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UNIVERSIDAD NACIONAL EXPERIMENTAL DE LOS LLANOS OCCIDENTALES “EZEQUIEL ZAMORA” VICERRECTORADO DE PLANIFICACIÓN Y DESARROLLO SOCIAL SUBPROGRAMA CIENCIAS DEL AGRO Y DEL MAR CARRERA MEDICINA VETERINARIA Sub-proyecto. Biotecnología productiva Integrantes. Hernández Soniandry Santa Bárbara Julio del 2023 TABLA DE CONTENIDO. 1.1 INTRODUCCIÓN. 2.1 TRANSFERENCIA DE EMBRIONES EN OVINOS, CAPRINOS Y EQUINOS. 3.1 HISTORIA Y CRECIMIENTO DE LA TRANSFERENCIA DE EMBRIONES EN OVINOS, CAPRINOS Y EQUINOS. 4.1 PRINCIPALES TÉCNICAS DE TRANSFERENCIA DE EMBRIONES EN OVINOS, CAPRINOS Y EQUINOS. 5.1 ANÁLISIS DE LAS DIFERENTES TÉCNICAS DE TRASFERENCIA DE EMBRIONES EN OVINOS, CAPRINOS Y EQUINOS. OJO TÉCNICAS ENTRE CADA ESPECIE POR SEPARADO, ÓSEA SI HAY 3 TÉCNICAS EN EQUINOS HACER UN ANÁLISIS DE LAS 3 TÉCNICAS Y SACAR SUS BENEFICIOS Y SU CONTRAS ASÍ CON CADA ESPECIE. 6.1 CONCLUSIÓN. 7.1 BIBLIOGRAFÍA Introducción. La transferencia de embriones es un método de reproducción asistida basado en la producción de múltiples embriones, por una hembra donante (madre genética superior) y transferidos antes de la edad de implantación, en varias hembras receptoras (madres portadoras gestantes. Ahora bien, la transferencia de embriones puede realizarse en un centro especializado o puede suceder de manera ambulatoria en el lugar donde se encuentran las donadoras y receptoras lo cual implica el desplazamiento del profesional en múltiples ocasiones, a los criaderos donde se ubican las hembras, esto debido a que es probable tener el animal donador en un criadero y a la receptora en otro; también la multiplicidad de desplazamientos responde al seguimiento para la detección de la ovulación, y a la búsqueda de la sincronización que debe suscitarse entre donadora y receptora, esto con el fin de lograr mayores porcentajes de preñez. Debido a que son diversos los factores a considerar dentro del proceso de transferencia de embriones en equinos y ovinos, existen diferentes protocolos que se dirigen a obtener mayor éxito; en la práctica el profesional suele adoptar un protocolo que aplica normalmente por lo cual adquiere cierta destreza y sistematización de cada una de las actividades; aun así la diversidad de variables a tener en cuenta permiten entender que son múltiples los factores limitantes que inciden en el porcentaje de éxito en la obtención de embriones, en los porcentajes de preñez y por consiguiente en los embriones que llegan a término. Transferencia de embriones en ovinos, caprinos y equinos. La transferencia de embriones es una técnica mediante la cual, los embriones (óvulos fertilizados) son colectados del cuerno uterino de la hembra antes de la nidación (donadora), y transferidos al cuerno uterino de otras hembras para completar su gestación (receptoras). Como resultado para la obtención de animales de alta calidad genética para incrementar la producción de leche y carne, generalmente. Cabe destacar que una alternativa para generar animales valiosos en el país desde el punto de vista genético, es mediante la utilización de la transferencia de embriones. Por muchos años, en la producción ganadera ha sido mejorado genéticamente desde el lado paterno mediante el uso de la Inseminación Artificial (lA). Por el contrario, mediante la técnica de la Transferencia de Embriones (TE) se puede acelerar el mejoramiento del animal dependiendo de la producción (Ovino, Caprino) desde el lado materno, disminuyendo el intervalo entre generaciones y acelerando el proceso de selección obteniendo un gran número de progenie de donadoras valiosas que permitirá incrementar la producción animal. Así mismo en el mejoramiento genético equino ya la función no sería para la producción sino para animales altos en valor para competencias y deportes la técnica de transferencia de embriones en yeguas es el procedimiento por el cual se recolecta uno o más embriones de una yegua donante inseminada. Sobre todo existen algunos factores cruciales en las etapas para realizar la transmisión de embriones donde incluye varias etapas, desde la selección de donadoras hasta la transferencia del embrión las principales etapas relacionadas son: Inducción de la superovulación (donadora) Sincronización del ciclo estral (receptoras) Recolección de los embriones (donadora) Clasificación de los embriones Almacenamiento por corto plazo y cultivo Criopreservación Transferencia de los embriones (receptoras). Ante todo el animal donador (hembra) debe cumplir algunas características específicas genéticamente superior quien sería estimulada a producir varios embriones en una sola vez, los cuales son colectados y transferidos para otras hembra (ovina, caprina y equina) de menor valor genético llamadas receptoras, que mantienen la gestación, dan a luz y los crían hasta el destete. Estas son algunas características que deben de cumplir las donadoras en cuanto en la producción pecuaria ovina y caprina. No presentar enfermedades hereditarias Tener excelente historial reproductivo y salud Alto valor en el mercado Ciclos estrales regulares No tener enfermedades que afecten la fertilidad El veterinario realizará una revisión veterinaria completa para asegurarse de que la yegua tiene un ciclo ovárico correcto y que pueda producir embriones viables. También se revisará si existen enfermedades de transmisión sexual o cualquier otra patología que influya en la técnica de transferencia, para poder tratarlas antes de comenzar el proceso de transferencia. Por otra parte se encuentran a las madres receptoras o portadoras Están las hembras no aportan nada genéticamente dentro del proceso de la transferencia, sino que sirven como recipientes. Las receptoras deben de cumplir unas características que les permita cumplir esta labor de madres portadoras o madres de alquiler. Debe ser un animal joven, libre de enfermedades, de probada fertilidad y habilidad materna. Además, debe tener un tamaño adecuado para no presentar problemas al parto. Aunque la raza no es un factor importante, generalmente se acepta que sean cruzadas ya que presentan una mayor fertilidad. Son revisadas para seleccionar aquellas que tienen ciclos estrales normales, así como unsistema reproductivo sano que indique una mayor probabilidad de que la gestación llegue a término. Si han tenido crías anteriormente, se seleccionarán aquellas que son buenas madres, es decir (yeguas, ovina y las caprinas) sean de abundante lactación para la alimentación correcta de la cría. Protocolos para transferencias de embriones. Cabe destacar que el protocolo son las etapas y pasos que se van a emplear para realizar la trasferencia de embriones que van desde en control y manejo de las sincronización de los celos, las hormonas a utilizar para la fertilidad y algunos factores que también influyen como sería el clima, la nutrición etc. Al momento de establecer el protocolo se debe tomar en cuenta la rapidez con la que el cliente quiere que realice el trabajo, si este quiere los embriones lo más rápido posible, se eligen las hembras que están ciclando, es decir, las que presenten cuerpo lúteo, se les establece el protocolo más corto. Sincronización de celo, ovulación para transferencia de embriones a tiempo fijo. Es una técnica biológica que consiste en manejar el ciclo estral también llamado calor o celo, es la etapa caracterizada por un periodo de receptividad sexual en donde la hembra acepta la monta y el apareamiento mediante el empleo de hormonas exógenas con la idea de concentrar la presentación de los celos y así de esta manera acortar o eliminar la detección de celo, permitiendo predecir el momento de estro con una seguridad razonable (Santiago H.G., 2019). Es importante diferenciar sincronización de inducción de estros. La sincronización consiste en acortar o prolongar el ciclo estral a través de la utilización de hormonas o asociaciones hormonales, que induzcan la luteolisis o prolonguen la vida del cuerpo lúteo, de manera que, un grupo de hembras entre en estro y ovulen durante un corto periodo de tiempo o en un mismo día en las especies ovina y caprina. Las hembras deben al menos a ver tenido una cría y se bebe considerar un mínimo de 2 meses en ovinos y a 5 meses en caprinos pos- parto antes de comenzar con el tratamiento hormonal a cortar estos tiempos puede significar una pobre fertilidad. En cuanto a la sincronización de la yegua se va a destacar en la yegua receptora implante el embrión y por tanto tenga lugar la gestación, debe de estar en la misma fase del ciclo estral que la donante, de modo que el embrión llegará a un útero en el mismo estado fisiológico que estaba el útero del que partió. Para que esta técnica tenga las mayores probabilidades de éxito, en cuando la donante ovule, solo serán aptas como receptoras las yeguas que hayan ovulado un día antes que ella, o lo hagan en menos de tres días. Eso es muy difícil de conseguir al azar, de modo que, lo que se hace es sincronizar los celos con un tratamiento hormonal en todas las yeguas: donante y receptoras. Se trataran hormonalmente varias receptoras para garantizar que alguna ovule con esos pocos días de variación respecto a la donante. Ventajas de la transferencia de embriones en yeguas. La posibilidad de conseguir más de un potro al año y que el embrión sea gestado por otra yegua va a suponer ventajas económicas, de salud e incluso de diversidad genética. Las yeguas de alto valor económico pueden seguir compitiendo: Una yegua de gran valor, por su morfología o por su carrera deportiva, no necesitará detener ni el entrenamiento ni la participación en competiciones. Se recuperan a mayor velocidad razas en peligro de extinción o líneas maternas: Al poder obtenerse varios potros al año de una sola yegua, en lugar de uno en las condiciones normales de reproducción, la recuperación en número de individuos es más rápida. Algo similar sucede si en una ganadería se da importancia a las líneas maternas, tanto o más que a las paternas, y se quiere mejorar la ganadería basándose en las madres. Se recuperan para la cría yeguas con problemas reproductivos: Existen yeguas que tienen diferentes problemas reproductivos que impiden que la gestación llegue a término, pero desarrollan embriones viables que trasplantados sí vivirían. Las yeguas con problemas de salud dejan de sufrir riesgos: Son yeguas en las que, aunque no tengan afectada su fertilidad, la gestación sí supondría un riesgo, como es el caso de yeguas con problemas de partos, lesiones en extremidades que se resentirían con el peso de la gestación, o enfermedades que sufrirían complicaciones al soportar la preñez. Desventajas de la trasferencia de embriones en yeguas. Limitaciones de cría en algunas asociaciones: Las asociaciones de cría de las distintas razas pueden establecer restricciones para la inclusión en su libro genealógico de potros nacidos por este método. Algunas no permiten en absoluto este tipo de técnica, otras limitan el número de potros por yegua al año, e incluso algunas determinan de qué raza deberá ser la receptora para poder incluir al potro. Coste económico: Es obvio que contratar los servicios de un veterinario que disponga de una tecnología avanzada, unos conocimientos precisos de la técnica y la capacidad de coordinación del equipo para poder realizar una transferencia de embriones de un modo profesional que lleve al éxito, tiene un precio. Por eso, por el momento es una técnica que solo resulta rentable en animales de alto valor económico o biológico. Ventajas de la transferencia de embriones en ovino y caprino. Los primeros trasplantes de embriones caprinos y ovinos se realizaron hace 50 años, la estimulación ovárica o superovulación sigue siendo un tema de real preocupación ya que los resultados no siempre son favorables, y a veces son negativos. La transferencia de embriones permite incrementar el número de crías de una hembra genéticamente superior, logrando obtener en promedio 4 crías por tratamiento de ovulación múltiple. Los recientes avances en el incremento de la eficiencia reproductiva en la transferencia de embriones han ampliado la posibilidad de su utilización en los programas de mejoramiento genético aumentando la difusión de los genes de las ovejas y cabras de alto valor productivo. Sin embargo, el componente más importante en este tema es la gran variabilidad entre individuos en su respuesta ovulatoria a los tratamientos. Las variaciones individuales pueden ser atribuidas fundamentalmente a la elección de los tratamientos superovulatorios aplicados a los animales, y en las diferentes respuestas de los mismos a un tratamiento dado. El objetivo del presente trabajo de revisión es dar a conocer la aplicación de esta técnica en los pequeños rumiantes con fundamentos de orden genético, comercial, sanitario y de conservación de especies. Palabras clave: Transferencia, embriones, ovinos, caprinos. Desventajas de la transferencia de embriones en ovino y caprino. En la industria de la transferencia embrionaria, a pesar de los avances en la producción de embriones y en su transferencia, la principal desventaja es la imposibilidad de asegurar que una donante potencial pueda proveer un apropiado número de embriones de calidad en un tiempo establecido. Historia y crecimiento de la transferencia de embriones en ovinos, caprinos. Los primeros trasplantes de embriones caprinos y ovinos se realizaron hace 50 años, La estimulación ovárica o superovulación sigue siendo un tema de real preocupación ya que los resultados no siempre son favorables, y a veces son negativos. En la industria de la transferencia embrionaria, a pesar de los avances en la producción de embriones y en su transferencia, la principal desventaja es la imposibilidad de asegurar que una donante potencial pueda proveer un apropiado número de embriones de calidad en un tiempo establecido. La transferencia de embriones permite incrementar elnúmero de crías de una hembra genéticamente superior, logrando obtener en promedio 4 crías por tratamiento de ovulación múltiple. Los recientes avances en el incremento de la eficiencia reproductiva en la transferencia de embriones han ampliado la posibilidad de su utilización en los programas de mejoramiento genético aumentando la difusión de los genes de las ovejas y cabras de alto valor productivo. Sin embargo, el componente más importante en este tema es la gran variabilidad entre individuos en su respuesta ovulatoria a los tratamientos. Las variaciones individuales pueden ser atribuidas fundamentalmente a la elección de los tratamientos superovulatorios aplicados a los animales, y en las diferentes respuestas de los mismos a un tratamiento dado. El objetivo del presente trabajo de revisión es dar a conocer la aplicación de esta técnica en los pequeños rumiantes con fundamentos de orden genético, comercial, sanitario y de conservación de especies. Historia y crecimiento de la transferencia de la yegua. En el año 1974 se realizó, simultáneamente en Inglaterra y en Japón, la primera transferencia embrionaria en equinos. Se da la paradoja de que estos dos países no han liderado nunca en el mundo la realización de transferencias embrionarias en equinos. Eso sí, demostraron que la técnica se podía hacer, pero ésta fue absorbida por la industria y desarrollada en lugares donde la cría y la producción de caballos es masiva, como Estados Unidos, Brasil y Argentina, que son los tres países que destacan actualmente en esta técnica. Para que adentrarnos en los misterios de esta técnica, su verdadero potencial, así como todo lo que mueve la transferencia de embriones en equinos en el mundo, tuvimos la oportunidad de conocer a uno de los mayores expertos, el argentino Luis Losinno, profesor titular de la Cátedra de Producción Animal en la Facultad de Agronomía y Veterinaria de la Universidad Nacional de Río Cuarto. Una de las razones principales de que la transferencia de embriones en equinos haya progresado tan lento es la falta de interés mostrada por la mayoría de las asociaciones de registro caballar (studbooks) durante los años 70-90. Por otro lado, razones técnicas como la mala respuesta del ovario a los tratamientos de superovulación debido a su estructura y baja sensibilidad a las gonadotropinas exógenas han complicado la utilización y difusión de la citada técnica de reproducción asistida. Las mejoras técnicas en cuanto a la sincronización de celos, superovulación, flushing y transferencia de los embriones obtenidos han hecho que la transferencia embrionaria se sitúe nuevamente en el punto de mira de ganaderos de élite. Esta técnica es util para reproducir animales con aptitudes morfológicas o funcionales admirables, pero también se puede utilizar como herramienta en yeguas con ciertos problemas de fertilidad y para reducir la transmisión de ciertas enfermedades al controlar exhaustivamente a los reproductores o incluso mediante lavado de los embriones. La transferencia embrionaria además de lo expuesto puede servir en aquellas razas que se encuentran en peligro de extinción o amenazadas para conseguir una mayor variabilidad genética de la población, basando dicho objetivo en explotar no solo los recursos genéticos del macho (algo que se hace mediante inseminación artificial), sino incrementando la producción reproductiva de la hembra, obteniendo varias crías por año, algo imposible en condiciones naturales de cría. Por otro lado está la implicación moral y ética de esta técnica. El veterinario bajo ningún concepto puede violar sus principios morales y debe ser sensible con sus pacientes y respetarlos. Por ello el veterinario tiene el derecho de rehusar cualquier intervención que considere inaceptable. El veterinario debe hablar con sinceridad con los clientes que quieran emplear esta técnica en sus animales, y el consentimiento informado debe estar a la altura del nivel especial de responsabilidad profesional establecido por las normas éticas. Principales técnicas de transferencia de embriones en ovinos, caprinos. Fecundación de la hembra. Donante La fecundación en las hembras donantes puede realizarse mediante servicio natural a corral o mediante inseminación artificial (IA), con semen fresco o congelado. El servicio a corral se realiza cada 12 horas, desde el comienzo del celo y hasta su finalización. Otros autores recomiendan realizar el servicio cada 6 horas (Ishwar y Memon 1996). La inseminación cervical en ovejas se considera poco eficiente para los programas de OM. La utilización de la laparoscopía para la deposición de semen intrauterino es una técnica que brinda aceptables tasas de fertilización en las donantes superovuladas cuando se utiliza semen fresco o congelado-descongelado y a su vez, permite aumentar las tasas de fertilización, así como reducir las dosis de inseminación. Dosis de inseminación: Las siguientes son dosis de inseminación de referencia para la IA con semen fresco (en millones de espermatozoides): - IA cervical: 800 (ovinos) - 400 a 600 (caprinos). - IA laparoscópica: 80 (ovinos) - 100 (caprinos). El momento óptimo de realización de la IA y tasa de fertilización donde la eficiencia de la fertilización en las hembras multiovuladas ha presentado resultados muy variables en función de la técnica de fertilización empleada, el momento de inseminación (con detección de celos o a tiempo fijo, IATF) y la respuesta multiovulatoria al tratamiento hormonal. Se debe tener en cuenta que mediante el servicio natural o IA por vía vaginal en las ovejas donantes de alta respuesta ovulatoria (más de 10 a 12 ovulaciones) se puede obtener una baja tasa 15 de fertilidad, debido a la reducción del transporte espermático en el tracto reproductivo. En el caso de utilizar el semen fresco por IA laparoscópica (IAL), en ovinos se recomienda realizar la IA entre las 24 a 28 horas post celo, lográndose porcentajes de fertilización entre el 81 y 82%. Colecta de embriones. La metodología empleada para la obtención de embriones consiste en inyectar un medio líquido para producir una corriente de arrastre (“lavado o flushing”) a través de los cuernos uterinos. Se utiliza un medio comercial en base a PBS (Solución Buffer Fosfato), al que se le debe adicionar un 10% de suero adulto bovino, ovino o caprino inactivado. Para la obtención de suero, se sangra un animal en forma aséptica con material esterilizado. El suero se centrifuga a 2000 g durante 15 minutos. Se toma el sobrenadante y se realiza una segunda centrifugación. Se filtra por membrana de 0.22 µm. La inactivación de la proteína complemento se realiza en baño de agua a 56 °C durante 30 minutos. El suero filtrado inactivado se puede conservar durante un año a -20 °C. Cabe destacar que en ovejas, la colecta embrionaria se realiza en los días 7mo u 8vo PREP. Debido a que el desarrollo embrionario inicial en caprinos presenta un retraso de 12 a 24 horas, la colecta de embriones se realiza en los días 8vo o 9no PREP. A continuación se detallan las técnicas de recolección de embriones en ovinos y caprinos: Técnica quirúrgica. La hembra se ubica en un plano inclinado en una camilla (cabeza hacia abajo). Se rasura y se desinfecta el campo operatorio. Se realiza una laparotomía media de 5 a 7 cm, y a 3 cm por delante de la ubre. Antes de comenzar con la recuperación embrionaria, se realiza la determinación de la respuesta ovulatoria (recuento del número de cuerpos lúteos, CL), mediante exteriorización de los ovarios o por observación laparoscópica. En base al número de estructuras colectadas se determina el porcentaje de recuperación embrionaria. La recuperación embrionaria consiste en la colocación de una sonda (K33) que en su extremo dispone de una aguja (50/20) con puntano traumática y dos perforaciones laterales y una central. Se realiza una punción en la unión útero tubárica y se enhebra la sonda en el interior de la luz del cuerno uterino (1 cm), fijando la misma por medio de un clamp vascular o ligadura. Aproximadamente a un par de cm de la bifurcación de los cuernos uterinos, se realiza una segunda punción, para la inyección de 20 ml de PBS a 38 °C. De esta manera se produce una corriente de arrastre que fluye hacia la unión útero tubárica, donde está ubicada la sonda, y el medio de colecta es recuperado en un Erlenmeyer estéril previamente entibiado. Se procede de igual manera con el otro cuerno uterino. Finalizada la recuperación embrionaria, se realiza la sutura de los planos quirúrgicos y se administran antibióticos. También es posible ubicar una sonda de Foley en la bifurcación de los cuernos uterinos, recuperando el líquido de colecta por la misma sonda. El medio recuperado es volcado en cajas de Petri cuadriculadas para proceder a la búsqueda de embriones bajo lupa (10X). Mediante la recuperación quirúrgica de embriones se obtienen tasas medias de recolección superiores a las reportadas mediante los procedimientos no quirúrgicos (tasa media de recolección, 50-60%). Sin embargo, la tasa de recuperación embrionaria decrece significativamente con las sucesivas intervenciones quirúrgicas, como consecuencia de la formación de adherencias. Técnicas no quirúrgicas. La técnica no quirúrgica por laparoscopía fue desarrollada por Mc Kelvey y col. (1986) en ovinos, y por Vallet y col. (1987) en caprinos. Se realizan tres punciones (con trócares) en la cavidad abdominal. La primera punción permite introducir el laparoscopio; la segunda, una sonda de tres vías -cada vía corresponde a-: 1) entrada del PBS, 2) salida del PBS y 3) insuflación del balón); y la tercera, una pinza no traumática. Esta pinza permite la manipulación del tracto reproductivo, a fin de hacer avanzar la sonda por la luz uterina y fijar la unión útero tubárica durante el flujo de PBS. Esta técnica requiere un muy buen entrenamiento y su costo es elevado debido a la necesidad de disponer de un laparoscopio. Presenta una menor eficiencia en la recuperación de embriones (60%). La obstrucción de la sonda por coágulos o mucus representa a veces una gran dificultad; pero su ventaja es que se producen menos adherencias y por lo tanto el porcentaje de recuperación embrionaria no disminuye en las intervenciones sucesivas. Vallet y col. (1987) obtuvieron tasas de recuperación del 59, 58 y 68% en caprinos. Recientemente, Gusmão y col. (2009) desarrollaron una novedosa técnica de recuperación transcervical de embriones, a partir de un estudio que permitió la expansión del cuello uterino en ovejas Dorper mediante la aplicación intravaginal de un análogo sintético de prostaglandina E1 (PGE1). Esta técnica permitió obtener una media de 6.0 (±3.6) embriones por donante. Gusmão (2011) presenta una interesante revisión sobre esta novedosa tecnología de recuperación transcervical de embriones. En caprinos, la recuperación transcervical de embriones puede ser considerada una alternativa viable para la TE. El tiempo medio para realizar una recuperación de embriones quirúrgica es de aproximadamente 15 a 20 minutos, 20 a 30 minutos por laparoscopía y 30 minutos por recuperación transcervical. Independientemente de la técnica de recuperación embrionaria utilizada, y si se desea contar con la seguridad de que las hembras donantes no queden preñadas por embriones no recuperados, se recomienda la administración de prostaglandinas PF2 alfa al final de las intervenciones. Búsqueda de embriones. El medio de lavado recolectado es vertido en una placa de búsqueda de embriones. La búsqueda se realiza bajo lupa con platina térmica a 38 ºC. Se recomienda efectuar siempre una segunda lectura de la placa. A medida que se identifican los embriones, los mismos son aspirados mediante micropipeta y colocados en una caja de Petri con medio de conservación o Holding, a resguardo de la luz y a temperatura de laboratorio. Una vez finalizada la búsqueda, se procede a la clasificación de los embriones. De ser posible es importante utilizar campana y aire filtrado. Cabe recordar que se debe trabajar en condiciones estrictas de esterilidad. Clasificación de embriones. La clasificación de los embriones se realiza en base a sus aspectos morfológicos y con 10 a 40 aumentos. Una micropipeta o una fina pipeta de vidrio permitirán mover los embriones, para poder observarlos desde distintos ángulos. Se debe observar la integridad de la membrana pelúcida y su esfericidad. El embrión debe tener un desarrollo acorde con el día de colecta; se tolera hasta un máximo de 24 horas de retraso. Las células deben ser claras y de contorno regular, siendo la opacidad signo de degeneración. El grado de calidad es una estimación de la predicción de sobrevivencia embrionaria. Uno de los sistemas de clasificación consiste en cuatro categorías (grados 1, 2, 3 y degenerados). Grado 1: Indica que el embrión es casi perfecto con más de 98% de la masa celular activa y saludable. Grado 2: Indica que el 70 a 98% de la masa celular es activa y saludable; pueden presentarse algunas blastómeras extruidas. Grado 3: Indica que los embriones son de baja calidad, presentan menos del 70% de la masa celular activa y saludable; varias blastómeras se presentan extruidas. Los embriones degenerados no presentan signos de masa celular activa y la mayoría de las membranas presentan ruptura. En algunos embriones se puede observar desprendimiento parcial de células en el espacio perivitelino. Esta característica es tolerable si el resto conforma una masa celular uniforme y sin opacidad. Cuando los embriones son dudosos, se recomienda realizar una segunda observación a las dos horas. Este tipo de examen morfológico no constituye un test absoluto de la viabilidad embrionaria. Sin embargo se presentan diferencias significativas en la sobrevivencia embrionaria cuando se transfieren embriones de calidad regular respecto a la calidad buena o excelente. Siembra de embriones. Se recomienda que el tiempo transcurrido entre la recuperación de los embriones y su siembra no supere las 2 horas en el medio de conservación embrionario. Si se trata de embriones previamente congelados, el tiempo máximo entre descongelamiento y siembra se reduce a 20 o 30 minutos. Los 2 métodos más utilizados en la siembra de embriones son el quirúrgico o no quirúrgico por laparoscopía en ambos casos se procede a realizar una punción en la cara dorsal del cuerno uterino, a 1 cm de la unión utero tubárica. Mediante una micropipeta, se deposita el embrión en la luz uterina (acondicionado en 10 µl de PBS). Existe una técnica combinada en la cual se visualiza el cuerno uterino por laparoscopía, se realiza una pequeña incisión de 1 cm en la línea media abdominal, y mediante una pinza no traumática, se exterioriza el cuerno uterino para realizar la siembra embrionaria (Siembra semiquirúrgica de embriones). El sitio habitual de siembra de los embriones es el cuerno ipsilateral del ovario con cuerpo lúteo. Se debe tener la precaución de evitar una lesión traumática del cuerpo lúteo durante la manipulación de la siembra embrionaria. En referencia a la siembra embrionaria por vía cervical, es de muy baja utilización debido a la dificultad que presenta el paso del cérvix según. (Lewalski y col. 1991, Flores-Foxworth y col. 1992, Wulster-Radcliffe y col. 1999). Se consideran la factibilidad de utilizar la siembra transcervical embrionaria mediante tratamientos combinados de estradiol y oxitocina. En las cabras lecheras se ha determinado una tasa superior de sobrevivencia embrionaria (crías nacidas/embriones transferidos) cuando se realiza una siembradoble. La utilización del laparoscopio permite realizar una buena clasificación de las receptoras por su respuesta ovulatoria. En ciertas oportunidades y en especial cuando se trata de cabras, se presentan receptoras con folículos quísticos o cuerpos lúteos regresados. Estas hembras no deben ser utilizadas como receptoras. Se debe asegurar que se dispone de hembras con uno o dos cuerpos lúteos correspondientes al día 6 o 7 del ciclo estral. Asimismo se debe tener presente, al realizar la selección de las receptoras, que la sobrevivencia embrionaria estaría influenciada por 24 el número de cuerpos lúteos. Conservación de embriones. Conservación por enfriamiento a 5 °C la posibilidad de conservación de embriones facilita la difusión de material de alto valor genético a nivel local o regional. Para un transporte a corta distancia, la refrigeración a 5 °C permite su conservación por 24 horas, en medio de cultivo (Ovum Culture Medium). La velocidad de enfriamiento se realiza a razón de 1 °C por minuto. El calentamiento de los embriones se realiza a 0.6 °C por minuto o bien se colocan directamente a 37 °C en PBS enriquecido. Se examinan a la lupa, se seleccionan y se siembran inmediatamente. El porcentaje de sobrevivencia varía entre el 35 al 48. Así mismo la Conservación por congelamiento en nitrógeno líquido En animales domésticos, los primeros resultados de congelamiento de embriones se publican en la década del 70 (Whittingham y col. 1972, Wilmut y Rowson 1973). En 1976 se publicaron los primeros trabajos en caprinos (Bilton y Moore 1976) y en ovinos (Willadsen y col. 1976). Al igual que el semen de estas especies, es posible realizar el congelamiento de sus embriones y mantenerlos en nitrógeno líquido por períodos prolongados. Este método de conservación ha permitido la comercialización internacional y por ende la difusión de material genético a nivel mundial. El procedimiento consiste en exponer a las células embrionarias a la incorporación de medios crioprotectores. Estos compuestos (polialcoholes) son capaces de penetrar en las células por difusión simple y su función es disminuir la formación de cristales de agua por medio del descenso del punto de congelación. El medio que contiene los embriones (extracelular) es más rico en agua que el medio intracelular. Por lo tanto, al comienzo del congelamiento, la formación de los primeros cristales de hielo se produce en el medio extracelular, generando la salida de agua intracelular hacia el exterior, por difusión, y disminuyendo la formación de hielo intracelular. Los tiempos y la velocidad del proceso de congelamiento determinan la futura viabilidad del embrión. La congelación se realiza con embriones de calidad excelente o muy buena, en estado de mórula compacta o blastocisto expandido (día 6to o 7mo post estro). El estadío de blastocisto es más resistente al congelamiento, debido a que una parte de las células puede sufrir severos daños, pero sin que se limite el futuro desarrollo del embrión. La selección de los embriones antes de su congelamiento es de vital importancia, debido a que su estado determina sus posibilidades de sobrevivir a la descongelación. Los blastocistos sin membrana pelúcida pueden ser congelados sin afectarse su sobrevivencia. Las limitantes en este caso son de tipo sanitario. La conservación de embriones en nitrógeno líquido puede llevarse a cabo mediante la técnica de congelamiento o vitrificación. Técnica de congelamiento. Una vez recuperados y seleccionados los embriones, se colocan sucesivamente en soluciones crecientes de etilenglicol 0.5, 1.0, 1.5 M durante 10 minutos/solución (Anexo 2) en PBS con 20% de suero fetal bovino a temperatura ambiente. Durante este período se produce encogimiento celular por pérdida de agua y lenta reexpansión por ingreso del crioprotector. Finalizada esta etapa, se colocarán en pajuelas de 0.25 ml. Es importante rotular las pajuelas, indicando la hembra donante, raza, número de embriones y fecha. Los embriones se acondicionarán en la pajuela con la solución de 1.5 M de etilenglicol en PBS, separados hacia ambos extremos por un espacio de aire y una columna de PBS + suero. A continuación, se sella la pajuela con alcohol polivinílico. Técnica de descongelamiento. El descongelamiento de los embriones se realiza en baño termostático en agua a 37 °C durante 30 segundos. Posteriormente, se realiza la extracción progresiva del crioprotector en etapas sucesivas (5 a 10 minutos cada una), sumergiendo los embriones en placas de Petri con concentraciones decrecientes de etilenglicol (1 M, 0.5 M) en PBS + suero fetal 20%, y luego se los coloca en una placa con PBS + suero. Seguidamente se realiza una evaluación de las características morfológicas. En este examen se lleva a cabo una selección de los embriones debido a los daños que se presentan por el proceso de congelamiento/descongelamiento. Como valor de referencia, se acepta entre un 10 y un 30% de embriones dañados. Otra técnica de remoción del crioprotector al descongelamiento, consiste en el empleo de sucrosa. Esta sustancia, debido a su alto peso molecular, no puede pasar al interior de los embriones y genera por lo tanto, un medio hiperosmótico extracelular que ejerce una difusión masiva del crioprotector hacia el exterior de los embriones. Asimismo produce retención de agua en el medio extracelular impidiendo que ésta ingrese a mayor velocidad que la salida del crioprotector. En la práctica, los embriones descongelados se colocan en una solución de sucrosa 0.25-0.5 M en PBS + suero durante 5 a 10 minutos, y luego se realizan 3 pasajes sucesivos de 5 a 10 minutos en PBS + suero. Se recomienda que ante la compra de embriones se solicite al laboratorio que realizó el congelamiento de embriones, el envío del protocolo de congelamiento y de descongelamiento y el certificado sanitario correspondiente. En ovinos, hemos empleado la técnica de congelamiento lento en cilindro sobre vapores de nitrógeno, acondicionados en pajuelas, en una cámara central de etilenglicol 1.5 M en PBS + suero y con la incorporación de las cámaras de sucrosa 0.25 M en ambos extremos. El descongelamiento se realizó en forma rápida en baño de agua, procediéndose al mezclado de las cámaras de la pajuela en una pequeña caja de Petri. Los embriones fueron clasificados bajo lupa, sembrándose inmediatamente 2 embriones por hembra receptora. Con esta metodología hemos obtenido tasas de preñez del 30 al 40%. En caprinos, si bien hemos empleado una metodología de congelamiento similar a la mencionada para los ovinos, obtuvimos mejores resultados al acondicionar los embriones en PBS enriquecido con bovine serum albumine (BSA) al 4%0; y mediante el descongelamiento en una solución de sucrosa 0.25 M en PBS+BSA y 3 pasajes sucesivos en PBS+BSA durante 5 a 10 minutos. Se sembraron 2 embriones por receptora, obteniéndose una tasa de preñez del 33%. Principales técnicas de transferencia de embriones en la yegua. Manejo de la yegua Yeguas donantes. Debe realizarse un examen completo de evaluación reproductiva de la yegua donante para saber si esa yegua puede ser usada en un programa de transferencia embrionaria. Si se identifican en el examen anormalidades que necesitan tratamiento (ej: endometritis bacteriana) deben ser tratadas antes de utilizar a la yegua para transferencia embrionaria. El manejo de la donante incluye el recelo (retajeo) para monitorear la conducta reproductiva, la palpación rectal y ultrasonografía para monitorear la actividad folicular durante el ciclo estral. Durante el celo, la donante es examinada diariamente para evaluar el crecimiento folicular que permite saber el momento óptimo de la inseminación con semen fresco, refrigerado o congelado. Yeguas receptoras. La seleccióny el manejo de la yegua receptora es posiblemente el factor más importante que afecta el éxito de un programa de transferencia embrionaria. Las yeguas receptoras deben tener ciclos estrales normales, y estar libres de normalidades uterinas y ováricas. La edad óptima de las yeguas receptoras es de 3 a 10 años. La sincronización entre la yegua donante y la yegua receptora puede ser llevada a cabo usando prostaglandina F2α PGF2α) sola o combinada con progesterona exógena Las yeguas en celo son examinadas diariamente por palpación rectal y ultrasonografía para monitorear el crecimiento folicular y detectar la ovulación. La sincronización de la ovulación entre la yegua receptora y la yegua donante tiene un intervalo de +1 a -3 días (ej: la yegua receptora puede ovular un día antes y hasta 3 días después que la yegua donante). Con el objetivo de eliminar la necesidad de sincronizar yeguas donantes y receptoras, se han utilizado yeguas ovariectomizadas tratadas con progestágenos como receptoras (11-14) sin embargo, el éxito obtenido varía y el método no ha sido ampliamente adoptado. Recuperación embrionaria. Los embriones equinos son selectivamente transportados a través del oviducto hacia el útero entre los día 5 a 6 postovulación estando en estadios de desarrollo de mórula compacta (a blastocito temprano. Después de entrar al lumen uterino, el tamaño del embrión crece exageradamente hasta blastocito expandido. Aunque los embriones pueden ser recuperados entre los días 6 y 9 después de la ovulación, los días óptimos son el séptimo o el octavo. La principal indicación para recuperar embriones en el día 6 es para realizar el congelamiento de dichos embriones. Los embriones no son recuperados en el día 9 porque el porcentaje de transferencia exitosa es generalmente más bajo que para los embriones recuperados en los días 7 u 8 la recolección embrionaria es realizada por lavado uterino transcervical. Después de colocar a la yegua en el brete, la zona del periné es lavada usando detergente suave, bien enjuagado con agua limpia y secada. El operador se coloca un guante de plástico estéril en el brazo y gel lubricante estéril, luego introduce el catéter (o la sonda) estéril, que cuenta con un balón en la vagina. El autor utiliza un catéter de silicona de 80 cm con un diámetro interno de 8 mm (Escala Francesa 33); también están disponibles otros catéteres de lavado. Después de meter el catéter en la vagina éste es colocado a través del cérvix en el cuerpo uterino, el balón es insuflado con 80 cc de aire o solución salina estéril y luego se tracciona hacia atrás contra el orificio cervical interno para prevenir la pérdida de líquido. Una vez colocado el catéter, el útero es lavado tres a cuatro veces con solución salina amortiguada con fosfatos puro o modificado (DPBS) previamente entibiado (30 - 35º C) conteniendo 1% (v/v) de suero fetal bovino, penicilina (100 unidades/ml) y estreptomicina (100 μg/ml). El útero es llenado con 1 a 2 litros de DPBS en cada lavado (4 a 8 litros son usados durante todo el proceso de recolección). Después de llenado el útero se le permite al líquido salir y pasar a través de un filtro para embriones de 0.75μ. Es importante que el filtro de embriones no rebase o quede sin líquido; los filtros son ahora diseñados para prevenir ambos problemas. El líquido que pasa por el filtro es recolectado para evaluar cuanto se recuperó. Después del primer lavado el útero es masajeado a través del recto durante los subsiguientes lavados, y esto puede ayudar a que el embrión quede suspendido en el medio y además aumentar la recuperación total del líquido. La mayoría (> 90%) del líquido de lavado debería ser recuperado y estar libre de restos celulares o de sangre. La recuperación de líquido de lavado opaco indica que la yegua tiene un proceso de endometritis activa en el momento del lavado, y necesitará una evaluación diagnóstica futura. La presencia de sangre es asociada con un masajeo vigoroso del útero y o la manipulación del catéter. Una vez finalizado el lavado el contenido del filtro es vaciado en una caja de Petri con cuadrícula para la búsqueda y enjuagado con DPBS. El líquido recuperado es revisado utilizando un microscopio estereoscópico a un aumento de 15x. Los embriones de 8 días usualmente se ven a simple vista. Cuando un embrión es identificado, es lavado como mínimo por 3 pasajes sucesivos en gotas de un mililitro de medio DPBS con 10% de suero fetal bovino (esterilizado por pasaje por filtro de 0.22 μ); después del lavado el embrión se coloca en el mismo medio en una placa de Petri de 35 x 10 mm. El embrión es evaluado a mayor aumento (40 - 80x) y calificado usando la escala de 1. Los embriones pueden ser tomados utilizando pajuelas de 0,25 o 0,5 cc, pipetas capilares de vidrio de 25 μl, o cualquier otro instrumento adosado a una jeringa. Cada vez que se tome un embrión con un tipo de estos capilares o pajuelas, la columna de líquido que contiene el embrión debe ir rodeada de una burbuja de aire en cada extremo y luego una columna de medio líquido sólo. Esto previene accidentes como el de absorber la columna de medio al tocar con el extremo de la pajuela algún material absorbente. El proceso de levantar y depositar un embrión debería ser realizado bajo lupa estereoscópica. Una vez que los embriones son colocados en el medio de mantenimiento, estos deben ser rápidamente envasados para el transporte o transferidos a una hembra receptora, dado que la viabilidad del embrión disminuye después del almacenamiento por más de 3 horas en DPBS. Mientras los embriones están esperando a ser envasados o transferidos, aparentemente toleran temperaturas que varían entre la temperatura ambiente (25º C) y la temperatura corporal (37º C). Sin embargo es importante prevenir los cambios de temperatura rápidos y extremos. Envasado de los embriones para transporte. Los embriones equinos son refrigerados y transportados utilizando el método desarrollado por Carnevale que utiliza al medio F-10 de Ham como medio de mantenimiento y refrigeración. Previo a la utilización del medio éste debe ser amortiguado utilizando una mezcla de gases; 90 % N2, 5% O2, y 5% CO2 gaseando el medio durante 3 a 5 minutos. Luego el medio es suplementado con 10% (v/v) suero fetal bovino, penicilina (100 unidades/ml) y estreptomicina (100 μg/ml). Debido a que el medio F-10 de Ham debe ser gaseado antes de ser usado y esto requiere de un tanque de la mezcla de gases con su válvula reguladora, muchos veterinarios solicitan que el centro de transferencia embrionaria les envée el medio F-10 de Ham ya gaseado antes de la recuperación del embrión. Transferencia embrionaria. La transferencia embrionaria puede ser realizada en forma quirúrgica o no quirúrgica, sin importar si el embrión es transferido inmediatamente después de ser recuperado o después de ser refrigerado. Históricamente la transferencia embrionaria quirúrgica ha dado los mejores y más consistentes resultados de preñez, aproximadamente 70 a 75% una semana después de la transferencia Comunicaciones recientes de la técnica de transferencia no quirúrgica han demostrado un porcentaje de éxito igual y hasta superior al obtenido con la transferencia quirúrgica (20-21). La transferencia quirúrgica es realizada con la yegua en estación, por laparotomía por el flanco utilizando sedación y tranquilización en conjunto con anestesia local. Utilizando una técnica quirúrgica convencional se exterioriza el cuerno uterino a través de la incisión en el flanco, se perfora la superficie usando una aguja y luego se agranda colocando un fórceps de iris a través de la incisión hasta la luz uterina. El embrión contenido en un pequeño volumen de medio (< 250 μl) en una pajuela o en otro tipo de capilar, es depositado en la luz uterina.El orificio en el cuerno uterino no es suturado, el útero es colocado nuevamente en el interior del abdomen y la pared abdominal es suturada con la técnica estándar. Debido a la movilidad del embrión equino en el lumen uterino, este puede ser transferido en el cuerno uterino ipsilateral o contralateral a la ovulación. La transferencia embrionaria no uirúrgica es usualmente realizada utilizando: 1) pipeta de inseminación artificial estándar, 2) pistola de inseminación plástica desechable, o 3) pistola de inseminación de acero inoxidable reusable. En todos los casos se utiliza una camisa sanitaria plástica estéril para cubrir los instrumentos de transferencia. Para realizar la transferencia no quirúrgica, la yegua es colocada en un brete, sedada y luego se prepara el área perineal como fue descrito para la recolección embrionaria. Cabe destacar que el operador se coloca un guante plástico estéril en el brazo y encima un guante de látex estéril. Se coloca gel lubricante estéril en el dorso de la mano del operador y sobre la vulva de la yegua. La punta del instrumento de transferencia (cubierto por la camisa sanitaria estéril) es colocada en la palma de la mano y la punta es protegida por el pulgar. El instrumento es colocado a través de la vagina y la punta introducida en el orificio cervical externo aproximadamente 0.5 cm y en este momento se adelanta hacia la luz del cuerpo uterino. El embrión puede ser depositado en el cuerpo uterino o en alguno de los cuernos uterinos. Para depositar el embrión en el cuerno uterino el instrumento es guiado por palpación transrectal. Ubicado correctamente, el instrumento de transferencia es retirado lentamente de manera que la punta no sea obturada por la pared del endometrio mientras se descarga el embrión. Análisis de las diferentes técnicas de trasferencia de embriones en ovinos, caprinos. Existen dos técnicas de transferencia de embriones la quirúrgica y la no quirúrgica La transferencia o implante del embrión en las receptoras se puede realizar mediante técnicas quirúrgicas por laparotomía (ventral o lateral), pero actualmente se utiliza la no quirúrgica (transcervical), similar a una inseminación artificial, y el embrión se coloca en una pajuela. Es una técnica de reproducción animal artificial, mediante la cual una hembra gestada (donante) se le extrae los embriones antes de su implantación al endometrio, y son transferidos a hembras vacías (receptoras); con sus ciclos estrales sincronizados al de la donante, para que completen sus respectivos procesos de gestación. La técnica no quirúrgicas transervical, laparotomia lateral: se introduce en la cavidad abdominal, se sacan los cuernos uterinos hasta los labios de la herida y se hace una perforación con la parte roma de una aguja de sutura, por esta se introduce una pipeta Pasteur con el embrión y al llegar a la luz se deposita el contenido, se lleva el útero a su lugar y se cierra. El cuerno en el cual se deposita el embrión, es aquel que tiene el ovario con cuerpo luteo. Es un técnica que posee mayor porcentaje de preñes pero dificultosa y lleva demasiado tiempo. Transervical : Es similar a una inseminación artificial, el embrión se coloca en una pajuela o se comercializa pronto para implantar. Beneficios y sus contras. Ventajas. El aumento de la tasa de embarazo, de la tasa de implantación, de la tasa de parto y de recién nacidos vivos. La disminución del número de embriones a transferir y por lo tanto también menor riesgo de embarazos múltiples. La tasa de embarazo ectópico también puede estar disminuida. Facilita la selección de embriones a transferir tanto al embriólogo como al clínico, y los sobrantes a criopreservar. El porcentaje de preñez es de alrededor del 60% con embriones frescos y 40 a 50% con embriones congelados. Desventajas. Alto valor económico. La técnica quirúrgica conlleva mucho tiempo de reposo del animal. Análisis de las diferentes técnicas de trasferencia de embriones en yeguas. La transferencia embrionaria puede ser realizada en forma quirúrgica o no quirúrgica, sin importar si el embrión es transferido inmediatamente después de ser recuperado o después de ser refrigerado. Históricamente la transferencia embrionaria quirúrgica ha dado los mejores y más consistentes resultados de preñez, aproximadamente 70 a 75% una semana después de la transferencia. La técnica de transferencia no quirúrgica han demostrado un porcentaje de éxito igual y hasta superior al obtenido con la transferencia quirúrgica (20-21). La transferencia quirúrgica es realizada con la yegua en estación, por laparotomía por el flanco utilizando sedación y tranquilización en conjunto con anestesia local. La transferencia embrionaria equina es una valiosa técnica de reproducción asistida en la yegua. Aunque inicialmente el uso de la transferencia embrionaria en los programas comerciales fue obstaculizado por la necesidad de tener un grupo de yeguas receptoras en el lugar de la recolección embrionaria, o transportar a las yeguas donantes a los centros de transferencia embrionaria, el desarrollo de métodos exitosos de transporte de embriones refrigerados eliminó la necesidad de mantener a las yeguas receptoras en el mismo sitio. El transporte de embriones y el hecho de que los materiales necesarios para la recolección y transporte son accesibles, permite que más veterinarios ofrezcan el servicio de transferencia a los clientes que solicitan esta técnica. Aunque el servicio de transferencia embrionaria es accesible a más propietarios y criadores de caballos, la eficiencia de la transferencia embrionaria se ve limitada por la inhabilidad de inducir la superovulación en las yeguas. Beneficios y sus contras. Ventajas. Transferencia embrionaria quirúrgica ha dado los mejores y más consistentes resultados de preñez, aproximadamente 70 a 75% una semana después de la transferencia. La técnica de transferencia no quirúrgica han demostrado un porcentaje de éxito igual y hasta superior al obtenido con la transferencia quirúrgica (20-21). El aumento de la tasa de embarazo, de la tasa de implantación, de la tasa de parto y de recién nacidos vivos. Desventajas. Alto valor económico. La técnica quirúrgica conlleva mucho tiempo de reposo del animal. Conclusión. En cuanto a la Transferencia de Embriones, esta técnica favorece el desarrollo genético completo, si se tiene en cuenta que no solo se valora la historia del semental, sino que de forma paralela se puede comercializar la genética materna (Vizuete, 2016); un hecho relevante en la actualidad es que la comercialización de embriones para ser transferidos puede cruzar las fronteras y alcanzar cualquier continente; también se exalta la posibilidad que abre la TE de obtener potros de excelente exposición de raza de aquellos animales bien valoradas pero muy mayores para soportar una preñez adecuadamente, o la obtención de embriones de aquellas que se consideran superiores y por consiguiente generan una positiva influencia genética en su descendencia. En estos tiempos se reconoce la importancia que ostenta la producción, no solo en Venezuela sino en realidad en casi todo el mundo, por ello la técnica de transferencia de embriones es una labor significativa para el médico veterinario; es así que dependiendo de la práctica y de los conocimientos que el profesional tenga sobre el tema, la aplicación de la técnica puede conducir a resultados óptimos. Esto desde varias perspectivas, una es el favorecer la genética, otra es el aumentar el número viable de potros por año y de por sí, mantener activa la industria equina; y una alta producción ganadera en otras palabras, se contribuye a: la conservación de las especies, la producción animaly por supuesto al desarrollo investigativo y económico. Bibliografía. https://www.pavo-horsefood.es/blog/ventajas-y-desventajas-de-la-transferencia-de-embriones- en- yeguas/158#:~:text=La%20transferencia%20de%20embriones%20es,tambi%C3%A9n%20se%20le %20llama%20portadora. http://asosenepolcolombia.com/portal2/wp-content/uploads/2021/06/SELECCION-DE-HEMBRAS- Y-PROTOCOLOS-PARA-TE.pdf https://congresos.cio.mx/memorias_congreso_mujer/archivos/sesion4/S4-BCA35.pdf https://www.produccion-animal.com.ar/produccion_ovina/inseminacion_ovinos/06- transferencia_embriones.pdf https://www.ecuestre.es/app/caballo/temas-de-cria/la-transferencia-embrionaria https://www.pavo-horsefood.es/blog/ventajas-y-desventajas-de-la-transferencia-de-embriones-en-yeguas/158#:~:text=La%20transferencia%20de%20embriones%20es,tambi%C3%A9n%20se%20le%20llama%20portadora https://www.pavo-horsefood.es/blog/ventajas-y-desventajas-de-la-transferencia-de-embriones-en-yeguas/158#:~:text=La%20transferencia%20de%20embriones%20es,tambi%C3%A9n%20se%20le%20llama%20portadora https://www.pavo-horsefood.es/blog/ventajas-y-desventajas-de-la-transferencia-de-embriones-en-yeguas/158#:~:text=La%20transferencia%20de%20embriones%20es,tambi%C3%A9n%20se%20le%20llama%20portadora https://www.pavo-horsefood.es/blog/ventajas-y-desventajas-de-la-transferencia-de-embriones-en-yeguas/158#:~:text=La%20transferencia%20de%20embriones%20es,tambi%C3%A9n%20se%20le%20llama%20portadora http://asosenepolcolombia.com/portal2/wp-content/uploads/2021/06/SELECCION-DE-HEMBRAS-Y-PROTOCOLOS-PARA-TE.pdf http://asosenepolcolombia.com/portal2/wp-content/uploads/2021/06/SELECCION-DE-HEMBRAS-Y-PROTOCOLOS-PARA-TE.pdf https://congresos.cio.mx/memorias_congreso_mujer/archivos/sesion4/S4-BCA35.pdf https://www.produccion-animal.com.ar/produccion_ovina/inseminacion_ovinos/06-transferencia_embriones.pdf https://www.produccion-animal.com.ar/produccion_ovina/inseminacion_ovinos/06-transferencia_embriones.pdf https://www.ecuestre.es/app/caballo/temas-de-cria/la-transferencia-embrionaria
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