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tiras que tienen un gradiente de pH inmovilizado (IPG, inmovili-
nas). Al aplicar el campo eléctrico, las proteínas migran y se distri-
buyen de acuerdo con su pI, hasta alcanzar la zona de pH igual a ese
parámetro, puesto que ahí pierden su carga neta y ya no se mueven
durante el resto del isoelectroenfoque. 
Esa tira con las proteínas distribuidas según su pI es el punto de
partida para la segunda electroforesis, que consiste en la separación,
basada en el tamaño, sobre un gel, según las condiciones de
Laemmli. El campo eléctrico se aplica en dirección perpendicular al
sentido de la migración de la tira de isoelectroenfoque, y las proteí-
nas avanzan de forma inversa a su tamaño. 
Inicialmente, las tinciones de los geles finales se realizaban con
azul Coomassie, pero se han desarrollado otras alternativas más sen-
sibles para visualizar proteínas minoritarias, como el nitrato de plata
o colorantes fluorescentes, tipo Sypro-Ruby, Cy3, Cy5, entre otros,
que permiten una mayor sensibilidad y, sobre todo, compatibilidad
con la posterior digestión tríptica de la proteína, necesaria para
seguir el proceso de identificación por MS. Además, esos coloran-
tes son de más fácil eliminación que el azul Coomassie y muestran
poca interferencia en la MS, aunque queden residuos en la muestra
aplicada al espectrómetro.
Las ventajas de la electroforesis 2D-PAGE son varias: se puede
usar en muestras crudas, tiene gran capacidad de separación (se ha
logrado separar unas 5000 proteínas en un sólo gel 2D), y discrimina
isoformas de las proteínas debidas a las transformaciones postraduc-
cionales, como glicosilación, fosforilación y acetilación (Fig. A IV-1).
Algunas técnicas instrumentales en Biología Molecular y Proteómica | 747
Figura anexo IV -1. Cambios en la migración proteíca en
SDS-PAGE 2D por modificaciones postraduccionales: 1- La
N-glicosilación suele dar una serie de manchas que tienden a pI
más bajos y masas mayores por la presencia heterogénea de
restos siálicos, ácidos y con un tamaño apreciable. 2- La fosfo-
rilación suele dar una mancha de menor pI, pero no afecta la
masa por la pequeña contribución de estos grupos. También
suele ser más débil, porque sólo una pequeña parte de la proteí-
na está normalmente fosforilada. 3- La acetilación también
afecta sólo al pI, que es inicialmente básico y tiende a bajar, por
la conversión de grupos amino terminales catiónicos a grupos
acetilados neutros. 
1
2
3
pI ácido pI básico
Obviamente, este método es discontinuo porque conlleva la
localización de las proteínas de interés en el gel y su extracción. Un
inconveniente radica en la forma artesanal de obtener las proteínas
purificadas, puesto que hay que recortar el punto del gel donde se
sitúa la mancha de la proteína que se pretende estudiar y eluir esa
proteína del gel para continuar el proceso. El método manual puede
sustituirse por medios semiautomáticos (robots de coste elevado).
La separación 2D tiene poca reproducibilidad para la localización
exacta de cada proteína en distintas electroforesis, y las tinciones
tampoco permiten una determinación cuantitativa exacta. Además,
por diferentes causas, el método no es válido para proteínas muy
grandes o muy pequeñas, muy ácidas o muy básicas, o muy hidro-
fóbicas (de membrana).
El procedimiento, para ser usado en proteómica, se adapta
mejor a la técnica llamada de huella peptídica dactilar (Peptide
Mass Fingerprint, PMF), al uso de espectrómetros con ionización
MALDI y a la caracterización de los péptidos por el tiempo de vuelo
(TOF, del inglés time of flight). 
Ultracentrifugación 
En esta técnica se expone durante tiempos largos la mezcla de proteí-
nas a campos gravitatorios muy fuertes, superiores a 100 000 veces la
gravedad, aprovechando la fuerza centrífuga de rotación. Las proteí-
nas sedimentan a una velocidad que depende, tanto de su masa y
forma, como de la densidad de la disolución donde migran.
Normalmente, la mezcla de proteínas se aplica sobre la parte superior
de un gradiente, generalmente de sacarosa, previamente formado en el
tubo de la centrífuga, introduciéndose cada una de ellas a distintas
velocidades en dicho gradiente, lo que posibilita su separación.
De nuevo es necesario mencionar que las posibilidades y
variantes de la centrifugación son enormes, y esta técnica permite
separar y preparar no sólo proteínas, sino tipos celulares, suborgá-
nulos celulares, virus o tipos de ácidos nucleicos, siempre adecuan-
do el medio de separación en cuanto a densidad, viscosidad o pre-
sión osmótica a las peculiaridades y naturaleza de las sustancias a
separar. 
Cristalografía de rayos X 
A diferencia de las anteriores, esta técnica está enfocada al estudio
de la estructura molecular espacial de las proteínas, y no a su sepa-
ración. Por tanto, se utiliza en último extremo, una vez que la pro-
teína se ha purificado por alguna de las técnicas anteriores, o una
combinación de ellas y se ha cristalizado. Las distancias de enlace
en las proteínas están en el rango de 10–8 m, y la localización de los
átomos en estas moléculas sólo puede realizarse mediante radiación
de longitud de onda mucho más corta, como los rayos X, cuyo rango
es aproximadamente 100 veces menor (10–10 m). Las proteínas se
exponen a un haz de rayos X, que al incidir sobre los átomos se
difractan, como una dispersión, dando un patrón que se puede regis-
trar sobre una placa radiográfica y origina un mapa de densidad
electrónica. Estos mapas son procesados matemáticamente median-
te programas de ordenador complejos para reconstruir la imagen
proteica. 
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