0-Resumen BCM hasta teorico 11 inclusive

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Las bases químicas de la vida son: 
• Enlaces químicos 
• Compuestos químicos de las células 
• Obtención de energía 
• Termodinámica celular 
Hay dos grandes tipos celulares: 
 Células procariontes Células eucariontes 
Núcleo No Si 
ADN Circular Lineal 
N° de cromosomas 1 – circular N * 2 (humanos n=23 → hay 22 pares homólogos 
y 1 par sexual) 
Copias de cada gen 1 – haploide 2 – una en cada cromosoma homólogo – diploide 
Endomembranas No Si 
Mitocondrias No Si 
Ribosomas Si (70s) Si (80s) 
Citoesqueleto Si Si (actina, tubulina) 
Pared celular Si No (solo vegetales y hongos) 
Un cromosoma es una molécula de ADN (tanto en eucarionte como procarionte). El ADN es una hebra bicatenaria de 
desoxirribonucleótidos que forman una hélice. 
1. Bloques de construcción 
A partir de pequeñas moléculas se forman macromoléculas. La célula importa moléculas pequeñas: aminoácidos, bases, 
azucares, fosfatos, etc. A partir de ellas se generan otras moléculas pequeñas -neurotransmisores, nucleótidos, hormonas- y 
también grandes moléculas que forman parte de estructuras -proteínas, ácidos nucleicos, fosfolípidos, polisacáridos. Los lípidos 
no forman parte de esta clasificación. Los bloques de construcción son monómeros y forman polímeros: 
i. Azúcares: Monosacáridos con (CH2O)n, de los cuales dos se unen para formar disacáridos con enlaces glucosídicos 
(covalentes). Miles de unidades de monosacáridos se unen para formar polisacáridos (u oligosacáridos). 
ii. Proteínas: Aminoácidos formar polipéptidos con enlaces peptídicos (cov) con la perdida de una molécula de agua. 
iii. Ácidos nucleicos: Formados por nucleótidos o bases que se condensan. El ADN tiene a Adenina, Timina, Citosina y 
Guanina. En el ARN la timina se reemplaza por Uracilo. La citosina, timina y uracilo son pirimidinas (1 anillo hexagonal); 
la guanina y adenina son purinas (2 anillos, uno hexagonal y uno pentagonal) 
2. Complementariedad molecular 
Se trata de un juego de encastre. La interacción entre las moléculas depende de la forma -
especificidad- y se estabiliza o esta dada por interacciones que tengan forma especular. 
Cuando dos moléculas encastran de forma perfectamente complementaria y tienen muchas 
interacciones débiles en el medio, éstas se unen con alta afinidad, y va a generar que ese 
proceso ocurra. 
3. Equilibrio químico: Se debe respetar 
4. Energía en enlaces químicos: 
Se debe mantener el estado termodinámico adecuado. Los tipos de uniones que permiten tener estructuras en la célula son: 
o Covalentes: comparten electrones para llegar a la configuración electrónica del gas noble más cercano. 
Pueden ser polares cuando es entre átomos con electronegatividad muy distinta, lo que genera un momento dipolar; 
o pueden ser no polares cuando los átomos tienen electronegatividad similar. Ambos tipos permiten la formación de 
estructuras. 
o No covalentes: son interacciones que ayudan a que la vida ocurra y estabilizan estructuras. Pueden ser: 
1- Puentes de hidrogeno: contribuyen a la vida, pero no forman estructuras. Ocurren entre N, O y F con H. Ayudan 
a estabilizar interacciones proteína-proteína, proteína-ácido nucleico, proteína-fosfolípido, etc. Puede darse 
entre dos moléculas distintas o intramolecularmente. 
2- Iónicos: Cede y toma electrón, quedan con cargas netas e interaccionan por atracción electroestática en agua. 
3- Efecto hidrofóbico: “Lo no polar se une con lo no polar y lo polar con lo polar”. Lo no polar se va a conglomerar y 
va a estar aislado para reducir el contacto con el agua. Esta unión es muy fuerte entre las colas hidrofóbicas de 
los fosfolípidos. 
4- Fuerzas de Van der Waals: Ocurre entre dipolos eléctricos inducidos transitorios o permanentes. 
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La energética bioquímica se relaciona con la capacidad de la molécula de tener enlaces covalentes de alta energía, en donde 
la célula almacena energía. 
La termodinámica en cambio, se relaciona con el equilibrio químico. Una reacción está en equilibrio cuando XY, en ese estado 
no hay conversión neta, sino que V directa = V indirecta. En la célula no se está en equilibrio, sino que ésta gasta mucha energía para 
desplazar las reacciones; ya que si llega al equilibrio se muere. Por lo tanto, en la célula se llega a un estado estable en el que 
las concentraciones de reactivos y productos no cambian con el tiempo: estado estacionario. 
En la primer ley de la termodinámica se establece que “la energía no se crea ni se destruye, sino que se transforma”. La energía 
es la capacidad de realizar un trabajo que tiene la célula. Hay dos grandes tipos: 
 Energía cinética – del movimiento 
▪ Térmica (calor) se transforma en mecánica (movimiento) 
▪ Radiante (sol) se transforma en eléctrica (con el movimiento de electrones) 
 Energía potencial – almacenada 
 E. Química potencial: almacenada en enlaces de alta energía 
 E.P. en gradiente de concentración: 
 E.P. Eléctrica 
Las células transforman energía mediante la contracción muscular ( E.Q.P a E. Cinética), la transmisión nerviosa (E.Q.P a E.P.E) 
y por el transporte a través de membranas (E.P en gradiente a transporte) 
Reacciones energéticamente favorables 
Disminuyen la energía libre del sistema, tienen ΔG 
negativos (mayor energía en reactivos que en productos) y 
generan desorden. Como los productos tienen menor 
energía, significa que se liberó energía – reacción 
exergónica. 
Reacciones energéticamente desfavorables 
Su ΔG es mayor a cero. Como los productos tienen mayor 
energía que los reactivos, la reacción no va a ocurrir 
espontáneamente, sino que necesita que se le de energía 
– endergónicas, por lo que ocurren acopladas a una 
segunda reacción ( con ΔG<0). 
La energía libre se aprovecha para realizar trabajo o reacciones químicas. Depende de: 
 La entalpia (ΔH): energía de enlace. Cuando ΔH<0 la reacción es exotérmica y libera calor; y cuando ΔH>0 la reacción es 
endotérmica y toma calor. 
 Del cambio de entropía (ΔS) 
 La temperatura 
Cuando ΔG=0 ocurre la muerte de la célula. Esto también se ve en el índice ATP/ADP, que en la muerte se ve aumentada la 
[ADP]. Al contrario, cuando la célula esta viva tiene que realizar trabajo y ATP >>> ADP. 
La segunda ley de la termodinámica establece que “la cantidad de entropía del universo aumenta con el tiempo”. La entropía 
es una función de estado y describe la cantidad de desorden de un sistema. El desplazamiento hacia el desorden es un proceso 
espontaneo. Para revertirlo, hay que realizar un aporte de energía en forma de trabajo. 
La célula, al contrario de lo que establece la segunda ley, genera orden por el estado estacionario. Para mantener el interior 
ordenado, libera calor al medio. El calor es energía en su forma más desordenada. Entonces el aumento del orden en la célula 
se ve compensado por el aumento del desorden en el medio que la rodea; por lo que en el universo la entropía aumenta y la 
2da ley se cumple. Por ejemplo, la célula toma energía de los alimentos y la gasta para mantener el estado estacionario, en la 
hidrólisis de ATP (molécula transportadora activada que sirve como depósito de energía); este proceso es energéticamente 
favorable. 
La célula tiene energía almacenada en forma de enlaces químicos y en forma de electrones, ya que necesita formar enlaces y 
tener poder reductor. Las moléculas -coenzimas- que utiliza la célula para transportar energía, para almacenarla y usarla 
cuando y donde se la necesite son: 
❖ ATP: tiene enlaces de alta energía -al transportar fosfatos, tanto en reacciones de la vía catabólica (fragmentan 
moléculas de alimento en moléculas más pequeñas generando una forma de energía utilizable) y la vía anabólica o 
biosintética (que impulsan la síntesis de otras moléculas que se forman en la célula). 
❖ NADH y NADPH: participan en reacciones de óxido-reducción. Toman electrones, los transportan y ceden a otra 
molécula. La transferencia del ion hidruro tiene ΔG negativo,por lo que tiende a ocurrir. Cuando ocurre una reacción 
redox los protones pueden quedar solubles, pero los electrones si o si tienen que ser transferidos a las coenzimas. 
 
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En la célula proviene de los alimentos. La principal fuente de ATP es el catabolismo aeróbico de la glucosa en presencia de O2. 
En ello, ocurre la oxidación del azúcar hasta su nivel más bajo de energía que es H2O + CO2). En la célula, este proceso ocurre 
en etapas, en las cuales en cada una de ellas tiene una energía de activación más pequeña; las cuales son superadas gracias a 
la temperatura corporal gracias a la presencia de enzimas. Al ocurrir en etapas, de manera “escalonada” se libera energía de a 
poco y se va acumulando en las moléculas portadoras activadas – coenzimas. Se pierde también un poco de energía como 
calor, pero es muy poca. 
Oxidación de glucosa en eucariotas 
Ocurre en 4 grandes etapas: 
1) Glucolisis 
2) Ciclo del ácido cítrico 
3) Cadena de transporte de electrones 
4) Síntesis de ATP 
La glucolisis (1) transforma la glucosa en piruvato. Es un proceso 
anaeróbico que no necesita oxígeno y ocurre en el citosol. Se necesita 
una inversión de energía (ATP) que luego se recupera. El resultado neto es: 2 ATP, 2 NADH y 2 piruvato. 
Si la célula es aerobia (tiene O2), los piruvatos entran en la mitocondria y ahí ocurre una oxidación que genera que se transforme 
en acetil-CoA – mediante 3 enzimas del complejo de la piruvato deshidrogenasa. 
El acetil-CoA entra al ciclo del ácido cítrico (2). En el se oxida completamente a los átomos de C del acetil-CoA. El resultado neto 
de la vuelta al ciclo es 3 NADH, 1 GTP, 1 FADH2 y 2 moléculas de CO2. En el caso de estar en ausencia de O2 ocurre la 
fermentación láctica o alcohólica. 
Los electrones que se fueron acumulando en las coenzimas (FADH2 y NADH) van a participar de la cadena de transporte de 
electrones (3). Los electrones altamente energéticos pasan a un estado de menor energía. Paralelamente al transporte de 
electrones, se bombean protones al espacio intermembrana (que se acumulan como energía potencial de gradiente 
electroquímico – ya que se necesita energía para sintetizar ATP). Cuando pasan a través de la membrana, los protones van a 
pasar a través de la ATP sintasa a sintetizar ATP (4). El ATP formado sale de la mitocondria. 
Por cada molécula de glucosa se producen 30-32 moléculas de ATP. 
Oxidación de ácidos grasos 
Cuando se acaba la reserva de hidratos, se empiezan a hidrolizar triglicéridos para obtener energía. Se toman ácidos grasos 
que entran a la mitocondria y se transforman en acil-graso-CoA, que se transforma en acetil-CoA y éste entra en el ciclo del 
ácido cítrico (2) al igual que la glucosa. 
El ΔG es independiente de la velocidad de reacción. La velocidad depende de la energía de activación (EA); las enzimas -
proteínas especializadas que funcionan como catalizadores de reacciones- son las encargadas de disminuirla y generar que la 
reacción ocurra más rápidamente. 
Para realizar en la célula una reacción no espontanea -proceso que genera orden- hay que aplicar energía en forma de trabajo. 
Para eso, se tiene que acoplar – producir al mismo tiempo que una reacción con ΔG negativo que va a liberar energía. La energía 
que libera una reacción la utiliza la otra – reacciones acopladas. 
 
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Teórico 2 – Técnicas I: Microscopia 
La microscopia corresponde con la técnica por excelencia de la biología molecular – es una técnica de más de 400 años. Antonie 
van Leeuwenhoek fue el primero en armar un microscopio, y con el pudo ver: espermatozoides, corpúsculos rojos en la sangre 
(GR) y describe bacterias. Este científico “no contesto, pero lo hizo contestable”. Robert Hooke por otro lado, también se 
destacó en la microscopia al utilizar un microscopio compuesto – con más de una lente. También, publicó el primer libro con 
imágenes de microscopia y él acuña – describe por primera vez – el termino célula. 
Los microscopios ópticos actuales siguen siendo un microarreglo de lentes y su fundamento es el mismo que hace 400 años, 
pero en los últimos 10-15 años se mejoró mucho la microscopia y con la digitalización y el análisis de imágenes se convirtió en 
una técnica actual. Así con el análisis y procesamiento de imágenes, se logró obtener resoluciones que iban por debajo del 
límite teórico de resolución. 
La función del microscopio óptico es obtener una imagen magnificada, para así facilitar la observación de los detalles que 
escapan a la simple observación. Se busca magnificar estructuras para poder estudiarlas. Para la RAE el microscopio es un 
instrumento que permite observar objetos demasiado pequeños para ser percibidos a simple vista. Hay 2 tipos de microscopia: 
• Microscopia óptica: Compuesto por un sistema de lentes y utiliza luz visible – pero también puede usar luz no visible 
(en microscopia de fluorescencia). Tiene un límite de resolución de 0,2µm o 200nm – límite de difracción de Abbe – 
límite de resolución teórico (que pudo ser pasado o disminuido por las nuevas tecnologías). 
• Microscopia electrónica: Tiene una capacidad de resolución mucho mayor, se pueden llegar a ver virus o proteínas de 
10nm por ejemplo. 
La diferencia entre ambas es que la óptica utiliza lentes, mientras que la electrónica utiliza otros implementos para poder 
direccionar los haces de electrones que utiliza. 
Microscopio óptico 
Se encuentran 2 tipos: 
❖ El directo (o más común): Donde la luz viene de abajo, atraviesa la muestra o espécimen, entra por el objetivo y llega al 
ojo magnificado. 
❖ Microscopio invertido: La luz viene de arriba y los objetivos están abajo. Desde el punto de vista óptico es mucho más 
complejo (son más caros) y permiten observar células en medios de cultivo. 
Partes y funciones 
Los oculares permiten la magnificación final y la 
proyección de la imagen sobre la retina para que se 
pueda ver. 
Los objetivos son los que generan la magnificación 
de la muestra, y tienen distintas características. 
Estos están colocados sobre un revolver – que se 
gira para cambiar los objetivos. 
La muestra generalmente está montada sobre un 
portaobjetos de vidrio al cual se le puede agregar un 
cubreobjetos. La muestra esta sobre una platina, la 
cual tiene una serie de pinzas para agarrarla. 
El condensador concentra o enfoca la luz 
proveniente de la fuente de luz, que en estos microscopios 
clásicos es una lampara incandescente. Este cuenta abajo con 
un diafragma de apertura – iris que se abre y se cierra y 
modifica el cono de luz que llega a la muestra – son una serie 
de hojas superpuestas. 
El tubo ocular es donde están montados los oculares. El estativo 
es toda la parte fija del microscopio, y es lo que alinea la parte 
óptica – es el cuerpo. El I/O es el botón de encendido y apagado. 
El voltímetro regula la cantidad de luz que llega al ocular. 
Cuanto mayor es la magnificación del objetivo, necesita 
incrementar la cantidad de luz a partir del voltímetro. 
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Hay 2 tornillos -micro y macrométrico- que mueven la platina sobre el eje z, subiendo y bajando, permitiendo el enfoque. El 
tornillo macro permite un desplazamiento de la platina mucho más grande que el micro (que al ser más chico es más preciso). 
También hay un tornillo que mueve en el eje X-Y, que para desplazarse sobre la muestra, hay que mover la platina a partir de 
los tornillos de desplazamiento en X-Y. 
Los microscopios actuales están diseñados para que sus objetivos sean parfocales – es decir, cuando se gira el objetivo (cuanto 
mayor aumento y mayor apertura numérica del mismo, se está más próximo a la muestra) se va a ir un poco de foco. Para 
evitarlo, hay que ajustar con el tornillo micro el foco de la muestra. 
Parámetros de la microscopia 
El éxito de la operación en el microscopio depende de conocer y entender los parámetros fundamentales de la microscopia: 
 
o Magnificación 
o Resolución 
o Contraste 
La magnificacióny la resolución están determinadas por la 
construcción propia del microscopio. El contraste también 
depende de la construcción, pero además de como 
nosotros ajustemos el mismo en la observación – por lo 
que recae en la experiencia del observador. 
Para que un microscopio produzca un aumento a partir de un objeto y genere una imagen, necesita 2 fenómenos en los cuales 
la luz sufre cambios, y son las interacciones necesarias para la existencia del microscopio – fundamento de la microscopia: 
 Interacción luz-luz 
 Interacción luz-materia 
La luz es una onda EM, que puede ser estudiada en el modelo de onda y en el modelo de partícula. En el modelo de onda, se 
describe a la luz como un componente oscilante que se desplaza en el espacio. En ese desplazamiento, oscila con un 
componente eléctrico, y perpendicularmente oscila un componente magnético. El componente eléctrico es el que interesa en 
el microscopio. El parámetro longitud de onda se usa para definir a la luz, es el periodo espacial de la onda; la distancia sobre 
la cual se repite la forma de la onda o la distancia entre dos puntos de una misma fase (por ejemplo 2 máximos). Una onda 
también se puede definir por su parámetro frecuencia: magnitud que mide el número de repeticiones por unidad de tiempo 
de cualquier fenómeno o suceso periódico – es el periodo temporal de la onda; por ello su unidad es 1/tiempo → 1/seg = Hz. 
Si se relacionan la λ y la frecuencia, se obtiene la velocidad de la luz que es constante en el espacio que se esté desplazando. 
La luz puede sufrir interacciones con la materia. Puede encontrarse con determinado bloque 
o muestra y puede ser: refractada o reflejada; o transmitida. En la transmisión el material 
cambia la luz y se obtiene la luz transmitida  fenómeno que pasa en el microscopio óptico. 
También, la luz puede absorberse por esa materia y ser emitida con una longitud de onda 
distinta, como sucede en los procesos de fluorescencia. 
Otros fenómenos que puede sufrir la luz son la refracción, la dispersión, la difracción y la 
interferencia. 
Las interacciones luz-luz y luz-materia conforman la imagen que va a llegar a la retina. Dentro del microscopio, hay una parte 
que es fundamental, que es el objetivo. La lente objetivo va a ser la que capta la luz que sufrió un cambio cuando atravesó a 
la muestra y va a llegar al objetivo, que no es una sola lente, sino que son arreglos de muchas lentes – los que los hace más 
complejos (y más caros). El objetivo es el “alma” del microscopio 
- donde ocurre la magnificación y la formación de los haces que 
van a formar la imagen. El objetivo tiene un montón de 
parámetros marcados: 
Las correcciones ópticas del objetivo indican que tanto corrige las 
aberraciones que se pueden desarrollar durante la observación 
(cuantas más corrige es más caro). 
Justo por debajo se encuentra la magnificación/NA -que hablan 
de las prestaciones y las características de observación del 
objetivo, y si utiliza un medio de inmersión para ser utilizada. 
1. Magnificación 
La magnetización habla de cuantas veces amplia la muestra – cuantas veces aumenta el objetivo al objeto y; la apertura 
numérica esta directamente relacionada con la resolución. 
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La magnificación es cuantas veces más grande es la imagen generada en comparación con el objeto. Las dos lentes mínimas 
en un microscopio compuesto son el objetivo y el ocular. La magnificación total del microscopio = M objetivo * M ocular. El ocular 
más común suele ser de 10X. 
2. Resolución 
La resolución es la capacidad de un sistema óptico de diferenciar dos puntos como tales; es la distancia mínima a la cual tienen 
que estar los puntos que se conoce como límite de resolución. Cuando tengo dos puntos que no puedo diferenciar – y por ende 
los veo como uno, estoy por debajo del limite de resolución. Un 
punto emisor de luz se ve como un punto central bien brilloso y a 
su vez se ven aros concéntricos de menor intensidad de luz – patrón 
de Airy. La relación entre el patrón de Airy y la resolución se ve en 
el criterio de Rayleigh: El ojo humano puede distinguir dos puntos 
cuando el máximo de un punto coincide con el primer mínimo del 
otro. En la segunda imagen se cumple el criterio, y por ende se 
distinguen los puntos ya que no están lo suficientemente superpuestos – distancia a la cual todavía se pueden resolver los dos 
puntos. Cuando la distancia entre puntos es menor, no se distingue ni resuelve. La distancia mínima a la cual pueden estar dos 
puntos y ser resueltos como tales está dada por la distancia entre los máximos, que se denomina límite de resolución (d0). 
Para calcular el límite de resolución de un microscopio óptico → d0 = (0,61 * λ) / AN. Depende de la longitud de onda, es decir 
de la luz que está llegando al objetivo que paso por la muestra. El poder de resolución o poder resolutivo -es la inversa del 
límite de resolución- cuanto mayor es, mayor resuelve el microscopio el sistema óptica. Si el limite de resolución es de 1200nm, 
solo se van a resolver las estructuras de tamaño mayor a ese. 
Ernst Karl Abbe introdujo el término de la apertura numérica →NA=n*sen α (n=índice de refracción del medio). Cuando una 
muestra es iluminada los rayos se dispersan por el medio, sufren difracción. Cuanto más pequeño es el objeto que se está 
viendo, más difracción produce; objetos pequeños producen alta difracción – y se dispersan más. Que se puedan resolver 
estructuras pequeñas depende de que se puedan captar los rayos a través del objetivo.; entonces cuanto más rayos pueda 
capturar el objetivo, mejor resolución tendrá. La AN es una medida de la capacidad del objetivo de captar luz; y por ende nos 
dice cuál es la resolución. 
El ángulo α es la mitad del cono de luz que capta el objetivo. A mayor α, mayor es la NA y menor es el límite de resolución. El 
objetivo con menor apertura numérica se encuentra más alejado de la muestra que un objetivo con mayor NA, eso se denomina 
distancia de trabajo (WD) y es la distancia entre el cubreobjetos y el borde de la lente de mi objetivo. Para tener una mayor 
AN y mayor resolución, hay que aproximarse más a la muestra – tener una WD menor. El parámetro distancia de trabajo 
también es un parámetro importante indicado en el objetivo. 
El otro parámetro de la NA es el índice de refracción – n : indica que cuando hay dos medios en el cual se está desplazando la 
luz, cuando el haz de luz pasa de un medio a otro(con distintos n) se curva; lo que está dado por la ley de Snell y depende de 
la longitud de onda. La refracción es el cambio de dirección y velocidad que experimenta una onda al pasar de un medio a otro 
con distinto índice refractivo. El n afecta la AN y la resolución ya que la muestra esta en un cubreobjetos de vidrio (n=1,5); y la 
luz pasa del vidrio al aire (n=1), en este pasaje la luz se curva. En cambio, en una lente de inmersión que usa aceite (n=1,515), 
dado que la diferencia entre el n entre ambas es muy pequeña, los haces de luz no sufren una refracción tan grande como la 
que ocurre en una lente seca. Por eso, en este caso se capta más luz y por ende se tiene mejor resolución – logro menor d0. En 
las lentes secas no se puede usar aceite para mejorar la resolución, sino que en las lentes que tienen la posibilidad de usar 
aceite están diseñadas específicamente para esa función. 
Resolución vs. Magnificación: La magnificación no tiene ninguna relación con la resolución. De hecho, se pueden tener 
objetivos de 100X con AN 1,25 y otro de 60X con AN 1,43. En este caso, el objetivo de 60 a pesar de no producir una 
magnificación tan grande como el de 100X tiene una mejor resolución. El aumento o magnificación no es sinónimo de 
resolución. 
La resolución no habla del límite en tamaño de la estructura que puedo observar al microscopio, sino que habla de la distancia 
mínima o el tamaño mínimo que deben tener determinadas estructuras para reconocerlas como tales. El límitede resolución 
d0 máximo es el límite de resolución de Abbe de 200nm. Las estructuras menores a 200nm en un microscopio óptico si se 
pueden ver pero no se pueden resolver. Se pueden ver estructuras menores inferiores que el límite de resolución si estas son 
capaces de emitir luz. Lo que no se puede saber son detalles, si son una o dos o tres estructuras, ni su morfología determinada 
– solo se pueden ubicar posicionalmente como puntos de 200nm. Para poder ver los detalles, se debe aumentar el limite de 
resolución. 
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3. Contraste 
El contraste, que se define como la diferencia de intensidad (brillo) entre un punto de la imagen y su fondo - el ojo humano 
para poder ver un borde de una célula o un núcleo necesita que exista una diferencia de intensidad de contraste del 2-5% que 
tiene que ser abrupta – de esto se ve que la visión no es absoluta sino comparativa con el fondo. En la microscopia cuando se 
quiera lograr un contraste importante para poder ver una estructura y resolverla hay que ajustar las condiciones para llegar al 
contraste justo. Esto es ya que la visión depende de la comparación local y de que no es posible determinar el valor del brillo 
absoluto. Para lograr el contraste necesario hay dos formas de modificarlo: 
❖ A través de la modificación de los parámetros propios del microscopio → A través de modificar la iluminación: con el 
voltímetro – que cambia la intensidad de la luz. Si hay mucho brillo hay un pésimo contraste; y si es muy poca la luz 
hay demasiado contraste, es mucha la oscuridad y no se puede observar lo que se está viendo. 
❖ A través del diafragma del condensador – que se encarga de modificar el cono de iluminación. En un diafragma 
totalmente abierto el cono de iluminación es máximo y en este caso se ven estructuras muy iluminadas que se ven 
como “lavadas” (tengo la mayor AN y mayor resolución). Al ir cerrando el diafragma de a poco, se achica el cono de 
iluminación y se gana en contraste de la imagen observada - se resaltan y contrastan las estructuras. Pero, cuando se 
disminuye el cono de iluminación, el cono de luz que llega al objetivo es menor y se disminuye la NA del objetivo – ya 
no capta todos los rayos posibles. Eso repercute en una pérdida de la resolución. Así, se establece una relación de 
compromiso entre el cono de luz de iluminación, la apertura del diafragma, el contraste y la resolución. 
Por lo que nunca hay que usar el diafragma para disminuir la intensidad de luz, sino que se ajusta con el voltímetro. Y se ajusta 
el contraste con el diafragma. 
También existen estrategias para incrementar el contraste más 
allá del ajuste propio de la observación por parte del usuario. Una 
forma de contrastar es con marcación, por ejemplo: con 
colorantes. Donde la luz que sale de la fuente de luz que pasa por 
el condensador es luz blanca – constituida por todas las λ que van 
de los 380-750nm. Los colorantes absorben todas las longitudes 
de onda exceptuando la λ que atraviesa la muestra y llega a 
nuestro ojo. Por ejemplo, cuando vemos una hoja verde, vemos 
que esa hoja tiene un pigmento que absorbe todas las λ con 
excepción de la que está a los 520nm – la que el ojo interpreta 
como verde. Se ve por ende, lo que no absorbe la planta. En el 
microscopio, cuando se ve un núcleo en color azul, el colorante absorbe todas las λ menos la que el ojo interpreta como azul. 
Existen casos en los que no se puede utilizar un colorante, por ejemplo en las células en cultivo que están vivas – ya que el 
colorante necesita fijación lo que representa que la célula o tejido tiene que dejar de ser viable. Para esos casos existe la 
generación de contraste generada por las propiedades ópticas de los microscopios – contrastes ópticos (sin marcación). Las 
estrategias que se pueden utilizar son: el contraste de fases, el campo oscuro y el contraste de fases interferencia diferencial. 
Estos métodos se basan en las propiedades generadas por la interacción luz-luz y luz-materia, que se intensifican para generar 
contraste. 
Un ejemplo de esto es el campo oscuro, que tiene la particularidad de basarse en el principio de que un haz de luz cuando es 
dispersado puede llegar al detector. Para ello, se usa un anillo de campo oscuro que deja pasar la luz solo de los bordes – donde 
los bordes están lo suficientemente separados para que esa luz si no hubiese nada en el medio no entra al objetivo, pero si en 
el camino del haz de luz hay una muestra: cuando los haces de luz interaccionen con las diferentes estructuras de la muestra, 
los haces de luz van a sufrir un cambio de dirección – difracción y dispersión – y eso hace que algunos de esos haces puedan 
entrar al objetivo. Solamente entraran entonces, los haces que hayan sufrido un cambio de dirección porque interaccionaron 
con la muestra – así, solamente se ven brillantes los lugares donde había una estructura que permitió cambiar la dirección de 
la luz. Se trata de una situación ideal de contraste porque se tiene un fondo oscuro y solo se ven aquellas estructuras que 
cambian la dirección de la luz. 
En el contraste de fases – usa un microscopio de contraste de fases – los haces de luz que interaccionan con la muestra también 
son marginales (interaccionan con la muestra y cambian la dirección), pero en este caso el haz de luz que no interacciona con 
la muestra también ingresa al objetivo. Se basa en que cuando un determinado haz de luz que viene con una determinada λ, 
cuando interacciona con las muestras y esta tiene estructuras con diferente índice de refracción, cambia la velocidad de esa 
onda y se desfasa. Así, el microscopio compara las ondas que se desfasaron con respecto a las ondas que no interaccionaron 
con la muestra. La luz cuando atraviesa estructuras más gruesas y mayor índice de refracción (como el núcleo) cambia su 
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velocidad y cambia de fase – se vale de una interacción de la luz con la materia (cambio con n) y compara las luces. Cuando 
dos ondas están en fase, es decir sus máximos corresponden temporalmente en el mismo lugar (frecuencia parecida) estas 
sufren una interferencia positiva y se incrementa la altura del pico de la onda, lo que hace que se vea brilloso. En el caso de 
que si la luz atravesó la muestra y cambio de fase, cuando se suman las dos ondas se va a ver oscuridad porque hay una 
interferencia negativa. Así, se ven bordes brillosos y estructuras más oscuras; y se logra un contraste a partir de que la luz sufrió 
cambios que fueron explotados para generar contraste. 
La técnica de Nomarski o contraste de fases interferencia diferencial tiene un principio similar a el contraste de fases, pero 
además utiliza luz polarizada. Genera estructuras donde pareciera que la célula tiene relieve – aunque no debe confundirse 
con el volumen real de la célula, ya que lo que se esta observando es una generación de contraste. 
Otra forma de marcación (requiere de fijación y de permeabilización) es la fluorescencia que permite observar estructuras 
(inclusive proteínas) muy por debajo del limite de resolución, gracias a que esas estructuras emiten luz (como una luciérnaga). 
La fluorescencia es un método de contraste ideal, ya que lo que se ve es un fondo oscuro donde la molécula fluorescente que 
marca la estructura emite luz. También, se trata de un contraste selectivo, ya que marca una única molécula. La fluorescencia 
es un fenómeno por el cual cuando se irradia un átomo una molécula en particular con una determinada λ, los electrones que 
constituyen ese átomo van a cambiar de orbital (excitación) lo que luego baja a su orbital basal desexcitándose emitiendo luz. 
Se excita con una determinada λ, y la emisión es a una λ mayor (con menor energía que la λ que excitó). El tiempo que tarda 
en emitir define dos fenómenos: (1) Si la emisión es en nanosegundos (instantánea) se trata de fluorescencia, pero (2) Si la 
excito y tarda tiempo en desexcitarse (segundos, minutos, horas) es fosforescencia.En el caso de la fluorescencia, hay fluorocromos -moléculas fluorescentes que se excitan a una λ (menor, de mayor energía) y 
emiten a una mayor λ (de menor energía). Hay fluorocromos como el Cy5 que se excita con luz roja y emite en el infrarrojo, 
para ese tipo de microscopia el ojo no puede ver la emisión y se necesita una cámara especial que detecte esa emisión. También 
hay fluorocromos que se excitan en el UV y emiten en el visible. Los fluorocromos son por lo general moléculas de tipo 
orgánicas, básicamente anillos con dobles enlaces conjugados. 
Existen también los puntos cuánticos que no son moléculas orgánicas, sino son pequeños núcleos de semiconductores que 
dependiendo como estén constituidos pueden presentar diferentes colores de emisión. Los semiconductores no se degradan 
(como las moléculas orgánicas) y por ende tienen mayor vida media. 
Se pueden llegar a ver diferentes estructuras con diferentes colores que se pueden superponer y así, decir si una determinada 
estructura esta co-distribuyendo o si está en el mismo lugar que otra. Para que estas moléculas fluorescentes se unan 
específicamente o selectivamente a una estructura que se quiere evidenciar (o lo reconozcan) hay muchas estrategias: 
 Fluorocromo con selectividad: Directamente va a interactuar con una estructura o molécula particular de la célula. 
Un ejemplo es la molécula de Hoechst que se intercala en el ADN; por lo que se ve que cuando se agrega interacciona 
con el ADN y marca los núcleos en azul. Se obtiene selectividad ya de por si por cómo es la molécula. 
 Fluorocromo unido a una sonda de hibridación: La sonda es una molécula de ARN/ADN que, como el ADN se une por 
hibridación o complementariedad a otra molécula de ADN/ARN, logra que el fluorocromo se localice por esa 
interacción de fragmentos ADN-ARN/ADN en una determinada fracción del ADN que se está buscando. Haciendo 
diferentes combinaciones de fluorocromos con diferentes sondas (con secuencia de nucleótidos determinada – que 
se pegan específicamente a lugares con complementariedad de bases) se pueden ver los cariotipos, donde se tiñen 
los diferentes cromosomas. Si los tiño con diferentes tipos de fluorocromos los veo de diferentes colores. En este 
ejemplo, se pueden llegar a ver pares de cromosomas que no tienen un solo color sino varios; en los que ocurrió una 
traslocación de los cromosomas – proceso patológico en el cual un fragmento de un cromosoma se une a otro. 
También se pueden llegar a diagnosticar trisomías de pares. 
 Fluorocromo unido a anticuerpo: El anticuerpo es una proteína que tiene afinidad o selectividad por una estructura 
o proteína/HdC. Así, para reconocer una proteína o su localización en una célula, se generan los anticuerpos a los que 
se le unen la molécula fluorescente. Entonces cuando se observe la célula, se sabe que donde esta la fluorescencia 
está el anticuerpo y por ende, su molécula a la cual tiene afinidad. Un ejemplo, es la inmunofluorescencia. En ella se 
usa un anticuerpo primario que va a reconocer a la estructura que quiero revelar – antígeno; y se usa también un 
anticuerpo secundario unido al fluorocromo (molécula marcadora) que se va a unir al anticuerpo primario. Así, se 
amplifica mucho la señal, ya que se une un solo anticuerpo primario, pero más anticuerpos secundarios. Esto también 
sirve para que con un solo anticuerpo secundario se puedan revelar varias moléculas distintas. 
 Fluorocromos unidos a moléculas que le dan especificidad/selectividad: Como, por ejemplo, las leptinas. Otro 
ejemplo es la Faloidina-(FITC), que al fluorocromo verde (FITC) se lo conjuga y se lo une con una toxina – la faloidina. 
La faloidina (en hongos venenosos) se une solamente al citoesqueleto de actina polimerizado. 
9 
 
Teórico 3 – Microscopia II 
La microscopia de fluorescencia ayuda en situaciones problemáticas con respecto a la localización intracelular. Por ejemplo, 
en una representación esquemática, en el caso de que se quiera evaluar el efecto respecto de la localización de una 
droga/fármaco R y queremos ver cual es su efecto en una proteína T. Una proteína en una célula – sin ningún tipo de 
tratamiento - observada al microscopio de campo claro no se va a poder observar a menos que tenga una función desde el 
punto de vista de la morfología de la célula. Las células control con respecto de las células tratadas con el fármaco R se ven 
iguales, por lo que no se estaría viendo el efecto del fármaco. Para ver lo que está ocurriendo con la proteína en las 
circunstancias de utilización del fármaco, se puede utilizar un marcador fluorescente de núcleo (color rojo), que tiene afinidad 
para intercalarse en el ADN. Así, en las células control se ve el núcleo en rojo. La estrategia para observar la proteína T es la 
utilización de un anticuerpo – inmunofluorescencia, y por ejemplo se lo marca en verde. Se ve que en las condiciones control 
la proteína T (marcada con inmunofluorescencia) se encuentra fuera del núcleo, en el citosol (no homogéneamente distribuido 
– sino que está confinado en un dominio en particular). En las células tratadas con el fármaco R, se ve el núcleo en rojo y en la 
situación ideal, se vería a la proteína T verde en el núcleo de forma homogénea. Así, se observa si una proteína se esta 
movilizando intracelularmente ante el tratamiento con un fármaco por ejemplo. Para obtener estos resultados, se obtienen 
las fotos con cada fluorocromo y después se superponen. Lo que confirma que la proteína se translocó al núcleo es que tanto 
el fluorocromo verde como el fluorocromo rojo están colocalizados – están en el mismo lugar espacial desde el punto de la 
vista de la microscopia. Y al superponer en este caso rojo con verde la resultante es amarillo. 
Primero para hacer una inmunofluorescencia se necesita fijar a las células – hay que generar a través de un compuesto 
interacciones covalentes entre las diferentes macromoléculas – lo que hace que pierda la viabilidad. A su vez, se necesita 
permeabilizar a la membrana para permitir ingresar el anticuerpo o el fluorocromo (si este no atraviesa la membrana 
plasmática). Lo que lleva a que para que se pueda realizar una inmunofluorescencia las células tienen que ser no viables. 
Proteínas bioluminiscentes 
En los casos que interesa ver la translocación de la proteína in vivo, hay una posibilidad de usar la microscopia de fluorescencia 
en células vivas y es con proteínas. Para ello se desarrollaron proteínas fluorescentes. 
La primer proteína bioluminiscente que se utilizó para la microscopia de fluorescencia es la GFP (green fluorescent protein). 
Esta, es una adaptación de algo de la naturaleza – en la aequorea victoria se encontró esta proteína GFP. Esta proteína tiene la 
particularidad de formar entre sus 11 láminas β y el resto de sus aminoácidos un centro cromóforo – su configuración le va a 
permitir ser fluorescente. Por diferentes mutaciones y por el estudio de diferentes organismos, se vio que no hay solamente 
una proteína fluorescente verde, sino que hay muchísimos colores de proteínas fluorescentes – lo que es importante para 
poder marcar distintas organelas o diferentes proteínas. 
La GFP se aplica a la microscopia de fluorescencia. Para ver una 
proteína Y de color verde, hay que generar una proteína quimérica 
o proteína de fusión (especifica) – donde la proteína Y va a tener 
en su estructura primaria a la proteína GFP. En esas construcciones 
se debe validar que al agregar la porción de la proteína GFP a la 
proteína de interés conserve sus características funcionales y de 
movilización tal cual lo haría la proteína nativa. En el laboratorio 
se compran plásmidos (DNA circular) y en ellos se genera un 
plásmido con el gen de proteína de interés con al lado el gen de la 
GFP. Entonces al incorporar el plásmido a la proteína, se a expresar la proteína Y con la proteína GFP en su estructura primaria. 
El plásmido luego se amplifica, primero en bacteriasy luego se mete dentro de la célula. Luego, al microscopio de fluorescencia 
se van a ver algunas células con el verde y otras no, ya no que no todas fueron transfectadas con el plásmido. Así, la GFP 
permite seguir por ejemplo, la movilización de una proteína. La proteína GFP también se puede incorporar a un organismo, por 
ejemplo: son los GloFish son peces transgénicos que cuando se irradian con una luz emiten fluorescencia. 
Microscopios de fluorescencia 
Hay 3 tipos que tienen un principio muy parecido, pero tienen algunas cuestiones que los hacen más sotisficados que permiten 
técnicas más especificas para un objetivo en particular. Ellos son: 
 Convencional (widefield)  Confocal  Multifotónico 
En los microscopios de luz transmitida, hay una lampara incandescente de tungsteno (halógena) que es la fuente de luz; pasa 
por una lente colectora, puede haber un espejo y eso pasa por el condensador (filamento – lente colectora – condensador – 
objetivo – ocular – detector u ojo). 
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En el caso de utilizar fluorescencia, para excitar al fluorocromo verde hay 
que excitarlo con una luz azul – 480nm aprox (menor λ y mayor energía). Por 
lo que cuando se desexcita la molécula y ocurre el decaimiento desde el 
punto de vista de la energía – por emisión de energía no radiativas – emite 
a una λ mayor. Para ello, se necesita una fuente de luz que genere la luz azul 
(suelen ser lámparas de mercurio que no se pueden mirar directamente ya 
que dañan el ojo) para excitar el fluorocromo y que emita en verde. Pero la 
luz azul también debería llegar al detector – ya que la luz de excitación es 
muchísimo más intensa que la de emisión. Por ello, la iluminación tal cual se 
conoce en un microscopio de luz transmitida no podría ser utilizada en 
principio para la microscopia de florescencia. Por ello se utiliza la epiiluminación que utiliza una lampara de mercurio que 
emite con muchísima intensidad en todo el espectro visible. Eso pasa por una lente, un filtro (donde rebota como un espejo) 
va a la muestra -se excita y desexcita- que emite, pasa por objetivo, pasa por el pseudoespejo y llega a la detección. La 
epiiluminación tiene un camino de la luz de excitación es el mismo del camino de la luz emitida (hasta un cierto punto); y la luz 
de excitación va por el objetivo y la emitida también va por el objetivo. 
Configuración del microscopio de epifluorescencia 
El filamento de mercurio se excita, genera un arco voltaico y por la 
desexcitación del mercurio gaseoso se emite un haz de luz que contiene todas 
las λ – es una luz blanca que no es totalmente homogénea. Lo primero con lo 
que se encuentra ese haz de luz es con un filtro de excitación, que filtra de la 
luz blanca exclusivamente la λ que me interesa. En el ejemplo, se filtra una λ 
azul. La luz pasa por el filtro y se encuentra con un espejo dicroico a 45°, que 
esta diseñado para comportarse como espejo para la λ que corresponde a la luz 
azul que llega. Así, la luz rebota y sale por el objetivo; llegando así a la muestra. 
En ese momento la luz azul excita al fluorocromo que se va a excitar y desexcitar 
emitiendo a una λ correspondiente al verde. La emisión sale para todos lados 
(no se emite solo para un lugar) pero el objetivo capta el cono de luz emitido. La luz verde tiene otra λ y se encuentra con el 
espejo dicroico, que para esta λ no funciona como espejo sino como simplemente un vidrio fácilmente atravesado por la λ 
verde. Así, pasa y se encuentra con un filtro de emisión, que filtra exclusivamente al λ que se quiere ver. Eso atraviesa el ocular 
y llega al detector. Con esta configuración, la luz de excitación no puede llegar al ocular ni al detector genera una imagen con 
fondo negro donde exclusivamente se ve la emisión del fluorocromo de interés. Luego para ver fluorocromos de otro color, lo 
que se hace es rotar o cambiar el cubo de forma que cambie el filtro de excitación, el espejo dicroico y el filtro de emisión. De 
esa manera, se pueden observar por separado cada uno de los fluorocromos. También existen cubos que ven en simultaneo 
diferentes fluorocromos, hay miles de combinaciones según lo que se quiera detectar y según el uso que se le quiera dar. 
Mejoras que puede tener la microscopia de fluorescencia 
La luz para llegar a una estructura determinada, por ejemplo: el núcleo; debe atravesar toda la célula, y mientras fue 
atravesando ese haz de luz excitó no solo el fluorocromo de interés sino todo lo que estaba en el camino. Eso, suele generar 
imágenes con un fondo con fluorescencia fuera de foco – que se excitó y se metió en el objetivo pero que no es del campo del 
plano focal que se quiere mirar (parte de la célula que se quiere mirar). Para mejorar este problema existen dos métodos: 
1) Analógico: Por cambios en el microscopio 
Es lo que se llama un microscopio confocal. Cuando se excita con un láser (la especificidad de la λ ya no se hace con un filtro, 
sino que ahora es con un láser), se excita a la muestra en todo su volumen. Para ver solo una estructura, el microscopio confocal 
recoge únicamente y exclusivamente la emisión que proviene del 
punto de foco que yo quiero. Se pone un pin-hole para permitir pasar 
solo la fluorescencia de ese punto, ya que la fluorescencia que viene 
de otros lados no es capaz de atravesar el pin-hole y choca con las 
paredes de ese agujerito. Al eliminar la luz fuera de foco se pueden 
ver en mucho mayor detalle las estructuras. Además, permite sacar 
fotos a diferentes alturas de una célula – de diferentes planos; y con 
ellas se puede hacer un análisis de las diferentes partes (que en el 
microscopio común con la fluorescencia fuera de foco es engorroso) 
que permite reconstruir a la célula en 3 dimensiones. 
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El microscopio multifotónico es una variación del confocal, ya que nuevamente se excita con un laser a toda la muestra (aunque 
solo se recolecta el punto focal de interés). Eso hace que si bien se elige el plano focal, la fluorescencia restante se pueda meter 
dentro del pin-hole; lo que no es una condición inicial. Entonces, este tipo de microscopio en vez de mandar un único haz de 
luz con la energía exacta, manda 2 haces de luz con la mitad de la energía (mayor λ). Así, los dos haces de luz se encuentran en 
un único punto y ahí se suman. La resultante es que los dos haces, que al tener menor energía no tienen energía para excitar 
al resto de las moléculas, sino que van a excitar cuando se encuentren en un punto determinado de la célula. Así, permite una 
mejor resolución de imágenes y la observación de mayor cantidad de detalles. 
Comparando ambos microscopios: “Cuanto más energía tiene una onda EM, menos penetrancia tiene – cuanto más alta es la 
energía, menos profundidad va a lograr (va a entregar su energía antes de tiempo)”. Así, el microscopio multifotónico permite 
un nuevo tipo de microscopia: intra vital. Esto quiere decir, que por microscopia de fluorescencia se puede mirar el cerebro de 
un ratón vivo – con ello se pueden ver por ejemplo neuronas. En este caso entra en juego nuevamente la distancia de trabajo 
(WD), ya que si el microscopio tiene mucha AN la distancia de trabajo es muy corta y no se puede lograr la penetrancia a pesar 
de utilizar un microscopio multifotónico. Para esto, necesita también objetivos muy específicos buena AN y una WD muy larga 
(mm – que en microscopia es muchísimo) 
2) Digital 
Es muy importante el análisis digital de las imágenes. En este entra el fenómeno de convolución: que indica que al tener algo, 
el simple hecho de observarlo le va a incorporar algo a esa observación que genera una imagen que va a tener el componente 
del objeto original + la convolución (todo lo que aporta la misma observación). Es decir, la imagen obtenida es el producto de 
la imagen original más la convolución (función g). Lo que se busca en microscopia es ver cómo es originalmente la imagen que 
se está observando en el microscopio – se le aplicala deconvolución (sacar la convolución que sufrió la imagen o la función 
original). Para aplicarla, se necesita conocer que convolución mi sistema de observación provoco – que es lo que le hizo a una 
imagen conocida mi proceso de observación. Para ello se utiliza la PSF = función de dispersión de un punto – que busca 
observar en el mismo microscopio en las mismas condiciones algo que se sepa como es. Para ello se miran esferas, que se 
saben como son; pero se ven con patrones de difracción y dispersión que aporta el sistema de observación. Si se como es el 
objeto y se como es la resultante, se puede calcular la función de dispersión – que le pasó a ese punto para transformarse en 
esa imagen. Para ello, se usa la imagen original y se le aplica la función inversa; es decir si al punto le paso esto, a la imagen 
probablemente le paso lo otro. Así, se puede resolver una imagen fuera de foco. Es un análisis de software; a la imagen se le 
aplica un procesamiento matemático para resolverla. 
FRET Y FRAP 
Son dos técnicas que se utilizan con microscopia confocal principalmente, o con el multifotónico y con el convencional (un 
poco). Ambas permiten un análisis más allá de la imagen. 
FRET – fluorescence resonance energy transfer 
Indica que existe una transferencia de energía a partir de la fluorescencia entre dos fluorocromos. Al tener dos fluorocromos 
o dos proteínas fluorescentes, hay un donador (se excita a una λ determinada) y un aceptor. Lo que debe ocurrir para que se 
pueda realizar es que la emisión de uno de los fluorocromos o proteínas fluorescentes tiene que ser la energía de excitación 
del segundo fluorocromo o proteína fluorescente. 
Si las dos proteínas o fluorocromos están alejados, cuando se excite a la 
primera (con una λ adecuada para ella) emite su fluorescencia. Pero si las dos 
proteínas o fluorocromos interactúan, se encuentran a una distancia menor a 
5nm (o deberían estarlo); ahora al excitar a la primer proteína, se ve la emisión 
de la segunda proteínas. En este caso se evidencia si dos proteínas se 
encuentran íntimamente relacionadas, a menos de 5nm. Aunque no 
necesariamente se necesitan que sean dos proteínas distintas, puede haber una proteína quimérica donde hay 2 proteínas 
fluorescentes. Así, se ve en la imagen que cuando no hace FRET tiene una conformación y cuando ocurre un cambio 
conformacional que aproxime las dos porciones de proteína fluorescente ocurre el FRET. Es por lo tanto una técnica que 
permite evaluar la interacción entre moléculas sino para ver cambios de conformación dentro de una misma proteína. 
FRAP – florescence recovery after photobleaching 
Es una técnica que ve como se recupera la fluorescencia en una determinada porción de la célula en función del tiempo. Por 
ejemplo, en el caso de tener una proteína (marcada fluorescentemente) en un compartimiento determinado. Para ver in vivo 
lo que le pasa a la proteína se genera la proteína quimérica, se expresa y se la ve en un dominio especifico. En estas células en 
cultivo se les genera un fotoblanqueo – cuando se irradia ese tipo de fluorocromos o proteínas fluorescentes con mucha 
intensidad, el fluorocromo se destruye al destruirse el centro cromogénico y por ende dejan de emitir fluorescencia. Al hacer 
12 
 
esto, se ve que pasa en el tiempo en esa zona; es decir, cuanto tiempo tarda 
en recuperar la fluorescencia. Esa fluorescencia que se está recuperando no es 
de las proteínas fotoblanqueadas, sino de la misma proteína fluorescente que 
está viniendo de otros lados y volviéndose a incorporar en esa zona. De es 
forma se puede ver la velocidad de difusión de una molécula, la velocidad de 
transporte o la compartimentalización. También se puede ver como se pierde 
proteína fluorescente en el otro lado, que quiere decir que la proteína estaba ahí y pasó a la zona fotoblanqueada. 
Otro ejemplo son los indicadores. Se pone una molécula, se expresa en la célula o se incorpora en la célula (no tiene que ser 
necesariamente una proteína, sino que puede ser un fluorocromo permeable que ingresa a la célula) que emite fluorescencia 
cuando por ejemplo: interacciona con calcio. Se ve como se produce una corriente de calcio en un tiempo, bajo determinadas 
circunstancias o en un momento en particular como la fecundación. 
Microscopia electrónica 
Es otro tipo de microscopia en el cual no hay óptica – no hay lente de cristal, sino que hay otros tipos de elementos. La 
particularidad que tiene el microscopio electrónico es que tiene un límite de resolución menor que el microscopio óptico, ya 
que puede llegar a resoluciones a nivel de átomos (no experimentalmente, pero si teóricamente). Disminuir el límite de 
resolución y mejorar/aumentar el poder resolutivo, se puede hacer mediante dos maneras: (1) Aumentar la AN ó (2) Disminuir 
la λ de la onda electromagnética. El segundo inciso es importante ya que en la microscopia óptica se trabajaba básicamente en 
el espectro visible (380-750nm), pero la microscopia electrónica usa ondas EM de menor λ mayor energía, lo que repercute en 
la resolución. De hecho, la microscopia electrónica usa un haz de electrones que tiene una λ de 0,004nm; por lo que 
teóricamente se lograría una resolución de 0,002 nm – sin embargo, dado la AN y la imposibilidad de corregir muchas 
aberraciones que ocurren en la construcción de los equipos se logra una resolución de d0 = 0,1nm. Se puede ver la 
ultraestructura de una célula e inclusive de una organela. 
La construcción del microscopio electrónico es completamente distinta a la 
microcopia óptica. En la ME hay un filamento que genera electrones que van a 
acelerarse – se tiene un cañón de electrones. También hay una lente 
condensadora que es un electroimán – que condensa el haz de electrones que llega 
a la muestra (que se encuentra sobre una rejilla). Esos haces pasan nuevamente 
por una lente electrónica – electroimán – que haría de objetivo y por otro 
electroimán – lente colectora que hace de ocular. Dado que la λ del haz de 
electrones es muchísimo menor al espectro visible, a la vista humana no se vería 
(a pesar de ser un haz con una gran cantidad de energía – dañaría el ojo). Por ende, 
se necesita algo que capture el haz de electrones y lo transforme en una imagen 
observable – detector o película fotográfica. Dado que el haz de electrones tiene 
una altísima energía, si hubiese aire en el camino se vería dispersado por los 
propios átomos que conforman el aire; por lo que todo se encuentra en vacío. Si 
la muestra se encuentra en vacío, no se puede realizar en células vivas o viables, y las células tienen que estar fijadas. 
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Preparación de las muestras para el ME de transmisión 
1) Fijar (GA – glutaraldehído y TO4Os – tetróxido de osmio) 
2) Deshidratar – reemplazar agua de la muestra por un solvente 
3) Secciones 50-100nm : Cuanto menor λ, mayor es la energía de la onda EM; y cuanto mayor energía, 
menor penetrancia (llega a menores profundidades). Se trabaja con secciones muy finitas de tejido 
para poder realizar la microscopia. 
4) Contrastar (Pb y U – sales de): Dado que los componentes de los tejidos biológicos no son electrodensos, hay que 
contrastar utilizando metales muy pesados. Para que el haz de electrones pueda rebotar en los metales pesados y se 
vean en negativo las zonas donde no atravesó el haz de electrones 
Otra técnica que se utiliza para la preparación es el sombreado o réplica, donde en la muestra se evapora un metal como el 
platino, se le pone una capa de carbón y se elimina la muestra; por lo que se obtiene una réplica en relieve de la muestra que 
cuando se coloca en el microscopio electrónico se puede ver cómo era la célula. 
Hay otra técnica que es el microscopio crioelectrónico, donde la muestra no se fija ni sufre ninguno de los pasos anteriores, 
sino que directamente se congela a muy bajas temperaturas y se observa directamente congelado y se pueden realizar 
criofracturas del tejidoy ver inclusive moléculas o su configuración. 
Microscopio electrónico de barrido 
Es una variante del microscopio electrónico. En este caso no se ven 
los electrones que atravesaron la muestra, sino que toma los 
electrones que rebotan – son dispersados por la muestra. Su 
configuración es muy parecida con la diferencia de que tenemos la 
lente objetivo que va a enfocar, pero además hay un deflector – que 
mueve el haz de electrones para que haya como un barrido sobre la 
muestra. Y el detector detecta los electrones que se dispersan. Por 
la localización de los electrones y el tiempo que tardan en llegar al 
detector es que después se va a generar una imagen tridimensional 
del espécimen. 
 
14 
 
Técnicas del cultivo de células y del fraccionamiento celular 
Cuando se tienen células eucariontes, para estudiarlas se pueden ver sus características: 
❖ Estructura: Ya que es una célula altamente organizada 
❖ Ultraestructura: Como se organiza intracelularmente, como se disponen sus compartimientos celulares – típico de 
cada tipo celular 
❖ Morfología: Fenotipo típico en cada tejido 
❖ Composición química 
❖ Fisiología 
Para abordar el estudio de las células eucariontes hay que plantearse 3 preguntas: (1) ¿Qué quiero estudiar? ; (2) ¿Dónde lo 
quiero estudiar? En un órgano, o en los tejidos del órgano, o en células aisladas; en la célula entera o en compartimientos 
aislados (sistema libre de células) ; (3) ¿Cómo lo voy a estudiar? ¿Qué metodología? Microscopia, fraccionamiento celular, 
cultivo celular, cromatografía, electroforesis, western blot, PCR. Todo este conjunto son técnicas para el estudio de las células. 
Son los sistemas a donde quiero estudiar la característica celular. Por ejemplo, una característica celular es el transcriptoma – 
total de ARNm que ha sido transcripto a partir del genoma de una célula / conjunto de ARN expresados – se habla de calidad: 
de que genes se transcribieron en esa célula (ya que no todos los genes se expresan de la misma manera en todas las células – 
cada célula tiene un perfil de expresión característico que se ve reflejado en el ARN de ella). Para estudiar al transcriptoma, se 
lo puede hacer: 
 In vivo: Muestra de tejido u órgano que provienen de seres vivos (animales de experimentación o seres humanos). La 
muestra se obtiene directamente. 
 In vitro: A partir del ser humano o de los animales de experimentación se puede obtener una muestra. Cuando es de 
un ser vivo se denomina biopsia, y si es de un animal muerto es una necropsia. En el caso de que sea un órgano entero, 
se puede trabajar con las moléculas; o también se pueden aislar las estructuras que los componen. A partir de las 
estructuras aisladas se pueden separar las células que lo constituyen y tener células aisladas. Y en el caso que se quiera 
perpetuar el estudio y tener una gran cantidad de células se puede hacer un cultivo celular. – Todos los experimentos 
que ocurren fuera del organismo. 
 Sistema libre de células: Permite estudiar particularidades de la estructura y función celular; y está compuesto por los 
compartimientos aislados. Estos compartimientos aislados se pueden obtener a partir de todas las muestras 
anteriores, a través de un proceso de fraccionamiento celular. Estas células se mantienen por mucho tiempo y en gran 
cantidad lo hacen gracias a técnicas de cultivo celular. 
Aislamiento y cultivo de células celulares 
Es el conjunto de técnicas que permiten el crecimiento y el mantenimiento de las células fuera de un organismo, “in vitro”, 
preservando sus propiedades fisiológicas, bioquímicas y genéticas. Estos cultivos pueden realizarse obteniendo las muestras a 
partir de un animal de experimentación, un ser humano o a partir de una línea celular. 
Las células para realizar los cultivos celulares se obtienen: 
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Para realizar el aislamiento de células de un tejido hay que tener en cuenta qué tipo de tejido se tiene: solido o líquido. 
En las células de un tejido liquido se puede hacer: 
1. Centrifugación en gradiente: Se realiza en tubos tipo Falcon a los cuales se les agrega Ficoll-Paque – esta sustancia tiene la 
particularidad que cuando se la centrifuga es capaz de formar gradientes de concentración. En ellos, se siembra el líquido 
por encima de la muestra de Ficoll-Paque y luego se la centrifuga a una determinada cantidad de rpm en una determinada 
centrifuga. Luego, se ve la separación de la muestra liquida; donde los componentes más pesados van al fondo del tubo y 
en la parte de arriba se encuentran los componentes menos densos (ej. el plasma en la sangre). En este procedimiento, se 
ve la separación de distintos tipos de células. De la sangre, se pueden cultivar los glóbulos blancos – fracción granulocítica 
(neutrófilos, basófilos y eosinófilos) y fracción agranulocítica (linfocitos y monocitos). Para poder cultivar únicamente uno 
de esos tipos celulares se puede utilizar: 
2. Afinidad e imanes con Dynabeds (bolitas magnéticas): Es 
una forma muy sofisticada que se usa para obtener 
compartimientos que se utiliza para separar células, 
moléculas y vesículas celulares. Como cada célula tiene en 
su superficie proteínas o moléculas típicas y únicas de cada 
tipo celular – antígenos de superficie; a la solución se le 
pueden agregar pelotitas magnéticas conjugadas con 
anticuerpos dirigidos contra el antígeno de superficie 
especifico de la célula que se quiere separar. En este caso, 
para separar a los linfocitos que tienen CD3 en su superficie 
se utiliza un anticuerpo anti-CD3. Una vez que la bolita con 
su anticuerpo está en contacto con las células, el anticuerpo va a reconocer con alta especificidad por complementariedad 
molecular al antígeno CD3 (solo sobre linfocitos). De esta manera todos los linfocitos quedan unidos al anticuerpo y a la 
bolita magnética. Así, al final del procedimiento aplicando un imán muy potente sobre la superficie del tubo de trabajo, se 
pueden conservar donde se encuentra el imán, todas las células que hayan sido unidas por las partículas magnéticas. Y en 
la solución quedan todas las células que no tenían el antígeno – no eran magnéticas tampoco- y por lo tanto se pueden 
descartar con una pipeta. Una vez que las células de interés han sido aisladas pueden ser utilizadas para subcultivo. 
3. Citometria de flujo (FACS): Es la separación de células asistida por fluorescencia. En este caso, al linfocito que quiero 
separar, lo tengo que marcar con un anticuerpo que sea fluorescente. Así, la mezcla de células es introducida en un 
citómetro de flujo, donde atraviesan lásers – que detectan la emisión fluorescente y permiten la separación de las células 
fluorescentes (de interés) con respecto a las no fluorescentes. 
Con cualquiera de estos métodos se logra la separacion de distintos tipos celulares de un tejido liquido. Asi, queda el tipo 
celular aislado. Al tener la célula aislada, hay que recogerla en el tubo correspondiente (generalmente tubos tipo Eppendorf – 
hasta 2ml). Una vez centrifugado, se conservan las celulas que se encuentran en el pellet – sedimento y el liquido que queda 
por encima = sobrenadante se descarta porque puede contener restos de los medios que se utilizaron para la separacion 
celular. El pellet se resuspende en un medio adecuado – condiciones de cultivo adecuadas – y se translada a un recipiente para 
poder realizar el cultivo. A partir de este momento a las celulas que aisle del tejido, lo trato en condiciones de cultivo celular. 
El cultivo que se va a propagar dentro del material de cultivo en 
condiciones adecuadas se denomina cultivo primario. Se denomina 
así ya que las células que estoy cultivando fueron obtenidas en 
forma directa del organismo que quiero estudiar. 
La velocidad de crecimiento de cultivo es el número de divisiones que llevan a cabo las células por unidad de tiempo, lo que se 
representa en función de las generaciones celulares. Un cultivo primario en las primerasgeneraciones, la velocidad de división 
es muy elevada (cada 6hs) – el n° de divisiones de esa célula por unidad de tiempo es muy alta. Después, llega un momento a 
determinada generación (= madres a hijos) donde la velocidad de división va a disminuir (ej. cada 12hs) y esa velocidad de 
división se mantiene constante a lo largo de un gran numero de generaciones 
celulares, desde las 5 hasta las 50 – a eso se lo denomina fase 2. Va a llegar un 
momento donde esas células van a disminuir rápidamente la capacidad de 
dividirse, ya no se van a dividir – sino que la velocidad de dividirse va a ocurrir 
cada periodos más largos (1 vez cada 48hs, 1 vez por semana, 1 vez cada 6 
meses). Al proceso donde la velocidad de división disminuye, se lo denomina 
senescencia replicativa. La senescencia replicativa es un proceso donde la 
capacidad que tiene la célula de dividirse – su velocidad para la división celular 
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disminuye, NO significa que la célula se muere. Por ejemplo, los órganos en edad adulta están casi todos en senescencia 
replicativa y nosotros estamos vivos y nuestras células también. La senescencia replicativa es un fenómeno que se observa 
tanto in vivo como in vitro. Se inicia cuando las células alcanzan el límite de Hayflick (p50 – aprox 50 divisiones) y dejan de 
dividirse. El limite de Hayflick es el número de duplicaciones que puede sufrir una célula eucariota antes de entrar en 
senescencia. En la senescencia, el ciclo celular se suspende de manera permanente y las células quedan detenidas en la fase 
G0/G1 – por lo tanto, no responden a mitógenos (sustancias que estimulan la división celular). 
En general el fenómeno de senescencia se asocia y se debe al acortamiento de los telómeros. Un cromosoma duplicado es 
aquel ya que ha paso la fase S del ciclo celular. El cromosoma tiene partes con ADN altamente repetitivo – hasta 1000 
repeticiones de la misma secuencia – que son características, una de ellas es el centrómero y las otras son los telómeros 
(secuencias de ADN en el extremo del cromosoma). Los telómeros tienen varias funciones, la principal de ellas es “cerrar al 
cromosoma” ya que, si éste no existiera, el extremo del cromosoma estaría compuesto por una secuencia probablemente 
codificante – que estaría constantemente expuesta a la acción de sustancias y enzimas que podrían alterar y degradar la 
secuencia de genes. Entonces, tener en el extremo donde termina la secuencia de genes una secuencia de ADN altamente 
repetitiva no codificante y que se cierra sobre la punta del cromosoma acompañado de proteínas – como si fuera un nudo – 
protege la estabilidad del cromosoma. 
En cada división, la longitud de los telómeros se acorta; esto sucede por el mecanismo de acción de la ADN polimerasa en 
donde una de las cadenas queda sin su hebra complementaria. Para solucionar y evitar que se acorten los telómeros existen 
enzimas telomerasas – son transcriptasa reversas que utilizan un molde de ARN y ellas luego que se ha duplicado el cromosoma 
(ambas hebras de ADN que forman el cromosoma), aquellos extremos que hayan quedado más cortos van a ser reparados por 
la telomerasa. De manera que si el ADN es reparado y su longitud no se acorta, la célula puede seguir dividiéndose porque sus 
cromosomas pueden seguir duplicándose y manteniendo su información genética. Lo que ocurre, es que la actividad de la 
telomerasa es muy alta en personas jóvenes, pero a medida que avanza la edad, su actividad disminuye. A medida que la 
actividad de la telomerasa disminuye, disminuye la longitud del telómero – porque no puede ser reparado y en cada división 
celular se acorta. Para poder proteger el ADN celular de cada cromosoma, al disminuir la actividad de la telomerasa la célula 
entra en un estado senescente (y deja de dividirse). 
Por otro lado, las células en senescencia al dejar de dividirse las células quedan en G0/G1 y no pueden ingresar a la fase S. En 
el ciclo celular, la mayor parte de la célula ocurre en interfase – periodo del ciclo en el que la célula no entra en mitosis. Cuando 
la célula recibe el estímulo adecuado, entonces comienza la duplicación del ADN en la fase S y en ella al final, hay un cromosoma 
duplicado (forma X – con dos cromátides hermanas cada una tiene una molécula de ADN). Luego de G2 entra la fase M de 
mitosis, donde se dividen los núcleos celulares y cada uno de ellos va a recibir una cromátide hermana de los cromosomas que 
se duplicaron. Para que una célula pueda dividirse, debe ser responsivas a señales desde el extracelular – a los mitógenos. Los 
mitógenos activan el ciclo celular a través de vías de señalización que provienen del exterior celular y llegan hacia el núcleo, 
activando una serie de mecanismos complejos que permiten que la célula pase de G0 a G1 y entre a la división celular. 
Las líneas celulares que se utilizan BCM son las MDCK – células epiteliales de 
riñón de perro (se compran). Las células que pierden la senectud y readquieren 
la capacidad de dividirse se denominan líneas celulares. Estas, pueden ser 
consecuencia de una transformación en su genoma – puede haber mutaciones 
– espontaneas no oncogénicas ó transformaciones no espontaneas. La célula 
está transformada en cuanto al ADN, porque ya no tiene el ADN original; pero 
las células que se obtienen espontáneamente o por manipulación no son 
tumorales – son una línea, donde se favorece que se puedan dividir 
constantemente sin entrar en senescencia. 
Las otras células que también son una línea y se puede trabajar en ellas son las células de transformación oncogénica – tienen 
su ADN mutado, pero se han mutado dentro del organismo del cual se obtuvieron. 
Para que las células puedan crecer en cultivo hay 3 tipos de requerimientos (los cuales 
todos son necesarios): 
1. : El medio nutricio y la superficie de 
cultivo 
El medio nutricio que requieren las células animales para que puedan proliferar en 
cultivo. Aporta un medio de cultivo (está a un pH adecuado entre 7,2 y 7,4; y 
preparado con agua desionizada – es rojo por el indicador de pH - este vira cuando la 
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célula prolifera mucho en el cultivo y está metabólicamente muy activa y por lo que libera CO2 – así, vira del rojo al amarillo. 
Cuando vira, es un indicador de que debemos cambiar el medio ya que se está agotando en cuanto a sus nutrientes; y como el 
crecimiento celular fue muy alto indica que se debe hacer un subcultivo). Para que la célula pueda construir estructuras y 
obtener ATP se necesita el medio de cultivo. 
También contiene SFB que se agrega, ya que el medio de cultivo tiene factores de crecimiento (mitógenos que estimulan la 
cascada de señalización que permite el pasaje de G0/G1 a S). El suero es fetal, es decir se obtiene de un organismo con alta 
cantidad de factores de crecimiento para que las células puedan recibir el estímulo adecuado y puedan proliferar. Además, el 
SFC contiene ácidos grasos, que son fundamentales para que las células puedan construir membranas (sin ellos no pueden) y 
así se pueden dividir. Los AG provienen en las lipoproteínas plasmáticas o vienen en el suero unidos a la albumina o a proteínas 
unidoras de AG. 
Por último, el medio nutricio contiene un antibiótico que se agrega debido al proceso de manipulación pueden ingresar al 
cultivo bacterias o hongos (por más de que se trabaje en condiciones de asepsia) que contaminan el cultivo. Así, se previene la 
contaminación y que se invalide el procedimiento. 
Con respecto a la superficie: Lo primero es que hay 2 tipos de células en cultivos celulares: 
a. Células adheridas a un soporte: crecen en monocapa 
Generalmente son las células que provienen de los tejidos solidos) Estas necesitan para poder crecer los mitógenos (del SFB), 
necesitan tocarse o estar en contacto entre ellas – es decir estar en una densidad adecuada para poder dividirse; y necesitan 
generar una lamina basal (parte de la matriz extracelular, inmediatamente por debajo dela superficie basal de las células). La 
lamina basal se encuentra compuesta por colágeno tipo IV, laminina, perlecano y entactina es generada por las propias células. 
En el cultivo necesitamos que las células que se van a colocar en el recipiente para ser cultivadas generen la matriz extracelular. 
Para ello, se han generado superficies solidas (de vidrio o plástico) en las cuales la superficie va a estar cubierta por una 
densidad de cargas (negativas o positivas) o por alguna sustancia que sea inductora de cargas, o por una cubierta de colágeno 
o por una cubierta de polilisina. Las sustancias con alta densidad de carga inducen que la célula sintetiza ME, y favorecen que 
la célula se adhiera al soporte. Una vez que la célula se adhirió, va a tratar de emitir prolongaciones – filopodios – para tratar 
de establecer contacto con células vecinas y así, activa de manera concreta la división de las células en cultivo (favorecida por 
los mitógenos). 
Las superficies solidas de plástico o de vidrio pueden ser: cajas de Petri, multi cajas de Petri (o multipocillos o multiwells, que 
van de 4 a 96 agujeros) y botellas (se usan para tener una gran cantidad de células, ya que tienen una gran superficie). Todo 
este material debe estar estéril – ya se compra así, generalmente es sometido a esterilización por radiación gamma. 
 También existen los transwells, que tienen una superficie con un filtro 
poroso donde se siembran las células – así, se permite cultivar en 
condiciones determinadas, que tienen bien definida la superficie basal (que 
se le puede agregar un medio basal determinado) y una superficie apical a 
la que también se le puede aplicar un medio apical determinado. Este tipo 
de cultivo permite tener a la célula en una superficie basal distinta de la 
superficie apical, haciéndolo más parecido al ambiente que la célula tiene 
en el órgano de origen (se usan mucho en farmacia para ver como las drogas 
pueden ser absorbidas por las células). Por ende, los transwells sirven para estudiar la capacidad de migración celular. 
Cuando las células crecen en monocapa y se las agrega al recipiente de cultivo (luego de ser 
extraídas del órgano) lo primero que hacen es adherirse a la superficie de cultivo ya que 
generan la ME inducidas por el recubrimiento del soporte de cultivo. Esto ocurre cuando 
recién se agregan las células, y al microscopio se observa una baja densidad de células. Con el 
tiempo, las células comienzan a dividirse y la densidad aumenta. Las distintas densidades que 
ha alcanzado un cultivo celular (monocapa) después de un periodo de tiempo se denomina 
confluencia. El grado o % de confluencia da idea de la densidad (o del crecimiento) del cultivo. 
Un cultivo confluente es aquel que tiene la monocapa de células adherentes continua y 
uniforme donde las células han alcanzado entre el 80-100% de confluencia. En esa situación, 
se dice que el cultivo llego a confluencia total o está confluente (que ocupo toda la superficie de cultivo). En estas condiciones 
disminuye el crecimiento celular debido a la inhibición activada por el contacto célula-célula (ya que se establecen múltiples 
contactos entre células que emiten señales) y se impide que la célula se siga dividiendo. Cuando se llega a confluencia total se 
debe hacer un subcultivo. 
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Todos estos cultivos proliferan hasta ocupar toda la superficie – son cultivos bidimensionales (ocupan el largo y ancho). Hoy 
en día hay cultivos tridimensionales – además tienen volumen y tienen un aspecto más parecido a lo que se puede encontrar 
en el organismo (ya que la desventaja de los cultivos celulares es que no mimetizan las condiciones del organismo). Para 
lograrlos, a las células se las crece en gotas o matrigel. 
Los cultivos tridimensionales en gota o cultivos esferoides. Un método sencillo para generar esferoides consiste en crear gotas 
sobre una suspensión celular (“método de la gota colgante”) sobre la cara inferior de una superficie de vidrio o plástico. En 
cada una de esas gotas se siembra una cantidad mínima de célula (pero adecuada), esas gotas nunca se van a adherir al soporte 
ya que la caja con las gotas se apoya de manera invertida. Entonces las células están en la gota, pero al no poder estar en 
contacto con la superficie de cultiva, éstas no se pegan a la superficie de cultivo y a diferencia de pegarse se van a aglutinar 
entre ellas y van a empezar a establecer interacciones entre ellas, de manera tal en que crecen en forma de esfera. 
Aunque hoy en día los cultivos tridimensionales están más adelantados y existen los cultivos organoides, donde no solo hay 
un tipo celular, sino que hay diversos tipos celulares. De manera que cuando el cultivo 3D se genere, hay algo parecido a un 
órgano. Los organoides son cultivos tridimensionales derivados de células madre que presentan una estructura y 
funcionamiento similares a los órganos – son mini sistemas biológicos. Los organoides pueden recrear una gran cantidad de 
parámetros biológicos, incluida la organización espacial de células heterogéneas específicas de tejido, interacciones célula-
célula, interacciones célula-matriz y ciertas funciones fisiológicas generadas por células específicas de tejido dentro del 
organoide. Por esto, es más representativo al sistema in vivo. Esta técnica puede mejorar el testeo de fármacos para fines 
terapéuticos y reemplazar, en un futuro, el uso de ratones en el laboratorio. 
b. Células que crecen en suspensión 
Nunca se van a adherir al soporte porque en su fuente original tampoco estaban adheridas a nada – por ej. células sanguíneas. 
También se cultivan en plásticos o vidrio, con la diferencia de que estos no deben haber sido tratados para células que crecen 
en monocapa (Ya que no se necesita inducir la generación de ME). También se pueden usar tubos tipo Falcon de cultivo. Este 
tipo de material también debe estar estéril. 
 
Cuando estamos en condiciones de asepsia, estamos en condiciones de esterilidad; es decir, en ausencia o falta de materia 
séptica – la que produce contaminación (ausencia de bacterias, hongos y virus que pueden hospedar los cultivos). Asepsia 
también es el conjunto de procedimientos que impiden la presencia de bacterias, hongos y virus en el ambiente, objetos y 
operador. Se debe trabajar en condiciones de asepsia para que nuestros cultivos no se infecten, ya que por un lado éstos 
pueden matar a las células y además pueden alterar los resultados esperados. 
Además de la cabina de bioseguridad se deben tener en condiciones de asepsia: 
• Los medios de cultivo y soluciones de trabajo: Se pueden esterilizar con filtros que tengan un tamaño de poro de 0,22µm 
– es el tamaño de poro que retiene las bacterias, hongos y virus. Los filtros se colocan en la boca de jeringa y en la jeringa 
se coloca el líquido que se quiere esterilizar. Esta operación se coloca dentro de la cabina de bioseguridad. Esto permite 
esterilizar soluciones que contienen material que va a ser degradado por el calor – soluciones con glucosa, aminoácidos, 
o sueros. 
• Material de laboratorio y cirugía: Todo el resto del material que no tiene sustancias que se descomponen por el calor 
pueden ser esterilizadas por: (1) Calor seco, calentándolos en una estufa de esterilización por 1-2hs a 180°C ó en (2) 
Autoclave – olla a presión sofisticada que aumenta la presión, por lo que la temperatura a la que se tiene que someter las 
soluciones para poder esterilizarlas es inferior; y así se esterilizan tubos Eppendorf, por ejemplo. (3) Radiación gamma: 
Como se esterilizan los plásticos para cultivo – se llevan a la comisión nacional de energía atómica, que ellos lo hacen. 
• Operador y al ambiente: El operador debe tener guardapolvo de mangas largas, cofia, barbijo. Todo el ambiente debe 
estar lavado con lavandina al 1%. Las cosas que ingresan a la cabina de bioseguridad y las manos del operador deben ser 
desinfectadas constantemente con alcohol 70°.