practica extraccion de ADN por choque termico

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Practica: Extracción de ADN por choque térmico 
Asignatura: Técnicas Moleculares 
Licenciatura en QFBT 
Periodo 2022-2 
Docente: José De Jesús Rubio Bahena 
Integrantes: Cesia Carolina Castillo Izaguirre 
Fecha de entrega: 29/08/2022 
Investigación Previa: 
Técnicas de extracción de ADN Incubación del lisado para su uso: 
Una posible forma de aislar el ADN genómico es incubar el lisado crudo a temperaturas 
entre 90 – 100 ºC y luego usarlo directamente. Es evidente que mediante este método el 
ADN obtenido es de muy baja pureza y con aplicaciones muy reducidas. 
Otra desventaja de este método son las pérdidas de ADN por acción de las nucleasas y 
otros componentes de los orgánulos que están en contacto con el ADN y pueden 
destruirlo, por lo que no es útil para almacenar el ADN pues los contaminantes pueden 
degradar las moléculas de ADN. 
Lisis por ruptura mecánica y extracción con disolventes orgánicos 
Si se opta por realizar el lisado de las células mediante un proceso mecánico hay que tener 
en cuenta la posibilidad de ruptura de las moléculas de ADN que se intentan separar, por 
lo que este debe bastar para lograr la lisis de las células pero no ser muy agresivo para 
proteger el ADN. Este método puede ser usado para extraer ADN de material crudo, 
liofilizado o congelado, que puede romperse con un mortero, por congelación-
descongelación o usando ultrasonidos. 
Este método se puede usar para moléculas de ADN de alto peso molecular, obteniendo 
buenos rendimientos de moléculas relativamente puras, siempre teniendo en cuenta que 
hay que controlar el pH de la fase acuosa y la concentración de sales, que son los factores 
que aseguran una buena separación. 
Lisado y purificación con un detergente iónico. Método del CTAB 
 Este es un procedimiento básico para extraer ADN de vegetales, donde un detergente 
aniónico puede romper la pared celular y así se produce la lisis de las células. El uso de 
detergentes aniónicos no solo se restringe a la extracción de ADN vegetal, puede ser 
usado para ADN genómico de bacterias y otros tipos de organismos. El CTAB además, en 
presencia de EDTA como agente quelatante y TRIS-HCl como tampón, forma complejos 
insolubles con el ADN. Luego se extraen los residuos orgánicos con cloroformo, para 
separar posteriormente el ADN por precipitación con etanol. 
Método de salting-out 
 A partir de un lisado celular se pueden separar las moléculas de proteínas y otros 
contaminantes del ADN mediante la adición de altas concentraciones de sal que hacen 
que disminuya la solubilidad de las moléculas orgánicas en la fase acuosa. 
 En este método se utiliza frecuentemente la proteinasa K, el TRIS-HCl para regular el pH y 
otros reactivos químicos que aseguren la total inactivación de las enzimas que pueden 
actuar sobre las moléculas de ADN. Para la extracción se utilizan sales inorgánicas como el 
perclorato de sodio y el cloruro de sodio en concentraciones muy altas que hacen 
precipitar a las moléculas orgánicas. El precipitado formado se separa por centrifugacón y 
luego se puede extraer el ADN de la disolución acuosa mediante la adición de alcohol, por 
precipitación. 
Uso de la proteinasa K y el dodecilsulfato de sodio 
 El procedimiento conocido como PK-SDS por sus siglas en inglés proteinase K - sodium 
dodecyl sulfate, es uno de los más usados para la extracción de ADN ya que la digestión de 
la muestra se puede realizar con proteinasa K que es activada por el dodecil sulfato de 
sodio. La proteinasa K inactiva las DNAsas presentes en el lisado celular usando 
detergente aniónico el SDS. La proteinasa K también es usada en otros de los métodos 
descritos en este artículo para la digestión de las proteínas y otros contaminantes del 
lisado celular. 
Método de extracción de ADN con yoduro de sodio como agente caotrópico en un único 
tubo 
La compañía Wako pone a disposición de los investigadores y empresas varios kit de ADN 
que usan yoduro de sodio como agente caotrópico, que tienen la ventaja de que la 
extracción se realiza en un único micro tubo de centrifugado. El yoduro de sodio además 
de provocar la lisis celular rompe la capa de hidratación que rodea el ADN y logra que las 
cargas negativas de los grupos fosfatos del ADN queden más expuestas. 
Diagrama de flujo 
 
 
 Hipótesis 
Mediante la metodología presentada demostrar la extracción de ADN de un cultivo 
bacteriano. 
Materiales 
 Centrifuga 
 Pipeta 
 Asa bacteriológica 
 hielo 
 puntillas para pipeta automatizada 
 agua destilada 
 tubos ependorf 
 cultivo bacteriano en agar LB o nutritivo 
 
 
Metodología 
1. Suspender de 2 a 3 colonias en 100uL de agua miliQ estéril en tubos de 1.5 uL 
2. Incubar en termoblock a 96°C por 10 min 
3. Inmediatamente colocar hielo a una temperatura de 4°C 
4. Triplicar los pasos 1 al 3 por 3 ciclos 
5. Centrifugar a 14000 rpm por 5 min 
6. Tomar 200uL del sobrenadante y resuspender en 80 uL de agua MiliQ 
7. Anotar lo observado 
 Observaciones 
 Después que se centrifugo a 14000rpm se pudo observar la presencia de dos fases 
la organica y la acuosa 
 El botón se observó en el fondo del tubo ependorf 
Resultados 
 
 
 
Conclusiones 
Se pudo observar que la extracción de ADN bacteriano fue exitosa puesto que se observó 
el botón en el sobrenadante del tubo. Por otro lado no hubo ningún problema con el 
manejo de las muestras y el protocolo de extracción. 
Cuestionario 
1.-en qué se basa la extracción de ADN por choque térmico? 
El calentar un tubo con colonias bacterianas y enfriarlo inmediatamente para producir una 
colisión térmico que actúa como lisis de el muro celular de las bacterias y de esta forma 
lograr tener el ADN bacteriano de una manera mas fácil, empero no tan puro. 
2.-En qué condiciones deben estar los reactivos? 
A) en condiciones de Esterilidad 
B) sin haber pasado su fecha de caducidad 
C) Libres de ADNasa y ARN asa 
D) Todos son correctos 
3.- Que desventaja presenta? 
A) el ADN de extraído no es puro 
B) El ADN extraído se degrada facilmente. 
C)el ADN tiene un alto grado de pureza 
D) a y b Son correctas 
4.- Se podría purificar el ADN extraído in solubilizándolo con etanol? 
A) si 
B)no 
C) no se puede determinar 
5.- el Cultivo bacteriano debe ser? 
A) Pur o 
B) Mixto 
C) Puede estar contaminado con hongos 
D) ninguna de las anteriores 
Bibliografias 
 Fraga Nodarse, Jorge, Rodríguez, Jinnay, Fuentes, Omar, Castex, Mayda, & Fernández-
Calienes, Aymé. (2004). Comparación entre 5 métodos para la extracción de ADN de 
Triatomíneos: su utilización en la técnica de ADN polimórfico amplificado al azar 
(RAPD). Revista Cubana de Medicina Tropical, 56(3), 203-207. Recuperado en 29 de 
agosto de 2022, de http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0375-
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https://www.wakolatinamerica.com/blog-reactivos/noticias-wako/post/10-metodos-de-extraccion-
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Fecha de consulta: Agosto 29, 2022 
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https://conogasi.org/articulos/extraccion-de-adn/ 
 Guevara-Vega, M., Vertel-Morinson, M., & Paternina, L. E. (2019). Comparación de tres 
métodos de extracción de ADN a partir de garrapatas duras (Acari: Ixodidae). Revista U.D.C.A 
Actualidad & Divulgación Científica, 22(1). https://doi.org/10.31910/rudca.v22.n1.2019.1208 
 
 
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https://doi.org/10.31910/rudca.v22.n1.2019.1208