Bioanalitica 2

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CAPITULO I – MODELOS PARA ESTUDIOS METABOLICOS
Modelo: representación de un sistema o proceso real de interés, permite mimetizar un sistema más complejo. El modelo será in vivo o in vitro dependiendo donde ocurrió el efecto que quiero probar.
· In vivo: el fenómeno de estudio y las correspondientes preguntas experimentales que nos formulamos sobre él acontecen en el organismo vivo (animales, humanos, organismos inferiores).
· In vitro: el fenómeno en estudio ocurre en un ambiente artificial más o menos alejado de la complejidad de la situación verdadera, que es el organismo completo (cultivo de órganos, de tejido, de células o sistema libre de células).
Cultivo: conjunto de métodos y técnicas que mantienen células, tejidos y órganos viables in vitro, mantiene propiedades fisiológicas y metabólicas, permite comprender fenómenos a nivel celular o molecular.
· Ventajas: 
· Control estricto sobre el medio ambiente
· Caracterización y homogeneidad de la muestra
· Los cultivos son expuestos directamente a los reactivos en concentraciones bajas y definidas
· Menos gasto en reactivos y drogas por utilizar volúmenes pequeños 
· Disminuye el sacrificio de animales
· Desventajas:
· Deben ser llevadas a cabo en condiciones estrictas de asepsia (bajo flujo laminar)
· Alto gasto de esfuerzo y de materiales
· El metabolismo de una célula en cultivo puede no ser el mismo que el metabolismo de esa misma célula formando parte de un organismo o sistema
Tipos de cultivos:
· De órganos: mantiene las características histológicas y de arquitectura del tejido vivo. El tejido es cultivado en una interfaz gas-líquido. No permite un crecimiento importante y tiene poca reproducibilidad.
· De explantes primarios: se obtienen a partir de un fragmento de tejido u órgano colocado en una interfaz soporte – líquido.
· Celulares: deriva de células dispersadas tomadas del tejido original, de explante primario o de líneas celulares, obteniéndose una suspensión celular que puede ser cultivada como monocapa adherida a un sustrato sólido o como una suspensión en medio líquido. Es mucho más homogéneo, presenta menos variabilidad.
Evolución de un cultivo celular:
1. Cultivo primario: adhesión, adaptación al medio, proliferación. Heterogéneo
2. Línea celular: uniformidad, aumento el número de células, Homogéneo
3. Línea celular continua: Inmortalidad
4. Muerte celular: senescencia
Fases de cultivo??
PRACTICA
Protocolo: forma esquemática de representar los pasos a seguir para llevar a cabo un experimento.
· General: pasos generales del modelo experimental
· Específico: detalle de los pasos de una técnica en particular
Ejemplos:
· Estudiar si un factor aislado de sangre de carnero tiene efecto sobre la diferenciación de las células pluripotenciales de la sangre
IN VITRO: 
· Obtengo línea celular de células pluripotenciales de la sangre
· Realizo grupo control que trato con el vehículo y grupo experimental que trato con el factor asilado de sangre de carnero
· Analizo y obtengo una conclusión
· Estudiar el efecto de la insulina porcina sobre el metabolismo de los hidratos de carbono en humanos
IN VIVO:
· Busco población deficiente de insulina tratados con insulina humana
· Mido niveles de glucosa en sangre
· Suministro una dieta a base de hidratos de carbono
· Realizo un grupo control que trato con insulina humana y un grupo experimental que trato con insulina porcina
· Mido nuevamente los niveles de glucosa en sangre de ambos grupos
· Obtengo conclusiones
CAPITULO II – METODOS PARA EL MONITOREO DE BIOMOLECULAS
Anticuerpos: son proteínas producidas por los vertebrados como defensa contra las infecciones, poseen un sitio de unión distinto (paratope) que reconoce específicamente una parte del antígeno (epitope o determinante antigénico). Los linfocitos B son los encargados de producirlos.
					Fab: sitio de unión al Ag
Fc: unión a células y fijación del sistema complemento
· Policlonales: Se inyecta varias veces a un animal (conejo o cabra) una muestra de Ag y posteriormente se recoge el suero rico en Ac. Este antisuero contiene una mezcla heterogénea de Ac con distinta especificidad. La mayor parte de los Ag contienen varios epitopes capaces de estimular muchos clones de linfocitos B, cada uno de los cuales responde a un solo epitope y es capaz de producir solo una forma molecular de Ac.
· Monoclonal: Técnica de hibridomas Khöler y Milstein. Esta técnica requiere el uso de linfocitos B de un animal previamente inmunizado con el Ag de interés y una célula de mieloma que a diferencia de los linfocitos es capaz de crecer en cultivo. Se realiza la fusión de ambas células, mediada por polietilenglicol. Los híbridos se seleccionan en un medio selectivo que contiene aminopterina (bloquea la ruta normal de biosíntesis de nucleótidos), por lo que las células deben utilizar una ruta paralela para poder sintetizar sus ácidos nucleicos.
Las células de hibridoma pueden crecer ya que las células B contribuyen con enzimas que pueden sintetizar nucleótidos por una ruta paralela a la bloqueada por aminopterina y debido a que ahora tienen las propiedades de crecimiento de las células de mieloma.
Luego se chequea la producción del Ac de interés con el Ag purificado en cada capsula. Con las capsulas positivas se hace una dilución de manera tal de asegurarse de tener en una determinada alícuota un solo hibrido, que será sembrado en otra capsula. Luego propagamos el cultivo favoreciendo su crecimiento en un medio adecuado y nuevamente se utiliza el Ag de interés purificado para seleccionar los pocillos que contienen el Ac específico. 
Sensibilidad: Un método es más sensible que otro cuando detecta menores cantidades de un compuesto determinado.
Especificidad: Capacidad del método para detectar una determinada sustancia sin dar falsos positivos.
Límite de detección: menor cantidad de sustancia que puede ser detectada.
Límite de cuantificación: Menor cantidad de sustancia que puede ser cuantificada.
Radioinmunoensayo (RIA)
-Ac o Ag marcado con I125
-Emite radiación gama que es cuantificada
· RIA sándwich
1. Fijo Ac específicos
2. Bloqueo sitios de unión inespecífica
3. Lavo 
4. Agrego la muestra con el Ag a determinar
5. Lavo
6. Incubo con un Ac* específico para el Ag que se una a otro determinante antigénico que el primero
7. Lavo
8. Evaluó la presencia de radioisótopos
Para analizar cuantitativamente en el paso 4 agrego soluciones con diferentes concentraciones de Ag conocidas y realizo curva estándar.
Control +: en el paso 4 agrego solución control de concentración conocida, entro en la curva y corroboro con el valor de referencia.
Control -: en el paso 4 agrego solución control sin Ag, no debo ver señal.
· RIA competitivo
1. Fijo Ac específicos
2. Bloqueo sitios de unión inespecífica
3. Lavo 
4. Agrego cantidad fija y conocida de Ag* junto con cantidades variadas y conocidas de Ag frío en diferentes pocillos
5. Lavo
6. Registro y grafico la cantidad de radiación en cada pocillo
Para cuantificar mi muestra debo en el paso 4 agregar la misma cantidad fija y conocida de Ag* junto con mi muestra y en el paso 6 entro en la curva estándar.
Control +: en el paso 4 agrego la misma cantidad fija y conocida de Ag* junto con solución control de concentración conocida, entro en la curva y corroboro.
Control -: en el paso 4 agrego la misma cantidad fija y conocida de Ag* junto con solución control sin Ag frío, debo ver máxima señal.
Ventajas y desventajas del RIA:
· Alta sensibilidad, detectan cantidades del nanogramo
· Alto costo de equipamiento
· Requiere personal capacitado
Enzimoinmunoensayo (ELISA)
La enzima marcadora debe ser:
· Estable en condiciones de almacenamiento, conjugación con el anticuerpo y ensayo
· De bajo peso molecular
· De alta actividad específica
· Económica
· ELISA sándwich
1. Fijo Ac específicos
2. Bloqueo sitio de unión inespecífica
3. Lavo
4. Agrego muestra con el Ag a determinar
5. Lavo
6. Incubo con Ac*con enzima que se una a otro determinante antigénico que el primero
7. Lavo
8. Agrego sustrato
9. Agregosolución stop
10. Evaluo la formación de producto por reacción colorimétrica
Para analizar cuantitativamente en el paso 4 agrego soluciones con diferentes concentraciones de Ag conocidas y realizo curva estándar.
Control +: en el paso 4 agrego solución control de concentración conocida, entro en la curva y corroboro con el valor de referencia.
Control -: en el paso 4 agrego solución control sin Ag, no debo ver señal.
· ELISA competitivo
1. Fijo Ac específicos
2. Bloqueo sitios de unión inespecífica
3. Lavo
4. Agrego cantidad fija y conocida de Ag* con la enzima, junto con cantidades variadas y conocidas de Ag frío en diferentes pocillos
5. Lavo
6. Agrego el sustrato
7. Agrego solución stop
8. Evaluo la formación de producto por reacción colorimétrica y realizo la curva estándar
Para cuantificar mi muestra en el paso 4 debo agregar cantidades fijas y conocidas de Ag* con la enzima, junto con mi muestra para luego entrar en la curva estándar.
Control +: en el paso 4 agrego la misma cantidad fija y conocida de Ag* con la enzima, junto con la solución control de concentración conocida y en el paso 8 entro en la curva estándar
Control - : en el paso 4 agrego la misma cantidad fija y conocida de Ag* con la enzima, junto con la solución control sin Ag, debo ver la máxima señal.
Inmunofluorescencia (IF)
· Inmunofluorescencia directo:
1. Fijo Ac específicos
2. Bloqueo sitios de unión inespecífica
3. Lavo
4. Agrego la muestra
5. Lavo
6. Agrego Ac contra otro determinante antigénico marcado con fluoróforo
7. Lavo
8. Observo al microscopio fluorescencia
Para analizar cuantitativamente en el paso 4 agrego soluciones con diferentes concentraciones conocidas de Ag y realizo curva estándar.
Control +: en el paso 4 agrego solución control de concentración conocida, entro en la curva y verifico con el valor de referencia.
Control -: en el paso 4 agrego solución control que no presenta Ag, no debo ver señal.
· Inmunofluorescencia indirecto:
1. Fijo Ac específicos
2. Bloqueo sitios de unión inespecífica
3. Lavo
4. Agrego la muestra
5. Lavo
6. Agrego Ac contra otro determinante antigénico
7. Lavo
8. Agrego Ac antigammaglobulina de la misma especie que el Ac 2 pero distinta especie que el 1
9. Lavo
10. Observo señal al microscopio
Para analizar cuantitativamente en el paso 4 agrego soluciones con diferentes concentraciones conocidas de Ag y realizo curva estándar.
Control +: en el paso 4 agrego solución control de concentración conocida, entro en la curva y verifico con el valor de referencia.
Control -: en el paso 4 agrego solución control sin Ag, no debo ver señal.
Sistema avidina-biotina (Aumenta la sensibilidad del método)
· A
1. Inmovilizo Ag
2. Agrego Ac marcado con biotina
3. Lavo
4. Agrego avidina marcada con enzima o fluoróforo
5. Lavo
6. Evalúo señal
· B
1. Inmovilizo Ag
2. Agrego Ac marcado con biotina
3. Lavo
4. Agrego avidina y biotina marcada con enzima o fluoróforo
5. Lavo 
6. Evalúo señal
Electroquimioluminiscencia (ECLIA) (Aumenta la superficie de reacción)
1. Genero fase solida (macropartícula paramagnética + avidina)
2. Agrego Ac unidos a biotina
3. Desactivo imán para que se encuentren y vuelvo a activarlo
4. Lavo
5. Agrego la muestra
6. Desactivo el imán y vuelvo a activarlo
7. Lavo
8. Agrego Ac unido al complejo de rutenio
9. Desactivo el imán y vuelvo a activarlo
10. Lavo
11. Agrego TPA
12. Aplico voltaje para activar la reacción
13. Mido emisión de luz con fotomultiplicador
Electrofisiología celular
· Electrofisiología clásica: permite medir variaciones en la concentración celular de un ion determinado. Esta variación debe ser estable en el tiempo. Para determinar la concentración de un ion específico, se debe contar con un material que sea solo permeable al ion de interés, construyéndose con este una barrera que se coloca entre la solución incógnita y una solución de concentración conocida. La diferencia de potencial eléctrico a través de la barrera selectivamente permeable será una medida directa de la relación de concentración del ion específico entre las soluciones.
El tip del microelectrodo es llenado con un compuesto orgánico para construir una barrera selectivamente permeable al ion. El microelectrodo se introduce en la célula, conectado con un microelectrodo de referencia.
· Patch clamp: permite medir la actividad de canales iónicos en tiempo real.
· Cell attached: es la configuración de elección cuando el canal en cuestión requiere factores citosolico para su apertura. No es invasiva, deja el canal iónico en su ambiente fisiológico. La desventaja es que no se puede controlar ni cambiar la composición iónica de las soluciones a ambos lados de la membrana.
· Inside-Out: permite cambiar la solución del lado citosolico del parche, por lo tanto es el método de elección cuando se estudian canales activados por 2° mensajeros intracelulares. Se pierden factores citosolico.
· Outside-Out: permite cambiar la solución del lado extracelular del parche por lo tanto es el método de elección cuando se estudia el efecto de hormonas y neurotransmisores. Se pierden factores citosolico.
· Whole - Cell: mide actividad de canales de toda la célula. Una desventaja es que imposibilita cambiar el medio citosolico.
Sondas intracelulares
Permiten conocer la concentración de un ion en una zona determinada de la célula. Son específicas de iones. Mide cambios de concentración rápidos. 
Pueden ser luminiscentes (emiten luz espontáneamente) o fluorescentes (emiten luz visible cunado son expuestos a la luz UV). Los hay liposolubles (pueden atravesar la membrana) o hidrosolubles (hay que permeabilizar la célula para su ingreso).
Métodos de permeación celular
Permiten introducir moléculas, que no atraviesan la membrana plasmática, al interior de la célula para estudiar su comportamiento.
· Microinyección: Se microinyectan las moléculas al interior de la célula a través de una micro pipeta de vidrio. La principal desventaja es que cada célula debe ser microinyectada individualmente.
· Generación de poros:
· Shock eléctrico (electroporación): se coloca el cultivo en un medio con la partícula que desee ingresar y se le aplican pulsos eléctricos cortos. Genera grandes poros en la membrana sin dañar las membranas intracelulares. No usar con neuronas.
· Shock químico: se coloca el cultivo en un medio con la partícula que desee ingresar y se le agregan bajas concentración de detergente.
· Liposomas: Se construyen vesículas membranosas que contienen moléculas de interés en su interior, luego estas vesículas se fusionan con la membrana plasmática de la célula blanco y el material de interés queda introducido dentro, También se pueden crear vesículas que tengan lípidos o proteínas de interés en la membrana, para luego de fusionarse queden estas moléculas de interés en la membrana plasmática de la célula.
CAPITULO III – METODOS PARA EL AISLAMIENTO Y PURIFICACION DE BIOMOLECULAS
Métodos de separación y propiedades físicas de las biomoléculas
· Basados en la polaridad
· Solubilidad diferencial
· Precipitación por sales
· Precipitación por solventes orgánicos
· Desnaturalización selectiva
· Adsorción
· Basados en la reactividad química diferencial
· Basados en el tamaño
· Centrifugación
· Filtración
· Diálisis
· Cromatografía de exclusión
· Basados en las características iónicas
· Cromatografía de intercambio iónico
· Electroforesis
· Basados en la forma
· Cromatografía de afinidad
Cromatografía: Permite separar componentes de una mezcla mediante una serie de etapas de equilibrio. Este equilibrio depende de la partición o adsorción diferencial de los componentes individuales entre dos fases, una fase móvil (FM) y una fase estacionaria (FE).
El componente que pasa más rápido por el sistema posee una relación de equilibrio que favorece menos su permanencia en la FE. El compuesto que tenga mayor afinidad por la FE demorará más tiempo en abandonar el sistema.
La FM puede ser un líquido o un gas y la FE puede ser un sólido o un líquido.
La cromatografía líquida permite trabajar a temperatura ambiente ypor lo tanto es una metodología adecuada para la separación de moléculas termolábiles, no volátiles y altamente polares. La cromatografía gaseosa es ampliamente utilizada en la separación de moléculas no polares y que puedan volatilizarse sin perder su estructura particular.
Cromatografías de reparto
 Se basa en que si dos fases se encuentran en contacto una con otra y una de las dos contiene un soluto, este se distribuirá entre ambas fases. Este fenómeno recibe el nombre de reparto y está representado por el coeficiente de reparto (K).
La FE recibe el nombre de sorbente, este puede ser un líquido que es mantenido en forma estacionaria por un soporte o matriz sólida. La FM es el disolvente y los componentes de la mezcla que van a ser separados constituyen el soluto. 
· Cromatografía en papel: Se siembra un pequeño volumen de la disolución de la mezcla a separar en un punto marcado del papel (origen) y luego se seca. A continuación el papel se coloca en una cámara cerrada y el extremo donde se sembró la muestra se coloca en un solvente apropiado (FM). Por capilaridad asciende la fase móvil a través del papel y disuelve la muestra cuando pasa por el punto de siembra, de manera tal que los componentes se mueven en la dirección del flujo de la fase móvil. Después que el frente de disolvente haya alcanzado un punto cercano al otro extremo del papel se saca la tira de la cuba y se la seca. Las manchas se detectan por métodos específicos y se marcan.
La distancia desde el punto de origen hasta el centro de la mancha dividido la distancia desde el punto de origen hasta el frente de disolvente se denomina Rf. Este parámetro depende de la sustancia, del disolvente usado y de las condiciones de corrida. El Rf de la mancha incógnita se compara con los Rf de estándares sembrados en la misma placa y de esta forma se identifica el compuesto.
Uno de los factores importantes que afectan a la separación es la velocidad de disolución de la muestra en la FM. 
· Cromatografía en capa fina (TLC): Se desarrolló por la necesidad de separar lípidos. Aquí la FE es una lámina de sorbente uniformemente extendido sobre una placa de vidrio o plástico.
La muestra se aplica sobre un borde y se seca. La placa de TLC se coloca en una cámara que contiene el disolvente y se desarrolla por cromatografía ascendente. Cuando el frente del disolvente ha alcanzado casi el borde superior, se quita la placa de la cámara y se la deja secar. Se determina el Rf y se lo compara con los Rf de estándares sembrados en la misma placa para identificar el compuesto.
Si la mezcla a separar tiene compuestos con propiedades semejantes, puede volverse a cromatografiar en una dirección perpendicular a la inicial en un sistema de solventes distinto (bidimensional).
Cromatografía de adsorción
Utiliza una FM líquida y una FE sólida. Si se siembra en la parte superior de una columna un volumen dado de una muestra y luego se deja fluir un solvente (FM), las sustancias eluirán a distintos tiempos.
La velocidad con que se mueven las sustancias está relacionada con la fuerza de unión al adsorbente y sus solubilidades en el solvente, siendo más lento el movimiento cuando más firme es la unión.
Cromatografía de intercambio iónico
 Las moléculas cargadas se unen a los intercambiadores de forma reversible, de modo que dichas moléculas pueden ser unidas o separadas cambiando las condiciones del ambiente. Un intercambiador iónico es un sólido que tiene entrelazados químicamente grupos cargados a los que se unen iones por fuerzas electroestáticas. Si la matriz está cargada positivamente une iones cargados negativamente (intercambiador aniónico), si la matriz está cargada negativamente une iones cargados positivamente (intercambiador catiónico). 
La capacidad total de un intercambiador iónico es la medida de la captación de iones intercambiables y se expresa como miliequivalentes de grupos intercambiables por miligramo de peso seco. Este dato es suministrado por el fabricante y es importante porque si se excede en su capacidad, los iones pasarán a través de la columna sin unirse.
La capacidad aprovechable es la capacidad bajo las condiciones experimentales dadas (pH, fuerza iónica, etc).
Hay dos métodos de elución: Uno de ellos es usar buffers a distintos pH, donde la proteína o analito cambia su carga y eluye (debo saber el pI del analito) o usar sales en concentración en aumento o disminución (aumentar o disminuir la fuerza iónica)
	Compuesto
	Carga
	pI
	A
	-
	4,5
	B
	--
	8
	C
	---
	12
Cromatografía en columnas hidrofóbicas 
Las sustancias son separadas basándose en sus interacciones hidrofóbicas con el gel de la matriz (a la cuan están unidos grupos hidrofóbicos). Luego de aplicada la muestra, la elución se lleva a cabo aplicando un gradiente salino descendiente.
Cromatografía de exclusión molecular
Se basa en una columna de partículas muy finas de una sustancia inerte, que contenga poros muy pequeños. Si se hace pasar una disolución con moléculas de distintos tamaños a través de la columna, las moléculas con un tamaño mayor que el de los poros se moverán solo en el espacio que queda entre las partículas, por o tanto no sufrirán retraso y eluiran primero en un solo pico. Las moléculas con un tamaño menor que el de los poros difunden al interior de la partícula, debido a esto su movimiento de descanso a través de la columna se hace más lento. Las moléculas que tienen un tamaño muy pequeño en proporción al tamaño del poro son fuertemente retardadas, por esta razón eluyen al final y en un solo pico. Es decir que las moléculas eluyen de la comuna por orden de tamaño decreciente.
La principal ventaja es que la interacción del analito con la columna no es química sino física.
Para determinar el volumen de elución o el peso molecular que corresponde a mi analito debo realizar una curva de calibrado con estándares de volumen y peso conocido (log PM vs Ve). Una vez trazada la recta puedo entrar con el volumen de elución o con el log PM de mi analito.
	Compuesto
	PM
	A
	80 kDa
	B
	120 kDa
	C
	33 kDa
	D
	50 kDa
	E
	180 kDa
 Rango: 70 kDa – 150kDa
Cromatografía de afinidad
 Utiliza la afinidad específica entre la sustancia que debe aislarse y la molécula a la que esta puede unirse en forma específica (ligando). Esta cromatografía ofrece un alto grado de purificación en un solo paso, suele utilizarse como último paso en un proceso de purificación.
Para eluir puedo agregar el ligando en mayor concentración o agregar buffer en condiciones que desfavorezcan la unión.
Cromatografía gaseosa
 La FM es un gas y la FE puede ser un líquido adsorbido a la superficie interna de un tubo o columna o a un soporte sólido. Un cromatógrafo gaseoso está formado por un sistema de gases, un inyector, un horno con temperatura variable (donde se encuentra la columna), un detector y un registrador (interpreta los datos enviados por el detector y los grafica en forma continua a modo de picos).
La muestra puede ser cualquier compuesto capaz de ser volatilizado sin sufrir descomposición, se introduce con un gas inerte y se calienta por encima del punto de volatilización. Cuando la mezcla de componentes volátiles es introducida en la columna, cada molécula de soluto de la muestra es trasportada hacia el detector. La proporción de cada especie molecular que permanece en la FM en cada instante depende de la presión de vapor de cada soluto. Los componentes con mayor presión de vapor permanecen menos tiempo en la FE y eluyen rápidamente, los de menor presión de vapor ya sea por tener punto de ebullición mayor o por tener más interacción con la FE, eluyen más tarde.
Algunos de los factores que afectan la presión de vapor de los solutos son: la temperatura de la columna, el flujo de la FM y el tipo de FE (una fase polar reduce la presión de vapor de solutos polares por medio de interacciones soluto-FE).
La separación de los picos cromatográficos (resolución) está dada por dos factores: la eficiencia de la columna y la eficiencia de la FE. El primero se relaciona con el ensanchamientodel pico, este efecto resulta del diseño de la columna y de las condiciones de corrida y puede ser representado por la altura equivalente del plato teórico (HETP). La eficiencia de la FE resulta de la interacción soluto-FE y determina la posición relativa de las bandas de los distintos compuestos separados.
· Eficiencia de la columna: está dado por el N, siendo N= 5,54 (Tr/w1/2)2
Si aumenta la temperatura aumenta la presión de vapor, disminuye el Tr y aumenta el K (FM/FE). El analito pasa más tiempo en la FM por lo tanto no interacciona mucho con la FE, eluyendo antes y aumentando la eficiencia de la columna (disminuye el ancho del pico).
Velocidad de flujo:
A 	B 	HETP µ	 N Tr
B	C	HETP	 µ	 N Tr
C	B	HETP µ	 N Tr
B	A	HETP µ N Tr
· Eficiencia de la FE: cada pico debe tener su tiempo de retención
· Resolución: Representa la separación de los picos y es el resultado de la eficiencia de la columna y de la FE
R = 2d/(w1 + w2) d: distancia entre los máximos de los picos
			 w: ancho de los picos en la base
· Si R>1,5 Buena eficiencia
· Si 1,23<R> 1,5 Par crítico
Columnas
· Rellenas o empacadas: Están constituidas por un tubo de acero inoxidable o vidrio. SU diámetro es de 2 a 6mm y su longitud entre 05 y 6 metros. El relleno es un material granulado que puede ser, un soporte inerte impregnado en un líquido orgánico llamado FE (cromatografía gas-líquido) o un adsorbente (cromatografía gas-líquido)
· Capilares: Están constituidas por un tubo de sílica vacío, recubiertas por un polímero que le da mayor resistencia y elasticidad. La FE esta químicamente unida a la superficie de la sílica.
Detectores
· FID: detector de ionización en llama
Es universal ya que responde a los compuestos que presentan enlaces C-H. Una desventaja es que es destructivo y no permite realizar cromatografías preparativas.
· TCD: detector de conductividad térmica
Compara la conductividad térmica de dos flujos de gases, un gas puro (de referencia) y el gas carrier mas la muestra (efluente de columna).
Está compuesto por dos celdas cada una con un filamento que es calentado eléctricamente. EL gas que sale de la columna pasa a través de una de las celdas y una corriente del mismo gas por la otra (de referencia). Ambas resistencias están conectadas de manera de formar un puede de Wheastone. Cuando un compuesto emerge de la columna se desequilibra el puente y origina una desviación del galvanómetro. La señal es amplificada y trasmitida a un registrador o computadora.
· ECD: detector de captura electrónica
Contiene una celda recubierta con 63Ni que emite partículas β que colisionan con las moléculas del gas carrier para generar electrones de baja energía. Los electrones libres producen pequeñas corrientes, llamadas corrientes de referencia, que son colectadas y medidas en un circuito. Cuando una molécula emergente de la columna toma contacto con los electrones libres estos pueden ser capturados por la muestra para crear grandes iones cargados negativamente, los cuales se eliminan sin ser colectados, por lo tanto disminuye la corriente. Esto genera un pico negativo, que es convertido a voltaje y grabado.
· NPD: detector de nitrógeno y fósforo
Presenta iones de metal alcalino que pasan a la llama, minimizando la normal ionización de los hidrocarburos e incrementando la ionización de los compuestos de nitrógeno y fosforo. Es un detector sensible y específico para aquellos compuestos que tengan nitrógeno y fosforo en su molécula. La corriente generada es proporcional a los iones colectados.
· MSD: detector selectivo de masas
La muestra ingresa al detector en forma gaseosa y se hace pasar en un flujo continuo a la cámara de ionización. EN esta cámara la muestra pasa a través de una corriente de electrones de elevada energía, los cuales ionización algunas moléculas de la muestra formando iones moleculares de carga z. Estos iones son inestables y se rompen en fragmentos menores, del tipo radicales libres y otros iones. Las placas de aceleración de iones aceleran las partículas cargadas positivamente (las neutras y negativas no son aceleradas y se eliminan mediante bombas de vacío). Luego pasan por un tubo analizador donde sufren una deflexión por parte de un campo magnético que le obliga a seguir una trayectoria curva. Así las partículas de m/z progresivamente crecientes irán alcanzando sucesivamente el colector e irán siendo detectadas.
El espectro de masas es una representación gráfica de la abundancia frente a la relación masa/carga (m/z) de los fragmentos. El espectro se presenta de forma de grafico de barras, cada pico representa un fragmento de la molécula y la intensidad es proporcional a la abundancia relativa de dicho fragmento.
HPLC
El equipo está constituido por una bomba que es la que impulsa el solvente a alta presión desde un reservorio a través de la columna, que contiene en su interior la FE formada por partículas de tamaño y forma homogénea. Entre la bomba y la columna se intercala el inyector, donde se introduce la muestra. A la salida de la columna se encuentra el detector que mide determinadas propiedades de la sustancia de interés.
La FM es siempre líquida (mezcla de solventes) y la FE puede ser líquida (partición/reparto) o sólida (adsorción, exclusión, intercambio iónico)
	
	Fase normal
	Fase reversa
	Polaridad de la FE
	Polar
	Apolar
	Polaridad de la FM
	Baja-media polaridad
	Media-alta polaridad
	Orden de elución
	1° los más apolares
	1° los más polares
	Incremento de la fuerza
	Aumenta la polaridad
Disminuye el Tr
	Disminuye la polaridad
Disminuye el Tr
· Se puede cambiar la fuerza sin cambiar la selectividad, cambiar la concentración del solvente más fuerte.
· Se puede cambiar la selectividad sin variar la fuerza, cambiar el solvente más fuerte por el de otro grupo de igual polaridad.
Electroforesis
Es la migración de solutos iónicos bajo la influencia de un campo eléctrico, las partículas migran hacia el cátodo (-) o ánodo (+) según su peso, carga y forma.
· Electroforesis en papel: la muestra se aplica como una mancha o una línea. La tira del papel se satura con el tampón y los extremos se sumergen en el reservorio de la solución para establecer contacto con la fuente de poder. El sistema se cierra con una tapa para evitar la evaporación y se aplica el voltaje deseado. Cuando la separación llega a su fin, se retira el papel y se seca.
Cuando no es posible la completa resolución de todos los componentes de una muestra se acopa a una cromatografía (separación bidimensional).
· Electroforesis en gel: el uso de geles como poliacrilamida y agarosa como soportes proporcionan una gran resolución en la separación de proteínas y ácidos nucleicos. Puede ser monodimensional o bidimensional. El gel puede ser restrictivo (tamaño del poro similar al del analito) o no restrictivo (tamaño del poro mayor al del analito).
Hay distintos sistemas:
· Continuo: pH del buffer, de los reservorio y del gel iguales. Concentración del gel constante.
· Discontinuo: Geles divididos en dos áreas (apilamiento y separación). Distinto tamaño de poro, distinto pH, mayor resolución.
· En gradiente: Varía el tamaño del poro a lo largo del gel.
· Gel de agarosa: el rango de aplicación incluye grandes moléculas y complejos supra moleculares (lipoproteínas, complejos enzimáticos, ácidos nucleicos y algunos virus)
· Gel de poliacrilamida: Es el más afectivo para la electroforesis de proteínas y pequeñas moléculas de ARN. Está formado por acrilamida y bis-acrilamida (responsable del entrecruzamiento). El tamaño del poro del gel depende de dos factores, la cantidad total de acrilamida presente y el porcentaje de entrecruzamiento. A mayor concentración de acrilamida y mayor entrecruzamiento, menor tamaño de poro.
· Electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS (SDS-Page): Se utiliza para separar proteínas según su PM. El gel se prepara con el agregado de un detergente (SDS) y un agente desnaturalizante (2-mercaptoetanol). Las proteínas se unen al SDS y se disocian, los puentes disulfuro se abrengracias al mercaptoetanol, por lo que pierden su estructura secundaria. La carga ahora está determinada por el SDS más que por la carga intrínseca de los aminoácidos, por lo que la movilidad electroforética esta únicamente relacionada con el PM de la proteína.
Para determinar el PM podemos utilizar distintos marcadores de PM y generar una relación lineal entre el log PM y la movilidad electroforética de las proteínas.
· Isoelectroenfoque: Permite separar según pI. Utiliza geles no restrictivos con un gradiente de pH. Para cada proteína existe un valor de pH característico al cual presentan carga neta nula y se denomina pI, la molécula migrará hasta aquel punto del gel donde el pH sea igual a su pI. Es capaz de resolver proteínas que difieran solamente en 0,01 unidades de pH en su pI. Presenta baja recuperación.
· Electroforesis bidimensional: Permite obtener mayor información de las proteínas individuales de una mezcla. El más usado consta de una primera dimensión que separa por pI (isoelectroenfoque) y en una segunda dimensión por PM (SDS-Page).
· Inmunoelectroforesis: Los Ag son primero separados por electroforesis en un gel de agarosa libre de Ac. El gel se corta en tiras y cada tira es combinada con otro gel que contiene Ac contra todos los Ag de la muestra. Cuando un Ag y su Ac específico se encuentran en concentraciones equivalentes se forma un precipitado en forma de pico. El área del pico es proporcional a la concentración del Ag presente y la posición identifica al Ag.
· Electroforesis capilar: Consta de dos reservorios de buffer donde se ubica el ánodo y el cátodo, el equipo de detección está acoplado a una columna. Los analitos son separados por migración electroforética a diferentes velocidades siendo todos dirigidos al cátodo debido a su carga o bien al efecto electroendosmótico.
Efecto electroendosmótico: los grupos silanoles libres de la pared del capilar están cargados negativamente a pH mayor a 3. Los iones positivos del buffer son atraídos por estas cargas dando una primera capa fija y luego más iones positivos se unen a esta capa dando una segunda capa móvil. Esto genera un flujo neto hacia el cátodo.
++ + o - - -
· Para eliminar el EEO puedo trabajar a pH menor a 3 para eliminar la carga negativa de la sílica o usar capilares recubiertos
· Para invertir el EEO puedo usar capilares recubiertos modificación químicamente o adicionar surfactantes catiónicos.
· Electroforesis micelar capilar crítica: Permite separar moléculas neutras. Se agregan concentraciones críticas de SDS dando lugar a la formación de micelas que tienen cabeza polar y cola apolar. Tienen un componente negativo muy grande pero por el EEO van a llegar al detector. Las moléculas más hidrofóbicas se particionan más en la micela.
	Proteína
	Característica al pH de trabajo
	pI
	A
	Muy soluble en fase micelar
	7
	B
	Equilibrio de solubilidad entre dase micelar y acuosa
	7
	C
	Altamente soluble en agua
	7
	D
	++
	9
	E
	--
	5
	F
	Muy soluble en fase micelar
	7
	G
	+
	8
· Blotting: El gel que contiene a la muestra separada se coloca sobre una membrana inmovilizada y se hace un sándwich con hojas de papel de filto. Al aplicar un campo eléctrico al sándwich, las bandas son trasferidas desde el gel a la membrana, donde quedan permanentemente unidas y de fácil acceso para análisis posteriores. Es aplicable tanto a proteínas como a ácidos nucleicos.
Filtración por membranas
· Filtros de nitrocelulosa: Los poros tienen forma irregular. Debido al pequeño tamaño del poro y a la tensión superficial, los líquidos no atraviesan con facilidad la membrana por lo que se emplea presión o succión.
· Filtros de fibra de vidrio: El reticulado no puede fabricarse tan fino por lo que son relativamente gruesos. La ventaja es la velocidad de flujo, su gran capacidad antes de colmatarse, la resistencia a casi todos los disolventes, la resistencia al calentamiento y el bajo costo. La desventaja es que en algunas ocasiones pueden pasar pequeñas partículas de fibra a las soluciones.
Filtración molecular (diálisis)
Consiste en introducir una disolución acuosa que contiene macromoléculas y moléculas pequeñas en una bolsa de colodión (permite el paso de pequeñas moléculas no de las grandes) que a su vez se encuentra sumergido en una solución buffer. Las moléculas pequeñas pasan libremente a través de la membrana hasta alcanzar el equilibrio con la solución del buffer exterior. El agua también pasa libremente a través de la bolsa.
En la diálisis inversa la bolsa de colodión se introduce en un polímero seco y soluble en agua, que sea impermeable a la membrana. Como consecuencia el agua abandona la bolsa para equilibrarse con la fase externa seca. Se utiliza para concentrar el material dentro de la bolsa.