537682563-08-27-22h-Produccion-Biologica-de-Hidrogeno-Por-Fermentacion-Oscura

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Universidad Nacional Mayor de San Marcos
(Universidad del Perú, Decana de América)
Escuela de Ingeniería Química – 07.2
Departamento Académico de Procesos
Proyecto de investigación
PRODUCCIÓN BIOLÓGICA DE HIDRÓGENO por fermentación oscura PARA SU USO COMO COMBUSTIBLE en automóviles
Integrantes: 	Cruz Lozano Milagros María 
Garay Calderón Fiorella Joanne 
Revilla Orbegozo Diana Sofía 
Vega Mamani Omar Aldo 
Docente:	Ing. Cornejo Sánchez Óscar Alberto
Agosto de 2020
1. INTRODUCCIÓN
Para comprender la importancia y el alcance que llegará a tener el hidrógeno en la industria automotriz durante los próximos años, se debe analizar los grandes problemas que presentan la mayoría de países debido a la emisión de gases provocado por los vehículos, el cual se basa fundamentalmente en los combustibles fósiles los cuales han desencadenado una gran contaminación. Estos son recursos finitos y se tiene conocimiento que los automóviles representan el 73% de las emisiones de CO2 provocadas por el sector transporte. Además, a nivel global, el sector transporte es la fuente de emisiones de mayor crecimiento, con aumento proyectado de 70 por ciento al 2050 en base al 2010 (Vergara et al., 2015).
2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
2.1. JUSTIFICACIONES
2.1.1. La producción biológica de hidrógeno como combustible para automóviles representa una alternativa prometedora e innovadora contrastándola con las vías tradicionales, ya que es una opción renovable, sostenible y limpia.
2.1.2. El método elegido, a comparación de otros, como producción de hidrógeno mediante métodos electroquímicos, termina siendo mucho menos costoso.
2.1.3. Esta alternativa conlleva un plan sostenible, donde las bacterias inmersas en la producción de hidrógeno, lo hacen mediante procesos de reciclaje de residuos precedentes de la agricultura o de la industria alimentaria.
2.1.4. Al contrario de la producción de hidrógeno producido a partir de un combustible fósil, el hidrógeno producido fotosintéticamente es una energía de carácter renovable.
2.1.5. En esta opción, la actividad fotosintética está ligada a la captura de CO2 que se incorpora en la biomasa, siendo sumamente beneficiosa.
2.1.6. Diferenciado de las alternativas convencionales, la producción biológica de hidrógeno tiene como producto final de su combustión agua, en lugar de gases de carbono, azufre o nitrógeno, que son contaminantes y tóxicos.
2.1.7. El hidrógeno biológico producido por este método, tendría aplicación directa en síntesis industrial de amonio, que consume 45% de hidrógeno obtenido a partir de hidrocarburos fósiles.
2.2. OBJETIVOS
2.2.1. OBJETIVO GENERAL
Producción biológica de Hidrógeno mediante fermentación oscura para su uso como combustible en automóviles.
2.2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
2.2.2.1. Promover el desarrollo de investigación de producción biológica de hidrógeno en América Latina dada su condición dependiente al combustible fósil.
2.2.2.2. Reducción de costos energéticos, métodos alternativos de obtención como la fermentación y reducción de la contaminación producida durante su obtención.
2.3. IDENTIFICACIÓN DEL PROBLEMA
Los automóviles han contribuido con la contaminación atmosférica y acelerado el calentamiento global. Cuando hablamos de consecuencias ambientales, los vehículos representan un porcentaje muy elevado del impacto negativo hacia el medio ambiente debido al uso de combustibles hechos a base de hidrocarburos y petróleos en los automotores. De manera que, la combustión en los motores genera emisiones de partículas y gases contaminantes. 
Por el contrario, el hidrógeno es una fuente de energía limpia ya que la combustión de este elemento solo emite vapor de agua. Sin embargo, uno de los inconvenientes es la obtención de hidrógeno como elemento aislado. Por ello, en la presente investigación se estudia la fermentación oscura de microorganismos como una opción prometedora de producción de hidrogeno debido a su carácter renovable. Así pues, a través de este método biológico se pretende obtener hidrógeno para su uso como combustible y como consecuencia reducir las emisiones de elementos contaminantes.
3. ANTECEDENTES DEL ESTUDIO:
La producción biológica de hidrógeno, con el fin de ser usado como combustible, se ha presentado como una gran oportunidad de reducir la contaminación. Montagne (2015) nos confirma que el uso del hidrógeno en un motor de combustión, solo presenta agua como producto de la reacción; pequeñas cantidades de óxidos de nitrógeno (NOx) debido a la reacción del O2 y N2 en el aire; y lo mejor, cero emisión de CO2 (Montagne, 2015).
A nivel biológico existen diferentes puntos de estudio, pues el proceso se puede ver afectado tanto por las condiciones de reacción, como por la influencia de reactivos de alimentación o productos. Es así como Seijas, Seijas V. & Seijas B. (2012) realizaron un estudio para determinar la influencia del CO2 y los ciclos de fotoperiodo en un fotobiorreactor solar donde se empleó la microalga Arthrospira “espirulina” a condiciones anaeróbicas; y se observó que a medida que aumenta la concentración de CO2 y los ciclos de fotoperiodo, existe una disminución de la producción de H2 en el medio. La mayor producción de biohidrógeno fue de 1.78 ml de H2 /mg.h siendo los parámetros óptimos del sistema: fotoperiodo 8/16 h y concentración de CO2 de 0.15% v/v (Seijas et al., 2012).
La producción biológica también puede depender del tipo de reactor o sustrato utilizado. La producción anaerobia de hidrógeno según Fernández (2018) se puede llevar en biorreactores del tipo batch, y mediante el uso de Polietileno Tereftalato (PET), cuya degradación química sirve como fuente de hidrógeno. Sin embargo; los resultados no fueron favorables; pues la producción del biogás fue mínima llegando a 15 mL, volumen que no puede ser analizado por cromatografía de gases (CG). A pesar de esto, si se pudo analizar los medios de cultivo mediante CG acoplado a espectrofotometría de masas, encontrando compuestos orgánicos como el Octanal, pivalato y β-sitosterol, los cuales presentan actividad antimicrobiana que explica la baja tasa de producción de hidrógeno (Fernández, 2018).
Otro tipo de reactores de operación continua como el reactor UASB (en español: reactor anaeróbico de flujo ascendente) han sido evaluados junto a inóculos provenientes de lodos activados para producir hidrógeno a partir de la fermentación. Sin embargo, la producción continua de hidrógeno en el reactor con recirculación muestra un potencial aún no alcanzado, es decir, podría incrementarse hasta el orden de cuatro veces la producción promedio obtenida si se incrementa el tiempo de residencia en el reactor, de manera que se asegure la calidad de la recirculación. (Morales et al., 2014, p. 65). Se tiene la producción neta promedio de hidrógeno, expresada en mL/día (54 a 67 mL/día).
El origen de los inóculos también es partícipe en su elección para uso en la producción de hidrógeno. Vera, Moreno & García (2015) demostraron esto, comparando inóculos provenientes de una planta de tratamiento de una industria cervecera (Inóculo A) y una planta de tratamiento de aguas residuales domésticas (Inóculo B); quienes pasaron por un pretratamiento de choque térmico y se usó un sustrato de glucosa al 5% enriquecido con medio mineral. Los reactores del Inóculo A gene­raron un acumulado de 128.27 mL de biohidrógeno, 12 veces mayor que los del Inóculo B (9.11 mL), con productividades de 85.52 mL y 6.07 mL de H2/L reactor/d respec­tivamente, lo que se atribuye a las cantidades de microorganis­mos presentes en los inóculos comparados (Vera et al., 2015).
Otros estudios tuvieron como objetivo utilizar un reactor anaeróbico de lecho fluidizado (AFBR) a temperatura ambiente para producir hidrógeno a partir de melaza de caña de azúcar. Carneiro (2018) toma como fuente de microorganismos, lodos recolectados de un reactor de manta de lodos (UASB) utilizado en una planta de tratamiento de aguas residuales. Estos se analizaron a diferentes tiempos de retención. La tasa máxima de producción de hidrógenofue de 1.44 L H2 /L-1 reactor.h-1 a un tiempo de retención de 4h; mientras que el mayor rendimiento fue de 3.07 mol H2/ mol glucosa a un tiempo de retención de 6 h (Carneiro, 2018). 
Diversos estudios han indicado que el proceso de fermentación oscura es el más eficiente y sostenible; sin embargo, este proceso también presenta cierta inestabilidad. Braga (2017) nos indica que el desafío de este proceso es la selección de bacterias productoras de hidrógeno, pues se plantea que la inestabilidad del proceso se puede deber a la presencia de bacterias lácticas que compiten por el sustrato y/o bacterias que consumen hidrógeno. El proceso se llevó a cabo en un reactor CSTR donde se obtuvo un rendimiento de 0.65 mol H2/ mol glucosa. Además se presentó una operación inestable debido a la dispersión de datos de velocidad de producción y rendimiento, detectando que hubo consumo de hidrógeno por homoacetogénesis en las operaciones con tiempos de residencia de 6 y 10 h (Braga, 2017).
4. MARCO TEÓRICO
4.1. Bioquímica de la producción Biológica del Hidrógeno
El entendimiento de los fundamentos moleculares de la producción de hidrógeno es fundamental para su investigación aplicada.
La producción biológica de hidrógeno se debe principalmente a la presencia en las células de enzimas como la hidrogenasa y la nitrogenasa. La hidrogenasa está ampliamente distribuida en los microorganismos anaeróbicos. Ésta tiene diversos orígenes filogenéticos y produce el hidrógeno tanto irreversible como reversiblemente, dependiendo de las condiciones medioambientales en las que se encuentre, siendo reversible sólo en condiciones de anaerobiosis estricta (Vignais et al., 2006). Esta enzima se ha clasificado en tres grupos principales: Fe-hidrogenasa, Ni-Fe-hidrogenasa e hidrogenasa libre de metales (Franchi, et al., 2004; Dutta, et al., 2005; Gutekunst et al., 2006). La Fe-hidrogenasa, una de las más conocidas, tiene como función remover los equivalentes (H+) excesivos en los anaerobios estrictos y puede ser inhibida por la presencia de oxígeno o por altas concentraciones de su producto hidrógeno. Se sabe que la reacción catalizada por la hidrogenasa tiene la forma:
H2 ↔ 2H+ + 2e- (1)
La nitrogenasa está presente en gran cantidad de microorganismos fijadores de nitrógeno, puede producir hidrógeno en una reacción irreversible de forma continua, incluso con saturación de producto (atmósfera al 100% H2). Esta enzima es empleada para reducir el N2 a NH3; sin embargo, cuando hay ausencia de N2, reduce los H+ a hidrógeno consumiendo 4 moles de ATP. Se ha encontrado que además del N2, el O2 y el NH4 + pueden inhibirla (Kovács et al., 2004, 2006).
N2 + 8H+ +8e- +16ATP → 	2NH3 + H2O +16ADP + 16Pi (2)
Se han realizado numerosos estudios a nivel molecular con estas enzimas para el mejoramiento de la producción de hidrógeno. Además, se han llevado a cabo estudios estequiométricos en diversos microorganismos, con el fin de aclarar las vías metabólicas utilizadas en la producción de hidrógeno. Es común el estudio en especies del género Clostridium para determinar los rendimientos máximos teóricos de la conversión de glucosa en hidrógeno en condiciones anaerobias.
4.2. Producción Biológica del Hidrógeno
Las vías de producción de hidrógeno tienen como fuentes primarias de energías renovables, a la biomasa, residuos, así como a la energía geotérmica, solar, hidráulica y eólica. Dentro de la fuente de biomasa, la obtención de hidrógeno se puede realizar por procesos de metabolismo y fermentación, gasificación y pirolisis.
Figura 1. Vías de producción general de hidrógeno a partir de biomasa (elaboración propia).
Para nuestro estudio y planteamiento de producción biológica de hidrógeno, se revisará los principales métodos: biofotólisis, fotofermentación y fermentación oscura.
Figura 2. Mapa conceptual comparativo de métodos para producción de biohidrógeno (elaboración propia).
4.2.1. BIOFOTÓLISIS
4.2.1.1. BIOFOTÓLISIS DIRECTA
Lo expuesto por Ghirardi (2000), a partir de luz solar y agua, se genera un proceso fotosintético de producción de hidrógeno y oxígeno realizado por algas verdes.
2H2O luz→ 2H2(g) + O2(g)
Inicialmente, la célula desarrolla aeróbicamente (origina O2 por fotosíntesis y acumula carbono como biomasa). Después, en el segundo ciclo anaerobio, las algas agotan metabolitos celulares y generan H2. La escisión de estas etapas, inicia cuando se despoja a las células de nutriente azufre inorgánico por 2 o 3 días; obligando a la célula a gastar sus metabolitos, pues reduce la síntesis de proteínas. El fotosistema II (PSII) se reestablece constantemente en el cloroplasto y esta privación hace que este ciclo de reparación se suspenda (Ghirardi et al., 2000). Así, según Melis (2000) el alga sólo puede emplear el PSI para generar ATP, ya que la respiración no es posible en el ambiente anaerobio y la fotosíntesis tampoco pues carece de PSII. Los electrones proceden de sustratos orgánicos celulares, mayormente, proteínas (Melis, Zhang, Forestier, Ghirardi & Seibert, 2000).
Ghirardi (2000), indica que la primera etapa, aeróbica, dura 30 horas aproximadamente. Posteriormente se emplea un medio sin S hasta que se activa anaeróbicamente en otras 30 horas; resultando la producción de H2 en 60 horas (Ghirardi et al., 2000).
Para el crecimiento, Melis (2000), se recurre a un medio buffer Tris-acetato-fosfato (TAP), pH 7 y 25 ºC, con burbujeo de 3% de CO2. Los recipientes chatos con un camino óptico de 3 a 5 cm, para que penetre luz (Melis et al., 2000).
4.2.1.2. BIOFOTÓLISIS INDIRECTA
Lo estudiado por Dutta (2005), señala que es realizado por cianobacterias y algas azul verdosas. Partiendo desde el proceso fotosintético, el CO2 se establece en sustratos ricos en hidrógeno endógeno, obteniéndose hidrógeno molecular en condiciones anaerobias (Dutta et al., 2005).
6CO2(g) + 6H2O(l) luz→ C6H12O6 + 6O2(g)
C6H12O6 + 6H2O luz→ 12H2 + 6CO2
Según Kovács (2006), empleándose un sistema de cultivo para fotosíntesis normal y otro, para obtención de hidrógeno (Kovács et al., 2006). Las cianobacterias tienen enzimas implicadas directamente en el metabolismo de hidrógeno. Una de estas enzimas, la nitrogenasa, cataliza la producción de hidrógeno durante la fijación de nitrógeno. La hidrogenasa captadora, oxida el hidrógeno sintetizado por la nitrogenasa y las hidrogenasas bidireccionales, oxidan y sintetizan hidrógeno.
En los resultados obtenidos por Jeffries (1978), la producción es influenciada por intensidad de luz, sin embargo presentan tasas bajos de producción como 13μL/mg (peso seco/h) (Jeffries et al., 1978), además que se debe remover O2 producido, ya que inhibe de nitrogenasa y hidrogenasa (Kapdan & Kargi, 2006).
4.2.2. FOTOFERMENTACIÓN
4.2.2.1. GENERALIDADES
La producción de H2 en relación con la energía lumínica es baja, se ve influenciada por el diseño del biorreactor que debe exponer el área más grande posible a la luz. El pH y temperatura también deben controlarse, siendo los óptimos de 7,0 y 30-35 °C. Como alimentación de las bacterias púrpuras no del azufre, consumen moléculas orgánicas de cadena corta como fuente de carbono. Los microrganismos involucrados son procariotas y realizan la fijación de nitrógeno; cabe señalar que no se conocen organismos eucariotas capaces de ello (Madigan, Martinko & Parker, citado por Martínez & García, 2010).
4.2.2.2. REACCIONES PRINCIPALES
C6H12O6 + 6H2O luz→ 12H2 + 6CO2
CO(g) + H2O(l) → CO2(g) + H2(g) + ATP
8H+ + 8e- + N2 + 16-24ATP → 2NH3 + H2 
4.2.2.3. MECANISMO
Primero, se reduce N2 a amoníaco (NH3); al ser el N2 una molécula muy estable e inerte, se necesita una gran cantidad de energía para reducirla. La enzima nitrogenasa, encargada de la fijación, debe transferir 6 electrones al N2 para resultar en dos moléculas de NH3, aunque en el proceso se consumen 8 electrones. Cada electrón transferido está asociado a la hidrólisis de 2-3 ATPs. Entonces, se libera una molécula de H2 al ambiente con los 2 electrones extra que se consumen; afiliándose a la actividad de la nitrogenasa. Los electrones derivande la ferredoxina o flavodoxina (Madigan, Martinko & Parker, citado por Martínez & García, 2010).
8H+ + 8e- + N2 + 16-24 ATP → 2NH3 + H2
La nitrogenasa se paraliza veloz e irreversiblemente con O2. Los organismos aerobios que realizan la fijación, como algunas cianobacterias, protegen a la nitrogenasa del O2 mediante compartimentos o capas mucosas. (Türker, Gümüs &Tapan, 2008).
4.2.2.4. ORGANISMOS E INÓCULOS
Otros organismos fijadores son anaerobios, como las bacterias púrpuras o fototróficas no del azufre, pues captan la energía de la luz mediante bacterioclorofilas y compuestos carotenoides que le dan ese color, no captan CO2 del aire como las plantas verdes, como por ejemplo Rhodobacter sphaeroides, Rhodopseudomonas capsulatus, R. pallustris o Rhodospirillum rubrum (Türker, Gümüs & Tapan, 2008), cultivándose en biorreactor sobre materia orgánica de desecho, vía anaerobia con luz.
Se ha estudiado con microorganismos del género Rhodobacter, en lotes y en menor grado, continuo (Zurrer & Bachofen, 1979; Kapdan & Kargi, 2006). Se reporta tasas de producción de hidrógeno entre 0,009 L/L*h y 0,008 L/L*h a un pH 5 y temperatura 35 °C (Eroglu et al., 2006).
4.2.2.5. EQUIPO
Biorreactores desarrollados, del tipo fotobiorreactores con configuraciones tubulares, de panel de platos y columna de burbujeo, consiguiendo resultados diversos, en virtud, a diferencias en la agitación e intensidad de luz, principales parámetros (Reith et al., 2003; Kapdan & Kargi, 2006).
4.2.3. FERMENTACIÓN OSCURA
4.2.3.1. GENERALIDADES
La fermentación oscura es un proceso metabólico de carbohidratos, donde se rompe la molécula de carbohidrato para obtener energía, esta ocurre naturalmente en ciertas bacterias anaeróbicas (como por ejemplo las del género Clostridium sp. y Enterobacter sp.); se denomina fermentación oscura ya que la luz no es un requisito, no necesariamente debe ocurrir en oscuridad. Generándose productos como ácidos, alcoholes y moléculas orgánicas de cadena corta.
4.2.3.2. REACCIONES PRINCIPALES
C6H12O6 + 2H2O → 2CH3COOH + 4H2 + 2CO2
7C6H12O6 + 6H2O → 6CH3CH2CH2COOH + 24H2 + 18CO2
4.2.3.3. MECANISMO
Inicialmente, se degrada el carbohidrato hasta ácido pirúvico o derivado; se obtiene también ATP pero en bajo rendimiento.
En la siguiente etapa, aeróbica, se degrada totalmente el piruvato, produciendo ATP con alto rendimiento; se requiere una molécula de O2 que se convertirá en H2O. Si esta molécula final acepta electrones no es el O2, es de tipo anaeróbica.
En ambientes anóxicos, algunos microorganismos efectúan otro proceso en vez de respiración anaeróbica: fermentación. Estos ganan ATP sólo por glucólisis, pero consumen NAD+ y NADP+, transformándose en NADH y NADPH. La fermentación recupera NAD+ y NADP+ para proseguir con la glucólisis. Para regenerarlos, traspasa electrones al ácido pirúvico o derivado (Madigan, Martinko & Parker, citado por Martínez & García, 2010).
4.2.3.4. ORGANISMOS E INÓCULOS
Las bacterias del género Clostridium realizan fermentación butírica y las enterobacterias, fermentación ácidomixta (Madigan, Martinko & Parker, citado por Martínez & García, 2010). Los clostridios, por ejemplo Clostridium buytricum, C. thermolacticum, C. pasteurianum, C. paraputrificum y C. bifermentants, son bacterias Gram positivas, anaeróbicas, formadoras de esporas y fermentadores forzosos. Las enterobacterias, como Enterobacter cloacae o Escherichia coli, son Gram negativas, no esporulantes, anaerobios facultativos, y capaces de fermentar glucosa.
Ambas vías fermentativas son la ácido-mixta y la 2-3 butanodiólica. Los productos son etanol, H2 y CO2, más algunos ácidos en la primera y butanodiol en la segunda. La fermentación tipo ácido-mixta genera menor CO2 que la butanodiólica (Madigan, Martinko & Parker, citado por Martínez & García, 2010).
4.2.3.5. EQUIPO
Biorreactores de configuración continuo de tanque agitado (CSTR) (Yang et al., citado por Bedoya, Castrillón, Ramírez, Vásquez & Arias, 2007). Existen otros, la mayoría basados en procesos de digestión anaeróbica para producir metano. La retención de bacterias en birreactores, logra un posible aumento de biomasa, generando ambientes locales anaeróbicos favorables. Se retienen bacterias productoras logrando más capacidad catalítica y altas tasas de carga orgánica, que logra llegar a mayores tasas volumétricas de producción de hidrógeno, evitando así, la detención de bacterias metanógenas o productoras de propionato.
Para reactores biológicos secuenciales (SBR), las bacterias son retenidas en un periodo de inmovilización, hallándose tasas volumétricas y específicas de hidrógeno semejantes a los resultados en CSTRs. La inmovilización se da en matrices de etilén-vinil-acetato (EVA), celulosa, capas de alginato-polivinil-acetato, carbón activado y alginato de calcio, explotando la creación de biopelículas en las matrices (Wu et al., citado por Bedoya, Castrillón, Ramírez, Vásquez & Arias, 2007). 
También se han empleado reactores de lecho fluidizado (FBR), lecho empacado (PBR) con cultivos mixtos libres de metanógenos, reactor de lecho ascendente anaerobio (UASB), reactor de cargador inducido granular (CIGSB) y anaeróbico bafleado de tres compartimentos (ABR) (Chen, Yang, Yeh, Liu, & Chang, 2008).
Figura 2. Disposición esquemática del proceso de producción de biohidrógeno en tres etapas secuenciales de fermentación oscura, fotofermentación y biofotólisis (Lo, Chen, Lee & Chang, 2010).
4.2.3.6. SELECCIÓN DEL SUSTRATO
Deben ser de origen renovable y estar en la cantidad o concentración necesaria para una fermentación óptima. Los sustratos más usados son las glucosa y sacarosa, también se han utilizado otros como la maltosa, lactosa, galactosa, manosa y xilosa (Lin et al., 2006; Lin & Cheng, 2006; Das & Kotay, 2007; Ogino et al., 2005). Sin embargo, recientes estudios se enfocan en materiales de residuo como los desechos y aguas residuales de las industrias de alimentos (Yokoi et al., 2001; Kádár et al., 2003; Bálint et al., 2005), también desechos agrícolas y lodos de plantas de tratamientos (Kapdan & Kargi, 2006).
Asimismo se busca minimizar los procesos de pretratamientos del sustrato y con ello el costo de producción. 
4.2.3.7. PRETRATAMIENTO DEL SUSTRATO
El objetivo es mejorar la calidad del sustrato, incrementando su capacidad de ser biodegradable. Se emplean procesos térmicos (temperaturas de ebullición por ciertos periodos de tiempo), químicos (tratamiento con ácidos y bases a pHs extremos) y enzimáticos. Para aguas residuales, el pretratamiento consta de la eliminación de componentes indeseables, desnaturalización de proteínas y sustancias orgánicas complejas, dilución de la carga orgánica, regulación del pH y adición de ciertos componentes necesarios para lograr el proceso fermentativo (Kapdan & Kargi, 2006; Hawkes et al., 2007).
4.2.3.8. REACTORES DE PROCESO
Se cree que los bioreactores para la fermentación oscura maximizan el rendimiento de biohidrógeno con respecto a los diferentes sustratos de interés. Se ha dedicado mucho trabajo al análisis de reactores discontinuos para la fermentación de biohidrógeno oscuro, con el fin de evaluar el conjunto óptimo de parámetros operativos (cepas bacterianas, sustrato, pH, temperatura) (Arooj et al., 2007; Argun et al., 2011). En diferentes estudios (Argun et al., 2008), Argun y sus compañeros de trabajo exploraron la fermentación oscura en polvo del trigo en polvo, encontrando que las relaciones Carbono/Nitrógeno y Carbono/Fósforo son cruciales, ya que el rendimiento de biohidrógeno aumenta al aumentar C/N y C/P. Registraron un valor óptimo de la relación C/N/P, 100/0.5/0.1 (p/p/p) para la tasa específica de producción de hidrógeno (SHPR).
En este sentido, el reactor por lotes secuencial anaeróbico (SBR) representa una solución eficiente, debido a que la alta retención de biomasa a través de su proceso puede aumentar la productividad anual de biohidrógeno (Cheong et al., 2006; Arooj et al., 2007, 2008; Kim et al. 2010). Es el efluente, que contiene una gran cantidad de VFA, lo que limita la conversión delsustrato en hidrógeno. Por esta razón, las etapas de fermentación oscura a menudo van seguidas de pasos de fotofermentación; Es probable que estos procesos mixtos se conviertan en el punto de referencia de la producción de biohidrógeno (Argun et al., 2011).
También se han considerado sistemas continuos (Jung, et al., 2011). El tiempo de retención hidráulica (TRH) se ha demostrado como un factor clave en el proceso del biorreactor, y afecta la elección de la población microbiana. Sin embargo, a pesar del flujo y el reactor empaquetado, la producción por lotes parece ser la ruta más prometedora, ya que permite el control de algún factor inhibidor (como el pH), al tiempo que mantiene la concentración de biomasa tan alta como sea necesario.
4.2.3.9. FACTORES QUE AFECTAN LA PRODUCCIÓN
La producción de hidrógeno depende de varios factores, los cuales están asociados con condiciones ambientales, operacionales y químicas. Estos factores han sido evaluados por diferentes investigadores con el objetivo de obtener la máxima producción de 4 moles de H2 por mol de glucosa. En esta sección se tratará cada uno de ellos explicando cómo afectan la producción de hidrógeno.
Inóculo
Se ha demostrado que el inóculo es uno de los factores determinantes en la producción de hidrógeno, un estudio realizado con inóculo obtenido de lodos activados obtuvo 0,15 moles H2. Mol-1 de glucosa y un inóculo obtenido de lodo anaerobio digerido obtuvo 1,35 moles H2. Mol-1 de glucosa (Kawagoshi et al., 2005). 
Los miembros de Clostridium y Enterobacter fueron los más empleados como inóculos para la producción de hidrógeno fermentativo. La dificultad de emplear cultivos mixtos es que en el medio coexisten bacterias consumidoras y productoras de hidrógeno. Esto se puede solucionar si se hacen condiciones duras a las bacterias consumidoras (Sinha & Pandey, 2011).
Los cultivos mixtos de bacterias de lodos anaerobios, lodos de plantas de tratamiento, compost y el suelo se han empleado como inóculo para la producción de H2 (Li & Fang, 2007), debido a que existe una amplia fuente de alimentos que los contienen y son potencialmente más resistentes a cambios en las condiciones ambientales en relación con los cultivos puros. Sin embargo, en la producción de H2 empleando cultivos mixtos, el H2 producido puede ser consumido. Por esta razón, para proteger las bacterias productoras de H2, el inóculo es pretratado empleando métodos tales como: choque térmico, acidificación, alcalinidad, congelación y descongelación, aireación y adición de cloroformo, los cuales inactivan la actividad bacteriana de las bacterias consumidoras de H2 para impedir que estas proliferen (Wang, 2008).
ph del cultivo
En cuanto al pH, la producción se da en un amplio rango, encontrándose que a pH menores de 4.0 y mayores de 12.0 se inhibe por completo la producción de hidrógeno. Los rangos de producción varían entre 6.0 y 6.8 con rendimientos aceptables para la fermentación con cultivos mixtos (Cai et al., 2004). Es importante mencionar que debajo de 4,7 es altamente desfavorable para la producción de hidrógeno, puesto que inhibe la actividad de la hidrogenasa y otras enzimas involucradas en el proceso (Lay, 2000).
Sustrato
Para la producción de H2 se han empleado diferentes clases de sustratos. La glucosa, sacarosa y el almidón son los que más se han empleado como sustrato (Wang & Wan, 2009). En muy pocos estudios se han utilizado residuos orgánicos como sustrato para la producción de H2 (Sinha & Pandey, 2011).
Para la producción de H2 no es ideal emplear sustratos con estructuras moleculares complejas debido a que estos son difíciles de asimilar por los microorganismos, sin embargo después de emplear un pretratamiento con algunos métodos estos sustratos pueden ser fácilmente asimilados por las bacterias productoras de H2 (Wang & Wan, 2009).
Los pretratamientos más conocidos para la degradación de sustratos difíciles son la ultrasonificación, acidificación, el congelamiento y descongelamiento, esterilización y las microondas.
Temperatura
La temperatura es un factor que influye en la actividad de las bacterias productoras de H2 y en la producción de H2 fermentativo, siendo un parámetro de tipo selectivo pues afecta la tasa de crecimiento y la ruta metabólica de los microorganismos. Las bacterias son capaces de producir H2 en rangos de temperatura que van desde 15 hasta 85°C, en rango mesofílico (25-30 °C), termofílico (40-65 °C) e hipertermofílico (>80 °C) (Blanco & Rodriguez, 2012).
Nutrientes
En el proceso de fermentación de hidrógeno se necesitan suplementos como nitrógeno, fosfato y otros minerales traza inorgánicos. Estudios previos indicaron que el nitrógeno orgánico parece ser más favorable para el desarrollo del hidrógeno, comparado con uno inorgánico. El fosfato es uno de los nutrientes inorgánicos importantes requerido para una producción óptima de hidrógeno (Show, Lee & Chang, 2011).
El nitrógeno es un componente de las proteínas, ácidos nucleicos y enzimas, por lo tanto una concentración de nitrógeno apropiada favorece el crecimiento de las bacterias productoras de hidrógeno y la producción de H2 fermentativo (Bisallion et al., 2006).
En relación con los fosfatos estos son necesarios para la producción de H2 debido a su valor nutricional, así como a su capacidad de tamponamiento (Wang & Wan, 2009). Los iones metálicos más importantes en la producción de H2 fermentativo son el Mg2+, Na+, Zn2+ y Fe2+, dado que estos elementos son necesarios para los cofactores enzimáticos, los procesos de transporte y las deshidrogenasas (Lin & Lay, 2005). De estos iones el Fe2+ es el que más se ha investigado al ser un componente clave en la actividad enzimática de la hidrogenasa (Wang & Wan, 2008).
4.2.3.10. SEPARACIÓN DEL HIDRÓGENO PRODUCIDO
El biogás obtenido en la fermentación no puede ser utilizado directamente por lo tanto se requiere una separación de los gases (Claassen et al., 2005; Búcsu et al., 2006). Es primordial una remoción continua del hidrógeno para evitar su acumulación junto con otros gases producidos en la fermentación como el CO2 ya que reducen la tasa de producción del H. (Levin et al., 2004). El proceso más usado es donde se maneja una presión conducida por membranas, con membranas porosas o no porosas, basándose en la permeabilidad y selectividad de los gases (Bélafi et al., 2006). A 25 ºC se han utilizado membranas no porosas de polímeros que tienen gran permeabilidad por el hidrógeno y selectividad en mezclas hidrógeno-nitrógeno a esta temperatura (Horváth et al., 2004). En las membranas porosas la permeabilidad de los gases se ve influenciada sólo por los pesos moleculares y la separación se determina por la relación entre éstos (Bélafi et al., 2006).
Tabla 1. Velocidades de producción y rendimientos de producción de H2 a partir de diversos inóculos y sustratos en cultivo en lote (elaboración propia).
	Inóculo
	Sustrato
	VVPH (mmol H2/Lcultivo-h)
	Rendimiento
de H2
	Condiciones de cultivo
[pH, temperatura (°C),
% H2 en biogas (%v/v)]
	Referencias
	Clostridium butyricum
CGS5
	Sacarosa
(20 g DQO/L)
	8.2
	2.78 mol H2/
mol sacarosa
	5.5-6.0c, 37, 64
	Chen et al., citado por Bedoya, Castrillón, Ramírez, Vásquez & Arias, 2007 
	Clostridium Saccharoperbutyla cetonicum ATCC 27021
	Suero de leche crudo
(ca. 41.4 g lactosa/L)
	9.4
	2.7 mol H2/
mol lactosa
	6.0d, 30, NRb
	Ferchichi et al., citado por Bedoya, Castrillón, Ramírez, Vásquez & Arias, 2007
	Escherichia coli W3110,
SR11*, SR12*, SR13*
	Ácido fórmico
(25 mM)
	11795
	1.0 mol H2/
mol formiato
	6.5d, 37, NR
	Yoshida et al., citado por Bedoya, Castrillón, Ramírez, Vásquez & Arias, 2007
	Bacteria mesofílica HN001
	Almidón (20 g/L)
	59
	2.0 mol H2/
mol glucosa
	6.0c, 37, NR
	Yoshida et al., citado por Bedoya, Castrillón, Ramírez, Vásquez & Arias, 2007
	Suelo agrícola (tratamiento térmico)
	Materia orgánica de aguas residuales
	6.2
	100 ml H2/
g DQOremovida
	6.1d, 23, 60
	Van Ginkel et al., citado por Bedoya, Castrillón, Ramírez, Vásquez & Arias, 2007
	Lodo anaerobio (Tratamiento ácido, aclimatado en CSTR)Sacarosa (20 g
DQO/L)
	96
	1.74 mol H2/
mol sacarosa
	6.1d, 40, 45
	Wu et al., citado por Bedoya, Castrillón, Ramírez, Vásquez & Arias, 2007
	Lodo anaerobio
	Glucosa
(∼21.3 g/L)
	4.9 - 8.6
	0.8-1.0 mol
H2/mol hexosa
	5.7c, 34.5, 59-66
	Chen, citado por Bedoya, Castrillón, Ramírez, Vásquez & Arias, 2007
	Lodo anaerobio
	Sacarosa (10 g/L)
	8
	1.9 mol H2/
mol sacarosa
	5.5c, 35, NR
	Mu et al., citado por Bedoya, Castrillón, Ramírez, Vásquez & Arias, 2007a
	Lodo anaerobio
	Sacarosa
(24.8 g/L)
	20
	3.4 mol H2/
mol sacarosa
	5.5c, 34.8, 64
	Mu et al., citado por Bedoya, Castrillón, Ramírez, Vásquez & Arias, 2007b
	Lodo anaerobio
	Glucosa (3.76 g/L)
	9
	1.0 mol H2/
mol glucosa
	6.2d, 30, 66
	Wu et al., citado por Bedoya, Castrillón, Ramírez, Vásquez & Arias, 2007
Notas: a Casos ensayado en diversas condiciones, se reportan las óptimas. b NR: No reportado. c Valor controlado. d Valor inicial, sin control. e Conversiones de unidades, en condiciones reportadas por autores. VVPH: Velocidad volumétrica de producción de H2. DQO: Demanda química de oxígeno. CSTR: Reactor de tanque agitado en continuo (Continuous Stirred Tank Reactor). *Cepa modificada genéticamente.
5. MARCO CONCEPTUAL
5.1. La biomasa:
Según la Directiva 2009/28/CE que fomenta el uso de energía de fuentes renovables, se entiende por biomasa a la fracción biodegradable de productos o residuos de origen biológico que provienen de actividades agrarias, o actividades relacionadas a esta industria como la silvicultura, la pesca y la acuicultura, la biomasa también incluye a los residuos biodegradables municipales o urbanos. (Directiva 2009/28/CE del parlamento Europeo y del Consejo, de 23 de abril del 2009, citado por, Lucas & Peso, 2012).
Figura 3. Tipos de biomasa (Fuente: http://sostenible.palencia.uva.es/system/files/publicaciones/Biomasa%2C%20Biocombustibles%20y%20Sostenibilidad.pdf)
5.2. Los biocombustibles:
Los biocombustibles son recursos energéticos que procesan y utilizan los seres humanos a partir de la “biomasa” concepto del cual se detalló anteriormente. Estos combustibles biológicos pueden ser sólidos, líquidos o gaseosos y su principal objetivo es liberar la energía que llevan contenida a través de reacciones de combustión. Los biocombustibles son el medio ideal para pasar de una economía basada en combustibles fósiles, a una basada en el aprovechamiento de fuentes renovables como el Hidrógeno. (Álvarez, 2009).
5.3. Las cianobacterias 
Las cianobacterias son organismos procariotas que se encuentran dentro del reino monera. Comparten similitudes con otras bacterias fotosintéticas, así como con la mayoría de la demás bacterias. Durante mucho tiempo se les denominó “algas azules” (Cianophyta). Las cianobacterias actúan como productores primarios a gran escala, y entre sus funciones más importantes está el contribuir a mantener los ciclos de carbono, oxígeno y nitrógeno en la biósfera. Además son fuente de principios activos, es decir tiene propiedades farmacológicas y son muy importantes en la protección del planeta contra el calentamiento global debido a que actúan como sumideros de dióxido de carbono. En los principios teóricos, detallamos su capacidad como material biológico generador de biocombustibles (Peleato, 2011, p.9).
5.4. La Hidrogenasa: 
Las hidrogenasas son enzimas que producen hidrógeno en las cianobacterias. Existen 2 tipos de hidrogenasa, la primera es la hidrogenasa de captación la cual es codificada por hupSL (Tamagnini, 2002 citado por, Dutta, et al., 2005).
Las  hidrogenasa de captación se encarga de oxidar el Hidrógeno, el otro tipo de hidrogenasa es la hidrogenasa bidireccional o reversible la cual es codificado por hoxFUYH y se encarga de absorber o producir hidrógeno. Las enzimas de la hidrogenasa de captación se encuentran dentro de la membrana tilacoide donde realizan la oxihidrogenación, además la hidrogenasa de captación consta de dos subunidades: la proteína codificada por hupL que se encarga de absorber el hidrógeno y la codificada por hupS que se encarga de la reducción del hidrógeno. (Dutta, et al., 2005). 
5.5. La Nitrogenasa: 
La nitrogenasa es otra enzima, al igual que la hidrogenasa ya mencionada, que genera hidrógeno. Ambas enzimas son las más importantes en el proceso de producción de hidrógeno. 
Está constituido por dos proteínas diferentes. La dinitrogenasa, llamada también proteína MoFe o proteína I, la cual se encarga de unir y reducir el N2 u otros sustratos; y la dinitrogenasa reductasa, llamada también proteína Fe o proteína II, que cumple la función de de pasar electrones a la dinitrogenasa. El sustrato para la nitrogenasa es el N2, aunque existen también una extensa cantidad de sustratos que pueden ser reducidos por la nitrogenasa. (Burris, 1991, citado por, Rojas, 2008, p.28).
5.6. Microalgas: 
Las microalgas, al igual que las cianobacterias son microorganismos unicelulares realizan la fotosíntesis, es decir, generan biomasa orgánica a partir de CO2 y luz solar, para esto oxidan el agua a O2 y de esta manera la utilizan como dador de electrones. Existen diferencias importantes entre las cianobacterias y las microalgas, para comenzar las primeras son organismos procariotas mientras que las microalgas son eucariotas, otra diferencia importante es que las cianobacterias pueden fijar nitrógeno, en cambio las microalgas necesitan de un compuesto nitrogenado para hacerlo (Fernández, 2014).
Según Salgueiro (2018) En los últimos años ha aumentado la investigación de los cultivos microalgales, esto debido a su elevado potencial (rápido crecimiento, alto contenido en lípidos, vialidad de cultivo en diferentes hábitats, etc). Todas estas propiedades permiten que sean usadas para fines energéticos como la producción de biocombustibles, además de tratamiento de aguas residuales y para la obtención de productos cosméticos, de nutrición y de salud humana (Salgueiro, 2018).
5.7. Fotobioreactor: 
Los fotobioreactores (FBRs) son dispositivos en los que se realiza el cultivo masivo de microalgas. Para esto, deben cumplir con determinadas condiciones de temperatura, pH, además de baja concentración de O2. Es importante también que los fotobioreactores proporciones los nutrientes necesarios para el correcto crecimiento de microalgas. Existen dos tipos de diseño opuestos. Los reactores abiertos que priorizan el ahorro económico aceptando un control pobre del entorno y los FBR cerrados que consiguen condiciones minuciosamente controladas permitiendo a las microalgas crecer a una velocidad óptima a cambio de un mayor coste. (Fernández, 2014).
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Biomasa
Fermentación
Biogás
Hidrógeno
Fuente primaria de energía renovable
Procesos
Fuentes secundarias de energía
Procesos
Portadores químicos de energía
Reforming
Gas de síntesis
Metabolismo
Hidrógeno
Gasificación
Gas de síntesis
Hidrógeno
Producto
Pirólisis
Gas de síntesis
Hidrógeno
Producción de biohidrógeno
Con energía lumínica
Biofotólisis directa
Fotofermentación
Sin energía lumínica
Fermentación oscura
– Bacterias anaerobias
– Fermentación de sustratos ricos en carbohidratos
– Acumulación de AGV
– Algas verdes
– Separación de H2O por procesos fotosintéticos
– Sensible a la formación de O2
– Bacterias púrpuras
–Fotofermentación de ácidos orgánicos
– Condiciones estrictas de operación
Biofotólisis indirecta
– Algas azulverdosas y cianobacterias
– Sensible a la formación de O2
– A partir del procesos fotosintético