CARRILLO LEONOR Microbiologia Agricola Completo

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MICROBIOLOGÍAMICROBIOLOGÍA
AGRÍCOLAAGRÍCOLA
Leonor Carrillo
Dra. en C iencias Químicas (Orientac ión Biológica)
Profesora Titular en
Facultad de Ciencias Agrarias, UNJ u
y Facultad de Ingeniería, UNSa
© Universidad Nacional de Salta
ISBN 987-9381-16-5 
(http://www.unsa.edu.ar/matbib)
2003
 
 
CONTENIDOCONTENIDO
1.Microorganismos.1.Microorganismos.
Reinos. Organismos procarióticos: eubacterias, arqueobacterias, actinomicetos, cianobacterias,
mixobacterias. Organismos eucarióticos: mohos levaduras, macromicetos, mixomicetos, protozoos,
algas, líquenes. Organismos acelulares: virus, viroides, priones. Transferencia genética en bacterias:
conjugación, transformación , transducción, fusión de protoplastos.
2. Vida y muerte de 2. Vida y muerte de los microorganismolos microorganismo s.s.
Crecimiento. Tipo de nutrición. Factores de crecimiento orgánicos y minerales. Transporte de solutos.
Factores ambientales: agua y presión osmótica, tensión superficial, pH, oxígeno, potencial redox,
temperatura. Medios de cultivo. Esterilización. Acción del calor, radiaciones, luz ultravioleta,
microondas y ultrasonido. Separación por filtración. Desinfección. Interacciones microbianas: antibiosis,
mutualismo y simbiosis. Fijación simbiótica del nitrógeno. Micorrizas. Biopelículas. Predación.
3. Actividad microbiana.3. Actividad microbiana.
Suelo. Metabolismo. Degradación de biopolímeros: celulosa, almidón, levanos, xilanos y otras
hemicelulosas, pectinas, quitina, lignina, lípidos, proteínas, polinucleótidos. Metabolismo productor de
energía. Respiración: degradación de hexosas, ciclo del ácido tricarboxílico, cadena de transporte de
electrones, fosforilaciones. Fermentaciones: lácticas, alcohólica, propiónicas, fórmicas, butírico-
butanólica, acéticas, de aminoácidos. Oxidaciones incompletas. Respiración anaeróbica. Desnitrificación,
reducción a nitritos, sulfatorreducción y metanogénesis. Bacterias autotróficas. Nitrificación,
sulfooxidación, ferrooxidación. Biosíntesis. Síntesis de proteínas y otros compuestos.
4. Estructuras fúngicas.4. Estructuras fúngicas.
Estructuras somáticas. Estructuras reproductoras anamórficas y teleomórficas.
5. Rumen y biogas.5. Rumen y biogas.
Metanogénesis, diversidad de las arqueobacterias metanogénicas. Rumen, un digestor natural.
Características del biogas. Digestores anaeróbicos, materia prima, factores ambientales, criterios de
diseño y construcción, operación, peligros potenciales y seguridad.
6. Micotoxinas.6. Micotoxinas.
Hongos en el campo y el almacenamiento. Honhos toxigénicos y micotoxinas “naturales”. Producción
de micotoxinas. Peligros. Prevención.
7. Hongos.7. Hongos.
Clasificación. Macromicetos. Ascomycota y Basidiomycota. Hongos micorrizantes, inoculación de
plantines. Cultivo del champiñón, obtención del micelio, preparación del compost, siembra del inóculo,
producción. Cultivo de hongos lignívoros, preparación del substrato, inoculación y producción de las
setas, cultivo sobre troncos.
ApéndiceApéndice
Medios de cultivo y esterilización. Aislamiento y cultivo de microorganismos. Fijación simbiótica de
nitrógeno en leguminosas. Microorganismos del suelo. Inhibidores y desinfectantes. Digestión
anaeróbica de residuos agrícolas. Morfología microscópica de hongos. Identificación de mohos
toxigénicos. Micorrizas. Microorganismos del agua.
 
 
ÍNDICEÍNDICE
Actinomicetos 1-8
fijadores de nitrógeno 2-7
Aerobio 2-7
Agua 2-5
actividad 2-5
humedad relativa 2 -5
microorganismos A-31
potencial 2-6
Algas 1-13
Amonificación A-16
Anaerobio 2-7, 3-19
Antibacteriano 2-14, A-21
Antibiosis 2-14
Antifúngico 2-14, A-2 1
Arqueobacterias 1-7, 3-21, 5-2
Autotótrofo 2-2, 3-21, A-2
Bacterias
butíricas 3-19
celulolíticas 3 -6
eubacterias 1 -4
fijadoras simbióticas 2 -16
fijadoras vida libre 3-24
formas 1-7
gr am-positivas 1-4
gr am-negativas 1-4
halófilas 1-8
lisogénicas 1-14
metanógenas 1-8, 3-21, 5-1
ruminales 3-21, 5-4
termoacidófilas 1 -8
Bactericida 2-14
Bacteriocinas 2 -14
Bacteriófago 1 -14
Bacteriostático 2-14
Bacteroide 2-16, 3-25
Biodegradación 3-5
Biogas 5 -1
características 5-8
Biopelícula 2-18
Biosíntesis 3-20, 3-23
ácidos grasos 3-25
aminoácidos 3 -23
glúcidos 3-26
nucleótidos 3 -25
proteínas 3 -23
Cadena respiratoria 3 -16, 3 -20
Capacidad de campo 2 -6, 3 -3
Catabolismo 3-14
Células
eucarióticas 1-1 0
procarióticas 1 -3
Cianobacterias 1-9, 3 -25
Ciclo del
azufre 3 -21
citrato 3 -16
nitrógeno 3-2 1
Colonias de bacterias 1-6
Coloraciones A-10
Crecimiento 2-1
Cultivos
bacterias 2-9, A-8
hongos 7-11, 7-12, A -11
medios 2 -9, A-2
Degradación de
almidón 3-8
biopolímeros 3-4
celulosa 3-6, A-18
hemicelulosas 3-9
hexosas 3-15
levanos 3-15
lignina 3-11
lípidos 3-12
pectinas 3-10
polinucleótidos 3 -14
proteínas 3-13
quitina 3-11
xilanos 3-9
Desinfección 2-13, A-21
Desnitrificación 3 -19, A -16
Digestión anaeróbica 5 -2, A-23
carga 5-13, 5-14
construcción 5-10
criterios de diseño 5 -10
digestores rurales 5-5
etapas 5-2
factores ambientales 5-9
microorganismos 5-2
operación 5-1 3
otros digestores 5-6
parámetros 5-7. 5-11
residuos 5-6
seguridad 5 -14
División celular 1-7
Endosporos bacterianos 1-6
termorresistencia 2-11
Esporas fúngicas 1 -11, 4 -2
Esterilización
calor 2-11, A-3
filtración 2-13, A-4
presión autoclave 2-11
radiaciones 2-12
 
 
Factores de crecimiento 2-3
Factores ambientales 2-5, 3-3, 5-9
actividad agua 2-5
luz ultravioleta 2 -13
microondas 2-13
oxígeno 2-7
pH 2-6
potencial agua 2-6
potencial de reducción 2-8
presión osmótica 2 -5
radiaciones 2-12
temperatura 2-8, 3-3
tensión superficial 2-6, 2-14
ultrasonido 2-13
Facultativo 2-7
Fermentaciones 3-17
acética 3-19
ácida mixta 3-18
aminoácidos 3-19
butanodiólica 3-1 8
butírico-butanólica 3-19
etanólica 3 -18
fórmicas 3 -18
lácticas 3-17
propiónicas 3-18
Ferrooxidación 3-22
Fijación del CO2 3-26
Fijación de nitrógeno
vida libre 3-24, A -17
inoculante 2-17, A-13
mecanismo 3 -24
simbiótica 2-16, A-13
Flagelos bacterianos 1-5
Fotosíntesis bacteriana 3-26
Fotótrofo 2 -2, 3 -26
Genética bacteriana 1 -15
conjugación 1-16
genoma 1-4
plásmidos 1 -6
recombinación 1-1 6
replicación 1-15
transducción 1-18
transforma ción 1-17
Halófilo 2-6
Heterótrofo 2-2, A-2
Hongos 4-1, 7-1, A -25
ascomicetos 4-4, 7 -3
anamorfos 4-2
basidiomicetos 4-5, 7-4
clasificación 7-1
champiñón 7-11
cultivo 7-11, 7-12
deteriorantes 6-1
estructuras somáticas 4-1
estruct. reproductoras 4-1
levaduras 1-1 2
lignívoros 3 -11, 7 -12
macromicetos 1-12, 7-3
mohos 1-11
micorrizantes 2-18, 7-8, A-29
teleomorfos 4-4
Humedad relativa 2-5
Inoculantes
bacterianos 2-17, A -13
fúngicos 7-10
Interacciones microbianas 2-15
Levaduras 1-12, 4-1
Líquenes 1-13
Macromicetos 1 -12, 7 -3
Medios de cultivo 2-9, A -2
Membranas bacterianas
citoplasmática 1-4
internas 3-22
Mesófilo 2-8
Metabolismo 3-4
bacteroides 3-2 5
productor de energí a 3 -14, 3 -20
Metabolitos secundarios 3 -26, 6 -1
Metanogénesis 3 -21, 5-1
Micorrizas
ectomicorriza 2-18, 7-9, A-29
endomicorriza 2-18, 7-9, A-29
inoculación 7 -10. A-29
Micotoxinas 6-1
mohos toxigénicos 6-3, A-27
prevención 6 -6
principales toxinas 6 -3
producción 6 -2
toxicidad 6-4
Microorganismos 1-1
agua A-31
amilolíticos 3 -8
celulolíticos 3-6
desnitrificantes 3 -19
eucariotas 1 -10
lignívoros 3 -11, 7 -12
pectinolíticos 3-10
procariotas 1-3
quitinolíticos 3-11
suelo 3-1
tamaño 1-1, A-12
Micronutrientes 2-3
Mixobacterias 1 -9
Mixomicetos 1-12
 
Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice 11
Apéndice
Guía de trabajos prácticos
CONTENIDOCONTENIDO
1. Medios de cultivo y esterilización
2. Aislamiento y cultivo de microorganismos
3. Fijación simbiótica de N 2 en leguminosas
4. Microorganismos del suelo
5. Inhibidores y desinfectantes
6. Digestión anaeróbica de residuos agrícolas
7. Morfología microscópica de hongos
8. Identificación de mohos toxigénicos
9. Micorrizas
10. Microorganismos del agua 
 
Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice22
TRABAJO Nº TRABAJO Nº 1. 1. Medios de cultivo Medios de cultivoy esterilizacióny esterilización
ObjetivoObjetivo. Preparar los substratos o medios de cultivo, cuya com posición varia según el tipo de
organismos y la selectividad esperada, para estudiar los microorganismos en el laboratorio.
Esterilizar estos materiales para eliminar los microorganismos que pudieran alterarlos antes del
uso. 
IntroducciónIntroducción
NutriciónNutrición
Los microorganismos toman del ambiente circundante los materiales o nutrientes que son el
punto de partida para las reacciones metabólicas que los convierten en constituyentes celulares.
Hay nutrientes necesarios sin los cuales una célula no puede crecer, y otros útiles pero no
indispensables.
La primera división en las categorías nutricionales tiene en cuenta dos parámetros: la
naturaleza de la fuente de energía y la naturaleza de la fuente principal de carbono. Los
organismos que usan la luz como fuente de energía se denominan fotótrofos y los que utilizan
fuentes de energía química se denominan quimiótrofos. Los que emplean CO 2 como principal
fuente de carbono se definen como autótrofos, pero los que utilizan compuestos orgánicos para
el mismo fin se llaman heterótrofos. Los microorganismos necesitan una diversidad de
minerales para su crecimiento, y los más comunes son el potasio, sodio, magnesio, calcio e
hierro. Los factores de crecimiento son compuestos orgánicos específicos requeridos en muy
pequeñas cantidades y no puede ser sintetizados por la célula.
Diseño de un medio de cultivoDiseño de un medio de cultivo
En el cuadro siguiente se consideran tres medios de distinta complejidad.
Medio Medio 1 1 Medio Medio 2 2 MediMedio o 33
agua 1 L agua 1 L agua 1 L
cloruro de amonio 1 g peptona o triptona 5 g peptona de soja 10 g
fosfato dipotásico 1 g extracto de carne 3 g glucosa 10 g
carbonato de calcio 1 g agar 15 g extracto de levadura 2,5 g
sulfato de magnesio 10 mg agar 15 g
sulfato ferroso 10 mg
cloruro de calcio 10 mg
sales inorgánicas de 0,02 mg
Mn, Mo, Cu, Co, Zn de cada uno
Al elaborar un medio de cultivo para un organismo cualquiera, el objetivo pricipal consiste en
proporcionar una mezcla equilibrada de los nutrientes requeridos, en concentraciones que
permitan un buen crecimiento. El punto de arranque es componer una base mineral que
proporcione las sales inorgánicas que pueden suministrarse a cualquier organismo. Esta
solución puede suplementars e luego, si es necesario, con una fuente de carbono, una de energía,
una de nitrógeno y algún factor de crecimiento requerido.
El medio 1 puede permitir el crecimiento de bacterias nitritantes autótrofas que usan eldióxido de carbono como fuente de carbono y oxidan amonio para obtener energía. El medio 2
es un medio complejo que favorece el desarrollo de muchas bacterias heterótrofas que obtienen
energía y también carbono de aminoácidos y péptidos, pero no requieren factores de
crecimiento. El 3 contiene glucosa, varios constituyentes nitrogenados orgánicos y factores de
crecimiento como para cubrir las necesidades nutricionales de mohos y levaduras.
Cualquier medio adecuado para el crecimiento de un organismo específico es, en cierto modo,
selectivo para él. Los microorganismos deseados pueden obtenerse de los ambientes naturales
 
Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice 33
tales como el suelo, empleando medios selectivos.
Como agente gelificante de los medios de cultivo se utiliza comúnmente el agar que es
obtenido de algas pero no es nutriente para la mayoría de los microorganismos. El gel de agar
es firme a las temperaturas de incubación pero se convierte en líquido (sol) cuando se calienta a
la temperatura de ebullición del agua, gelificando nuevamente cuando se enfria a 45ºC. Otra
manera de proporcionar una superficie nutritiva es utilizar un filtro de membrana de esteres de
celulosa depositado sobre un disco de absorbente embebido con el medio de cultivo. El medio
traspasa los poros permitiendo el desarrollo de los microorganismos que están en la superficie.
El extracto de carne es un extracto acuoso de músculo de bovino, concentrado hasta una
consistencia pastosa o desecada hasta polvo, que contiene compuestos solubles tales como
azúcares, aminoácidos y sales. El hidrolizado de proteína se obtiene por digestión de músculo
con pepsina (peptona) o tripsina (triptona) o de caseína (casitona, tripticase) o de proteina de
soja (peptona de soja). Los medios complejos deshidratados contienen algunos componentes
cuya concentración varía con cada partida y suelen tener una baja capacidad reguladora del pH.
EsterilizaciónEsterilización
Esterilizar significa eliminar toda clase de microorganismos. Esto puede realizarse de
diferentes modos. Pueden eliminars e las bacterias del aire por filtración, como en las cámaras de
flujo laminar estéril, y de los líquido a través de membranas fltrantes u otro filtro. La
destrucción de las bacterias puede hacerse mediante calor seco o húmedo para el tratamiento de
la mayoría de los materiales, o rayos ultravioletas para el caso de superficies, o con radiaciones
ionizantes para esterilizar plásticos deseartables.
El calor seco se utiliza en estufa de aire caliente, pero
no es un método eficaz de calentamiento porque el
aire es un mal conductor del calor. En ausencia de
humedad las formas más resistentes (endosporos
bacterianos) requieren temperaturas por sobre 160ºC
durante una hora y media para morir.
El vapor a presión es el procedimiento más efectivo
de esterilización por calor húmedo. El vapor a una
presión absoluta de 2,066 kg/cm 2 proporciona una
temperatura de 120,6ºC que es mortal para los
endosporos bacterianos en pocos minutos, pero el
tiempo de aplicación varía según el tiempo necesario
para homogeneizar la temperatura en el material
tratado.
La presión absoluta a la que está sometido el
material dentro del autoclave es igual a la presión
leída en el manómetro sumada a la presión
atmosférica del lugar. Como esta última varia con la
altura sobre el nivel del mar, debe calcularse la
presión manométrica necesaria para llevar a cabo la
esterilización en cada localidad, haciendo caso omiso
de las graduaciones en temperaturas adicionadas al
manómetro por los fabricantes a nivel del mar. En la figura 1 se ven las curvas de temperaturas
alcanzadas en función del tiempo en un autoclave con distinto grado de purgado del aire. La
figura 2 muestra el tiempo requerido para esterilizar distintos volúmenes a 120,6ºC.
La temperatura de ebullición del agua puede ser usada para esterilizar materiales nutritivos
que se alterarían a temperaturas mayores, mediante el siguiente artilugio: el material es tratado
durante 30 minutos el primer día e incubado a la temperatura ambiente, vuelto a calentar 30
minutos el segundo día y otra vez incubado, para finalmente calentarla otros 30 minutos el
tercer día. El tratamiento durante el primer día destruye las formas vegetativas, el período de
 
Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice44
incubación permite la
germinación de muchos
endosporos y las formas sensibles
srcinadas mueren con el
segundo calentamiento. Los
endosporos que persistieron
germinarán durante el segundo
período de incubación y las
células formadas morirán con el
tercer calentamiento. Como se ve,
la tindalización es efectiva
únicamente cuando el medio a
esterilizar es favorable para la
germinación de los esporos. No
destruirá los endosporos de
anaerobios si la incubación no se
lleva a cabo en condiciones de
anaerobisis y tampoco destruirá a
los endosporos del grupo
termofílico.
Teniendo en cuenta la cinética
microbiana el fin práctico de la
esterilización mediante un agente
letal es lograr que la probabilidad
de que el material tratado
contenga tan sólo un
superviviente, sea muy
pequeña. Los procedimientos habituales de esterilización se proyectan siempre de forma que
proporcionen un amplio margen de seguridad.
FiltraciónFiltración
Los microorganismos quedan retenidos por el pequeño tamaño de los poros del filtro y con
algunos tipos de materiales filtrantespor adsorción sobre los mismos, además de la influencia
del pH del líquido sobre las cargas de los microorganismos y el filtro. Comúnmente en el
laboratorio se usan membranas de esteres de celulosa con porosidades de 0,45 µm ó 0,2 µm,
pero también suelen usarse en otros casos unos filtros de porcelana o vidrio fritado
(sinterizado).
ProcedimientoProcedimiento
Preparación del material de vidrioPreparación del material de vidrio
Obturar con algodón la extremidad no aguzada de las pipetas con la ayuda de un punzón.
Colocar dos o tres de ellas en un sobre de papel y cerrarlo con broches metálicos, o bien
envolverlas separadamente en una tira de papel. Envolver con papel cada caja de Petri cerrada.
Tapar los tubos de ensayo con algodón prensado de tal modo que, se pueda quitar y colocar el
tapón sin deformarlo. Reunir unos diez tubos en un paquete.
Esterilización por aire calienteEsterilización por aire caliente
El material limpio y bien seco, una vez tapado con algodón y/o envuelto con papel, se ubica
en el interior de la estufa (horno o esterilizador). Luego se calienta hasta que la temperatura
alcance 170ºC y se la mantiene durante 30 a 60 minutos enfriar según la carga. Se deja enfriar el
aparato antes de abrir, para evitar la rotura del vidrio por el contacto brusco con el aire frío. Al
 
Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice 55
terminar la operación, el algodón y/o el papel de diario tendrán un color tostado pálido. Desde
los 150ºC ambos comienzan a amarillear, pero a los 180ºC pierden la propiedad de detener las
bacterias y se forman residuos carbonosos más o menos antisépticos.
Control de la eficacia de la esterilizaciónControl de la eficacia de la esterilización
Se coloca en la estufa, junto con el material de vidrio, un tubo con endosporos bacterianos
(cultivo seco o suelo tamizado). Una vez sometido al tratamiento térmico, se le agrega un medio
nutritivo líquido y se incuba a 30ºC durante 48 horas. Si se ha logrado la esterilización, no habrá
desarrollo bacteriano.
Preparación de medios de cultivoPreparación de medios de cultivo
La mayoría de las bacterias heterótrafas pueden multiplicarse en el medio 2 denominado "
agar nutritivo". Para disolver el agar se calienta el recipiente en un baño de agua hirviente o en
el autoclave a vapor fluente. El pH del medio debe estar próximo a 7. Si se prepara sin agar se
obtiene el medio llamado "caldo nutritivo".
Los hongos suelen crecer más lento que las bacterias y toleran mejor la acidez, por lo que suele
usarse para su cultivo el medio 3 conocido como "agar micológico" cuyo pH es
aproximadamente 5,6, al que se le añadió extracto de levadura para que desarrollen aun los
organismos exigentes en vitaminas.
Los medios se distribuyen en tubos de ensayo o en matraces de Erlenmeyer ocupando sólo un
tercio de su capacidad. Tanto los tubos como los matraces llevan tapones de algodón, excepto
cuando tienen tapa a rosca esterilizable. Los tubos se reúnen en cestos y se los cubre con dos o
tres hojas de papel poroso donde se escribe con lápiz el nombre del contenido. Se cubren los
matraces con un capuchón de papel y un hilo atado de tal forma que pueda quitarse fácilmente.
Los medios de cultivo se esterilizan en autoclave.
Esterilización por vapor de agua a Esterilización por vapor de agua a presiónpresión
En el autoclave se logra que la temperatura del vapor de agua sea superior a la ebullición
(96ºC a 1300 m s.n.m.) por medio de un aumento de la presión, luego de la eliminación del aire
por la espita o válvula de purga. Si funciona a 1,18 kg/cm 2 por sobre la presión atmosférica
promedio local (0,88 kg/cm 2 = 884 HPa), el agua hervirá a 121ºC.
Al mantener esta temperatura durante 15 minutos se logra la destrucción de toda forma de
vida en volúmenes menores a 100 mL. El mismo resultado se alcanza prácticamente en
materiales poco contaminados, calentando a 115ºC (0,84 kg/cm 2 de presión manométrica)
durante 20 minutos. Los sólidos o liquidos muy viscosos deben ser calentandos a 121ºC durante
30 minutos. Si el autoclave está muy cargado, o los volúmenes son mayores, es necesario
prolongar el tiempo de calentamiento.
Con estas condiciones de tratamiento pueden sobrevivir los endosporos de bacterias
termofílicas, pero éstas no crecen a las temperaturas comunes de incubación (25 - 37ºC).
Colocar agua hasta la rejilla, ubicar los recipientes y cerrar el autoclave, ajustando las
mariposas opuestas para que la tapa quede bien apoyada sobre la junta de goma. Encender el
mechero. Cerrar la espita, o válvula de purga, recién cuando sale un chorro de vapor continuo
pues entonces se ha logrado purgar el aparato. A partir de este momento comienza a aumentar
la presión, la que se regula y mantiene con la altura de la llama. Vigilar el autoclave durante la
esterilización.
Cumplido el tiempo, cerrar la llave de gas y esperar hasta que la aguja del manómetro vuelva
a cero, antes de abrir la espita para igualar las presiones, interna y externa. Luego abrir la tapa.
Si se abriera la espita durante el enfriamiento, la brusca descompresión producirla la ebullición
violenta de los líquidos y los proyectarla fuera de los recipientes. Por otra parte si se abre
demasido tarde, el vapor se habrá condensado sobre los papeles y algodones, y se habrá
acelerado el deterioro de la junta de goma por el vacio formado.
 
Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice66
Control de la temperatura de Control de la temperatura de esterilizaciónesterilización
Se coloca un tubito con ácido benzoico en polvo (p.f. 121ºC) junto al material a esterilizar.. Si
se alcanza la temperatura de fusión durante el proceso de esterilización, luego del enfriamiento
quedará una masa homogénea de ácido benzoico.
También se usan mezclas indicadoras adheridas sobre cartón u otro material, tal como la
compuesta por carbonato de plomo + azufre precipitado + carbonato de litio (10 + 1+ 3). Esta
mezcla vira al gris después de 30 minutos a 100ºC, en 3 ó 4 minutos a 110ºC y en 30 segundos a
121ºC. Toma color negro si está expuesta más de 30 minutos a 110ºC y
en 5 minutos a 121ºC.
Esterilización por filtraciónEsterilización por filtración
Se eliminan los bacterias de las soluciones que se descomponen o
inactivan al someterlas a la temperatura del autoclave, pasándolas a
través de membranas con poros de 0,2 ó 0,45 µm u otros filtros. La
membrana o disco filtrante se coloca sobre una superficie porosa rígida,
en una suerte de embudo desmontable adaptado a un matraz de
Kitasato (ver figura 3) mediante un tapón de goma, para poder hacer un
vacio parcial con una bomba o una trompa de agua. La tubuladura
lateral del matraz se conecta a un tubo engrosado en su parte media,
donde se coloca algodón. Se envuelve el conjunto con papel y se
esteriliza en el autoclave. Después se ubica el disco filtrante en el
embudo desmontable cumpliendo con las reglas de asepsia y se conecta
el matraz de Kitasato a la trompa de agua o la bomba de vacío.
Control de la eficiencia de la filtraciónControl de la eficiencia de la filtración
Dos porciones del material nutritivo filtrado se transfieren en condiciones de asepsia a
recipientes estériles y se incuban, uno a 30ºC y otro a 45ºC, durante 48 horas. Si se logró la
esterilización no debe haber desarrollo microbiano.
BibliografiaBibliografia
o Madigan TM et al. Brock- Biología de los Microorganismos. Prentice Hall, Madrid, 1998
o Stanier RY et al. Microbiología. Reverté, Barcelona, 1984
o Carpenter P, Microbiología, Interamericana, México, 1979
o Umbreit W. Modern Microbiology. WH Freeman & Co, San Francisco, 1962
 
Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice 77
TRABAJO N° 2. TRABAJO N° 2. Aislamiento y cultivo de micAislamiento y cultivo de microorganismosroorganismos
ObjetivoObjetivo. Separar por métodos físicos los microrganismos, provenientes de un ambiente natural,
de tal manera que al multiplicarse sobre un substrato nutritivo se obtenga una población (en el
caso de bacterias o levaduras) o un individuo(en el caso de un moho).
Reconocer al microscopio las características generales de los microorganismos mediante
preparaciones en fresco o coloraciones de extendidos del material.
IntroducciónIntroducción 
Microbios uni y pluricelularesMicrobios uni y pluricelulares
Los organismos más sencillos son aquéllos que están constituidos por una sola célula. Como
las células se miden en micrómetros ( µm) estos organismos unicelulares caen dentro de la
categoría general de microbios o microorganismos. La organización unicelular se observa en
protozoos, algunas algas, levaduras y la mayoría de las bacterias. Un tipo más complejo de
organización biológic a es la de los organismos pluricelulares. Aunque surgen en general a partir
de una sola célula, en estado maduro constan de varias células permanentemente unidas unas a
otras de un modo característico, lo cual le confiere una forma típica al organismo. Así un moho
esta compuesto por filamentos ramificados. Cada filamento se denomina hifa y al conjunto de
hifas se lo llama micelio.
Aislamiento, cultivoAislamiento, cultivo
Dos clases de operaciones fundamentales en la microbiología clásica son el aislamiento o
separación de un microorganismo determinado de las poblaciones mixtas que existen en la
naturaleza, y el cultivo o crecimiento del microorganismo en medios artificiales bajo
condiciones de laboratorio. Estas operaciones son básicamente iguales para el estudio de las
bacterias, los hongos, las algas, los protozoos y las lineas de células vegetales o animales (cultivo
de tejidos).
Para el aislamiento directo se emplean medios gelificados. Cuando un inoculo mixto que
contiene una cierta variedad de organismos diferentes se extiende directamente sobre la
superficie de un medio gelificado, todos aquéllos que puedan crecer sobre el mismo producirán
colonias. La dispersión de los microbios sobre el medio elimina gran parte de la competencia
por los nutrientes y por ello algunos que crecen lentamente son capaces de multiplicarse en el
mismo ambiente de los que crecen rápidamente.
Como consecuencia del aislamiento aparecen luego de la incubación, poblaciones de bacterias
y levaduras e individuos fúngicos sobre la placadel medio de cultivo. Se los puede mantener
vivos en el laboratorio mediante transplantes a otros medios de cultivo.
AmbienteAmbiente
Los principales ambientes naturales de los microorganismos son el suelo y el agua. Muchos
organismos se encuentran en una capa delgada de suelo de algunos decímetros de espesor. Los
microrganismos de las masas de agua, por ejemplo lagos, están concentrados en la superficie y
en el fondo por encima del cieno. Los microorganismos transportados por el aire son seres que
accidentalmente se encuentran en este medio y provienen del suelo, agua u otros organismos
vivos.
Es necesario que haya ciertas condiciones en el ambiente para que sirva como reservorio de los
microorganismos. El crecimiento depende del abastecimiento adecuado del agua y las
substancias nutritivas, el pH conveniente, la tensión de oxigeno suficiente, la temperatura
necesaria y otros factores.
OxígenoOxígeno
Muchos organismos requieren oxigeno molecular pues dependen de la respiración aerobia
para cubrir sus necesidades energéticas y se los denomina aerobios obligados. Entre éstos,
 
Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice88
algunos crecen mejor a presiones parciales de oxigeno menores que la presente en el aire y se los
conoce como microaerófilos. Hay microorganismos son anaerobios facultativos, pues pueden
crecer tanto en presencia como en ausencia de aire. Comprende dos subgrupos: uno, el de las
bacterias que tienen un metabolismo productor de energia exclusivamente fermentativo pero no
los afecta la presencia de aire; otro, el de las levaduras o bacterias que pueden pasar del
metabolismo respiratorio al fermentativo. En cambio los anaerobios estrictos sólo fermentan y
son sensibles al oxigeno.
Crecimiento, coloniaCrecimiento, colonia
En cualquier sistema biológico el crecimiento puede definirse como el aumento ordenado de
todos los constituyentes químicos de un organismo. El crecimiento determina la multiplicación
celular y en los organismos unicelulares motiva un aumento del número de individuos,
mientras que en los
multicelulares lleva al
aumento del tamaño
del individuo.
En el aislamiento se
tomó una pequeña
cantidad de células
microbianas y al
deslizar el asa sobre el
agar se las distribuyó
por la superficie.
Durante la incubación
la célula aislada se
dividió repetidamente hasta formar una masa visible llamada colonia sobre el medio de cultivo.
El crecimiento de las poblaciones bacterianas está normalmente limitado por la desaparición de
los nutrientes accesibles o por la acumulación de productos metabólicos tóxicos. Al describir
una colonia se usan distintos vocablos para describir forma, elevación y borde de la misma
como se muestra en la figura 4.
BacteriasBacterias
La mayoría son organismos unicelulares que se multiplican por escisión binaria transversal. Se
distinguen varios tipos respecto a su forma y agrupación como se esquematiza en la figura 5.
Algunas bacterias forman células de reposo, conocidas como endosporos, que tienen bajo
contenido de agua, son muy refringentes y se tiñen con dificultad.
Los endosporos soportan el calor, la desecación y algunas substancias químicas, muchos
resisten a 100º.C durante unas 20 horas, otros sólo unos minutos a 90ºC
Las bacterias móviles tienen uno o varios flagelos. Para verlos con el microscopio óptico se los
debe engrosar mediante un mordiente antes de la coloración. Suele obs ervarse el movimiento
bacteriano cuando se coloca una gota de un cultivo en medio líquido entre cubre y portaobjetos.
Los actinomicetos son un grupo de bacterias filamentosas, ramificadas, que forman un micelio
delgado y en la mayoría de los casos células de multiplicació n llamadas esporos.
 
Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice 99
ColoracionesColoraciones
El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resulta difícil de ver con el
microscopio óptico. La principal dificultad es el poco contraste entre la célula y el medio que la
rodea, y la manera más simple de aumentarlo es utilizando colorantes.
Las células generalmente son tratadas de diversa manera, antes de teñirlas, para coagular el
protoplasma en un proceso que se llama fijación. En el caso de las bacterias, la fijación por calor
es lo más corriente, aunque también puede emplearse formaldehido, metanol o ácidos. La
fijación se realiza habitualmente en células que han sido secadas sobre un portaobjetos. Luego le
sigue la tinción.
La mayoría de los colorantes usados son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad
especifica con los materiales celulares. El azul de metileno es un buen colorante que actúa
rápidamente sobre las bacterias y es útil para detectar bacterias en medios naturales, puesto que
no tiñe la mayor parte del material extraño.
Tinción de GramTinción de Gram
Es un método diferencial de tinción para bacterias. Luego del tratamiento con cristal violeta
todas las células están coloreadas. Al agregar iodo se forma un complejo con el colorante en el
interior de las mismas. Después de añadir etanol o acetona algunos organismos se decoloran
(Gram-negativos) y otros no (Gra m-positivos) según la estructura física de l a pared, no p or los
constituyentes químicos pues las levaduras son gram-positivas aunque tienen una pared
químicamente distint a a las de las bacterias.
Para poner de manifiesto las células incoloras se utiliza una coloración de contraste, tal como
safranina o fucsina básica que tiñen de rojo a las células gram-negativas mientras las gram-
positivas permanecen violetas.
ProcedimientoProcedimiento
Aislamiento de microorganismos del polvo ambientalAislamiento de microorganismos del polvo ambiental
La técnica depende del material a partir del cual se intenta aislar los microorganismos y de las
características de estos últimos. Vertir unos 15 mLde agar nutritivo, licuado en baño da agua
hirviente, en una caja de Petri e igual cantidad de agar de
Sabouraud licuado en otra. Dejar gelificar y luego exponer las placas
al aire dejando sedimentar el polvo ambiental durante 30 minutos.
Incubar a 27—30ºC durante 48 horas la caja con agar nutritivo y a
25-27ºC por 5 días la del agar de Sabouraud. Al cabo de ese tiempo
examinar las colonias microbianas presentes.
Aislamiento de bacterias esporuladasAislamiento de bacterias esporuladas
del suelodel suelo
Calentar una suspensión de suelo por 10
minutos en un baño de agua a 80ºC.
Flamear el asa hasta que tenga color rojo
brillante y dejar que se enfríe dentro de la
zona de convección del mechero. Tomar
una gota de la suspensión y extenderla sobre la superficie de una placa de agar nutritivo
haciendo las primeras estrías como se muestra en la figura 6. Flamear el asa y hacer la segunda
serie de estrias con el asa vacia. Flamear otra vez el asa y hacer la tercera serie de estrías con el
asa vacía. Incubar las cajas con la tapa hacia abajo (invertidas) a 25-30ºC duran te 48 horas.
Aislamiento de rizobios de nódulos radicales de leguminosasAislamiento de rizobios de nódulos radicales de leguminosas
Lavar la raíz para quitar el suelo adherido. Elegir los nodulos de mayor tamaño, separarlos y
colocarlos en un tubo o frasquito. Lavarlos nuevamente, agitando con fuerza para eliminar la
 
Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice1010
mayor parte de los residuos. Poner los nodulos durante 30 segundos en etanol 95% y luego
sumergir en lavandina concentrada diluida al 1/10 durante 3 a 6 minutos. Lavar tres o cuatro
veces, agitando enérgicamente, en sendos tubos de agua estéril. Para transferir los nodulos de
un recipiente a otro usar una pinza co n la punta previamente mojada en alcohol y flameada.
Tomar un nodulo y colocarlo entre dos portaobjetos cuyas caras enfrentadas habían sido
flameadas. Aplastarlo y tomar el material del nodulo con el asa para hacer estrías sobre la placa
del medio de cultivo especifico como se muestra en la figura 6. Incubar a 25-30ºC.
El medio de cultivo para rizobios contiene manitol 10 g, extracto de levadura 4 g, carbonato de
calcio 3 g, fosfato dipotásico 0,5 g, sulfato de magnesio 0,2 g, cloruro de sodio 0,l g, agar 15 g,
rojo Congo 25 ppm o verde brillante 125 ppm, agua 1 litro; pH 7,0. Se esteriliza a 115ºC durante
20 minutos.
Observación de las placas de aislamientoObservación de las placas de aislamiento
El inoculo fue diluido progresivamente en cada estría sucesiva de tal manera que, después de
la incubación en la estufa, el crecimiento es confluente en los trazos iniciales y las colonias están
bien aisladas a lo largo de las últimas estrías. Observar las características macromorfológicas de
las colonias y registrarlas en la planilla de informes correspondiente. Tomar con un asa material
de una colonia y hacer un extendido sobre un portaobjetos. Luego de secar y fijar por calor,
hacer una coloración de Gram para observar las células somáticas o de Wirtz para ver los
endosporos.
Tinción de GramTinción de Gram
Poner el portaobjetos sobre un soporte y cubrirlo con una solución de violeta cristal. Luego de
1 minuto agregar solución de iodo. Después de 1 minuto, lavar con agua. Decolorar con alcohol
96°. Lavar con agua y cubrir con una solución de safranina durante 1 minuto. Lavar con agua y
secar. Colocar una gota de aceite para inmersión. Llevar el portaobjetos a la platina de un
microscopio. Mirar a través del objetivo de bajo aumento (10x) y una vez enfocado el objeto
colocar el objet ivo de inmersión en aceite (100x) moviendo el revólver. Levantar el condensador
pues la intensidad de la luz debe ser mayor con los objetivos de mayor aumento. Ajustar el
enfoque mediante el tornillo micrométrico. Regular la cantidad de luz por medio del diafragma.
Las bacterias Gram-negativa s se tiñen de rojo anaranjado y las Gram-positivas adquieren color
violeta. Dibujar lo observado manteniendo la proporción respecto al campo microscópico .
La solución de violeta cristal contiene 1 g de colorante disuelto en 20 mL de alcohol 96° y 80
mL de agua. La de safranina se prepara de igual manera usando 0,25 g de colorante. La solución
de iodo según Lugol contiene 1 g de iodo y 2 g de ioduro de potasio en 100 mL de agua.
Coloración de endosporosColoración de endosporos
Cubrir el extendido con solución de verde de malaquita. Encender un hisopo embebido en
alcohol y calentar el portaobjetos por debajo del soporte. Apagar y repetir la operación luego de
un minuto. Repetir el calentamiento dos veces
más. Lavar con agua. Cubrir con solución de
safranina durante 1 minuto. Lavar con agua y
secar. Colocar una gota de aceite para
inmersión. Los endosporos se verán verdes y las
células somáticas de color rojo anaranjado.
Dibujar lo observado.
La solución de verde de malaquita contiene 2 g
de colorante disuelto en 20 mL de alcohol 96° y
80 mL de agua.
Selección y transplantes de Selección y transplantes de coloniascolonias
Elegir colonias de bacterias y hongos en las
placas anteriores y repicarlas como se muestra
 
Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice 1111
en la figura 7. Incubar los cultivos de bacterias a 30-35°C en la obscuridad, si se trata de hongos
colocarlos a 25-27°C preferentemente donde reciban una iluminación diurna difusa para
favorecer la esporulación.
a) cultivo de bacterias en aerobiosis
sobre medios gelificadossobre medios gelificados. Flamear el asa hasta que tenga color rojo brillante. Tomar el tubo con
la mano izquierda. Quitar el tapón de algodón sosteniéndolo con el dedo meñique de la mano
derecha. Pasar la boca del tubo por la llama
del mechero. Introducir el asa, estéril y fría, en
el tubo y extraer un poco de material
microbiano. Volver a flamear la boca del tubo
y colocar el tapón. Tomar el tubo con medio
estéril, destapar y flamear como el anterior.
Introducir el asa y depositar los
microorganismos rayando en zig-zag la
superficie del medio gelificado, con mucha
suavidad. Sacar el asa, flamear la boca del
tubo y tapar. Flamear el asa.
en medios líquidosen medios líquidos. Proceder igual que en el
caso anterior y depositar los
organismos dentro del medio
líquido.
b) cultivo de hongos
El procedimiento para sembrar
levaduras es similar al empleado
para bacterias. Para cultivar
hongos se emplea un gancho,
inserto en el mango de Kolle, que
permite tomar los filamentos para
transferirlos al nuevo medio.
microcultivo.microcultivo.Colocar sobre un portaobjetos, previamente flameado y
enfriado, un trozo de medio gelificado de 1 cm de lado y 2 a 3 mm de
espesor, tomado de una placa estéril. Sembrar en los bordes libres del
trozo de agar como se muestra en la figura 8. Colocar un
cubreobjetos, también flameado y enfriado. Incubar los microcultivos
en una cámara húmeda, lograda poniendo algodón mojado bajo el
soporte de los portaobjetos dentro de un recipiente cerrado.
Observación de los cultivos en tubosObservación de los cultivos en tubos
macroscópica
Después de la incubación observar los cultivos a simple vista o con
ayuda de la lupa y registrar en el informe las características
morfológicas (ver figura 9). Evitar la agitación del medio líquido
pues si ha crecido una película superficial, esta puede caer
confundiéndose con el sedimento.
microscópica
Hacer un preparado de las bacterias (ver figura 10), fijar por calor en
la llama o microondas, y colorearlo según el método de Gram.
Suspender los hongos en agua, líquido de Patterson o colorante de
Gueguén al hacer el preparado en fresco y con ayuda de dos agujas
separar los filamentos.
 
Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice1212
El colorante de Gueguén contiene 0,1 g de azul de algodón y 0,1 g de Sudán III en 100 g de
ácido láctico, además de 10 gotas de tintura de iodo. El líquido de Patterson se prepara
mezclando 50 mL de solución acuosa de acetato de potasio al 2%, con 20 mL de glicerina y 30
mL de etanol 96º
Observar el microcultivocon el objetivo de menor aumento, luego de enfocar un objeto
adherido a la cara inferior del cubreobjetos se podrá utilizar el siguiente objetivo.
Medida del tamaño de los microorganismosMedida del tamaño de los microorganismos
El método más práctico usa un ocular
autoenfocable, con una escala arbitraria
dividida en cien pequeñas partes iguales, a
veces numeradas, la que debe calibrarse con la
escala de 1 mm con cien divisiones de diez
micrómetros cada una, grabada en un
portaobjetos llamado micro-métrico (ver figura
11). Enfocar al portaobjetos y mover éste de
modo que su escala quede paralela a la del
ocular.
Observar cual número de las pequeñas
divisiones de 10 µm grabadas en el portaobjetos
coincide con un número entero de las
contenidas en el ocular. Calcular el valor en
micrómetros correspondiente a una división
pequeña de la escala del ocular mediante la
regla de tres simple.
Calibrar la escala del ocular para cada
aumento del microscopio. Tener en cuenta que
las rayas del ocular siempre tendrán el mismo
espesor mientras que las del portaobjetos irán
engrosándose al cambiar los objetivos.
BibliografiaBibliografia
o Hall GS et al. Methods for the Examination of Organismal Diversity in Soils and Sediments. CAB International,
Wallingford, 1996
o Seeley HW & Van Demarck PJ. Microbios en Acción. Blume, Madrid, 1973
o Umbreit W. Modern Microbiology. WH Freeman & Co, San Francisco, 1962
 
Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice 1313
TRABAJO Nº 3. Fijación simbiótica de NTRABAJO Nº 3. Fijación simbiótica de N22 en leguminosasen leguminosas
Objetivo.Objetivo. Observar las características macro y micromorfológicas de los nódulos radicales de
leguminosas. Comprobar la capacidad de nodular de la cepa de rizobio aislada.
IntroducciónIntroducción
Fijación simbiótica del nitrógeno molecular Fijación simbiótica del nitrógeno molecular 
Una de las simbiosis más importantes es la que se da entreleguminosas y bacterias de los géneros Rhizobium y Bradyrhizobium .
La infección de las raíces con una cepa adecuada de la bacteria (hay
especificidad de huésped) conduce a la formación de nódulos
radicales que tienen distinta forma según la planta hospedadora
(figura 12).
Los rizobios específicos entran en la raíz por el extremo de los
pelos absorbentes que se retuercen en forma de báculo. Se forma en
el pelo uno o varios tubos de infección dentro de los cuales los
rizobios se hallan dispuestos en fila. El tubo de infección penetra en
las células del córtex de la raíz. Algunas células de la raíz se
dividen activamente produciendo un meristema.
Los rizobios contenidos en el tubo de infección son liberados en el
citoplasma de estas células meristemáticas donde adquieren una
forma distinta al rizobio de vida libre y se los llama bacteroides.
éstos son capaces de fijar el nitrógeno molecular. En los nódulos la
presión parcial de oxígeno es muy baja, si se eleva la enzima
nitrogenasa quedaría inhibida y no se produciría la fijación. Sin embargo el nódulo consume
oxigeno provisto por la leghemoglobina, una molécula transportadora de O 2 que contiene grupohemo y da a los nódulos color rojizo.
Nodulación de leguminosasNodulación de leguminosas
Nódulos Nódulos efectiefectivosvos
o pocos y situados sobretodo en la raíz primaria
o voluminosos, con superficie lisa o rugosa
o actividad meristematica y nodular prolongada
o infección generalizada, zona bacteriana grande con muchos bacteroides
o interior pigmentado de rojo por la leghemoglobina.
Nodulos inefectivosNodulos inefectivos
o numerosos y repartidos en todo el sistema radicular
o pequeños con superficie lisa
o actividad meristematica y nodular corta
o pocas células infectadas, pocos o sin bacteroides y granulos de almidón
o interior no coloreado de rojo.
Inoculante para leguminosasInoculante para leguminosas
La búsqueda y selección de buenas cepas de rizobios puede resultar inútil si l as leguminosas
nodulan eficientemente con las cepas nativas, situación frecuent e en especies tropicales. Pero, en
muchos suelos el nivel y la eficiencia de las cepas nativas pueden no ser los adecuados y la
nodulación y la fijación de nitrógeno resultan insuficientes para satisfacer las demandas del
cultivo.
La inoculación artificial resulta imprescindible cuando se introducen nuevas leguminosas,
sobre todo si son hospedadores de alta especificidad o cuando la deficiencia en nitrógeno limita
Fi ura 12
 
Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice1414
el desarrollo vegetal. El método y las condiciones de inoculación deben permitir la
supervivencia de los rizobios, además la semilla inoculada debe poseer la especie de rizobio
adecuada y en número suficiente. Las condiciones del suelo próximo a la semilla deben
favorecer la colonización de la rizósfera por la bacteria para lograr la formación de los nodulos y
su funcionamiento efectivo.
Para determinar la necesidad de
inoculación se suele emplear un ensayo
simple de tres tratamientos:
- la inoculación con una cepa de rizobio
conocida para saber si es efectiva en el
hospedador,
- la fertilización para asegurar un buen
desarrollo del hospedador si no hay
inhibidores en el suelo,
- el control no inoculado para observar la
presencia o ausencia de rizobios nativos
y su efectividad.
Las cepas usadas en los inoculantes
deben ser cuidadosamente seleccionadas
y mantenidas, y probarse anualmente
para minimizar la posibilidad de cambio
en las propiedades simbióticas.
La eficencia de la fijación se evalúa por
el número de nódulos, la masa nodular,
el peso seco de la planta y el contenido de nitrógeno de la parte aérea. Son bacterias eficaces las
que, por intermedio de los nódulos radicales, aportan nitrógeno reducido a la planta
hospedadora produciendo un aumento de peso de la misma.
ProcedimientoProcedimiento
Examen de los nódulos y bacteroidesExamen de los nódulos y bacteroides
Tomar un nódulo de la raíz de una leguminosa, medirlo y dibujar su forma. Cortarlo y
observar el color. Si la fijación de nitrógeno era efectiva se lo verá rosado o rojo, a veces pardo.
Aplastarlo entre dos portaobjetos. Extender el material interno mezclado con una gota de agua,
haciendo movimientos circu lares con el asa. Secar cerca de una llama. Fijar pasando tres veces el
portaobjetos por dentro de la llama.
Colocar el portaobjetos sobre un soporte colocado en una bandeja o la pileta. Cubrirlo la
solución colorante (fucsina básica 0,3 g, etanol 96º 10 mL, fenol 5 g, agua destilada 90 mL).
Luego de un minuto lavar con agua. Secar cerca de una llama. Depositar una gota de aceite de
inmersión, apoyar un cubreobjetos y sobre éste poner otra gota de ese aceite.
Observar al microscopio los bacteroides coloreados y dibujarlos tratando de mantener la
proporción respecto al campo microscópico. Anotar el aumento.
Germinación de semillas de Germinación de semillas de leguminosasleguminosas
Colocar las semillas necesarias, de buen poder germinativo, en un matraz de Erlemeyer con
etanol al 70% v/v y agitar durante 3 a 5 minutos. Volcar y añadir agua lavandina al 10% v/v,
agitando por igual tiempo. Lavar varias veces con agua destilada estéril. Depositarlas sobre
agar-agua estéril y dejar germinar.
Preparación del inoculantePreparación del inoculante
Sembrar en matraces con 50 mL de medio de cultiv o con la cepa aislada de nódulos durante el
desarrollo del trabajo nº2. El medio de cultivo contiene: fosfato monopotásico 0,5 g, fosfato
Testi o
Ensa o
Figura 13
 
Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice 1515
dipotásico 0,5 g, cloruro de sodio 0,1 g, nitrato de potasio 0,8 g, sulfato de magnesio 0,2 g,
extracto de levadura 4 g, fosfato diamónico 0,3 g, glicerol 10 g, agua 1 L, pH 6,8. Esterilizar a
121ºC durante 15 minutos.
Inoculación de leguminosasInoculación de leguminosas
Escoger de las placas de germinación las dieciseis plántulas de mejor aspecto y trasladarlas al
medio mineral inclinado en tubos grandes. Dejar en lugar iluminado y ventilado. Uno o dos
días después verter1 mL del cultivo homogeneizado de rizobio sobre la radícula de ocho
plántulas cultivadas.
El medio mineral contiene: fosfato dipotásico 0,5 g, sulfato de magnesio 0,2 g, cloruro
de sodio 0,1 g, cloruro férrico 0,01 g, fosfato tricálcico 2 g, agua 1 L, agar 15 g, pH 7. Esterilizar
a 110ºC durante 20 minutos.
Control de las leguminosas inoculadasControl de las leguminosas inoculadas
Medir la longitud de las plantas inoculadas y las testigo. Observar y registrar la ubicación,
tamaño y forma de los nódulos. Controlar la humedad del substrato.
BibliografíaBibliografía
o Balatti AP & Jardim Freire JR. Legume Inoculants. Selection and Characterization of Strains. Production, Use and
Management. Kingraf, La Plata, 1996
o Frioni L. Ecología Microbiana del Suelo. Universidad de la República, Montevideo, 1990
o Umbreit W. Modern Microbiology. WH Freeman & Co, San Francisco, 1962 
 
Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice1616
TRABAJO Nº TRABAJO Nº 4. 4. Microorganismos del sueloMicroorganismos del suelo
Objetivo.Objetivo. Demostrar la biodiversidad de los grupos fisiológicos de microorganismos del suelo
mediante cultivos selectivos que provean las condiciones ambientales y disponibilidad de
nutrientes adecuadas.
IntroducciónIntroducción
Los microoganismos juegan un papel significativo en la mayoría de los procesos naturales que
afectan al ambiente. Un ejemplo es la fijación del nitrógeno molecular por los organismos de
vida libre y los simbióticos, otro es el reciclado de materiales orgánicos. La materia orgánica que
llega al suelo a través de residuos de cosechas, la caída del follaje, las raíces y sus productos de
descamación y exudación, los restos animales y microbianos sufren una serie de procesos de
degradación que asegura la continuidad de los ciclos biogeoquímicos.
Empleando medios selectivos se puede lograr cultivos enriquecidos en microorganismos con
una característica fisiológica determinada, por ejemplo si carece de una fuente de nitrógeno
soluble sólo crecerán las bacterias capaces de reducir el nitrógeno gaseoso disuelto, procedente
de la atmósfera.
AmonificaciónAmonificación
El nitrógeno orgánico de los productos de hidrólisis de proteínas y polinucleótidos, se
convierte en amoníaco por el proceso de desaminación. La urea se hidroliza rápidamente a
amoníaco y dióxido de carbono por la enzima ureasa producida por muchos microorganismos.
La evolución de la microbiota varía según la materia nitrogenada transformada. En general,
primero aparecen bacilos, esporulados o no, y cocos. Después se observan actinomicetos y más
tarde mohos.
La demostración de la amonificación se basa en investigar amoníaco mediante el reactivo de
Nessler en el medio acuoso con aminoácidos (peptona, etc). La solución de yodo-mercuriatopotásico alcalinizada srcina desde un color amarillo hasta un precipitado rojo ladrillo según la
cantidad de amoniaco presente.
El amoniaco formado puede ser asimilado directamente por otros microrganismos o ser
convertido en nitrato por las bacterias específicas. Si se añade a un suelo materiales tales como
estiércol, aumenta en consecuencia la velocidad de nitrificación.
NitrificaciónNitrificación
El nitrógeno tiene tres formas estables de oxidación en la naturaleza (nitrógeno molecular,
amoníaco, nitrato) cuya interconversión está dada casi exclusivamente por bacterias. Algunos
organismos pueden usar directamente amonio para sintetizar sus aminoácidos y otras
moléculas nitrogenadas de la célula, pero otros, incluyendo las plantas, prefieren nitrato. La
oxidación del amonio a nitrato se denomina nitrificación y unas bacterias autótrofas aerobias las
llevan a cabo en dos etapas:
1) oxidación del amonio por Nitrosomonas, Nitrosococcus 
2) oxidación del nitrito por Nitrobacter, Nitrococcus
Tanto la formación de nitrito como la de nitrato por los microorganismos quimioautótrofos
constituyen procesos metabólicos aeróbicos generadores de energía. Ocurre rápidamente en
suelos bien drenados a pH neutro. Aunque el nitrato es fácilmente asimilado por las plantas,
como es muy soluble en agua resulta rápidamente lavado de los suelos que reciben una gran
cantidad de lluvia. Por el contrario, el amonio queda fuertemente adsorbido a las arcillas.
DesnitrificaciónDesnitrificación
Es el proceso en el cual algunos organismos que pueden usar el nitrato como aceptor final de
electrones durante la respiración anaeróbica producen moléculas reducidas gaseosas (óxido de
dinitrógeno, nitrógeno molecular) que desaparecen del ecosistema. Existen otros
 
Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice 1717
microorganismos que pueden reducir nitrato hasta amonio, manteniendo el nitrógeno en el
ecosistema (reducción asimilatoria del nitrato).
Si un suelo queda anegado se producen condiciones anaeróbicas y ocurre la desnitrificación,
principalmente si es rico en materia orgánica. También sucede cuando se srcinan puntos de
anaerobiosis por otras causas. Como los productos de la desnitrificación son gaseosos se
escapan del suelo disminuyendo el contenido en nitrógeno del mismo. En el laboratorio tales
gases quedan atrapados en la campanita del medio de cultivo.
Fijación de nitrógeno molecular Fijación de nitrógeno molecular 
La utilización de este como fuente de nitrógeno es una propiedad que poseen ciertas bacterias
y cianobacterías. A continuación se da una lista abreviada de organismos fijadores de nitrógeno
de vida libre.
Algunos géneros de bacterias con especies fijadoras de nitrógeno
Aerobios AnaerobiosAerobios Anaerobios
HeterotróHeterotró ficos ficos Fotosintetizadores Fotosintetizadores Heterotróficos Heterotróficos FotosintetizFotosintetiz adoresadores
 Azotobacter cianobacterias Clostridium Chromatium 
Klebsiella Chlorobium
Beijerinckia Rhodospirillum
Bacillus Heliobacterium
 Azomonas
 Azospirillum (microaerófilo)
El nitrógeno es reducido a amonio en el proceso de fijación catalizado por el complejo
nitrogenasa, uno de cuyos componentes proteínicos contiene molibdeno, los otros hierro. La
enzima es inactivada por el oxígeno. El nitrógeno molecular es muy inerte y su reducción
requiere mucha energía.
 Azotobacter crece en un medio liquido sin agitación, en forma de una película superficial. Es
bastante sensible a la acidez pues no suele crecer por debajo de pH 6. Al microscopio se
observan bacilos gram-negativos, grandes, de 4 a 6 µm de largo, acompañados de células de
mayor tamaño con paredes gruesas y apariencia de levadura, conocidas como cistos. Esta
bacteria tiene una gran capacidad respiratoria, medida como velocidad de consumo de oxigeno,
para proveer la energía requerida por la fijación.
Los clostridios fijadores no sólo son incapaces de crecer en presencia de aire sino que
generalmente son muertos por el oxígeno, a menos que se encuentren en forma de endosporos,
pero pueden crecer por debajo de la película de Azotobacter , generando burbujas de gas por la
fermentación de azúcares.
Sulfo-oxidaciónSulfo-oxidación
El sulfuro de hidrógeno, el azufre elemental y el ion sulfato son tres formas estables
importantes del azufre. El sulfuro de hidrógeno es tóxico para la mayoría de los organismos y
los sulfuros son oxidados a sulfato por bacterias aerobias del género Thiobacillus y azufre
elemental por bacterias fotosintetizadoras anaerobias de ambientes acuáticos, el que se acumula
en la célula, sufriendo una posterior oxidación en algunos casos. La mayoría de los
microorganismos oxidantes del azufre son autótrofos obligados.
Sulfato-reducciónSulfato-reducción
El sulfato y otros compuestos oxigenados del azufre, pueden ser reducidos a sulfuro de
hidrógeno por bacterias heterotróficas anaerobias. Esta actividad microbiana es muy evidente
en los barros del fondo de estanques y lagos. Suelen usar hexosas, alcoholes o ácidos orgánicos
como fuente de carbono, pero algunas especies crecen autotróficamente con hidrógeno
molecular y tiosulfato, por ej. Desulfovibrio .
 
Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice1818
Celulolisis,amilolisisCelulolisis, amilolisis
El almidón y la celulosa están compuestos por unidades de glucosa, pero conectadas de
diferente manera: uniones 1,4 α- y 1,4 β-glucosidicas respectivamente, lo que afecta a sus
propiedades. La celulosa es insoluble y se digiere a mucho menor velocidad que el almidón
soluble. La celulosa forma largas fibrillas a las que se encuentran intimamente asociados los
microorganismos que la degradan. Muchos hongos son celulolíticos, pero entre las bacterias
esta propiedad está restringida a unos pocos grupos: mixobacterias, clostridios y actinomicetos.
El almidón, en cambio, es hidrolizado por muchos hongos y bacterias.
Las bacterias celulolíticas predominan en la zona radicular y su densidad decrece en
muestras tomadas a cierta distancia de la planta. Por otra parte, es el proceso fundamental
que ocurre durante el compostaje de residuos agrícolas, donde predominan los
microorganismos termófilos.
Solubilización de fosfatosSolubilización de fosfatos
Algunos mohos comunes, por ej. Penicillium, Aspergillus, Fusarium , pueden solubilizar fosfatos
insolubles como polvo de huesos y apatita. Aproximadamente un décimo de las bacterias del
suelo también los solubilizan. La solubilizació n de fosfato de calcio se ap recia como zonas claras
que rodean las colonias y generalmente se produce cuando los microorganismos forman ácidos
orgánicos tales como ácido 2-ceto-glucónico (bacterias), ác. citrico u oxálico (hongos), pero éstos
son rápidamente degradados por otros organismos del suelo. Los fosfatos de hierro y aluminio
pueden ser solubilizados por los microorganismos productore s de sulfuro de hidrógeno.
ProcedimientoProcedimiento
Fijación de nitrógeno molecular Fijación de nitrógeno molecular 
El medio contiene: manitol 10 g, carbonat o de calcio 0,5 g, solución salina 50 mL, solución de
oíigoelementos 1 mL, agua 1 L. Se distribuye en matraces de Erlenmeyer de 250 mL de
capacidad, a razón de 50 mL en cada uno y se esteriliza a 110ºC durante 20 minutos. Sembrar
unos granulos de suelo e incubar a 25-27°C durante 7 días.
La solución salina contiene: fosfato dipotásico 5 g, sulfato de magnesio heptahidrato 2,5 g,
cloruro de sodio 2,5 g, sulfato ferroso heptahidrato 0,05 g, agua 1 L, pH 7 - 7,5.
La solución de oíigoelementos contiene 0,05 g/L de las sales siguientes: molibdato de potasio,
borato de sodio, nitrato de cobalto, sulfato de cadmio, sulfato de cobre, sulfato de zinc, sulfato
de manganeso, cloruro férrico.
Hacia el tercer día el medio se enturbia ligeramente y en la superfiie aparece un velo grisáceo.
Los días siguientes el velo se pliega, dando una superficie rugosa y mamelonada que se vuelve
parduzca. Finalmente caen trozos de velo dentro del liquido. A su vez el liquido se enturbia
cada vez más y suelen aparecer burbujas en el fondo. La observación microscópica del velo
muestra células bacilares, ovales, cocoides y a veces cistos esféricos, mientras que el material
tomado del fondo permite ver bacilos esporulados Gram- positivo o variable.
Medio para Azotobacter : sacarosa 20 g, fosfato dipotá sico 0,05 g, fosfato monopotásico 0,15
g, cloruro de calcio 0,01 g, sulfato de magnesio heptahidrato 0,2 g, molibdato de sodio 0,002 g,
cloruro férrico 0,01 g, azul de bromotimol (al 0,5% p/v en etanol) 2 mL, carbonato de calcio 1 g,
agua 1 L, pH 6,8. Esterilizar a 110ºC durante 20 minutos.
Medio para
Derxia
: Reemplazar la sacarosa por almidón o glucosa y omitir el carbonato decalcio.
Medio para Azospirillum: ácido málico 5 g, fosfato dipotásico 0,5 g, sulfato de magnesio
heptahidrato 0,2 g, cloruro de sodio 0,1 g, cloruro de calcio 0,02 g, molibdato de sodio 0,002 g,
sulfato de manganeso 0,01 g, etilén -diamino-tetra-acetato férrico (al 1,64% p/v) 4 mL, azul de
bromotimol (al 0,5% p/v en etanol) 3 mL, biotina 0,1 mg, agua 1 L, p H 6,8.
Medio paraClostridium pasteurianum: glucosa 10 g, fosfato monopotásico 0,75 g, solución
 
Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice 1919
salina 50 mL, solución de oligoelementos 1 mL, agua 1 L. Distribuir en tubos con campanita de
Durham. Luego de sembrar cubrir con agar al 1,5% fundido o vaselina estéril.
DesnitrificaciónDesnitrificación
El medio de cultivo contiene: nitrato de potasio 2 g, carbonato de calcio 5 g, glucosa 10 g,
solución salina 50 mL, solución de oligoelementos 1 mL, agua 1 L. Los tubos llevan dentro una
campanita de vidrio y se esterilizan a 110ºC durante 20 minutos. Inocular unos gránulos de
suelo sin agitar e incubar una semana a 25-27ºC.
Si se ha reducido el nitrato hasta el estado de nitrógeno molecular u óxido de nitrógeno
quedarán retenidos en la campanita inmersa en el tubo. La formación de nitritos se comprueba
agregando 1 mL del reactivo de Griess al tubo de cultivo. Aparecerá un color rosado si hay
nitritos.
Preparar el reactivo de Griess en el momento de usarlo, mezclando partes iguales de las
soluciones siguientes:
o Disolver 0,05 g de naftilamina en 1 00 mL de ácido acético al 30% (v/v) en agua.
o Disolver 0,32 g de ácido sulfanilico en 100 mL de ácido acético al 30% (v/v) en agua.
NitrificaciónNitrificación
El medio de cultivo para formadores de nitritos contiene: sulfato de amonio 0,5 g, carbonato
de calcio 1 g, solución salina 50 mL, agua 1 L. Se distribuye en matraces de Erlenmeyer de 250
mL de capacidad, a razón de 50 mL en cada uno.
El medio para productores de nitratos contiene 1 g de nitrito de sodio en lugar del sulfato de
amonio. Esterilizar a 110ºC durante 20 minutos.
Sembrar unos gránulos de suelo en ambos matraces e incubar a 25-27ºC durante dos semanas.
Formadores de nitritos.Formadores de nitritos.Volcar 5 mL del cultivo en un tubo de ensayo y agregar 1 mL del
reactivo de Griess recien preparado. Aparecerá un color rosado si se han formado nitritos por
acción microbiana.
Formadores de nitratos.Formadores de nitratos.Transferir unos 5 mL del cultivo a un tubo de ensayo y agregar 1 mL
del reactivo de Griess. Si esta reacción da negativa los microorganismos han oxidado los nitritos
a nitratos. Colocar otros 5 mL de cultivo en un tubo, agregar unos 50 mg de urea y 10 gotas de
acido sulfúrico. Calentar para eliminar los nitritos. Luego añadir 1 mL de reactivo difenilamina
por las paredes del tubo. Si en la zona de contacto aparece un color azul hay nitratos formados
por acción microbiana.
El reactivo difenilamina contiene: difenilamina 1 g, agua destilada 20 mL, ácido sulfúrico 100
mL. Colocar en frasco obscuro.
AmonificaciónAmonificación
El medio de cultivo contiene peptona 0,2 g, solución salina 50 mL, solución de
oligoelementos 1 mL, agua 1 L. Se distribuye e n tubos y se ester iliza a 110ºC durante 20
minutos. Sembrar unos gránulos de suelo e incubar una semana a 25 -27ºC.
Después agregar 1 mL de reactivo de Nessler a cada tubo a ensayar. La aparición de un color
ladrillo indica la presencia de amoniaco.
El reactivo de Nessler consta de dos soluciones que se mezclan en partes iguales en el
momento de usar.
o Colocar en un mortero 5 g de ioduro mercúrico y 3,65 g de ioduro de potasio, añadir un
poco de agua destilada y triturar hasta disolver. Completar a 100 mL con agua.
o Disolver 15 g de hidroxido de potasio en lentejas en 100 mL de agua destilada.
CelulolisisCelulolisis
El medio de cultivo contiene: nitrato de amonio 1 g, solución salina 50 mL, solución de
oligoelementos 1 mL, agua 1 L. Se distribuye en tubos con tiras de papel de 1 x 10 cm y esteriliza
a 110ºC durante 20 minutos. Sembrar unas gotas de una suspensión de suelo, que haya sido
abonado con estiércol , e incubar d os a t res semanas a 25-27C.
 
Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice2020
Donde el papel sobresale del líquido se acumulan las bacterias celulolíticas aerobias y suelen
colorearlo. Sacar la tira de papel y colocarla en un portaobjetos para observar el ataque de las
fibras bajo la lupa. Comp robar si se disgrega con facilidad al tocarla con el asa.
Medio para clostridios: sulfato de amonio 0,5 g, cloruro de sodio 0,1 g, fosfato dipotásico 0,7
g,sulfato de magnesio heptahidrato 0,05 g, cloruro de calcio 0,05 g, celulosa en polvo 3 g,
carboximetilcelulosa 1 g, extracto de levadura 1 g, azul de metileno (0,005% p/v) 1 mL, agar 15
g, agua 1 L, pH 7,0; esterilizar a 121ºC durante 15 minutos. Agregar 0,5 mL de clorhidrato de
cisteína (al 1% p/v) a cada tubo con 10 mL de medio estéril fundido, sembrar de inmediato con
unas gotas de la suspensión de suelo y colocar en agua fría para una rápida gelificación.
AmilolisisAmilolisis
El medio de cultivo contiene: almidón soluble 2 g, nitrato de amonio 1 g, solución salina 50
mL, solución de oligoelementos 1 mL , agar 15 g, agua 1 L. Esterilizar a 110ºC durante 20
minutos. Distribu ir en cajas de Petri. Sembrar con unos gránulos de suelo e incubar a 25-27ºC .
Cubrir la superficie con solución acuosa de yodo, por ejemplo la de Lugol. La zona de
hidrólisis alrededor del crecimiento microbiano aparece clara sobre un fondo azul.
Sulfato-reducciónSulfato-reducción
El medio de cultivo contiene: cloruro de amonio 1 g, fosfato dipotásico 0,5 g, sulfato de
magnesio heptahidrato 2 g, sulfato de sodio 0,5 g, cloruro de calcio 0,1 g, lactato de sodio (al
60% p/v) 6 mL, extracto de levadura 1 g, tioglicolato de sodio 1 g, agua 1 L. Repartir en tubos
colocando 10 mL en cada uno. Esterilizar a 110ºC durante 20 minutos. Sembrar con unos
gránulos de suelo e introducir un clavo previamente pasado por la llama y enfriado. Cubrir con
agar al 1,5% fundido o vaselina. Incubar dos o tres semanas a 25-27ºC. Ver si el clavo se ha
ennegrecido por la formación de sulfuro de hierro debido a los microorganismos.
Sulfo-oxidaciónSulfo-oxidación
El medio de cultivo contiene: fosfato dipotásico 0,25 g, cloruro de magnesio 0,1 g, cloruro de
sodio 0, 1 g, nitrato de amonio 2 g, carbonato de calcio 5 g, agua destilada 1 L. Repartir en tubos
a razón de 5 mL en cada uno y esterilizar 20 minutos a 110ºC. Agregar a cada tubo 1 mL de una
solución a 10% de monosulfuro de sodio y sembrar unos gránulos de suelo. Incubar a 25-27ºC
durante dos a tres semanas.
Volcar 2 mL del cultivo en otro tubo, acidificar con dos gotas de ácido clorhídrico concentrado
y añadir 5 gotas de solución acuosa de cloruro de bario al 5%. p/v. La aparición de una
opalescencia indica que se han formado sulfatos por la actividad microbiana.
Solubilización de fosfatosSolubilización de fosfatos
El medio de cultivo contiene: extracto de levadura 2 g, glucosa 20 g, agar 15 g, agua 1 L,
fosfato tricálcico 2 g. Se esteriliza a 110ºC durante 20 minut os y se distribuye en caja de Petri.
Sembrar unos gránulos e incubar a 25-27ºC.
Observar la formación de una zona transparente alrededor de las colonias.
BibliografíaBibliografía
o Fenchel T et al. Bacterial Biogeochemistry: The Ecophysiology of Mineral Cycling. Academic Press, San Diego,
1998.
o Alef K & Nannipieri P. Methods in Applied Soil Microbiology and Biochemistry. Academic Press, London, 1995.
o Frioni L. Ecología Microbiana del Suelo. Universidad de la República, Montevideo, 1990.
 
Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice 2121
TRABAJO Nº 5. Inhibidores y desinfectantesTRABAJO Nº 5. Inhibidores y desinfectantes
ObjetivoObjetivo. Determinar la concentración inhibitoria mínima y la concentración letal mínima de
productos comerciales usados en el campo.
IntroducciónIntroducción
Los agentes que producen efectos reversibles causan inhibición sin
acción mortal inmediata. Los bacteriostáticos actúan sobre las
bacterias y los fungistáticos sobre los hongos. Los compuestos de
acción irreversible causan la muerte rápida. Los bactericidas y
fungicidas matan bacterias y hongos, respectivamente (figura 14).
La diferencia es cuantitativa más que cualitativa. La adición de 0,3%
de fenol impide el crecimiento de Escherichia coli , pero no mata las
células en varias horas mientras que 1% las elimina en minutos
(figura 15 ).
La palabra desinfección se empleó para expresar la
eliminación de cualquier agente que pudiera causar
infección o enfermedad. Los desinfectantes son agentes de esterilización. Las
células activas jóvenes tienen una notable sensibilidad a estas substancias. La
desinfección es más rápida al aumentar la temperatura del sistema. El medio en
que se encuentran los microrganismos puede alterar la eficacia de la
desinfección, por combinación del material orgánico con el agente activo.
También el pH modifica los mecanismos de desinfección.
Los endosporos bacterianos son más difíciles de destruir que las células
vegetativas. También presentan cierta resistencia los organismos encapsulados.
Otro factor que posibilita la desinfección es un contacto eficaz. La humedad es
esencial y los agentes tensoactivos mejoran dicho contacto.
Las pruebas de la concentración inhibitoria mínima (CIM) y la concentración letal mínima
(CLM) son útiles para comparar la eficacia de diversos productos químicos contra un organismo
determinado, o la sensibilidad de diferentes organismos a un mismo producto.
Los microorganismos comúnmente usados son cepas de colección de Escherichia coli,
Pseudomonas aeruginosa, Clostridium perfringens, Staphylococcus aureus, para establecer la acción
frente a organismos coliformes, seudomónadas, clostridios y otros aerobios, respectivamente.
El tamaño del inóculo suele ser de 10 4 a 106/mL, según el microorganismo y la substancia
estudiada.
ProcedimientoProcedimiento
Concentración inhibitoria mínimaConcentración inhibitoria mínima
Preparar una solución al 1/10 p/v ó v/v del compuesto en agua destilada estéril. Si se trata de
un curasemillas con un principio activo poco soluble, usar alcohol o acetona al 1/2 v/v en esta
primera dilución.
Poner 1 mL de la solución 1/10 en cada uno de los 9 tubos de ensayo estériles. Añadir al
primer tubo 1 mL de agua destilada estéril, al segundo 2 mL, al tercero 3 mL y asísucesivamente hasta agregar al noveno 9 mL, obteniendo diluciones que van desde 1/20 a
1/100.
Transferir 1 mL de la dilución srcinal al 1/10, y 1 mL de cada una de las otras diluciones a
sendos tubos con 9 mL de caldo nutritivo (en el caso del desinfectante) o agua estéril (en caso
del curasemillas), comenzando por la más diluida.. Las diluciones obtenidas van de 1/100 a
1/1000.
Figura 15
Figura 14
 
Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice2222
Bacterias
Añadir 0,1 a 0,2 mL de un cultivo de 24 hs en caldo, de Staphylococcus aureus o Escherichia coli , a
un tubo con 9 mL de caldo nutritivo de tal manera que se obtenga un suspensión de turbiedad
poco apreciable a simple vista. Luego transferir 0,2 mL de esta suspensión bacteriana a cada uno
de los tubos con diluciones de desinfectante en caldo. Incubar a 35°C durante 48 hs.
Hongos
Agregar agua estéril (con 0,05% v/v de Tween 80) al tubo de cultivo de 5 días a 25°C en medio
de Czapek o Sabouraud, de Penicillium expansum , Aspergillus flavus o Cladosporium
cladosporioides , agitando para suspender los esporos. Añadir 0,5 a 1 mL de la suspensión de
esporos a un matraz con 50 mL de agar de Sabouraud, fundido y enfriado a 45-50°C. Mezclar y
volcar en cuatro cajas de Petri estériles.
Una vez gelificado, se depositan discos de papel de filtro de 4 mm de diámetro previamente
humedecidos con las diluciones del producto, a razón de tres discos por placa. Se incuba a 25-
28°C durante 5 días.
Concentración letal mínimaConcentración letal mínima
Preparar, como se indicó arriba, una serie de tubos con 10 mL de cada una de las diluciones
del compuesto, que van desde 1/100 a 1/1000, utilizando agua estéril en lugar de caldo.
Adicionar a cada dilución 0,2 mL de una suspensión bacteriana preparada como se describió
arriba. Anotar la hora a la cual se agregó al primer tubo, y a intervalos de 2, 5, 10 y 15 minutos
cargar un asa (con un diámetro interno de 4 mm) de cada dilución y llevar a un tubo de caldo
nutritivo que contiene 0,1 % p/v de ácido tioglicólico para neutralizar la acción del
desinfectante remanente. Incubar a 35°C durante 48 hs.
BibliografíaBibliografía
o Collins CH, Lyne PM, Grange JM. Collinsand Lyne’s Microbiological Methods. 7º ed. Butterworth Heinemann,
Oxford, 1999
o Umbreit W. Modern Microbiology. WH Freeman & Co, San Francisco, 1962
 
Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice 2323
TRABAJO Nº 6. DiTRABAJO Nº 6. Digestión anaeróbica gestión anaeróbica de residuos agrícolde residuos agrícolasas
ObjetivoObjetivo. Transformar los residuos agrícolas en biogas y un lodo útil como fertilizante. 
IntroducciónIntroducción
Se emplea estiércol, paja y lodo procedente de otro digestor. El gas formado en la
fermentación metanica es una mezcla de metano y dióxido de carbono. Las denominadas
bacterias metánicas implicadas pertenecen a los géneros Methanococcus, Methanobacterium,
 Methanosarcina y otros. Dependiendo de la composición del material de partida, se puede
producir biogas con alrededor de 70%. de metano. Estas bacterias son anaerobias estrictas y
reducen al dióxido de carbono.
Las bacterias metánicas se diferencian de las demás debido a su peculiar estructura de la
pared y la membrana celular, y forman parte de las arqueobacterias junto a las termófilas y las
halófilas. Se encuentran en el rumen, los sedimentos de aguas estancadas y en los digestores de
las depuradoras de aguas residuales.
Las metanobacterias sólo podrán desarrollarse cuando por acción de las bacterias facultativ as
se haya consumido todo el oxígeno, y las fermentadoras hayan producido suficiente dióxido de
carbono e hidrógeno a partir de almidón, celulosa o aminoácidos.
Las bacterias metánicas son sensibles al descenso del pH producido por los ácidos orgánicos
formados por los clostridios. Pero en un sistema en equilibrio consumen los ácidos a medida
que aparecen manteniendo un ambiente neutro.
Las instalaciones pequeñas de biogás permiten la obtención de energía en zonas rurales.
ProcedimientoProcedimiento
Equipo de digestiónEquipo de digestión: 1 fermentador, 2 mecanismo de agitación con varilla, 3 material a fermentar, 4 baño
de agua, 5 acuario, 6 calentador conectado a una bomba de circulación, 7 termómetro y termostato, 8
depósito de gas (neumático de bicicleta), 9 frasco lavador (indicador de gas y lavado de CO2), 10 frasco
lavador abierto (para equilibrar la presión), 11 llave de triple vía, 12 tubo de vidrio con virutas de hierro(arrestallamas), 13 mechero. 
Colocar en un frasco de 1 L, unos 200 g de estiércol fresco de vaca, 25 g de paja cortada en
trozos pequeños y agua hasta unos 5 cm de la boca. Poner un tapón atravesado por un agitador
y un tubo para la salida de los gases.
Instalar el fermentador en un baño de agua a 37ºC. Unir la salida a un frasco lavador y éste a
otro frasco abierto para equilibrar la presión, y a una llave de triple via que está conectada al
Fi ura 16
 
Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice2424
depósito de gas y al mechero. Entre el mechero y la llave de triple via se coloca un tubo de
vidrio lleno con virutas de hierro para evitar el retroceso de la llama. Controlar la hermeticidad
de todos los cierres.
Agitar diariamente la mezcla en descomposición. Luego de uno o dos días vaciar la cámara
para eliminar la mezcla explosiva de biogás y aire. Dejar hasta que se llene nuevamente el
depósito y comprobar cómo arde el biogás a la salida del mechero. Controlar diariamente el
nivel de agua del baño, la temperatura y la cantidad de gas.
BibliografíaBibliografía
o Madigan TM et al. Brock- Biología de los Microorganismos. Prentice Hall, Madrid, 1998
o Jagnow G, Dawid W. Biotecnología. Acribia, Zaragoza, 1991
 
Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice 2525
TRABAJO Nº 7. TRABAJO Nº 7. Morfología micMorfología microscópica de hongosroscópica de hongos
ObjetivoObjetivo.. Conocer las estru cturas microscópicas de mohos, levaduras y setas.
IntroducciónIntroducción
Micelio es el cuerpo filamentoso de un hongo y un trozo del mismo se denomina hifa. Las
hifas pueden presentar septos y entonces el micelio está tabicado. Si los tabiques están ausentes
es un micelio contínuo. Rizoides son las hifas de succión que penetran en el substrato.
Apresorios son unas hifas achatadas de sostén que se adhieren al hospedador o substrato.
Cuando el cuerpo del hongo es una sola célula se lo llama levadura. Los cortos filamentos
formados por las células brotantes de la levadura se conocen como pseudomicelio.
Plecténquima es un conjunto de hifas que se asemeja a un tejido. Esclerocio es un plecténquima
generalmente macroscópico que puede permanecer largo tiempo con vida latente.
Clamidospora es una célula de resistencia, terminal o intehifal, con pared gruesa y substancias
de reserva. Las esporas son los elementos de multiplicación de los hongos. De acuerdo a su
forma y srcen reciben distinto nombre como se observa en la figura 17 .
Anamorfo es el hongo con reproducción asexuada o mitospórica. Los conidios son mitosporas
que se hallan sésiles o sobre un
conidióforo (simple o ramificado), o
dentro del plecténquima de un picnidio.
Un esporangio contiene numerosos
mitosporas dentro de una membrana
peridial simple.
Teleomorfo es el hongo con
reproducción sexuada o meiospórica.
Las ascosporas son meiosporas que se
encuentran dentro de los ascos libres de
las levaduras, o los ascos encerrados en
el plecténquima de un ascoma o sobre el
mismo. Las basidiosporas surgen de los
esterigmas del basidio donde ocurrió la
meiosis. Los basidios generalmente se
encuentran sobre laminillas, tubos o
espinas del basidioma.
Las figuras 17 y 18a muestran
esquemas de diversas estructuras
fúngicas. Los conidióforos simples son cortos filamentos que generalmente nacen
perpendiculares a la hifa y srcinan en su extremo el o los conidios. Los ramificados suelen
terminar en ramas con forma de botellón (fiálides) de donde surgen los conidios. Algunas
estructuras son típicas de géneros comunes y llevan su nombre: cabeza aspergilar, penicilio.
También los conidióforos simples o ramificados suelen estar reunidos en: coremio (como un
fósforo), esporodoquio (como una almohadilla), picnidio (dentro de un plecténquima con forma
de pera).
Un esporangio contiene innumerables esporas, pero un esporangiolo sólo contiene tres o
cuatro y se encuentra en el ápice de una rama lateral del esporangióforo. La columela es la
punta dilatada del esporangióforo y está dentro de la esfera del esporangio. En algunos casos,
unas pocas esporas están reunidas en merosporangios (bolsitas como dedos de guante) que se
asientan sobre la columela.
Los ascomas tienen distinta forma: cleistotecio (cerrado) que se rompe al madurar las esporas,
peritecio (forma de pera) con abertura u ostíolo por donde salen las esporas maduras, apotecio
(forma de copa) con los ascos expuestos.
Fi ura 17
 
Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice2626
Los basidiomas más conocidos
son: el champiñón con laminillas
en la parte inferior del sombrero
donde se srcinan las esporas, el
boleto con poros en vez de
laminillas, la bola de nieve que al
romperse libera las esporas
maduras (figura 18b). Hay otras
formas como el basidioma
excéntrico de los pleurotos, los
estantes rígidos que crecen sobre
troncos, las formas gelatin osas.
ProcedimientoProcedimiento
MicrocultivosMicrocultivos
Observar los microcultivos con el objetivo 4x y una vez enfocada una estructura próxima al
cubreobjetos o adherida al mismo, pasar al objetivo 10x. Luego para ver detalles se puede pasar
al objetivo seco de mayor aumento, si la distancia focal de la lente lo permite.
PreparacionesPreparaciones
Hacer preparaciones en fresco colocando un trozo de micelio en una gota de lactofenol, o
colorante de Gueguén, y desagregar con ayuda de dos agujas, montadas en sendos mangos .
Poner un cubreobjetos y observar al microscopio. Dibujar las estructuras vistas.
El lactofenol contiene: ácido láctico 100 mL, fenol 20 g, glicerol 50 mL, agua 40 mL.
BibliografíaBibliografía
o Deacon JW . Introducción a la Micología Moderna. Limusa-Noriega, México, 1993
o Alexopoulos CJ. Introducción a la Micología. EUDEBA, Buenos