Practica N9

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PRACTICA 9
ÁCIDO ÚRICO Y GOTA
INTRODUCCIÓN
El ácido úrico es el producto final del catabolismo de las purinas que forman parte de los nucleótidos, ácidos nucleicos y nucleoproteínas en el hombre y primates (ver figura), en otros mamíferos el ácido úrico puede ser oxidado hasta alantoina y en otros animales que no son mamíferos la degradación puede llegar hasta urea y amonio. La concentración de ácido úrico en el suero varía de un individuo a otro de acuerdo a diversos factores como la dieta, raza, constitución genética, sexo, altitud en la que vive, etc. Sus niveles anormales en el suero son consecuencia de una mayor formación en el organismo o defectos en su eliminación. 
La hiperuricemia (niveles séricos de ácido úrico superiores a 7 mg % ) determina en un alto porcentaje la presencia de artritis gotosa. En estos pacientes se presenta el depósito de cristales de ácido úrico y sus sales a nivel de las articulaciones y tendones, determinando una inflamación muy dolorosa. En la gota se encuentra frecuentemente masas nodulares (tofos) de cristales de urato monosódico en los tejidos blandos: También se observa en varios de estos pacientes la formación de cálculos de ácido úrico a nivel renal. El diagnóstico definitivo de la gota requiere la aspiración y examen del líquido presente en las articulaciones (líquido sinovial) o en los tofos de la persona afectada. Usando microscopía de luz polarizada se debe confirmar la presencia de cristales tipo aguja de urato monosódico. 
En una cantidad importante de pacientes, la hiperuricemia que lleva a la gota es causada por la menor excreción de ácido úrico. Esto se puede deber a defectos heredados o secundarios a otras enfermedades como la acidosis láctica o la ingesta de drogas como diuréticos tiazídicos o exposición al plomo. Los casos de gota por mayor producción de ácido úrico, son menos frecuentes y en la mayoría de casos de origen aún no esclarecidos; sin embargo en algunos pacientes ha sido posible detectar mutaciones en el gen de la PRPP sinteasa localizado en el cromosoma X. En el síndrome de Lesh Nyhan que es por defecto de la enzima Hipoxantina Guanina Fosforribosiltransferasa hay un incremento en la disponibilidad de PRPP. En pacientes con desórdenes mieloproliferativos que reciben quimioterapia tienen un aumento en la disponibilidad de purinas que lleva a la mayor formación de ácido úrico en otros casos la hiperuricemia es una manifestación secundaria a otros desórdenes, como cuadros de anemia hemolítica, alcoholismo y la deficiencia de glucosa 6 fosfatasa (glucogenosis tipo 1ª).
Figura Nº Degradación de nucleótidos púricos en el hombre
ACIDO URICO
AMP
IMP
INOSINA Purinoribonucleósido
 ADENOSINA 
 HIPOXANTINA
XANTINA
XANTINA OXIDASA
XANTINA OXIDASA
ADA
Pi
Ribosa 5 P
AMP Desaminasa
5’ Nucleotidasa
Fosforilasa
N
N
H N
N
H
H
H
O
O
O
EXPERIMENTO 1 
DETERMINACION DEL ACIDO URICO
Fundamento.
El ácido úrico es hidrolizado por la uricasa para rendir alantoína y peróxido de hidrógeno. Este último es quien desarrolla color en presencia de un reactivo cromógeno ( ácido 3, 5 - Dicloro-2-hidroxibenzo sulfónico con 4 - aminofenazona ).
ACIDO URICO
ALANTOINA
H2O2
H2O
Reactivo cromogénico
COMPLEJO DE COLOR
+
Uricasa
Peroxidasa
 
Se entiende que la intensidad del color del complejo es directamente proporcional a la concentración de ácido úrico en la muestra (suero, orina, etc.)
Procedimiento.
1. Para preparar la solución reactiva colocar todo el contenido del frasco (mezcla enzimática) dentro del vial 2 (solución tampón) y mezclar suavemente hasta que se disuelva.
2. Teniendo en cuenta que la solución estándar viene lista para su uso, mida en dos tubos de ensayo lo siguiente:
	REACTIVOS
	M
	Est
	Suero o plasma heparinizado o con EDTA
	50 μl
	-----
	Solución estándar
	-----
	50 μl
	Solución reactiva
	2 ml
	2 ml
3. Mezclar bien e incubar por 5 minutos a 37 ºC.
4. Medir las absorbancias de la muestra y del estándar frente al blanco de reactivo, teniendo en cuenta que las absorbancias permanecen estables por 45 minutos .
Expresión de Resultados y Cálculos (Vyctoria)
Complete lo siguiente:
Absorbancia de la muestra (M) 0.441 
Absorbancia del estándar (Est) 0.281 
Teniendo en cuenta que la concentración del estándar es de 10 mg % . estimar el Factor de calibración y completar: 
Expresar la concentración del ácido úrico sérico en:
 
Interpretación de los resultados.
Valores de Referencia (Normales).
· Hombres 3.4 a 7.0 mg % ( 200 – 420 μmoles / litro )
· Mujeres 2.4 a 5.7 mg % ( 144 – 300 μmoles / litro 
Según los valores de referencia dados, los valores obtenidos en la muestra exceden los valores normales en mg% (15,7) y en μmoles / litro (934,52), tanto para el rango normal de mujeres como para el de varones. Esto indica que el paciente de la muestra estaría sufriendo de hiperuricemia, es decir, un aumento de la concentración de ácido úrico. 
TALLER 
CUESTIONARIO
1. Expresar la concentración del ácido úrico del paciente del caso clínico 1, en mg% (PM del ácido: 168). (Paola)
2. La concentración intracelular del PRPP es normalmente es de 10-5 a 10-6 mol/L. La determinación de la KM de la fosforribosil pirofosfato amidotransferasa para PRPP en un paciente gotoso dio un valor de 2 x 10-5 M, en comparación con un control normal cuyo valor resultó 3 x 10-4 M. Utilizando estos datos proponga el mecanismo que explicaría la hiperuricemia del paciente. (Vyctoria)
Según los datos brindados, el valor de Km en el paciente gotoso es menor que la del paciente normal, y, sabiendo que, a un valor menor de Km indica que hay mayor afinidad entre la enzima y el sustrato, es decir, mayor actividad enzimática, se puede decir que la enzima PRPP amidotransferasa está hiperactiva y por eso sigue convirtiendo el PRPP en fosforribosilamina hasta AMP y GMP, lo que después es degradado hasta ácido úrico y por ello el aumento de su concentración. Los problemas en la regulación de la vía se generan por varias razones, y una de ellas puede ser la resistencia de la PRPP sinteasa u otra enzima reguladora a su inhibición por retroalimentación. Sería el caso en que sus metabolitos reguladores, como el GMP, AMP e IMP en el caso de la PRPP sintasa, que normalmente se unen a la enzima y la inactivan, por algún cambio en la estructura de la misma, no se pueden unir y por lo tanto sigue aumentando la síntesis de nucleótidos púricos.
3. Para determinar si una persona con gota ha desarrollado su enfermedad por una sobreproducción de ácido úrico o a causa de una disminución en su capacidad de excretarlo, se hace con frecuencia la prueba de la administración oral de un aminoácido radioactivo. ¿Qué aminoácido sería el más apropiado y cómo se procesaría dicha prueba?(Grecia) 
El aminoácido más apropiado sería la glicina por esta razón, se recomienda un análisis de sangre para medir los niveles de ácido úrico y creatinina en la sangre, pero estos análisis de sangre pueden ser confusos. Algunas personas tienen niveles de ácido úrico elevados, pero nunca tienen gota. Y algunas personas tienen signos y síntomas de gota, pero no tienen niveles inusuales de ácido úrico en la sangre. (1)
4. ¿Qué alimentos por su alto contenido en purinas deben ser excluidos de la dieta del paciente gotoso? Es suficiente este tipo de tratamiento para normalizar los valores séricos de ácido úrico en los pacientes gotosos? (Daniela)
Los pacientes gotosos tienen que evitar las carnes como el hígado, el riñón y las mollejas, que tienen un alto contenido de purinas y contribuyen al aumento de los niveles de ácido úrico en sangre, al igual que limita el tamaño de las porciones de carne de vaca, cordero y cerdo, algunos tipos de mariscos, como las anchoas, los moluscos, las sardinas y el atún, tienen mayor contenido de purinas que otros tipos; Sin embargo, los beneficios generales para la salud de comer pescado pueden superar los riesgos para las personas con gota. En una dietapara la gota se pueden incluir porciones moderadas de pescado.
Para poder seguir una dieta para los pacientes que sufren de gota puede ayudar a limitar la producción de ácido úrico y aumentar su eliminación, es probable que hacer una dieta no sea suficiente para bajar la concentración de ácido úrico en la sangre a fin de tratar la gota sin medicamento, la dieta puede ayudar a disminuir la cantidad de ataques y moderar su gravedad. (2)
5. Explicar la hiperuricemia de los pacientes con el síndrome de Lesch-Nyhan. Proponga alguna explicación sobre la causa de las alteraciones neurológicas que estos pacientes presentan.(Daniela)
El síndrome de Lesch-Nyhan es un trastorno hereditario, afecta la forma como el cuerpo produce y descompone las purinas que son una parte normal del tejido humano y ayudan a conformar la constitución genética del cuerpo, pueden encontrarse también se encuentran en muchos alimentos diferentes, El síndrome de Lesch-Nyhan se transmite como un rasgo ligado al sexo, o un rasgo ligado al cromosoma X, y en su mayoría se presenta en niños varones. Las personas con este síndrome no tienen o tienen muy poca cantidad de una enzima llamada hipoxantina guanina fosforribosiltransferasa (HPRT) , una sustancia que el cuerpo necesita para reciclar las purinas, si no existiera estas se acumulan en el cuerpo niveles anormalmente altos de ácido úrico. (3)
6. Explicar la hiperuricemia que se encuentra frecuentemente asociada a: (Grecia) 
a) La deficiencia de glucosa 6 fosfatasa (Enfermedad de Von Gierke)
La enfermedad de Von Gierke o déficit de glucosa 6 fosfatasa o glucogenosis de tipo Ia, o glucogenosis hepatorrenal, es una enfermedad metabólica rara hereditaria, incluida dentro de los errores innatos del metabolismo, que pertenece al grupo de las glucogenosis, enfermedades producidas por depósito o acúmulo de glucógeno (sustancia que se forma en el organismo para almacenar la energía que proviene de los hidratos de carbono). En este caso, la mayor disponibilidad en glucosa-6-P aumenta la tasa de flujo hacia la vía de las pentosas fosfato, esto hace aumentar los niveles de ribosa-5-P y, en consecuencia, de PRPP y este incremento se traduce en una mayor síntesis de purinas. (4) 
b) La hiperactividad de la glutatión reductasa.
La glutatión reductasa es una flavoenzima dependiente del nicotinamín adenín dinucleótido fosfato reducido (NADPH) que cataliza la reducción del glutatión oxidado (GSSG) a glutatión reducido (GSH) el cual será utilizado por la glutatión peroxidasa (GPx) para la reducción del peróxido de hidrógeno (H2O2) y de lipoperóxidos (L-OOH), los cuales son elementos tóxicos. Es decir, específicamente tiene una función de pivoteo en el estrés oxidativo. Esta se encuentra en todos los organismos aeróbicos así como en algunas plantas superiores por lo que aparenta ser una enzima casi universal. La GRd permite mantener concentraciones de GSH en la célula no sólo para ser utilizado por la GPx en la eliminación del H2O2; este GSH es de utilidad en la recuperación de las vitaminas C (ácido ascórbico) y E (alfa-tocoferol) luego de participar en la eliminación de radicales libres generados in situ o a distancia. (5)
7. ¿Cómo actúa el alopurinol en el tratamiento de la gota? ¿Por qué se señala que el alopurinol es un inhibidor suicida? (Paola)
El alopurinol es un análogo estructural de la base natural de purina: la hipoxantina. Después de la ingestión, el alopurinol actúa como un sustrato “suicida”, uniéndose al centro activo como si fuera el sustrato. Posteriormente, se produce la oxidación del alopurinol a 2‐hidroxialopurinol, también llamado aloxantina u oxipurinol, por la propia enzima diana de la inhibición (6).
El alopurinol y su metabolito activo inhiben la xantina oxidasa, la enzima que convierte la hipoxantina en xantina y la xantina en ácido úrico. La inhibición de esta enzima es responsable de los efectos del alopurinol. Asimismo, este medicamento aumenta la reutilización de la hipoxantina y la xantina para la síntesis de nucleotidos y acidos nucleicos mediante un proceso que involucra la enzima hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (HGPRTasa). Este proceso resulta en un aumento de la concentración de nucleótidos, lo que causa la inhibición de la retroalimentación de las biosintesis de purinas de novo. El resultado final es una disminución de las concentraciones de orina y ácido urico serico, lo que disminuye la incidencia de síntomas de gota (7). 
8. ¿Cuál es el mecanismo de acción de la colchicina en el tratamiento de la gota? ¿En qué momento se usa? (Valentina)
La colchicina ejerce su acción principalmente a través de la inhibición de la polimerización de los microtúbulos del citoesqueleto celular. Por su capacidad de asociarse a la tubulina, proteína microtubular, la colchicina interrumpe así la polimerización de los microtúbulos y esto afecta a una variedad de procesos esenciales celulares que incluyen formación del huso mitótico, el mantenimiento de la forma, señalización, división, migración y transporte celular. 
La colchicina se usa para prevenir los ataques de gota como el dolor repentino e intenso en una o más articulaciones, causado por niveles anormalmente altos de una sustancia de ácido úrico en la sangre. 
9. ¿Cómo se explica que los cristales de ácido úrico en el líquido articular de los gotosos corresponda a urato monosódico, en cambio en la orina de los mismos pacientes los cristales sean frecuentemente de ácido úrico solamente? ¿Podría encontrarse en estos pacientes, cristales de urato disódico en algún lugar del organismo? (Paola)
A pH fisiológico (7,4) el ácido úrico es un ácido débil con un pKa de 5.8 y existe mayormente como urato, la sal del ácido úrico (urato monosódico). Asimismo, debido al pH ácido de la orina (5-5,5), el ácido úrico tiende a encontrarse en forma ácida, muy poco soluble (8). Por otro lado, los uratos disódicos no son comunes de encontrar en el líquido sinovial, debido a que son más solubles que los uratos monosódicos, ya que estos poseen una carga mayor. 
10. ¿Por qué mecanismo (s) el alcoholismo puede determinar hiperuricemia? (Valentina)
El alcohol ocasiona hiperuricemia, se convierte en ácido láctico que reduce la excreción renal de ácido úrico inhibiendo competitivamente la secreción de ácido úrico.
El alcohol incrementa la producción de purinas y de ácido úrico, así acelerando la degradación de ATP a adenosina monofosfato, un precursor de ácido úrico.
En el caso de la ingesta de Cerveza eleva los índices de uricemia más aun que otras bebidas alcohólicas por su alto contenido en guanosina.
11. ¿Qué explicación puede dar a los resultados mostrados en el electroforetograma de las isoenzimas de ADA en el caso clínico 2?. Teniendo en cuenta que en los hematíes hay una gran cantidad de proteínas, cómo se puede mediante la técnica utilizada,detectar solamente las dos isoenzimas más importantes de la Adenosina Desaminasa? (Daniela)
Según los resultados presentados por el espectrofotométrica de la actividad importante de ADA, la niña no presenta coloración cosa que comparándolo con un control normal se puede encontrar una deficiencia en el electroferograma de isoenzimas de ADA luego de su tinción para medir su actividad la niña deficiente de ADA, para luego determinar los niveles de desoxinucleótidos de adenina en los eritrocitos detectados en la niña, cosa que no es normal, ya que se pudo comparar con los de un paciente normal. 
12. ¿Cómo se explica la linfopenia del paciente del caso clínico 2 y los continuos cuadros de infección respiratoria que presentó? (Grecia)
La niña tenía una alteración en el catabolismo de purinas y la enfermedad es: Inmunodeficiencia Severa Combinada (SCID) donde la enzima afectada es la Adenosina
Desaminasa ADA que provoca una deficiencia en el desarrollo de linfocitos T y C, y por eso padecía de Linfopenia (números bajos de linfocitos en la sangre) afectando así la respuesta inmunológica y en consecuencia, los distintos cuadros infecciosos.
13. Que evidencia (s) existe (n) que los altos niveles dedATP en los pacientes con deficiencia de ADA sean los que inhiban a la Ribonucleótido Reductasa y determinen menor síntesis de ADN y con ello el daño a los linfocitos? (Vyctoria)
Una deficiencia de ADA, indica que se acumula el sustrato, en este caso, la adenosina, y ante el bloqueo, el sustrato se dirige hacia otras vías como la fosforolisis hasta ATP o volver a formar parte de un nucleótido como el AMP; en ese caso, las cantidades de dATP aumentan, lo que inhibe a la ribonucleótido reductasa debido a su regulación alostérica. Según fuentes e investigaciones, la enzima está estructurada por dos subunidades: la R1 y la R2. En la R1 se encuentra el sitio catalítico y dos sitios de unión sujetadas a efectos alostéricos que determinan la actividad de la enzima y su preferencia con el sustrato, manteniendo el balance de sus productos por un mecanismo de feedback entre el sitio especificidad (sitio S) y el sitio de actividad (sitio A). En este sentido, se sabe que el sitio A se encuentra sujeto a la proporción de dATP (inhibidor), y ATP (activador), y, cuando los niveles de dATP son elevados, existe una mayor afinidad con el sitio A, por lo que se une más fácilmente e inhibe a la enzima. (9) Así, la síntesis de DNA se vería afectada y retardada, evitando la maduración de los linfocitos T y por lo tanto, a una mayor exposición y sensibilidad a las bacterias y/o virus, incluso los más comunes, ya que el sistema inmunológico no está totalmente desarrollado. 
14. De qué manera se ven afectadas las reacciones con deficiencia de ADA. Utilice en su explicación el siguiente esquema.(Valentina)
METIONINA
S- ADENOSILMETIONINA (SAM)
S-ADENOSILHOMOCISTEINA (SAH)
Metil Transferasa
ADENOSINA
HOMOCISTEINA
Hidrolasa
X
X – CH3
En el esquema se muestra que a partir de la metionina es convertida a SAM por la metionina adenosiltransferasa, que hace la función de donante en muchas reacciones de transferencia de metilos y es convertido en SAH luego de ser atacada por una la enzima hidrolasa dando homocisteína y adenosina. Un destino de la homocisteína puede volver a generar metionina, en cambio en la adenosina si esta reacción no tiene un desarrollo adecuado tendrá una deficiencia en la enzima adenosina desaminasa (ADA), es un desorden en el metabolismo de las purinas que conduce a una inmunodeficiencia ,la falta de la actividad enzimática produce la acumulación de metabolismo tóxicos que afecta la función de los linfocitos y alteraciones en el organismo.
REFERENCIAS
1. Mayoclinic.org. [citado el 8 de noviembre de 2021]. Disponible en: https://www.mayoclinic.org/es-es/diseases-conditions/gout/diagnosis-treatment/drc-20372903 
2. ¿Pueden los alimentos que ingieres ayudar a controlar la gota? (2018). Retrieved November 10, 2021, from Mayo Clinic website: https://www.mayoclinic.org/es-es/healthy-lifestyle/nutrition-and-healthy-eating/in-depth/gout-diet/art-20048524
3. Síndrome de Lesch-Nyhan: MedlinePlus enciclopedia médica. (2020). Retrieved November 10, 2021, from Medlineplus.gov website: https://medlineplus.gov/spanish/ency/article/001655.htm.
4. Enfermedades-raras.org. [citado el 8 de noviembre de 2021]. Disponible en: https://enfermedades-raras.org/index.php?option=com_content&view=article&id=1008&Itemid=171#:~:text=La%20enfermedad%20de%20Von%20Gierke,por%20dep%C3%B3sito%20o%20ac%C3%BAmulo%20de 
5. Sld.cu. [citado el 8 de noviembre de 2021]. Disponible en: http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0864-03001995000100003 
6. Inhibidores enzimáticos como fármacos con interés biomédico [Internet]. Usal.es. [citado el 4 de noviembre de 2021]. Disponible en: https://gredos.usal.es/bitstream/handle/10366/139416/InhibidoresEnzimaticos_def.pdf;jsessionid=90BB3AF40D38BCDDA6BF807203253BDE?sequence=1 
7. Allopurinol [Internet]. DrugBank. [citado el 4 de noviembre de 2021]; Disponible en: https://go.drugbank.com/drugs/DB00437 
8. Mendoza M. Nivel de ácido úrico en pacientes con diabetes mellitus tipo 2: un estudio de casos y controles en pacientes del programa de diabetes e hipertensión del Hospital Hipólito Unanue de Tacna en el año 2019 [Internet]. [Tacna]: Universidad Nacional Jorge Basadre Grohmann; 2020. Disponible en: http://repositorio.unjbg.edu.pe/bitstream/handle/UNJBG/4011/1762_2020_mendoza_japura_mv_facs_medicina_humana.pdf?sequence=1&isAllowed=y 
9. DEPARTAMENT DE BIOQUÍMICA I BIOLOGIA MOLECULAR Programa Oficial de Postgrau en Biotecnología [Internet]. 2013. Available from: https://core.ac.uk/download/pdf/71008968.pdf