CAPÍTULO 02 Métodos histológicos

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Métodos histológicos
"El arte y la ciencia tienen su punto de encuentto en eI método."
Bulwer
La totalidad del conocimiento actual re-
ferido a la estructura y la función de los or-
ganismos biológicos tiene su fundamento
en los métodos necesarios para Ia investi-
gación de las células y los tejidos. En algu-
nos casos, los grandes avances en Ia com-
prensión v el conocimiento fueron conse-^cuencia 
directa del desa¡rollo de una nue-
va técnica. La creación de la microscopia
electrónica, los métodos de fracciona-
miento celular, la inmunohistoquímica y
Ia tecnología del DNA son eiemplos claros.
Es necesario contar con ciertos conoci-
mientos respecto de los principios funda-
mentales de los métodos aplicados con
mayor frecuencia, para que el estudio de la
histología no sea tan sólo un aprendizaie
de determinados hechos, sino que además
permita adoptar una postura crÍtica frente
á ellos. En consecuencia, se comenzará el
estudio de Ia histología con un breve aná-
lisis de las generalidades de los métodos
histológicos, si bien a menudo será de gran
utilidad revisar algunos de estos métodos,
relacionados con el estudio específico de
las células y los teiidos.
En general, los métodos histológicos se
clasifican en dos grupos: los que se basan
en la observación directa de células y teli-
dos vivos, y los que analizan material
muerto o inanimado. En un lugar interme-
dio se ubican las técnicas de aislamiento
de los componentes de células vivas me-
diante métodos de cenfrifugación. En to-
dos los casos se comienza con el análisis
microscópico, de importancia fundamen-
tal para todos Ios métodos histológicos.
Ocular
Prisma
Estativo
Tornillo
macrométrico
Tornillo
micrométrico
oio
Tubo
Análisis microscópico
EI microscopio es el instrumento más
importante en la histología, debido al pe-
ouéño tamaño de las estructuras analiza-
das. Cabe destacar que cuando en este texto
se alude al término "microscopio" siempre
se refiere al microscopio óptico, a menos
que se especifique otra cosa.
Revólver
Ob¡etivo
Platina
Condensador
Tornillo de centrado
Fil tro de luz diurna
Brazo del condensador
DiafragmaFig.2-1. Dibujo esque-
mático que muestra un
microscopio óptico co-
mún. (Dibujo cedido
gentilmente por Fa. Carl
Zeiss AG.)
C A P í T U t O
Lámpara Colector Espejo
MÉTODOS HTSTOLOGTCOS 1s
Cuando la luz atraviesa un material bio-
lógico, por ejemplo un preparado histoló-
gico, cambian sus características, y estas
modificaciones se hacen visibles median-
te los sistemas de lentes. El ojo puede di-
ferenciar variaciones de intensidad de la
luz (contraste entre luz y sombras) y de
color (distintas longitudes de onda). En
consecuencia, es necesario modificar la
luz, para que el preparado se observe co-
mo formado por elementos más oscuros y
más claros o de distintos colores. Las cé-
lulas y los tejidos no coloreados se suelen
captar con el microscopio como carentes
de color y transparentes, porque no pre-
sentan suficiente contraste. Con la ayuda
de tinciones histológicas se logra uná ab-
sorción diferencial de la luz, de modo que
se visualizan las distintas estructuras.
Poder de resolución y aumento. Estos
dos conceptos se emplean para determi-
nar la utilidad de un microscopio v se de-
ben diferenciar con claridad éntrá sí. Es
Apertura numérica y poder de resolución
La capacidad de refracción o índice de
refracción de un medio se define como
Ia relación entre la velocidad de Ia luz
en el vacío y en el medio en cuestión.por
lo tanto, el Índice de refracción es una
medida de la velocidad de dispersión de
una onda luminosa a través del medio,
La luz se refracta al atravesar un obieto.
El ángulo de refracción será tanto máyor
cuanto más finos sean los detalles.
La aperfura numérica (NA) es una me-
dida de la capacidad del microscopio de
agrupar las refracciones de la Iuz produ-
cidas por los detalles finos del objeto, da-
do que expresa el tamaño del haz de luz
que es captado por el objetivo después de
Fig.2-2. Este dibujo esquemático muestra la
mitad del ángulo máximo (u) del haz de luz
captado por el objetivo.
mucho más importante el poder de reso-
lución d, que se define como 1o distancia
mínima que debe existir entre dos puntos
del objeto para que se visualicen separa-
dos. La calidad de una imagen (claridad y
riqueza de detalles) depende del poder de
resolución de un microscoDio.
El aumento se define como 1o rcloción
entre el tamaño de Ia imagen y del objeto,
en valores Lineales. El aumento no denen-
de del poder de resolución, pero se tiene
en cuenta esta propiedad al elegir el au-
mento. En cuanto todos los detalles re-
sueltos se visualizan con facilidad, todo
aumento ulterior sólo hace más borrosa la
rmagen, porque no se incrementa el poder
de resolución. La imagen no adquiere más
detalles y se habla de aumento vacío.
Microscopio óptico
El microscopio óptico está compuesto
por partes mecánicas y ópticas. Los com-
haber atravesado el objeto, Se expresa co-
mo N.A = n x sen u, donde n es el índice
de refracción del medio que separa el cu-
breobjeto del preparado de la lente fron-
tal del objetivo, y u es la mitad del ángu-
lo superior del haz de luz (fig. 2-2).
Como se vio antes, el poder de resolu-
ción es función de Ia apertura numérica
y de la longitud de onda de la luz utili-
zada,X" (lambda). El poder de resolución
(d) se puede expresar según la siguiente
fórmula:
0,61 x l,
/'l -
NA
donde d es la menor distancia entre dos
puntos que permite visualizarlos separa-
dos. Nótese que cuanto menor sea d, tan-
to mayor será el poder de resolución. Da-
do que u no puede superar g0o, el seno
de u debe ser inferior a i.. En consecuen-
cia, el NÁ móximo seró de alrededor de
1,4, puesto que eI índice de refracción a
lo sumo se puede acercar a 1,b si se
reemplaza el aire que separa el cubreob-
jeto y el objetivo con aceite (denominada
técnica con aceite de inmersión para la
que se emplean objetivos de inmersión
especiales). La longitud de onda de la
Iuz empleada suele ser de alrededor de
0,500 pm, que corresponde a la luz ama-
rillo-verdosa, para la cual el ojo humano
tiene especial sensibilidad. De este mo-
do, se obtiene un poder de resolución de
aproximadamente 0,25 pm.
20 METODOSHISTOLOGICOS C A P í T L
ponentes ópticos constan de tres sistemas
de lentes: condensador, obietivo y ocular
retina del ojo del observador'
El aurnento total resultante se determi-
na mediante el producto del aumento del
obietivo por el aumento del ocular (even-
tualmente se debe multiplicar por un fac-
tor que depende del tubo).
E[ poder de resolución depende de la
longitud de onda de la luz utilizada y de
las áperturas numéricas del objetivo y el
condensador (el ocular sólo actúa aumen-
tando la imagen del obietivo, no meiora el
poder de resolución).
El móximo poder de resolución que se
puede obtener es de 0,2 ¡Jm, pero con los
preparados de rutina habifuales rara vez ex-
cede de 0,5 pm.
Como se vio antes, los detalles resueltos
se deben aumentar lo suficiente para poder
ser observados sin esfuerzo, lo cual se lo-
gra con el aumento adicional del ocular.
Pa¡a obtener el m¡áximo poder de resolu-
ción, de alrededor de 0,2 pm, se requiere
un aumento de unas 1.000-1.400 veces' da-
do que el poder de resolución del ojo, a la
distancia normal de observación (25 cm)'
es de aproximadamente 0,2 mm. Como re-
gla mnómotécnica vale que, p¿Ira evitar el
áumento vacío nunca se debe empleor ma'
Sobre la base del microscopio óptico
común se han desarrollado varios micros-
copios especiales, cada uno de los cuales
présenta ventaias y limitaciones específi-
cas, según veremos a continuación.
Microscopio de campo oscuro
El microscopio de campo oscuro se uti-
liza para analizar partículas pequeñas,
que presentan muy escaso contraste con
la microscopia óptica o que se encuentran
de en esta lente la luz desviada o esparci-
da por las pequeñas partículas qu_e se_ de-
sea investigar. Estas se observan lumino-
sas sobre un fondo oscuro (del mismo mo-
do que las partículas de polvo se visuali-
z¿rn por la dispersión que realizande la
luz de un rayo de sol).
En histología se utiliza a menudo el
c¿rmpo oscuro para el anólisis de prepara-
dos radioautogróficos (véase más adelan-
te), mientras que es una importante aplica-
ción clínica la determínación de la espito-
queto de la sífilis, el Treponemo pallídum.
Microscopio de conhaste de fase
Los teiidos no coloreados producen muy
escaso contraste, dado que no absorben
cantidades importantes de luz. Sin emba¡-
go, producen cierfo retardo en las longitu-
des de onda, de acuerdo con Ia "densidad
óptica" variable de los teiidos, es decir, los
distintos índices de refracción. Este retraso
variable de Ias ondas sinusales produce
cierto desfasamiento entre ellas' Mediante
el microscopio de contraste de fase es posi-
ble transformoÍ estas diferencias de fose,
no visibles, en diferencias de amplitud, es
decir, que las diferencias de refracción en-
tre los componentes del tejido se transfor-
man en diferencias de intensidad, que pue-
den ser captadas por el oio humano. De es-
ta manera es posible transformar en visibles
componentes de las células wvos que, _de
otra manera, sólo se observan en tejidos
muertos y teñidos (fig. z-3).
Fig.2-3. Se observan dos fotomicrografías (A y
B) de las mismas células vivas (fibroblastos
de cultivo de teiido), A obtenida con un mi-
croscopio óptico común y B captada con un
microscopio de contraste de fase. En la imagen
de contraste de fase se observan con clar¡dad
el límite entre las células (flechas), el núcleo
(A/), los nucléolos (Nu), mitocondrias alargadas
(rVl), lisosomas redondos (L) y otros detalles
que apenas se distinguen con el microscopio
óptico común. (Según Novikoff y Holtzman.)
\
cAP í ru to MÉToDosHtsroLÓctcos 21
Microscopio de interferencia
El microscopio de interferencia está
construido sobre la base de principios si-
milares al microscopio de contraste de fa-
se, dado que también en este caso se utili-
zan las diferencias de fase producidas por
la luz que atraviesa el objeto. Mientras que
eI microscopio de contraste de fase sólo es
un instrumento cualitativo, mediante el
microscopio de interferencia es posible
obtener datos cualtitativos. Esto se logra
al dividir la luz de una única fuente en dos
haces luminosos, de los cuales uno se en-
vía a través del objeto y el otro no se alte-
ra, por lo que actúa como haz de referen-
cia. Después se vuelven a unir ambos ha-
ces, que interfieren entre sí del mismo mo-
do que en el microscopio de contraste de
fase. El haz que atravesó el objeto sufre un
retraso respecto al haz de referencia, es de-
cir, sufre una modificación de fase. Dado
que el retraso es función del Índice de re-
fracción y del espesor, el valor del retaso
se puede emplear para determina¡ la masa
por unidad de superficie del preparado y,
en consecuencia, Ia mosa de los elementos
celulares individuale s.
_ Una varia¡te especial del microscopio
de interferencia es el microscopio de cón-
traste por interferencia diferencial (tam-
bién denominado microscopio de interfe-
rencia de Nomarski), en el cual los dos ha-
ces luminosos separados tienen polaridad
opuesta, por lo que se aumenta el conhas-
te y se obtiene una imagen de aspecto fridi-
mensional del objeto investigado (hg. 2-a),
Microscopio de luz polarizada
Los componentes cristalinos y fibrosos
del material biológico poseen una orienta-
ción característica de las moléculas. En
consecuencia, cuando se ilumina el obie-
to con luz polarizada plana (luz que sólo
vibra en un plano), ésta se divide en dos
componentes con distinta velocidad, es
decir, desfasados entre sÍ. Se habla de es-
tructuras birrefringentes o anisótropas (gr.
on, no; isos, igual; frope, movimiento). En
contraste, se denomina estructuras isótro-
pas a las que no dividen la luz polarizada,
por lo que el índice de refracción es igual
en todas direcciones.
Se obtienen datos referidos a la anisotro-
pía del objeto mediante el microscopio de
luz polarizada, llue se diferencia aél ml-
croscopio óptico común por tener dos fil-
22 MÉTODOSHISTOLÓGICOS
ha¡ las modificaciones de Ia polarización
de la luz que ha atravesado el preparado.
I.a birrefringencia de un objeto depen-
de de una estructura regular determináda.
En las células y los tejidos puede ser una
disposición asimétrica regular de molécu-
las o iones, por ejemplo, en cie¡tas inclu-
siones celulares, birrefringencia cristali-
na, o una distribución reqular de unida-
des submicroscópicas aJimétricas, por
ejemplo, en Ias fibras musculares, biire-
fingencia de forma. En consecuencia, me-
diante el microscopio de luz polarizada es
posible obtener información respecto a la
estructura a nivel molecular. Además, el
microscopio de luz polarizada se puede
utilizar para el estudio de células vrvos.
Microscopio de fluorescencia
Determinadas sustancias fluorescen, es
decir, tienen la particularidad de irradiar
luz de otra longilud de onda (color) al ser
Fig.2-4. Fok
de una célula
oído interno c
microscopio
rencia difere
croscopio de
cia de Noma
vese el notab
dimensional. >
Morup Jorgen
C A P I T I ,
Submicroscópico
Por submicroscópico se entiende Io
que "está por debajo de la resolución del
microscopio". La denominación está mal
definida y se aplica ocasionalmente con
respecto a las estructuras demasiado pe-
queñas para ser reconocidas incluso con
iluminadas. La luz irradiada siempre pre-
senta una longitud de onda más larga que
la original. Algunos componentes biológi-
cos (p. ej., la vitamina A) tienen fluores-
cencia natural y se denominan autofluo-
rescentes, mientras que otros adquieren Ia
fluorescencia después de un tratamiento
con determinados colorantes fluorescen-
¿es, por ejemplo fluoresceína, que emite
una intensa fluorescencia verdosa al ser
irradiada con luz azul.
En el microscopio de fluorescencia se
ilumina el preparado con intensa luz de Ia
Iongitud de onda capaz de activar el colo-
rante fluorescente empleado. Esto se lleva
a cabo mediante un filtro del color ade-
cuado que se coloca por debajo del con-
densador: así se filtra la luz antes de que
incida en el preparado. Además, se coloca
un filtro por encima del obietivo con un
color correspondiente a la longitud de on-
da de la luz que emite el colorante utiliza-
do cuando fluoresce. De esta manera se lo-
gra que la imagen se forme sólo debido a
la emisión de la luz fluorescente. Las es-
tructuras fluorescentes se destacan enton-
ces en color sobre fondo oscuro (véase fig.
2-14), como fuentes luminosas, por lo que
es oosible visualizar estructuras de di-
meñsiones mucho más pequeñas que el
poder de resolución del microscopio.
En los últimos años se ha observado un
notable incremento en el empleo de la mi-
croscopia de fluorescencia, debido funda-
mentalmente a la aplicación de colorantes
fluorescentes que ie ligan a anticuerpos
específicos, que reaccionan con determi-
nados componentes tisulares (véase más
adelante en este capítulo).
Fig.2-5. lmagen de las células productoras de
insulina en los islotes de Langerhans del pán-
creas, captada con microscopio de barrido
confocal. Se distinguen gránulos citoplasmáticos
que contienen insulina mediante reacción con un
aniicueroo fluorescente azul contra insulina, se
determina la presencia de una molécula ligada a
la membrana celular (denominada transportado-
ra de glucosa) con un anticuerpo fluorescente ro-
jo y se observa una molécula localizada sobre el
núcleo celular (llamada factor de transcripción
para insulina) mediante un anticuerpo fluores-
cente verde. (Cedida por L.-1. Larsson.)
el microscopio electrónico. Sin embargo,
su uso más frecuente se aplica a estruc-
turas demasiado pequeñas para ser de-
tectadas con el microscopio óptico (la
oalabra comenzó a utilizarse antes de la
óra del microscopio electrónico).
Microscopio de barrido confocal
Una limitación de la microscopia de
fluorescencia radica en la necesidad de
que todo el espesor del preparado emita
fluorescencia, pero sólo es posible enfocar
el objetivo en un plano del corte a Ia vez.
En consecuencia, la luz emitida por fluo-
rescencia desde zonas del preparado ubi-cadas por encima y por debaio del plano
focal puede restar nitidez a Ia imagen. Me-
diante el microscopio de barrido confocal
se impide esta tendencia, dado que se ex-
cluye Ia Iuz no emitida por el plano focal.
EI preparado se ilumina por un rayo láser
que barre todos los puntos del plano focal,
mientras que la luz emitida por el prepa-
rado atraviesa una hendidura muy estre-
cha que detiene la luz emitida por otros
niveles, distintos del plano focal, De esta
manera se logra obtener la información
necesaria para formar una imagen bidi-
mensional (fig. z-5) que se registra sobre
una pantalla de televisión. AI recoger con
una computadora una serie de imágenes
de distintos planos focales es posible re-
construir una imagen tridimensional del
obieto.
C A P í T U t O METODOSHISTOLOGICOS 23
Microscopio de luz ultravioleta
Con el empleo de luz ultravioleta con
Iongitud de onda de alrededor de 2b0 nm,
es decir, casi Ia mitad de la luz visible que
se uti l iza habitualmente en el microsóo-
pio óptico, en principio es posible dupli-
car el poder de resolución (disminuir d a
la mitad). El microscopio de luz ultravio-
leta, cuyo sistema óptico suele estar cons-
truido en cuarzo, permite el paso de la luz
ultravioleta, que es invisible. En conse-
cuencia, Ia formación de la imagen se re-
gistra en una película fotográfica.
Aunque se logra tn )igero aumento
del poder de resolución mediante esta
técnica, la principal importancia del mi-
croscopio de luz ultravioleta es que los
dcidos nucleicos absorben la luz ultra-
violeta de determinada longitud de onda
(260 nm), por lo que se pueden detectar
con facil idad.
Microscopio electrónico
La construcción del microscopio elec-
trónico representa un verdadero-logro en
cuanto a incrementos del aumento y del
poder de resolución. En principio se debe
a que se reemplaza la luz visible, de lon-
gitud de onda de alrededor de 500 nm,
por un haz de electrones de longitud de
onda del orden de 0,005 nm. Dado que d
(poder de resolución) es directamente
proporcional a l" (véase pág.20), en teoría
la aplicación de un haz de electrones per-
mite obtener un poder de resolución muy
elevado. Como los electrones no Dueden
atravesar las lentes de vidrio, es necesario
reemplazarlas por bobinas electromagné-
ticas (denominadas lentes electromagnéti-
cas). en cuyos campos electromagnóticot
o electrostáticos se modifica el trayecto
del haz de electrones, de modo similar a
como se refracta el haz de la luz visible en
una lente de cristal.
El esquema de construcción del mi-
croscopio electrónico de transmisión
(MET) se presenta en la figura 2-6 (la pa-
Iabra transmisión se refiere a que los elec-
trones ofrayiesan elobjeto). Se calienta un
cátodo filamentoso del metal tungsteno
(denominado filamento) en una atmósfera
de vacío, por Io que emite electrones que
son acelerados hacia el ánodo debido a
una diferencia de potencial de alrededor
de 50-100 kV. Et ánodo tiene Ia forma de
una placa metálica con un orificio (deno-
minado apertura) en el centro, a través del
cual pasan algunos de los electrones, para
formar un flujo constante o haz de electro-
nes. El haz de electrones se enfoca me-
diante Ia lente del condensador en el pla-
no del objeto, y la Iente del objetivo foima
la imagen del objeto. La imagen obtenida
24 MÉTODOSHISTOLÓGICOS
Cátodo
Ánodo
Lente condensadora
Objeto
Lente objetivo
Lente proyectora
lmagen
se aumenta por una lente proyectora, que
corresponde al ocular del microscopio óp-
tico. Dado que el haz de electrones es in-
visible, la imagen formada se registra por
proyección sobre una pantalla fluorescen-
te o una película fotográfica. Debido a la
escasa movilidad de los electrones en el
aire, todo el sistema debe estar en una at-
mósfera de vacío.
La formación de Ia imagen en el mi-
croscopio electrónico se debe, principal-
mente, a la dispersión de los electrones.
Así se dispersan los electrones que coli-
sionan con los núcleos atómicos y con sus
electrones en el objeto, a menudo de ma-
nera tal que inciden por fuera de la lente
objetivo. En consecuencia, la imagen so-
bre la pantalla se forma por la ausencio de
estos electrones, como "imagen en som-
bra". La dispersión de los electrones de-
pende del espesor del objeto y de su den-
sidad molecular. En especial depende del
número atómico de loi átomos presentes
en el objeto, dado que Ia dispersión obte-
nida es mayor, cuanto más elevado sea el
número atómico. La mayoría de los áto-
mos de las estructuras biológicas tienen
número atómico bastante baio v contribu-
yen muy poco a la formación 
-de 
la ima-
gen, por lo que se adicionan átomos pesa-
dos al preparar los materiales (véase más
adelante).
Como se vio antes, el valor del microsco-
pio electrónico radica en el gran poder de
resolución que se puede obtener, de unos
0,2 nm. No obstante, es importante diferen-
ciar entre el denominado poder de resolu-
ción del instrumento, que es del orden
mencionado y se puede iograr al analiza¡,
por ejemplo, polvo metálico, y el denomi-
nado poder de resolución del objeto. Este
último es el poder de rcsolución que se
Fig.2-6. Dibt
mático de un
pio electrónil
C A P i T L
Fig.2-7. Dibujo esque-
mático de un microsco-
pio electrónico de barri-
do. (De Hearle, Sparrow y
Cross.)
Valor del poder de resolución
Nótese que el poder de resolución a
simple vista, a distancia normal de lec-
tura, es de alrededor de 0,2 mm, para
los mejores microscopios ópticos, de
aproximadamente 0,2 pm, y para los
mejores microscopios electrónicos, de
unos 0.2 nm.
puede lograr en la investigación de prepa-
rados biológicos y es del orden de 2 nm, da-
do que depende en gran parte de los proce-
dimientos de preparación (véase más ade-
lante). Con el poder de resolución práctico
que se puede obtener es posibie lograr ou-
mentos útiles superiores a 500.000 veces.
El microscopio electrónico esIá limita-
do por el escaso poder de penetración del
haz de electrones. Esto implica la necesi-
dad de uti l izar cortes de teiido muy delga-
dos (de alrededor de 50 nm). Esta l imita-
ción se puede superar en pa-rte mediante
el uso del denominado microscopio elec-
trónico de alto voltaje, cuyo haz de elec-
trones es alrededor de 10 veces más rico
en energía que el que se utiliza en los mi-
croscooios electrónicos comunes. El mi'
c.or"opio estereoelectrónico permite cor-
tes de tejido más gruesos, ya que el mismo
preparado es fotografiado desde dos ángu-
los algo diferentes. Si después se analizan
Ias fotografías mediante un estereoscopio
se obtiene un notable efecto tridimensio-
nal, en el cual la profundidad es mayor,
cuanto más grueso es el corte de tejido.
Otra limitación es el requerimiento de
utilizor alto vacio, lo cual descarta inves-
tigaciones en células vivas.
Microscopio electrónico de barrido
Hasta aquí se analizó el microscopio
electrónico estándar que, como se men-
cionó, se denomina microscopio electró-
Fig. 2-8. lmagen de cilias de la tráquea cap-
tada con microscopio electrónico de barri-
do (Cedida por B. Holma.)
nico de transmisión (MET). Su contrapar-
tida es el microscopio electrónico de ba-
rrido (MEB) que, en principio y utilidad,
es totalmente diferente de los microsco-
pios óptico y electrónico de transmisión,
pero que representa un importante suple-
mento del MET. En el microscopio de ba-
rrido los electrones no atraviesan el obie-
fo, la imagen se forma indirectamente, a
través de Ia captación puntual de detalles
en la superficie del preparado. El prepara-
do se recubre de una delgada capa de un
metal pesado y se bombardea con un haz
de electrones muy estrecho (de alrededor
de 10 nm de diámetro), que "barre" sobre
el objeto en un patrón lineal y lo copia
(fig. z-z). Desde cada punto se emiten
electrones secundarios, de modo tal que
la intensidad de Ia emisión secundaria va-
ría según el ángulo con que incide el haz
de electrones sobre la superficie. Este án-
gulo depende de las irrógularidades del
contorno de la superficie. La emisión se-
cundaria se mide con un detector ubicado
cerca del preparado y adaptado a una pan-talla de televisión, cuyos rayos catódicos
barren en forma coordinada con el haz de
electrones "que iluminan". La imagen ob-
tenida se visualiza directamente sobre la
pantalla y se puede registrar en una foto-
grafía o en forma digital.
El MEB forma la imagen de la superfi-
cie y no es necesario utilizar cortes ultra-
finos, dado que el haz de electrones no
atraviesa el preparado . El poder de rcsolu-
ción con la microscopia electrónica de ba-
rrido só1o es de alrededor de 1.0 nm pero,
en contrapartida, la nitidez de la imagen
en profundidad es de hasta 10 veces la
Fuente de
electrones
Sistema de
lentes
"Scanner"
(barredor)
Objeto
cAP i ru to
Pantalla de TV
MÉToDosHIjT)LÓGICOS 25
que se obtiene con el microscopio óptico.
En consecuencia, se puede lograr una
imagen tridimensional definida de la su-
perficie (fig. 2-B).
Microscopio de túnel de barrido
(MTB)
Con este instrumento es posible captar
la estructura de la superficie de un pre-
parado hasta el nivel atómico. El princi-
pio se basa en colocar una sonda delgada
a una distancia de hasta 1 nm, por deba-
jo de la superficie del preparado. Se apli-
ca luego un contacto eléctrico en el ex-
tremo de la sonda, que al mismo tiempo
barre por sobre la superficie del prepara-
do. De este modo se crea un "túnel" de
electrones a través de la hendidura for-
mada entre el preparado y Ia sonda.
Mientras que ésta se desplaza por sobre
el preparado, se mantiene constante la
corriente debido al movimiento automá-
tico de la sonda hacia arriba y hacia aba-
jo por las irregularidades de la superficie
del preparado. La información obtenida
durante estos movimientos se registra en
una computadora, Ia cual produce una
"imagen" de la superficie del preparado.
La microscopia de túnel de barrido per-
mite, entre otros adelantos, obtener una
imagen de las dos hebras de Ia molécula
de DNA.
La microscopia de túnel de barrido está
limitada por la necesidad de que el prepa-
rado sea un conductor eléctrico.
Difracción de rayos X
La difracción de rayos X es un paso adi-
cional en dirección a Ia resolución de de-
talles cada vez más pequeños mediante la
aplicación de rayos de longitud de onda
más corta. Los rayos X parecerían ser es-
pecialmente adecuados para el análisis
microscópico, dado que se puede aumen-
tar el poder de resolución, pero no existen
lentes capaces de enfocar y sacar prove-
cho de estas longitudes de onda tan cor-
tas. En lugar de lentes se debe aplicar el
anólisis matemótico,lo cual limita la uti-
l idad.
El principio se basa en enviar un estre-
cho haz de rayos X a través de Ia muestra
que se desea analizar (fig. 2-9). El haz se
separa y se dispersa en un patrón de di-
fracción (Iat. fractum, rotura) que se regis-
tra en una película fotográfica ubicada por
debajo de la muestra. En la práctica sólo
es posible utilizar la difracción de rayos X
en la investigación de estructuras muy or-
denadas de naturaleza cristalina o semi-
cristalina (de allí que, en ocasiones, se de-
nomina cristalografía de rayos X) dado
que, en los demás casos, el patrón de di-
26 MÉTODOSHISTOLÓGICOS
fracción obtenido es casi imposible de
descifrar. Incluso en las estruciuras orde-
nadas la falta de imagen formada hace que
se pierda información referida a las rela-
ciones entre las fases y los rayos secunda-
rios, por lo que el patrón de difracción no
se corresponde con exactitud con el obje-
to investigado. En consecuencia se debe
trabajar con aproximaciones e interpreta-
ciones, que sólo presentan la estructura
mós probable.
Sin embargo, la difracción de rayos X
ha tenido importancia fundamental en eI
desarrollo de la biología molecular y ha
permitido obtener información esencial
respecto a más de 300 macromoléculas,
entre ellas la mioglobina, Ia hemoglobina
y el DNA.
Métodos de observación directa
de células y tejidos vivos
Si bien el objetivo de la histología es la
descripción y la comprensión de Ia es-
tructura de las células v de los teiidos vi-
vos, lamentablemente, por mot ivós técni -
cos, a menudo ha sido necesario seguir el
camino de la investigación de tejidos
muertos y preservados. Los procedimien-
tos utilizados implican muchas posibili-
dades de modificación del aspecto de las
estructuras debidas a causas técnicas V
dejan sin respuesta numerosas incógnilas
referidas a los procesos celulares vitales.
Además, es imposible lograr un control
más directo sobre el medio que circunda a
la célula y crear modificaCiones experi-
menta les del mismo.
En consecuencia, existen claras venta-
jas en el estudio de células y tejidos vivos;
a continuación se verán algunos de los
métodos disponibles.
Fig.2-9. Dibr
mático del pri
difracción de
(Según Ambe
Smith.)
Haz de rayos X
C A P I T (
Fig .2-10 . D ibu los de
cultivo de teiido conec-
t ivo embrionario. En a
se observa el explantado
como una masa central
negra, rodeada del creci-
miento más claro. b Y c
muestran el desarrollo a
aumentos crec¡entes.
(Según Leonhardt.)
- l
l m m 100 pm
b
Cultivo de tejido
El cultivo de teiido es un importante
método para eI estudio de poblaciones ce-
lulares iivas fuera del organismo. El mé-
todo se menciona a menudo como cultivo
in vitro. dado que se refiere a frascos de
reactivo o de vidrio (Iat. vitro, vidrio), a
diferencia de in vivo, es decir, en el orga-
nismo vivo.
En Ia actualidad, el cultivo de teiido se
clasifica en tres categorías: 1) El cultivo de
células comprende el cultivo de células
aisladas, ya no organizadas en un teiido.
Las células se pueden transportar a otro
frasco con medio de cultivo, a medida que
crece su número. z) El cultivo de tejido
por lo general comprende la transferencia
de un trozo de teiido embrionario (gr.
embryon, feto) o explantado a un medio
de cultivo. Durante el cultivo crecen ex-
crecencias celulares, que suelen ser de ti-
po conectivo (fig. 2-10). mientras que ias
células especializadas del órgano perma-
necen en el explantado, donde mantienen
algunas de sus funciones características'
3) El cultivo de órganos comprende ei ex-
plantado de órganos embrionarios o ma-
duros ltotalmente desarrollados), como
órganos completos o partes de ellos. Se in-
Inicios del cultivo de teiido
El cultivo de células eucariotas co-
tnenzó a principios de este siglo, como
parte de lá investigación tendiente a de-
terminar si los filamentos nerviosos cre-
cían desde el cuerpo de la célula nervio-
sa hacia el exterior o se formaban por fu-
sión de una serie de secciones preforma-
das del filamento. Ross Harrison colocó
partes de médula espinal del sistema
ñervioso no desarrollado de una rana en
un coágulo l infático y observó, con el
microscopio, la clara formación directa
de filamentos netviosos, como prolonga-
ciones del cuerpo celular. Otro pionero
tenta mantener la estructura del órgano y
sus funciones normales, además de su po-
sible evolución ulterior
Las primeras células de mamíferos que
se observaron en estado vivo fuera del or-
ganismo fueron las células sanguíneas'
Eran de fácil acceso y se podían analizar
al colocar una gota sobre un portaobieto,
cubierta por un cubreobjeto, y sellar los
bordes para evitar la evaporación. Si se
calentaba a temperatura del cuerpo la pla-
tina del microscopio se lograban condi-
ciones muy cercanas a las del organismo
vivo. De esta manera se descubrieron los
distintos tipos de glóbulos blancos y sus
propiedades de movimiento independien-
ie y-de captación de partículas (véase cap.
3). En Ia actualidad estos cultivos a corto
plazo de gtóbulos blancos tienen amplia
áplicación como e.l método mós simple
oara esludiar los cromosomas humanos
(más detalles en el cap. 4).
Los estudios más prolongados y Ia in-
vestigación de las céiulas en los tejidos or-
ganizados u órganos recién fueron_po_si-
bles después de la incorporación de los
cultivos de teiido. Para los estudios de
cultivo de teiido se toma la muestra y se
mantiene estéril (libre de microorganis-
mos vivos), porque los factores de creci-
fue Alexis Carrel, quien demostró, entre
otros descubrimientos, que los extractos
diante el cultivo de tejidos.Esta técnica clásica de explantado in-
cluido en un coágulo ha experimentado
numerosas mejoras técnicas que incre-
mentaron mucho las posibilidades de
aplicación.
C A P I T U L O MÉTODOSHISTOLÓGICOS 27
miento también favorecen la formación de
bacterias y hongos. Después de obtener la
muestra se debe mantener el teiido en una
solución de composición similar a la de
los Iíquidos tisulires. Mediante el trata-
miento cuidadoso con enzimas digestivas
como tripsina y colagenasa, que degradan
el material extracelular tendiente a man-
tener unidas las células, se liberan las
uniones entre ellas. El proceso se facilita
con el agregado de sustancias que captan
calcio, dado que los iones calcio son nece-
sarias para Ia adhesión intercelular. Ade-
más se efectúa una separación mecánica.
De esta manera, el teiido obtenido se divi-
de en células individuales.
Después del agregado de medio nutriti-
vo se pueden mantener las células en un
cultivo en suspensión, en el que flotan, o
se pueden transferir a una superficie de
vidr io o de p lást ico, a l que sé adhieren.
Sobre esta superficie crecen Ias células y
forman una capa única, denominada mo-
nocapa.
La composición del medio nutriüvo es
de importancia crítica para el exito del
cultivo de tejido. La meta ideal buscada ha
sido obtener medios sintéticos con compo-
sición química totalmente definida y sin el
agregado de sustancias orgánicas naturales
como, por ejemplo, plasma sanguíneo. Es-
te tipo de medio representa las mejores
condiciones para Ia investigación de la in-
fluencia de distintas sustancias sobre el
crecimiento y la función de Ias células es-
tudiadas, por ejemplo, factores de creci-
miento bien definidos. Hasta el momento,
Ios medios sintéticos desarrollados sólo
satisfacen Ios requerimientos de creci-
miento de muy pocos tipos celulares, dado
que la mayoría de las células y tejidos so-
lamente se pueden mantener vivos duran-
te corto tiempo sin el agregado de suero al
medio. En estos últimos casos se habla de
medios naturales. Un paso importante ha
sido Ia posibilidad de agregar antibióticos
y disminuir así en gran parte el problema
de las infecciones bacterianas en los me-
dios de cultivo. La temperatura óptima pa-
ra el cultivo de células es de alrededor de
37,5.C para las células de los mamíferos
(si bien varía en parte para distintos teji-
dos). pero para mantener una población
celular durante un período más prolonga-
do es necesario recurrir al conqelamenlo.
En condiciones normales. las cé'iulas mue-
ren debido a la formación de cristales de
hielo si se las enfría por debajo del punto
de congelación pero, si se toman algunas
precauciones, es posible controlar la for-
mación de cristales y entonces se pueden
congelar y preservar en nitrógeno líquido
a -196"C durante meses o años. Si después
se descongelan, estarán en condicionés de
continuar su crecimiento.
28 MÉTODOSHISTOLÓGICOS
Mediante el cultivo de tejidos es posi-
ble aislar clones celulares. Un clon celu-
lar (gr. klon, rama, brote) es una población
de células idénticas, originadas de Ia mis-
ma célula por mitosis (división celular).
El establecimiento de un clon celular. de-
nominado clonación, se efectúa, en prin-
cipio, a través del aislamiento de células
individuales, que después generan el clon
por cultivo. A su vez, el clon da origen a
una línea celular pura, es decir, un culti-
vo compuesto por un único tipo celular.
Para muchas de Ias investigaciones que se
realizan mediante cultivos de teiido es ne-
::;.".t" 
el empleo de líneas celulares pu-
También es posible aislar el tipo celular
que se desea investigar a partir de una
suspensión mixta, que contenga distintos
tipos celulares. Un método especialmente
efectivo para este fin es Ia selección celu-
lar activada mediante fluorescencia
(FACS). Se utilizan anticuerpos que se fi-
jan exclusivamente al tipo celular que se
desea aislar. A las moléculas de anticuer-
po se le adiciona un colorante fluorescen-
te (véanse más detalles más adelante) y se
agrega la mezcla a la suspensión mixtá de
células. El anticuerpo fluorescente se fija
exclusivamente al tipo celular que se de-
sea aislar. A continuación se separan las
células fluorescentes mediante un cifo-
fluorómetro de flujo.
En el cultivo de tejido es importante di-
ferenciar enúe líneas celulares primarias v
líneas celulares establecidos.-Una líneá
celular primaria aparece en el primer cul-
tivo del tejido, denomínado cultivo prima-
rio, inmediatamente después de la-obten-
por lo general, después de unas 50 divisio-
nes celulares para las células humanas, y
la mayor parte de las células mueren.
Por el contrario, las líneas celulares es-
tablecidas pueden crecer en cultivos con
elevada densidad de población. Una línea
celular establecida puede aparecer espon-
tóneamente, es decir, sin causa conocida,
debido a que algunas células del cultivo
primario retoma el crecimiento, tras Io
cual suele continuar de esa manera. Si es-
te tipo de línea celular se transfiere unas
70 veces de un frasco de cultivo a otro, se
considera establecido. Se dice que las cé-
lulas que dan origen espontánéamente a
una línea celular establecida han sufrido
una modificación o transformación es-
pontánea, donde las células transformadas
tienen capacidad para formarse casi sin in-
hibiciones. Sin embargo, Ias células tam-
bién se pueden transformar si se las expo-
C A P í T U
Fig. 2-11. Dibujo esquemático de hibridación
celular. Se induce la fusión celular por agrega-
do de virus Sendai, que favorece la formaciÓn
de un heterocarion y de células híbridas cuan-
do éste se divide.
ne a acc iones cancer ígenas como i r rad ia -
ciones, agentes químicos o infecclones por
virus cancerígenos. Se obtene una l ínea
celular establecida de este t ipo de células
transformadas a part ir de un tej ido tumo-
ral o de un cult ivo primario, después que
este últ imo ha sido expuesto a una acción
cancerígena. Se puede entonces establecer
un cultivo homogéneo de línea pura por
clonación del cultivo primario. Las lÍneas
celulares transformadas de crecimiento rá-
pido y supervivencia ilimitada (ing' rm-
mortal cell )ines) representan un material
especialmente importante para las investi-
gaciones experimentales.
Por último se verá el fenómeno de hibri-
dación celular, de gran importancia en la
investigación de células cultivadas. Las cé-
lulas híbridas se forman por fusión celular,
es decir, la unión de dos o más células. La
fusión celular se puede producir en forma
espontónea, por eiemplo en Ia fecundación,
cuando se unen las células sexuales mascu-
Iinas y femeninas, pero también se demos-
Células HeLa
En 1954 se exffaio un tumor de endo-
metrio de una mujer llamada Henrietta
Lacks. Una muestra del tejido tumoral se
utilizó para generar una línea celular es-
tablecida y se han cultivado estas células
tumoialeé desde'entonces. Henrietta
Lacks falleció al año siguiente peio, en su
tró, alrededor del año 1960, que ocurre en
la formación de células híbridas en cultivos
celulares. Sin embargo, recién cuando poco
después se descubrió que era posible lndu-
crr la fusión celula¡ en los cultivos celula-
res, mediante el agregado de ciertos virus
[el más usado es e] denominado virus Sen-
doi, que incrementa la tendencia a Ia fusión
de lai membranas celulares), cobró real im-
oortancia la técnica de Ia hibridación. Me-
áiutrt" lu fusión de dos células diferentes
desde el punto de vista genético, la célula
formada contiene dos núcleos con distinto
contenido genético, lo que se denomina he-
terocarion (fig. 2-11). Algunas de las célu-
las formadas tendrán capacidad para divi-
dirse y los dos núcleos comienzan Ia divi-
sión al mismo tiempo. A su vez, esto a ve-
ces también da lugar a la formación de dos
células, cada una de las cuales contiene un
núcleo. Este núcleo (en cada una de las dos
células híbridas neoformadas) contiene una
copia de los cromosomas de ambas células;
este tioo celular se denomina sincarion.
Entie otras apl icaciones, Ia hibridación
celular ha contr ibuido a las investigacio-
nes sobre elcrecimiento de células tumo-
rales. donde se han fusionado células nor-
males con células cancerosas. La técnica
también se ha ut i l izado para demostrar
oue las proteínas de ias membranas celu-
láres t ienen capacidad para desplazarse
dentro de estas últ imas, como se verá con
mavor detal le en el capítulo 3. Una apl ica-
ción muv especial es el desarrol lo de an-
t icuerpos mónoclonales, cuya uti l ización
tiene gran importancia en las investiga-
ciones inmunohistoquímicas (véase más
adelante en este capítulo).
Para terminar con el tema de cultivo de
tej ido se puede decir que, si bien no es
una alternativa, representa una posibili-
dad para realizar trabajos experimentales
sobre teiidos humanos sin chocar con pro-
blemas éticos.
Manipulación experimental
de células vivas
Además de las posibilidades experimen-
tales de actuar sobre células y teiidos a tra-
vés de las modificaciones del medio circun-
memoria, se denominaron células HeLa
Ias células cultivadas. En la actualidad
se utilizan en cientos de laboratorios y,
como la Iínea celular transformada más
intensamente estudiada, han contribuido
a dilucidar numerosos interrogantes bio-
lógicos y médicos importantes.
\. I
r )
) 1
Virus Sendai
Heterocarion r-"/ i
C A P í T U t O METODOSHISTOLOGICOS 29
&, * I x
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" w
b
ü
6 S : 1 C . i *W s
Fig.2-12. Tinción supravital de macrófagos
de teiido conectivo, por agregado de carmín
de litio a un preparado de tejido vivo. Las partí-
culas rojas de carmín de litio han sido fagocita-
das por los macrófagos. x440.
dante relacionadas con el cultivo de teiido,
existen va¡ios métodos para la manipula-
ción más o menos directa de células vivas.
Tinciones vital y supravital. Algunos
colorantes relativamente inocuos son caD-
tados en forma selectiva por determinadás
células yjyas. En consecuencia, la locali-
zacíón del colorante se puede utilizar pa-
ra detectar estas células o determinadas
organelas, a las que se une el colorante
después de ser captado. De esta manera
también se pueden identificar algunas
sustancias intercelulares.
Para Ia tinción vital se inyecta el colo-
rante en el animal vivo. Para la tinción su-
pravital se agrega el colorante a las célu-
Ias o el tejido vivo después de su extrac-
ción del organismo.
El azul tripón y el carmin de litio se
componen de partículas finas y han teni-
do importancia definitiva para el estudio
de la fagocitosis, es decir, la forma en que
determinadas células captan partÍculas
del medio (frg. 2-12).
El rojo neutro y el verde lano se utilizan
para el estudio de los glóbulos blancos. El
verde fano tiñe selectivamente las mitocon-
drias y el rojo neut¡o para identificar los
distintos subtipos de leucocitos.
La alizarina se une a la matriz ósea neo-
formada y le confiere coloración roja. La
tinción vital con alizarina ha sido muy
30 MÉTODOS HISTOLÓGICOS
Macrófagos que contienen carmín de litio importante en los trabajos sobre el meca-
nismo de crecimiento óseo.
Micromanipulación mecánica. Nume-
rosas técnicas, agrupadas bajo Ia denomi-
nación micromanipulación o microciru-
gía, se han desarroilado sobre la base del
micromanipulador. Este instrumento se
compone de un microscopio, en el que el
preparado a estudiar se encuentra en una
cámara húmeda de operación, sobre la
platina, En el micromanipulador se mon-
tan agujas finas, ganchos o pipetas de vi-
drio, cuyos extremos aparecen en el cam-
po visual y que se pueden desplazar con
tanta precisión, que se pueden disecar las
células individuales con gran aumento.
Este método de disección ha incrementa-
do el conocimiento de la naturaleza fÍsica
de las células. Se ha demostrado que el pro-
toplasma es viscoso y se han desplazado las
organelas dentro de la células. También se
puede empujar el núcleo celula¡ dentro del
citoplasma y ha demostrado ser una vesícu-
la deformable llena de líquido. Así, se pue-
den hacer muescas en él al Dresionar con
una aguja. Con la microdiseición también
se demostró muy pronto la existencia de
una membr¿rna celula-r (fig. 2-13).
Fig.2-13. Fotomicrografías (a campo oscuro)
de células huevo de rana vivas, que demuestran
cómo se procede en la micromanipulación
mecánica. En a se observan dos invaginaciones
en la membrana celular producidas por presión
con dos microelectrodos. En b se visualizan los
m¡croelectrodos después de atravesar la mem-
brana celular hacia el interior del citoplasma La
medida incluida representa 100 ¡rm. (Según
Kanno y Loewenstein.)
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C A P I T U
Fig. 2-1 4. Fotomicrogra-
fía de una neurona de la
retina captada con mi-
croscopio de fluorescen-
cia. Mediante un microin-
yector se inyectó el colo-
rante fluorescente amari-
llo Lucifer directamente
en la neurona viva. Luego
se sacrificó el animal y se
efectuó un preparado his-
tológico de la retina (Ce-
dida por J. Zimmer.)
Los microelectrodos son pipetas muy
finas que contienen soluciones salinas
concentradas. Mediante la micromanipu-
lación se inyectan éstas en las células, y
después se puede medir la diferencia de
Fig,2-15 Fotomicrografía de una célula viva cap-
tada con microscopio de contraste de fase. La cé-
lula se encuentra en la etapa denominada metafa-
se de una división celulat por lo que se observan
claramente los cromosomas. La línea clara angos-
ta entre las dos flechas se forma por irradiación
con un haz de luz ultravioleta de 3 pm de an-
cho, que parece haber "desplazado" un corto seg-
mento de una hilera de cromosomas paralelos.
Esto se confirma al demostrar que los segmentos
claros de cromosomas ya no contienen DNA (me-
diante investigación histoquímica, según.el méto-
do de Feulgen). x900. (Según Bloom y Ozarslan.)
potencial eléctrico entre el interior de la
célula y el medio (fig. 2-13). De esta mane-
ra es posible investigar los potenciales de
membrana variables de los teiidos nervio-
so y muscular.
Los microinyectores son una variante
especial de microelectrodos y se pueden
emplear para la inyección de cantidades
microscópicas (picolitros) de sustancias
dentro de las células. Una aplicación es-
pecial es la inyección de un colorante que
difunde en las distintas partes del cito-
plasma y que se hace fluorescente con el
microscopio óptico. Con esta técnica es
posible dibujar el contorno de cada célula
individual en teiidos con estructuras muy
complicadas, por eiemplo, del sistema
nervioso central (fig. 2-1'a).
Utilización de haces de rayos angostos
y de alta energía. Mediante aparatos es-
peciales es posible concentrat protones
én un haz de rayos con un diámetro de
2,5 ¡tm, y con inadiación ultravioleta se
pueden lograr diámetros de alrededor de
1 ¡tm. Este microrrayo es tan angosto que
puede incidir y, en consecuencia, destruir
Ios componentes individuales del núcleo
celular, por ejemplo, parte de un cromoso-
ma (fig. 2-15). En el últ imo tiempo se han
utilizado especialmente los rayos láser
con este propósito.
Microcinematografia. Si bien esta téc-
nica no implica en sí misma una manipu-
lación direlta de células vivas, representa
un método importante para su observa-
ción. La microcinematografía (gr. kinema,
movimiento) es una técnica que registra
en una película (como imágenes vivas) lo
oue se observa a través del obietivo de un
microscopio, mediante una cámara de vi-
deo. Tiene especial importancia para el
anólisis de movimienúos cuando son de-
masiado rápidos o lentos para poder ser
considerados directamente. Por ejemplo,
con una aceleración de cien veces es posi-
ble observar Ia división celular y, además,
se ouede observar cómo se desplazan las
miiocondrias dentro de Ia célulá viva.
Por el proceso inverso (frenando los
movimientos muy rápidos) es posible
analizar, por ejemplo, Ios movimientos de
las cilias.
Métodos de fraccionamiento
celular
Mediante los métodos de fracciona-
miento celular es posible separar los dis-
tintos componentes celulares y mantener,
al mismo tiempo, sus funciones. Por lo
tanto, los métodos de fraccionamiento ce-
lular han jugado un importante papel en
la resolución dela organización funcional
de la célula.
C A P I T U L O MÉTODOSHISTOLÓGICOS 31
Centrifugación diferencial (centrifirga-
ción dinámica). Este es el método más uti-
lizado para la separación de organelas ce-
lulares. Antes de la centrifugación se efec-
túa una homogenizacíón. Se colocan pe-
queños trozos de tejido en una solución
adecuada (p.ej., de sacarosa) que contri-
buye a mantener intactas las organelas y
se opone a su tendencia a agruparse. Des-
pués se coloca la solución con los trozos
de tejido en un homogenizador, que pue-
de tener la forma de un cilindro de vidrio,
en el cual rota a gran velocidad una vari-
lla de teflón (fig. 2-16). Los trozos de teji-
do son aplastados por Ia fricción de la va-
rilla contra las paredes del cilindro. Así se
rompen las membranas celulares y que-
dan libres en la solución las organelás y
las inclusiones. Se pueden utilizar otros
métodos para la homogenización de las
células y los tejidos, por ejemplo ultraso-
nido. Después de unos minutos de reposo
se centrifuga el sobrenadante (lat. super-
natant, flotante) con velocidad moderada
y temperatura apenas superior a OoC. Des-
pués de la sedimentación de las partículas
más pesadas se puede hacer sedimentar
las partículas con masa menor, mediante
centrifugaciones con velocidades crecien-
tes. La identificación de una fracción y la
evaluación de su grado de purezo, eí el
caso de los núcleos celulares, se puede
efectuar por microscopia de contraite de
fase. Las partículas más pequeñas (es de-
cir, la mayoría) deben ser identificadas
mediante microscopia electrónica de los
cortes ultrafinos del sedimento sólido ob-
tenido por centrifugación, el denominado
"pellet". De esta manera se tiene la seguri-
dad de que las fracciones no contienen
mezclas de distintos tipos de organelas.
Centrifugación por gradientes de den-
sidad (centrifugación equilibrada). Con
este método es posible obtener mayor
cantidad de fracciones mós limpios que
con la centrifugación diferencial. Se ob-
tiene el homogenizado como en el caso
anterior y se agrega una solución de, por
eiemplo, sacarosa. que contiene concen-
traciones crecientes de sacarosa a medida
que se acerca al fondo, es decir, con den-
sidad creciente. La centrifugación prolon-
gada a gran velocidad hace que las partí-
culas sedimenten en el sitio que les per-
mite su densidad (se detienen cuando al-
car:zan una "profundidad" equivalente a
su propia densidad).
De esta manera se logra obtener fraccio-
nes casi puras de núcleos, elementos nu-
cleares, mitocondrias, lisosomas, riboso-
mas, retículo endoplasmático y gránulos
de secreción. Estos homogenados celula-
res fraccionados, en los cuales los compo-
nentes mantienen su función biológica, se
denominan sistemas libres de células. El
32 MÉTODOS HISTOLÓGICOS
estudio de estos sistemas libres de células
ha contribuido con gran parte del conoci-
miento actual sobre Ia biología molecular
de la célula, por ejemplo respecto a la re-
plicación y la transcripción del DNA y a
la síntesis de proteínas.
En años recientes, los métodos de frac-
cionamiento celular han sido suplementa-
dos con varias técnicas para la investiga-
ción de macromoléculas, entre ellas dis-
tintas formas de cromatografía y de elec-
troforesis. Sin embargo, estas técnicas
pertenecen más a la parte bioquímica de
la biología celular y no se las incluirá en
esta presentación general (se refiere al lec-
tor a textos de biología molecular y bio-
química), si bien es obvio que se hará re-
ferencia a ellas en relacioñes relevantes
de los próximos capítulos.
Preparación e investigación
de t-eiidos muertos
El estudio directo de células v teiidos
vivos sólo tiene aplicaciones l imiiadás. Es
difícil diferenciarlos distintos componen-
tes entre sí con la microscopia de transmi-
sión, dado que tienen iguál grado de re-
fracción de Ia luz. Además, por lo general
el tejido presenta un espesor tal que Ia pe-
netración de la luz es demasiado escasa.
En consecuencia, se utiliza con mucha
mayor frecuencia el tejido muerto, que se
mantiene mediante acciones químicas in-
mediatamente después de exiraÍdo y en-
tonces se corta en secciones muy delga-
das, denominadas cortes histológicos.
Después de la t inc ión con d is t in tos colo-
rantes se observan los cortes con el mi-
croscopio óptico, dado que el mayor con-
traste entre los componentes tisulares per-
mite diferencia¡los. Es obvio que al prepa-
rar los cortes histológicos se debe procu-
rar mantener, en lo posible, el aspecto de
Ias estructuras en el organismo vivo.
Preparación de tejidos
para microscopia óptica
Fiiación. Las células se matan con la fi-
jación, pata detener los procesos celulares
dinómicos con la mayor rapidez posible y
mantener la estructura con ias mÍnimas
modificaciones posibles. Esto se logra con
la insolubilización de los comDonentes
estructura les de Ia célu la y la formación
de enlaces cruzados. por la acc ión de d is-
tintos agentes químicos, los fiiadores. En
el proceso de fijación se estabilizan las
proteínas, porque los fijadores favorecen
la formación de enlaces cruzados entre las
moléculas proteicas. De esta manera se
mantienen todas las relaciones entre las
estructuras como en la célula viva. Las
C A P I T U L O
Fig. 2-16. D¡bulo esque-
mático del procedimiento
de fraccionam¡ento ce-
lular (véase el texto para
los detalles).
oroteínas solubles se unen a las estructu-
iales y se transforman así en insolubles.
AI mismo tiempo se alcanza cierta fuerza
mecánica, que posibilita los pasos si-
guientes del proceso de preparación. Al-
gunos fijadores como, por ejemplo, eI /or-
maldehído y, en especial, el glutaraldehí-
Célula intacta
Ribosomas
do son especialmente efectivos en lo refe-
rido a la fbrmación de enlaces transversa-
les. Estos dos fijadores, junto con el tetró-
xido de osmio, que también forma enlaces
t¡ansversales, son algunos de los agentes
más efectivos. Mantienen el aspecto de la
célula en condiciones muv similares a las
Centrifugación
200.000 g, t hora
cAP í ru to 2 MÉToDosHtsroLÓctcos 33
que se observan con el microscopio de
contraste de fase, como control de la es-
tructura de las células vivas.
La fijación también produce la inactiva-
ción de algunas de las enzimas celulares,
las cuales de otro modo iniciarían la auto-
digestión o autólisis y conducirían a la
degeneración post mortem (lat. mors,
muerte). Además, se eliminan bacterias y
muchos otros microorganismos. que po-
drían destruir el tei ido.
En la práctica, la f i jación se l leva a ca-
bo por inmersión de un pequeño trozo
de tejido en el fiiador, apenas se haya to-
mado la muestra. Es conveniente real i-
zar la extracción del teiido mediante
pinzas y una cuchi l la af i lada, y procurar
no dañar el tej ido. Para los tej idos huma-
nos, esto se puede efectuar durante pro-
cedimientos quirúrgicos o por biopsia
(gr. bios, vida; opsis, sin), es decir, una
muestra de tej ido extraída del organismo
vivo. De los tej idos accesibles directos,
como la piel, se puede tomar la muestra
por corte con cuchi l lo, pero también es
posible tomar muestras de órganos inter-
nos como, por ejemplo, el hígado o el r i-
ñón, mediante cánulas especiales. Las
b iops ias también se pueden ex t raer du-
rante procedimientos como endoscopias
(gr. endon, dentro; skopein, ver), es decir
estudios internos de cavidades mediante
un instrumento munido de una fuente
Iuminosa, el endoscopio. Después de Ia
extracción del tej ido se lo sumerge en el
fijador, en la fiiación por inmersión, a
diferencia de la fiiación por perfusión,
que se puede apl icar a animales de expe-
rimentación. En este caso se inyecta el
f i jador en el torrente sanguÍneo del ani-
mal vivo anestesiado y el f i lador l lega
por vía hematógena rápidamente a todo
el tej ido. De esta manera se Iogra matar
todas las células de un órgano completo
en forma casi instantánea después de in-
te r rumpi r Ia admin is t rac ión d 'e ox Ígeno.
y se obtiene una f i jación más rápida y
uniforme. El método se apl ica en traba-
ios muy ex igentes , por e jemplo prepara-dos para microscopia electrónica, en Ios
que se destacan con nit idez incluso las
pequeñas modif icaciones estructurales
post mortem.
Inclusión y corte. EI tejido fijado se cor-
ta en secciones delgadas, que permiten el
paso de la luz. La mayoría de los prepara-
dos para microscopia óptica tienen un es-
pesor de alrededor de 5-10 ¡rm, para lo
que se requiere un micrótomo, instrumen-
to similar, en principio, a una cortadora
de fetas. Para obtener la consistencia ne-
cesaria para poder cortar secciones tan
delgadas es necesario incluir antes el teii-
do en un mater ia l que, a l so l id i [ i carse . le
confiera suficiente dureza. Las sustancias
34 MÉTODOSHISTOLÓGICOS
Fig.2-17. La ilustración muestra el coÉe de
tejidos incluidos en un micrótomo de parafi-
na Tras el corte se reúnen los trozos en serie
sobre una pequeña "cinta transportadora" y se
colocan en el baño de agua caliente de la dere-
cha para que se estiren A continuación se
montan sobre portaobjetos y se procesan. So-
bre la mesa se ven 7 bloques de parafina, en
los que se dist inguen los trozos de tej ido inclui-
dos Cada bloque está f i jado a un pequeño cu-
bo de madera que se ajusta al micrótomo du-
rante el corte del bloque
adecuadas para este fin, los medios de in-
clusión, son tipos de cera insolubles en
agua, por Io géneral parafina. En conse-
cuencia, antes de Ia inclusión, es necesa-
rio deshidratar el tejido. Para ello se pasa
el tej ido por una serie de soluciones acuo-
sas de efanol en concentraciones crecien-
tes, hasta l legar al anhidro. El tej ido se su-
merge entonces en un l Íquido miscible en
etanol y parafina, por ejemplo xileno, pro-
ceso denominado "aclaramiento". Des-
pués del aclaramiento se coloca el tej ido
en parafina líquida, que disuelve ei xileno
y penetra así en ei tejido. Al enfriar, se so-
lidifica la parafina y forma, junto con el
tej ido incluido, un bloque sól ido o "taco",
que es lo que se secciona (f ig.2-17).
A pesar de los cuidados, se producen
ciertas modificaciones al procesar el taco.
El alcohol y el xi leno exfraen grasas y el
calentamiento de la inclusión inactiva
muchas enzimas; además, a menudo el te-
j ido se contrae de modo perceptible. Para
evitar estos problemas, a veces se efectúa
un corte por congelamiento de tejido fija-
do o no. Un taco de tej ido congelado t iene
consistencia suficiente para ser cortado
en un c r iós la to (véase f ig . 2 -33 . pág. a3) .
La técnica de congelación es tan rópida
que se pueden ob tener secc iones en pocos
minutos. Se uti l iza, por ejemplo, para de-
terminar si el material de una bioosia ex-
traída en un acto quirúrgico es benigno o
maligno. El resultado de la biopsia se ob-
t iene mientras el paciente permanece
C A P í T U
lslote de
anestesiado, por lo que el cirujano puede
decidir en el momento el alcance del pro-
cedimiento quirúrgico.
Método de congelación-desecación.
Con este método se intenta lograr que la
variación estructural y la extracción quí-
mica sean las mínimas posibles, para
conservar la actividad enzimática. Se
congela rápidamente el trozo de tejido y
se lo coloca en una cámara de vacío a ba-
ja temperatura, después se seca (se deshi-
drata) por evaporación lenta (sublima-
ción) del agua.
En la congelación-sustitución se efec-
túa primero una fijación moderada y un
tratamiento con sacarosa, después una
congelación rápida del tejido y a conti-
nuación una deshidratación a -B5oC en
metanol puro. Una vez eliminada el agua
se transfiere el tejido a un medio de inclu-
sión plástico adecuado, que se infiltra
mientras se incrementa gradualmente la
temoeratura hasta alrededor de -20"C. Por
último se polimeriza por irradiación con
luz ultravioleta el medio de inclusión,
que se seca, y ya se puede cortar el taco
terminado.
Fig.2-18. Fotomicrografía que muestra las ga-
mas de color del método de tinción histológica
de uso más frecuente, la coloración con he
matoxilina-eosina (HE). El corte de te¡ido es
de páncreas, por lo que se distingue un ¡slote
de Langerhans, con células cuyo citoplasma se
tiñe de color rosa claro con la eosina, y nume-
rosos ácinos, con células cuyo citoplasma se ti-
ñe de azul liláceo con la hematoxilina en la zo-
na basal y de rosa con la eosina, en la porción
aoical. x660.
El método es muy poco agresivo con el
tejido y es apropiado para muchos proce-
dimientos inmunohistoquímicos (véase
más adelante).
Coloración. Los cortes de teiido se sue-
len montar sobre portaobjetos y se colo-
rean. La mayoría de los colorantes histoló-
gicos se utilizan en solución acuosa, por
Io que los cortes incluidos en parafina de-
ben ser "desparafinados", mediante un
tratamiento con xileno, y rehidratados por
pasajes por concentraciones decrecientes
de alcohol en agua, antes de ser teñidos.
Los cortes por congelación se pueden tra-
tar con las soluciones acuosas inmediata-
mente después de seccionados.
La mavór Darte de los métodos de tin-
ción histblógicos se desarrollaron en fun-
ción de su capacidad para teñir selectiva-
mente los distintos componentes tisula-
res. El método de tinción más utilizado es
Ia combinación de hematoxilina y eosina
(HE), que tiñe los componentes nucleares
de azul violáceo, mientras que casi todas
las estructuras citoplasmáticas adquieren
una tonalidad rosada (fig. 2-18). En con-
secuencia, la tinción con HE muestra con
nitidez la forma y la estructura del nú-
cleo, además de ia forma y la extensión
de la célula. Cabe destacar, sin embargo,
que la tinción histológica es un procedi-
miento químico y que se ha producido
un gran desamollo en los métodos que in-
forman sobre Ia composición química de
las células y los tejidos. Esto se verá con
mayor detalle en la sección sobre histo-
química.
Después de la tinción, por Io general se
deshidrata y se aclara nuevamente la
muestra de tejido y entonces se monta, es
decir, se cubre con una gota de medio de
montaje transparente (Depex, Eukitt). Por
último se coloca un cubreobjeto para pro-
teger el preparado. Algunos medios de
montaje son miscibles en agua, por Io que
se puede montar inmediatamente, sin ne-
cesidad de deshidratación y aclaramiento.
Preparación de tejidos
para microscopia electrónica
Debido al poder de resolución mucho
mayor del microscopio electrónico, en es-
te caso se agudizan las exigencias de man-
tener las estructuras originales del tejido.
Para la fijación se suele utilizar glutaral-
dehído. También se puede emplear feúró-
xido de osmio que, además de fijar el teji-
do, se une con las membranas lipoprotei-
cas y así logra mayor contraste en Ia ima-
gen del microscopio electrónico. Esto se
debe al aumento de la dispersión de elec-
tlones por la membrana, a causa del eleva-
do número atómico del osmio. En conse-
cuencia, se habla de "tinción" o contras-
cAP í ru to MÉToDoSHISTOLÓGICOS 35
Fig .2-19 . lma
corte ultrafin(
con microsco
trónico, aume
13.000 veces.
muestra la par
túbulo renal, y
con claridad ur
del túbulo com
deada de partr
células vecinal
gran riqueza d
que facilitan la
ción de organe
srones, por ele
condrias (A/). (
A B Maunsba<
,,¡,!;
: r { ¡a r.,1,,
tado. EI contrastado con osmio se emolea
a menudo después de la f i jac ión con g lu -
taraldehído, que por sí misma no aumen-
ta el contraste.
Después de la fijación se deshidrata y
se incluye el teiido. Para la inclusión se
suelen utilizar resinas epoxi v distintos
moteriales plr isLicos. que adquieren gran
dureza después del secado y permiten la
sección de cortes ultrafinos.
36 MÉTODOSHISTOLÓGICOS
EI haz de electrones se detiene con faci-
lidad, por lo que 1os cortes de tejido utili-
zados no deben exceder de 20-100 nm.
Desde el punto de vista técnico, el corte
de estas secciones ultrafinas es muy di-
f Íci l y se necesita un ultramicrótómo.
con una cuchi l la de vidrio o de diaman-
te. El corte se controla con un microsco-
pio y se aumenta el contraste mediante
e l pasa ie ráp ido de las secc iones por una
C A P I T U
* :{i}"
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s " , ? 1 q
4
qr
W a
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. . : . e
' t l : ,
Fig.2-2O. Fotomicrograf ía de uncorte semif¡'
no de tejido de riñón Tras la fijación se incluyó
el tejido en plástico y se cortó en secc¡ones de
'I 
¡rm de espesor, que se colorearon con azul
de toluidina x660
solución de acetato de urani lo. Por lo
genera l no es necesar io e l im inar e l p lás-
t ico de inclusión, dado que es homogé-
neo y transparente, y además estabi l iza
el preparado durante el anál isis con el
microscoDio. Los cortes ultraf inos se
montan después de la sección sobre un
pequeño ret iculado de cobre, denomina-
do "gri l la", que suele estar cubierto por
una película plást ica de sostén muy del-
gada. En la observación microscópica
(f ig. 2-19), el haz de electrones atraviesa
el corte por Ios ori f icios de la gri l la.
La gran cal idad técnica que se obtiene
con Ia preparación de tej idos para la mi-
c roscop ia e iec t rón ica también se ap l i ca
para la mic roscop ia óp t ica , con los cor -
tes semif inos, de alrededor de 1 ¡rm de
espesor , y la pos ter io r t inc ión con, por
e jemplo , azu l de to lu id ina ( f ig . 2 -20) . Se
usa azul de toluidina por su capacidad
para penetrar en los medios de inclu-
sión de resinas eDoxi. io cual no ocurre
con los colorantes histológicos comu-
nes. Los cortes semif inos también se
pueden seccionar después de ser inclui-
dos en resinas acrí l icas (en Iugar de re-
sinas epoxi), que dan resultados de cal i-
dad muy similar y permiten Ia t inción,
por ejemplo, con hematoxi l ina y eosina
( f ie. 2-2t) .
Congelación y fractura (ing. freeze-
cleaving o freeze-fracfu¡e). Es una técni-
Fig.2-21. Fotomicrografía de la córnea Es un
corte semif¡no de tej ido incluido en resina
acrí l ica y teñido con hematoxi l ina-eosina. x440.
ca nueva que se ap l i ca a la inves t igac ión
de te j idos por mic roscop ia e lec t rón ica .
Consiste en congelar rápidamente el te-
j ido en nitrógeno l íquido y luego colo-
carlo en vacío, para después fracturarlo
con un cuchi l lo o navaia (de modo simi-
lar a como se parte un ladri l lo). Se colo-
ca entonces vapor de plat ino sobre la su-
perf icie de fractura, en ángulo incl ina-
do, lo que forma una delgada planti l la
de plat ino de esa superf icie, o répl ica,
or¿e acentúa las formas del relieve. Se
r-efu".ru entonceé la répl ica de plat ino
mediante la apl icación de partículas de
carbón. A continuación se el imina el te-
j ido con un ácido fuerte y se monta Ia ré-
pl ica de plat ino sobre una gri l la, para la
observación con el microscopio electró-
n ico de t ransmis ión , dado que e l hoz de
electrones es capaz de atravesar la répl i-
ca de lsada.
Las ventajas del método son evitar las
acciones de los fijadores químicos y de los
medios de deshidratación y de inclusión,
por Io que se han podido comparar las es-
tructuras de los tejidos fijados y no fijados
con el microscopio electrónico (f íg. 2-22).
El método tiene aplicación especialmente
importante en la investigación de las es-
tructuras internas de las membranas (véa-
se con más detal le en el cap. 3).
EI ooder de resolución es de alrededor
de 3 nm.
- 5 _ * * - - i * ' r r
C A P I T U L O METODOSHTSTOLOGICOS 37
Métodos histoquímicos
El elemento fundamental de los méto-
dos histológicos es Ia utilización de ac-
ciones físicas y químicas sobre prepara-
dos histológicos, paÍa determinar la lo-
ca]ización de sustancias químicas en las
céIulas y Ios tejidos. Para ia histoquímica
es esencial la Localización, dado oue el
empleo de cortes de tejido puede dlr in-
formación sobre la localización, imposi-
ble de obtener por determinacioneibio-
químicas obtenidas de homogenados de
teiidos.
Antes de la reacción histoquímica en sí
es necesario efectuar una lijación y una
preparación adecuadas, que conserven la
sustancia química estudiada y las estruc-
turas celular y tisular. Los lípidos son so-
Iubles en solventes orgánicos como el xi-
leno, por lo que se deben evitar cuando se
estudian esos compuestos. Debido a la ac-
ción desnaturalizante de los agentes fija-
dores sobre las proteínas, la mayoría de
las enzimas se inactivan con la fiiación
pero. por otra parte. algunas enzimas son
38 MÉTODOSHISTOLÓGICOS
solubles y se pierden si no se lleva a cabo
una fijación previa a la determinación his-
toouímica.
La reacción histoquímica debe inducir
la formación de un producto insoluble
visible. En consecuencia, debe ser colo-
reado o poder transformarse en fluores-
cente. Para Ia microscopia electrónica es
necesario que posea 
-electrondensidad
suficiente.
Se debe considerar la sensibilidad de Ia
reacción histoquímica, dado que los re-
sultados negativos no se pueden interpre-
tar de inmediato como ausencia de la pro-
piedad buscada. Es posible que la canti-
dad presente sea demasiado pequeña para
ser detectada, o que la sustancia se haya
perdido o modificado durante la prepara-
ción previa.
Se pasa gradualmente de los métodos
de tinción morfológicos a los procedi-
mientos histoquímicos más específicos.
Por lo tanto, se verán primero algunas
reacciones más generales antes de anali-
zar los principales métodos histoquími-
Fig.2-22. lmi
réplica de un
realizado por
ción y fractur
con mrcroscc
tróníco. La im
tra una célula
plexo coroidec
se ooservan c
el nucleolema
ros. x22.400. (
B. Van Deurs.)
C A P I T L
Acidofilia y basofilia
Para obtener suficiente contraste de co-
lor en los cortes histológicos comunes,
por lo general se emplean combinaciones
de colorantes ácidos y básicos. Tradicio-
nalmente se denomina acidofilia (g..f-
1ern, amar) a la capacidad de tinción de
Ios colorantes ócidos y basofilia ala capa-
cidad de tinción de los colorantes bósicos,
pero la designación de colorantes "óci'
dos" v "bósicos" proviene de la era clási-
ca de la histologíá, cuando las definicio-
nes de ácidos y bases diferían de las ac-
tuales (un ácido es una sustancia capaz de
Iiberar un protón y una base es una sus-
tancia capaz de aceptar un protón). En el
lenguaje /risfoquímico, un colorante áci-
do (aniónico) tiene capacidad para formar
un enlace electrostático (ionógeno) con
un grupo tisular con carga positiva. En
contraste, un colorante básico (catiónico)
ouede formar un enlace eléctrostático con
ün grupo tisular con carga negativa.
Así, las uniones entre colorantes ócidos
(aniónicos) y bósicos (catiónicos) y los
grupos tisularcs tienen, esencialmente,
características electrostó.ticos. En un corte
de tejido, el esqueleto proteico y muchas
otras macromoléculas contienen grupos
ionizables, capaces de formar enlaces
electrostáticos con los colorantes. Las dis-
tintas proteínas de un corte de teiido tie-
nen diferentes puntos isoeléctricos, dado
que varían las composiciones de amino-
ácidos. Para las tinciones histológicas co-
munes se utiliza un pH del que se conoce
por experiencia su buen contraste de co-
/o¡. Con el pH elegido, algunos compo-
nentes tisulares son acidófilos, mientras
que otros serán basófilos (fig. 2-18), pero
siempre en rcIación con el pH, A pH neu-
tro, el DNA y el RNA presentan fuerte ba-
sofilia, debido a la disociación de los gru-
pos fosfato de las moléculas (fig. 2-23).
Con ese mismo pH, la mayoría de las pro-
teínas citoplasmáticas son acidófilas.
Cuando se desea analizar si la basofilia
se debe a los ácidos nucleicos de, por ejem-
plo el RNA, antes de la tinción se puede
tratar el corte control con Ia enzima ribonu-
cleasa. De esta manera se elimina el RNA
del corte control, por lo que las zonaó ricas
en RNA ya no serán basófilas. El DNA se
identifica de modo similar, con Ia aplica-
ción de la enzima desoxirribonucleasa.
Con la fijación se modifican las propie-
dades de las proteínas, debido a la desna-
turalización, y el resultado es un aumento
de la afinidad por el colorante.
Para algunos métodos de tinción, por
ejemplo Ia coloración tricrómica de Ma-
llory, se utilizan varios colorantes, todos
ácidos, que tiñen distintas estructuras tisu-
lares. Se desconoce el fundamento químico
de Ia unión entre los colorantes y los com-
ponentes tisulares, debido a que estos mé-
iodos no son específicos, desde el puntode
vista histoquímico. Por el contrario, se de-
nominan selectivos cuando tiñen determi-
nados componentes tisulares (fi9. 2-2a).
Los métodos de tinción selectivos tienen
Flg.2-24. Fotomicrografía de un preparado de
la cápsula de un órgano, coloreado por el méto-
do de Mallory. Se observa una tinción selecti.
va, dado que, entre otras, las numerosas fibras
colágenas del tejido conectivo se colorean de
azul intenso. x275.
#ü
ü
q
t , ,
1|
{
f
i r ü "
*
Fig. 2-23. Fotomicrograf ía
de un corte de la médula
esoinal teñido con tionina.
En el centro de la imagen
se distingue una neurona
(una célula motora del as-
ta anterior, n) con nucléo-
lo basófilo y cúmulos ci-
toplasmáticos muy ba-
sófilos. x440.
*
cAP í ru to
" ' *
MÉToDoSHISTOLÓGICOS 39
Metacromasia
(rojo) Ortocromasia (azul)
Fig.2-25. Dibujo esquemático de la metacro-
masia, que muestra la agregación de las molé-
culas de colorante sobre la suoerficie de un oo-
límero pol ianiónico de elevado peso molecular
(p. ej. , un glucosaminoglucano en un cartí lago)
con viraje del color azul del colorante a violeta
rojizo. (Según Bradley y Wolf )
gran valor práctico, dado que el mayor con-
traste de color facilita la identificación de
los distintos componentes del tejido.
Metacromasia
Cuando se tiñen ciertos comDonentes
tisulares, como por ejemplo, la mátriz car-
tilaginosa, con el colorante azul de tolui-
dina, se modifica el color azul a púrpura o
rojo violáceo por unión con el tej ido. Esta
variación cromática se denomina meta-
cromasia (gr. meta, variación; kroma, co-
lor) y los colorantes capaces de sufrir esta
transformación se denominan colorantes
metacromáticos. Pertenecen a este tipo de
agentes ciertos colorantes básicos, de los
cuales los más importantes son los deriva-
dos t iazínicos azul de toluidinay t ionina.
Una solución diluida de un colorante
tiazínico es azul, debido a que se encuen-
tra como monómero. Si la solución es
concentrada, el colorante se agrega y for-
ma polímeros, por lo que el color vira al
rojo. Así, un colorante tiazínico puede
presentar distinto color, de acuerdo con eI
estado de agregación de las moléculas y
es precisamente este estado de agrega-
ción, que puede ser modificado por los
componentes tisulares, el que produce la
metacromasia. Si se tiñe un corte con una
solución diluida de azul de toluidina, es-
te colorante catiónico forma enlaces elec-
trostáticos co.n los sitios aniónicos V, por
los componentes t isularer 
"upaces 
á"'r"t
teñidos metacromáticamente (hay poli-
aniones de alto peso molecular), se agre-
40 METODOSHISTOLÓGICOS
gan las moléculas del colorante (fig.2-25).
En consecuencia, el colorante vira a rojo.
Los componentes tisulares que se colo-
rean por metacromasia son, en su mayor
parte, los muy ócidos glucosaminogluca-
nos sulfatados de Ia matriz cartilaginosa
(fíg. 2-26) y los mastocitos del tejido co-
nectivo, que contienen la sustancia po-
lianiónica heparina. Las nucleoproteínas
presentan metacromasia moderada.
Métodos basados en la reacción
de Schiffpara grupos aldehído
EI reactivo de Schiff es la leucofucsina
formada por el tratamiento del colorante
rojo fucsina con bisulfito. La Ieucofucsina
es incolora, pero forma tn producto de
adición estable rojo con los grupos aldehí
do. Esta reacción se incluye como paso fi-
nal de dos importantes métodos de tin-
ción histoquímicos: la reacción del ácido
peryódico-Schiff para compuestos ricos
en hidratos de carbono y la reacción de
Feulgen para DNA.
Método del ácido peryódico-Schitr (PAS).
La reacción de PAS se emplea para deter-
minar la presencia de macromoléculas ri-
cas en hidratos de carbono como el slucó-
geno y )as glucoproteínas.
El principio del método de PAS se basa
en que el ácido peryódico (HIO*) oxida
primero los grupos hidroxilo Iibres de dos
átomos de carbono adyacentes, por lo que
se transforman en grupos aldehÍdo. Al
mismo tiempo se escinde la unión entre
los átomos de carbono, por lo que se detie-
ne la oxidación. Los grupos aldehÍdo neo-
formados reaccionan entonces con el
Sit io de unión en el
pol ianión
Molécula de
colorante
re
i :.q .;'"'. "'.-.. q':
. ! " . ( .' - 
- - - \ . : f
Fig.2-26. Fot
fía de un corte
quea teñido cr
xi l ina-eosina, r
tra un ejemplr
cromasia. La
¡ntensamente
cea de la mita
de la imagen r
hial ino (c), cu1
basal se tiñe tr
cromas¡a. x1 1
C A P I T I
Fig, 2-27. Fotomicrogra-
fía de una t inción con el
método de PAS de un
preparado de la mucosa
del intestino delgado. En
el epitel io se dist inguen
células cal ici formes de t
color rojo intenso, que A
contienen secreción
(una glucoproteína) que
se tiñe con la reacción
de PAS. x275
Fig.2-28. Muestra el
principio del método de
Feulgen, en el que los
grupos púricos del DNA
son el iminados por hidró-
l isis ácida débil .
ru
&' 
*ff;
w.
@,
!ú
ü
*r :lli
*
'&1
,.r,',*".!. J,
{ }
i
p"
&
f.*
d$/
reactivo de Schiff, para dar lugar a la apa-
rición del color roTo magenta característi-
co (fig. 2-27).
Varios componentes tisulares reaccio-
nan con el método de PAS, se dice que
son "PAS-positivos", como se verá en los
próximos capítulos.
Para determinar si una sustancia PAS-po-
sitiva está compuesta por glucógeno se tra-
ta un prepa-rado control con la enzima ami-
loso, que escinde el glucógeno específica-
mente, antes de realizar la tinción de PAS.
Método de Feulgen. Es un método espe-
cífico para la determinación histoquímica
de DN,4, sobre la base del contenido de
desoxirribosa en el DNA. Se eliminan los
grupos purínicos del DNA por medio de
una hidrólisis ácida suave. De esta mane-
ra se abre el anillo de Ia desoxirribosa y se
forma un grupo aldehído [fig. 2-28), que
I- o - P - o :
I
o
I
O H
I- o P - O :
I
o
I
- 
k--{
,nr ,
Fig.2-29. Fotomicrografía de un preparado del
extremo de la níz de una cebolla, teñida con el
método de Feulgen, específico para DNA Só-
lo se t iñe de rojo la cromatina del núcleo (que
contiene DNA). El color verde del ci toplasma se
debe al coloranle de contraste verde claro En-
tre olras, en el centro de la imagen se dist ingue
una célula en mitosis (división), donde los cro-
mosomas están bien teñ¡dos x440
reacciona con el reactivo de Schiff, con
aparición del color rqo característico en el
sit io que corresponde al DNA (f ig. 2-29).
Como conf¡oi se utilizan cortes tratados
con Ia enzima desoxitibonucleoso antes
de la t inción de Feulgen.
Por Io general, Ios materiales positivos
para Feulgen se limitan aIa cromatina nu-
c}eo¡. Como se verá, en el capítulo 3, las
mitocondrias poseen DNA, pero en canti-
dad demasiado pequeña para ser detecta-
da con el método de Feulgen.
Determinación histoquímica de lípidos
Después de Ia fijación de los lípidos
con formalina se cortan secciones conge-
)adas,para evitar Ia extracción de los l ípi-
dos mediante solventes orgánicos. Para la
demostración histoquímicase uti l izan
muy a menudo los denominados coloran-
tes Sudán. Son casi insolubles en agua,
por lo que se utilizan disueltos en alcohol
diluido, que no disuelve las grasas. La
"tinción" se oroduce cuando Ias molécu-
las del coloránte se distribuyen entre \os
lÍpidos y el solvente, en relación coiles-
pondiente a Ia solubilidad en los dos me-
dios. Pare evitar la extracción del coloran-
C A P I T U L O MÉToDosHI}T)LÓGICOS 41
Fig. 2-30. Fotomicrografía de un corte congela-
do de tejido adiposo teñido con rojo Sudán
para los lípidos de los adipocitos (se usó "Light
Green" como colorante de contraste). x440.
te y los lípidos se incluyen los cortes, des-
pués de la tinción, en un medio acuoso.
De este modo, Ios colorantes Sudán ti-
ñen con intensidad los triacilgliceroles,
como por ejemplo, en la tinción de los
adipocitos con roio Sudán (fig. 2-30). El
negro Sudán tiene gran utilidad en Ia tin-
ción de las voinas de mielina de las fibras
nerviosas, compuestas por lipoproteínas.
Determinación histoquímica de enzimas
Las enzimas tienen vital imoortancia en
el metabolismo celular, dado- que actúan
como catalizadores biológicos de casi to-
das las reacciones químicas celuia¡es. En
consecuencia,