de la serie Polysep-
GFC-P (poliestireno, polihidroximetacrilato, estireno-divinilbenceno, etc.). En
el mercado de la cromatografía de exclusión molecular existe un gran número
de columnas que permiten seleccionar el intervalo de fraccionamiento que se
requiera (Phenomenex, 1994).
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Manual de prácticas de química analítica
Moléculas grandes
son excluidas
Moléculas
pequeñas
penetran el gel
Figura 2.2 Cromatografía de exclusión molecular.
Tabla 2.3 Columnas comerciales para la exclusión molecular.
Columna
Styagel HR 0.5
Styagel HT 4
Styagel HMW7
Rango PM
0 a 1 000
5 000 a 600 000
500 000 a 1x108
Aplicaciones
Aditivos, fenoles, epóxidos, urea
PM intermedio
PM alto
Cromatografía de afinidad
Se basa en la interacción específica que existe entre un soluto de una mezcla y
un sitio activo presente en el gel de la fase estacionaria de la columna. Las
interacciones están relacionadas más con las características estructurales que
con la carga, tamaño, solubilidad u otras propiedades que se aprovechan en
otros tipos de cromatografía. Ejemplos de aplicaciones son la relación sustrato
enzima y la relación antígeno anticuerpo (Day y Underwood, 1989).
Una mayor fuente de información sobre los métodos cromatográficos se
puede encontrar en los excelentes libros: Harris, 1992; Pecsok, 1981.
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Cromatografía líquida de alta resolución
Operación del cromatógrafo de
alta resolución (HPLC)
El HPLC consta de cuatro partes: el sistema de bombas encargado de mantener
constante el flujo de la fase móvil; el sistema de inyección que permite introducir
la muestra a trabaj ar; la columna que tiene la función de separar los componentes
de la muestra y el sistema de detección de los solutos eluidos, el cual manda
una señal al sistema de registro.
Sistema de bombas
Este sistema es un componente importante del cromatógrafo de líquidos, el
cual requiere de una bomba de alta presión, comúnmente de un máximo de
6 000 psi. La presión es necesaria para mover las partículas del soluto entre la
fase estacionaria de la columna. Una bomba para cromatografía de líquidos
debe tener un flujo continuo y libre de pulsaciones.
Existen dos tipos de sistemas de elución: uno donde el disolvente no cambia
de composición durante el proceso de aislamiento, conocido como elución
¡socrática, y otro que requiere de un gradiente para mejorar la separación de
los componentes en una mezcla (elución por gradiente).
Las bombas con pistones sincronizados son las más empleadas en los sistemas
de HPLC. Un pistón siempre bombea disolvente, mientras el otro se llena. Es-
te arreglo proporciona un flujo relativamente libre de pulsos o pulsaciones.
Pueden evitarse muchos problemas con las bombas si se cuidan los solventes
utilizados: no deben tener un pH muy bajo ni formar precipitados con facilidad.
En columnas convencionales de 5 mm de diámetro interno y con flujos entre
1 y 2 ml/min, pueden resultar presiones de 400 bar, dependiendo de la longitud
de la columna, el tamaño de partícula y el disolvente.
El sistema de bombas debe de mantenerse en óptimas condiciones si se
quiere tener reproducibilidad en las corridas cromatográficas.
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Manual de prácticas de química analítica II
Figura 2.3 Control del sistema de bombas del HPLC
Figura 2.4 Sistema de bombas del HPLC
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Cromatografía líquida de alta resolución
Operación del sistema de bombas (figuras 2.3 y 2.4):
Se enciende el aparato con el botón rojo de la parte inferior derecha (número
8 de la figura 2.4). La parte frontal consta de (figura 2.3):
1. Pantalla digital para conocer la presión del sistema, la cual está dada en
libras por pulgada cuadrada (psi). El número que aparece en la pantalla
debe multiplicarse por 10, a fin de obtener la presión verdadera.
2. Botones que fij an la presión mínima y máxima de trabaj o durante el
proceso de separación. Se recomienda establecer la presión baja en
cero psi y la máxima en 3 500 psi. El valor máximo depende del tipo de
columna a utilizar y de la viscosidad del disolvente o mezcla de ellos. Si
durante el proceso de separación la presión del sistema rebasa estos
valores, el sistema de bombas se apaga automáticamente.
3. Standby. Permite que el motorse apague y el sistema eléctrico siga
funcionando.
4. Reset. Botón que reenciende las bombas y restablece el fluj o y la presión
del sistema.
5. Led. Foco rojo que indica el apagado de las bombas y que el flujo del
sistema tiende a cero.
6. Control de fluj o. Consta de tres diales rotatorios individuales y permite
preseleccionar el flujo del sistema en ml/min. El flujo debe incrementarse
poco a poco (de décima de mi en décima de mi). Una lectura de 070
indica un flujo de 0.70 ml/min.
7. Válvula de purga. Permite la purga hidráulica del sistema.
8. Botón de encendido o apagado.
Sistema de detección de solutos eluidos
Existen diferentes tipos de detectores utilizados en la cromatografía de líquidos,
los hay de fluorescencia, índice de refracción, conductividad eléctrica, de UV-
visible, arreglo de diodos, etc.
El tipo UV-visible es el más ampliamente distribuido como detector en
HPLC, la mayoría de los compuestos tienen cuando menos alguna absorbancia
en las regiones del UV o el visible. El fundamento cuantitativo de estas
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Figura 2.5 Control del sistema de detección de solutos eluidos.
6
7
Figura 2.6 Detector UV-visible.
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Cromatografía líquida de alta resolución
determinaciones se encuentra en la ley de Lamber y Beer, la cual relaciona la
absorbancia del soluto con su concentración (c, en moles/1) y la longitud del
paso del haz de luz (b): A = 8be.
Los detectores de los equipos actuales tienen una mayor flexibilidad que los
espectros comunes, ya que pueden reportar valores menores de 0.001 unidades
de absorbancia.
Operación del sistema de detección
Se enciende el aparato con el botón rojo de la parte inferior derecha. La parte
frontal (figuras 2.5 y 2.6) consta de:
1. Pantalla. Permite leer hasta diezmilésimas de unidades de absorbancia.
2. Botón de polaridad. Sirve para cambiar la señal de salida del sistema de
registro.
3. Botón de corte (short switch). Conecta o desconecta las terminales
positiva y negativa nulificando la señal del integrador o registrador. Este
efecto es lo mismo que si se mandara una señal de cero volts al registrador,
permitiendo ajustar el cero independientemente del ajuste hecho en el
registrador o integrador.
4. Mark. Este botón permite producir una marca en la carta y se utiliza
generalmente para indicar el momento de la inyección de la muestra.
5. Auto cero. Este botón permite definir la línea base y tiene un intervalo de
± 0.7 UA (unidades de absorbancia). Cuando la lámpara parpadea indica
que la señal de salida de la línea base excede el intervalo de trabajo del
auto cero.
6. Pantalla indicadora de la longitud de onda seleccionada.
7. Control de selección de longitud de onda. Ajusta la longitud de onda de
trabajo entre 190 y 700 nm con incrementos de 0.2 nm.
8. Intervalo de unidades de absorbancia (AUFS, Absorbance Units Full
Scale). Cuenta con doce posiciones diferentes que seleccionan la
sensibilidad de las unidades de absorbancia.
9. Botón de control. Consta de seis posiciones que se pueden seleccionar
y observar en la pantalla:
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SE {Sample Energy). La pantalla reporta la energía UV de la celda
de la muestra problema.
RE (Reference Energy). Reporta la energía UV de la celda de
referencia.
AU (Absorbance Units). Se observan la unidades de absorbancia
presentes en la muestra problema.
Zero, cantidad en unidades de absorbancia que el aparato toma
como cero.
• DLV(Deuterium Lamp Voltage). Reporta el voltaje de la lámpara
de deuterio.
DLC {Deuterium Lamp Current). Reporta la corriente del filamento
de la lámpara en miliamperios, una lectura de 300 es ideal y de 285
a 315 es aceptable.
10. Tiempo de respuesta. Son cinco posiciones que seleccionan los diferentes
tiempos de respuesta:
• 0.05 sea, respuesta rápida que provoca picos angostos y mucho
ruido en la línea base.
• 0.10 sea, respuesta rápida con ruido ligeramente menor que la
anterior.
• 0.50 sea, más rápida que la respuesta normal y con ruido ligeramente
mayor de lo normal.
• 1.00 sea, respuesta normal con picos angostos y una cantidad
pequeña de ruido.
• 5.00 sea, respuesta lenta para una supresión máxima del ruido.
Operación del integrador SP4400
Es un equipo que permite interpretar la señal mostrando no sólo el croma-
tograma, sino también un reporte completo con los tiempos de retención, las
áreas y sus porcentajes. Si se requiere, también proporciona información sobre
las condiciones bajo las cuales se corrió el sistema y cuenta con programas
para hacer cálculos con patrones externos e internos (figura 2.7).
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Figura 2.7 Integrador
Figura 2.8 Vista parcial del teclado del integrador.
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Manual de prácticas de química analítica II
Dentro de las ventajas que tiene utilizar un integrador, se encuentran los
métodos numéricos que permiten realizar diferentes tipos de cálculos, como
los siguientes:
a) Método numérico cero: MN = 0. Es un método de porciento de área
usado cuando los resultados de concentración no son necesarios. Este
método no utiliza factores de respuesta del detector y de esta manera no
requiere de calibración. Una vez que el diálogo de rutina termina, se
selecciona el método en el reporte, el cual incluye todos los picos del
cromatograma identificados por orden de elución. Los nombres de los
componentes no son generalmente utilizados.
b) Método numérico uno: MN = 1. Es el más utilizado en cromatografía
de gases, en particular cuando todos los componentes de la muestra son
conocidos. Es muy similar al método cero, con excepción de que las
áreas (o altura) de los picos son corregidos por factores de respuesta,
calculados previamente en una corrida con sustancias patrón de con-
centración conocida.
c) Método numérico dos: MN = 2. Requiere la utilización de estándares
internos para cuantificar de manera exacta los componentes de una mezcla.
Es de uso común en análisis de compuestos farmacéuticos, aditivos ali-
mentarios, etc. La concentración del estándar interno debe ser ligeramente
mayor, pero no pasar de un factor de 10, con respecto a los componentes
de interés en una mezcla.
Descripción del teclado (figura 2.8)
Backspace: borra datos previos moviendo el cursor hacia atrás.
LCD status: Presenta un cuadro en pantalla donde indica el canal (C/z),
archivo (FI\ número de inyecciones en ese archivo (Biri), la velocidad
de la carta (Cs), atenuación (Atteri), tiempo de corrimiento (Runtime),
nivel (Level) y capacidad de memoria.
Inj/endA: Tecla que se debe oprimir en el momento de efectuar la
inyección en la columna "A".
Shift inj/endA: Detiene el desarrollo del cromatograma sin dar el reporte
del mismo.
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Cromatografía líquida de alta resolución
A ítem Se usa para verificar la atenuación en cualquier momento del
proceso cromato gráfico. Cuando se presiona, aparecen en la pantalla
los valores numéricos válidos para cambiarla. Entre paréntesis aparece
el valor que se está utilizando.
Chart speed: Se utiliza para verificar la velocidad de la carta en cualquier
momento del proceso cromatográfico. Cuando se presiona, aparecen
en la pantalla los valores numéricos válidos para cambiarla. Entre
paréntesis aparece el valor que se está utilizando. Se recomienda usar
velocidad 2 para cromatogramas con pocos picos y 2 o 4 para
cromatogramas ricos en picos.
PTeval: No debe utilizarse durante la corrida. Normalmente se ob-
serva su valor antes de inyectar nuevamente la muestra, ya que un valor
menor a 250 indica que ya no hay residuos de soluto del análisis anterior
pasando por el detector.
Metodología para el manejo del HPLC
1. Preparación del disolvente y la muestra a analizar. Ambos deben ser
filtrados en membranas de 0.4 |um, para evitar que las impurezas entren
y contaminen la columna. El disolvente debe ser grado HPLC.
2. Revisar que el sistema de entrada y salida de los disolventes estén
sumergidos en sus respectivos recipientes.
3. Encender el sistema de bombas (número 8 de la figura 2.4).
4. Ajustar el flujo oprimiendo los botones respectivos (número 6 de la
figura 2.3) del sistema de bombas.
5. Seleccione la longitud de onda con base en el sistema a separar, moviendo
el dial correspondiente (número 7 de la figura 2.6). Al igual que el
cromatógrafo de gases, el HPLC requiere de un tiempo (20 a 30 minutos)
para que se estabilicen las condiciones de trabajo.
6. Encender el integrador y ajustar la velocidad de la carta y la atenuación,
presionando primero la tecla Chart speed del teclado del integrador y
posteriormente la tecla Atten (figura 2.8). Se puede elegir entre una
serie de valores que van desde 0.5 hasta 4 096 en incrementos
geométricos para la atenuación. Si en una primera corrida los picos
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rebasan la escala del integrador, se puede aumentar la atenuación al
valor próximo, de manera que los picos reduzcan a la mitad su tamaño
(siempre y cuando se utilicen las mismas condiciones de separación).
7. Verifique el valor del PT evaluation: debe ser como máximo de 250.
8. Inyecte la muestra con una jeringa de 50 jal con aguja sin punta, mida
la cantidad establecida en el manual de prácticas de la muestra a correr
e introduzca la jeringa en la válvula de inyección. El mecanismo de
inyección de la muestra (figura 2.9) es de dos posiciones: carga y
descarga. Presione el émbolo para que la muestra pase a la tubería de
acceso (loop). Mueva la palanca a la posición de descarga para que la
muestra sea llevada a la columna, el líquido contenido en el loop será
desplazado hacia la columna. El movimiento debe ser rápido para evitar
una caída brusca de presión que desconecte el sistema de bombas.
Posteriormente oprima la tecla inj/endA del integrador.
Terminado el tiempo de corrimiento vuelva a presionar la tecla inj/end
A, el integrador le dará un reporte completo de su sistema separado.
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Cromatografía líquida de alta resolución
Hacia la
columna
Flujo
Alojamiento de
muestras
Flujo
Jeringuilla I
Exceso
de inyección
CARGAR
Unión
INYECTAR
Figura 2.9 Válvula de inyección para cromatógrafo de líquidos de alta
resolución.
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Práctica 3
Cuantificación de una muestra problema de
anisaldehído (método del patrón interno)
Introducción
El funcionamiento de un comatógrafo de alta resolución empieza con el sistema
de bombas de alta presión, el cual impulsa el disolvente a través de todo el
sistema. La muestra es inyectada por medio de una microj eringa, el volumen es
de unos cuantos microlitros para que la resolución de los picos sea buena y la
separación sea más rápida. Una vez en la columna, se realiza la interacción
soporte-soluto-disolvente, lo cual permite la separación de los componentes
de la muestra. El detector está compuesto por una microcelda en forma de
"Z", a través de la cual fluye la disolución; es excelente para que los compuestos
no se mezclen y el flujo sea rápido. Por último, en el integrador, la absorban-
cia es convertida en señal eléctrica y así es reproducida como cromatograma.
En la cromatografía de líquidos de partición existen dos grupos de trabajo,
el más frecuente se conoce como cromatografía de fase inversa, en ella la
fase estacionaria tiene un carácter no polar y se eluye con un disolvente polar.
El segundo grupo es la cromatografía de fase normal que utiliza un soporte
polar y un disolvente no polar. El sistema de elución puede ser isocrático o por
gradiente y el detector más común es el uv-visible, aunque también es utilizado
el de índice de refracción.
La cuantificación de una muestra problema por medio de un estándar interno
se puede efectuar con la elaboración de una curva estándar, la cual debe ser
hecha mínimo con tres puntos. En el laboratorio se debe tener especial cuidado
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sobre las condiciones de separación, en cuanto a volumen inyectado, flujo y
composición de la fase móvil. La curva se desarrollará en función de la relación
de alturas o áreas de los picos del compuesto entre las del estándar (ver capítulo
1: Cálculos en cromatografía). En las abscisas se coloca la relación de la
concentración del soluto entre la concentración de la sustancia patrón. La
concentración de la muestra problema se interpola de la curva patrón.
Objetivo
El alumno aprenderá a utilizar el cromatógrafo de líquidos de alta resolución
para cuantificar una muestra problema de anisaldehído, utilizando el método
del patrón interno.
Materiales y reactivos
Cromatógrafo de líquidos de alta resolución
Columna Spherisorb ODS C]810 mm
Filtros de teflón de 0.4 mm
Jeringa de 50 mi, con aguja para HPLC
5 frascos viales de 5 mi con tapa
2 pipetas volumétricas de 1 mi
Anisaldehído
Acetonitrilo
Tolueno
Muestra problema con anisaldehído
Normas de seguridad
Al preparar la mezcla acetonitrilo agua y acetonitrilo tolueno debe hacerlo
en la campana de extracción.
Revise su bitácora para recordar que el acetonitrilo es venenoso y fla-
mable, que debe evitar respirar sus vapores y que puede causar irritación
en la piel.
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Cuantificación de una muestra problema de anisaldehído
Procedimiento
1. Las condiciones de funcionamiento del cromatógrafo deben ser