Conocimientos previos - Extracción de ADN

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CONOCIMIENTOS PREVIOS 2. EXTRACCIÓN DE ADN. 
1. Propiedades fisicoquímicas del ADN
Los polinucleótidos de DNA y RNA son hidrófilos debido a que se pueden formar puentes de hidrógeno entre el agua y los fosfatos, o el agua y los OH de la pentosa. Por tanto, son más solubles que las bases que los forman.
A pH fisiológico, los grupos fosfato presentan dos cargas negativas (el pK más alto es 6), por lo que los polinucleótidos son de naturaleza ácida.
Debido a que los polinucleótidos son moléculas muy largas en relación a su diámetro, proporcionan soluciones viscosas.
Químicamente son muy estables, especialmente en el caso del DNA por carecer del 2’-OH. Es precisamente este radical el que proporciona las principales diferencias entre ambos ácidos nucleicos, además de ser el principal responsable de la actividad catalítica de las ribozimas.
Apilamiento de las bases: 
· se produce la interacción electrónica entre las nubes de electrones de las bases (interacciones hidrófobas), situación incompatible con las interacciones polares con el agua
· se disminuye la tensión superficial generada entre las bases y el agua. Al disponerse el agua por fuera del polinucleótido de una manera ordenada, éste tiende aún más a agregarse, por lo que se genera una especie de cavidad estable en el agua.
2. ¿Cuál es la función del fenol-cloroformo en la extracción de ADN?
- Da lugar a la aparición de 2 fases: 
· una fase acuosa superior que contiene los ácidos nucleicos
· una fase orgánica que contiene las proteínas disueltas en el fenol y los lípidos disueltos en el cloroformo.
- Para la purificación de ADN el fenol debe tener un pH≈7-8
- Desventaja: Es un método lento, laborioso y contaminante
3. ¿Para qué sirve el Tris-HCL y SDS en el proceso de extracción?
Tris-HCl: 
· Tris(hidroximetil) aminometano: se usa para preparar disoluciones tampón; el grupo ácido-base que ejerce el tamponamiento es el amino.
· Tris puede ser comercializada en su forma básica (tris base) y ácida (tirs hidrocloruro). La base es la forma más común. 
· Tris-HCl se prepara con tris base y HCl para ajustar el pH 
· Tris-HCl se usa par en la electroforesis como agente tamponante que mantiene el pH.
· Preparación de Tris-HCl: pesar 12.11 g de Tris y disolverlo en 100 mL de agua destilada. Ajustar el pH a 7.4 con HCl concentrado. Autoclavar y mantener en heladera.
Dodecil Sulfato De Sodio (SDS): es un detergente iónico utilizado para desnaturalizar proteínas en hibridación, purificación de ácidos nucleicos y sistemas de buffer de electroforesis, Disociar complejos de proteínas de ácido nucleico en protocolos de extracción de ADN, para alterar las membranas celulares y para preparar soluciones de prehibridación y / o hibridación.
Para preparar una solución de SDS al 10%, disuelva 100 g de SDS en 900 ml de agua ddi. Calentar a 68 ° C para ayudar a la disolución. Ajuste el pH a 7.2 agregando unas gotas de HCl. Ajuste el volumen total a 1 L con agua ddi, luego dispense en alícuotas.
4. ¿Por qué utilizamos isopropanol y Etanol en la extracción de ADN?
Ambos se usan para concentrar y desalinizar preparaciones de ácidos nucleicos en soluciones acuosas 
	
	Isopropanol
	Etanol
	Solubilidad del ADN
	ADN es menos soluble en isopropanol entonces ADN va a precipitar más rápido con menos concentración de reactivo. 
Desventaja: las sales también precipitaran junto con el ADN 
	Se necesita más concentración de etanol para precipitar 
Ventaja: sales seguirán solubles entonces no precipitan con ADN
	Volumen
	Si hay mucho volumen de ADN que se tiene que extraer, es mejor usar isopropanol para usar menos reactivo 
	Si hay poco volumen de ADN es mejor etanol porque la purificación es mejor 
5. ¿Para qué se adiciona la sal en el proceso de extracción de ADN?
La sal en disolución actúa disminuyendo la solubilidad de las proteínas, lo que hace que precipiten y se separen más fácilmente del ADN para poder obtenerlo con una mayor pureza.
· El ADN es soluble en alcohol pero se torna insoluble en presencia de sal (NaCl) porque el sodio neutraliza la carga negativa de los grupos fosfatos, por lo tanto el alcohol separa el ADN de otros componentes celulares, y la sal evita la unión de las proteínas al ADN.
6. ¿Cuáles son los principales factores que afectan el proceso de extracción de
ADN?
Uso de etanol o isopropanol (ver pregunta 4) 
Después de precipitar el ADN, en la redisolución del ADN (cuando se usa tris-HCl) es importante evitar el pipeteo y la agitación agresiva pues se pueden fragmentar moléculas de alto peso molecular. 
· Para evitar la fragmentación molecular se puede incubar a 55 °C el ADN, 1 a 2 horas con agitación suave.
Fuente de la muestra. Cuando se extrae ADN para biopsias, los tejidos deben de ser fijados en formaldehído. No usar tampones causa la degradación del ADN (ejemplo: en muestras que tienen varios años y están guardadas en formaldehído no tamponado). Como el ADN ya está degradado, sólo se pueden amplificar secuencias muy cortas. 
Si cuando se recolectó la muestra se congeló, se debe de disgregar con nitrógeno líquido para evitar la degradación de ADN por acción de DNasas 
Los kits de extracción de ADN aunque se basan en el mismo principio son diferentes en base al propósito. Ejemplo un kit para extraer ADN de sangre total, considera la presencia de hemoglobina y eritrocitos durante el proceso cosa que no lo toma en cuenta un kit diseñado para extraer ADN de células o tejidos animales
· El kit con perlas magnéticas usa soluciones a pH específicos y también usan un imán que atrae a las perlas para separarlas de las soluciones en las que se encuentran suspendidas. 
· Se añade a la solución de lisis una solución amortiguadora a pH ácido que permite cargar positivamente a las perlas, favoreciendo la unión de ADN
· Las proteínas y lípidos tienen baja afinidad por las perlas y son eliminados con soluciones de lavado a pH fisiológico.