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La transferencia de ADN entre células, o la introducción
de un ADN foráneo en un determinado organismo, es un
fenómeno altamente restringido en los seres vivos. Incluso
en los casos que presentan mayor eficacia de introducción de
ADN en un huésped (p. ej., los virus), existen mecanismos
de defensa de la célula hospedadora, como los sistemas de
restricción bacterianos, que detectan y degradan el ADN
extraño. A pesar de estas barreras, es técnicamente posible
introducir ADN en células hospedadora, procarióticas o
eucarióticas, mediante tratamientos específicos que se
comentan más adelante.
Para que un fragmento de ADN quede permanentemente
presente en la célula hospedadora y su descendencia, es
necesario que vaya unido a otras secuencias de ADN que
confieran al conjunto la capacidad de autorreplicación y 
que permitan, además, diferenciar fácilmente las células que
han captado el ADN (se han transformado) de las que no lo han
hecho. Por ello, es necesario unir in vitro los fragmentos de
ADN que se quieren clonar (ADN foráneo o inserto) a una
molécula de ADN (denominada vector) con capacidad de ser
introducida, replicada y seleccionada en las células hospeda-
doras. La unión covalente de dos moléculas de ADN para dar
un ADN híbrido, denominado ADN quimera o ADN recom-
binante, es posible realizarla mediante el uso de las enzimas
denominadas ADN ligasas.
En la mayor parte de los casos, el material de partida
para la clonación de un gen es una colección compleja de
fragmentos unidos al vector correspondiente. Antes de
seleccionar el gen de interés, esta colección debe introdu-
cirse en células hospedadoras adecuadas, por ejemplo, en un
cultivo bacteriano. El huésped amplifica los fragmentos
recombinantes, facilitando su identificación. Como la trans-
formación del huésped por introducción de moléculas
recombinantes se realiza en condiciones de gran exceso de
células hospedadoras y de eficiencia limitada, se necesitan
mecanismos sencillos para poder distinguir las bacterias que
han captado ADN de las que no lo han hecho. La selección
de las bacterias transformadas es sencilla cuando el vector
les confiere una nueva característica fácilmente identifica-
ble. Los marcadores más útiles empleados en vectores de
tipo plasmídico son genes de resistencia a antibióticos,
como ampicilina o tetraciclina. Estos vectores se emplean
con bacterias hospedadoras sensibles al antibiótico. Así, las
bacterias transformadas pueden crecer en medios que con-
tengan el antibiótico, pero las células que no hayan captado
el ADN, no lo harán.
La identificación de las células transformadas por un
ADN recombinante concreto, que han incorporado un inser-
to específico entre los muchos posibles, requiere la posesión
de un método de detección del gen o producto del gen.
Normalmente, se emplean fragmentos de ADN de tamaño
variable y secuencia complementaria a la del gen de interés,
denominados sondas génicas, o un anticuerpo frente a la pro-
teína codificada por éste. Estos reactivos específicos permi-
ten aislar un clon recombinante (conjunto de células que
derivan de una célula originaria que captó un ADN recombi-
nante específico), entre las diferentes colonias presentes en
las placas donde se han sembrado las bacterias hospedado-
ras. La amplificación del clon por siembra en un medio de
cultivo líquido permitirá multiplicar a voluntad el inserto clo-
nado (Fig. 23-1).
23.3 MANEJO DEL ADN
23.3.1 Aislamiento y fragmentación del ADN
Para su clonación, los fragmentos de ADN deben tener unas
dimensiones determinadas y limitadas. El tamaño del ADN
genómico, sea procariótico o eucariótico, es muy superior al
máximo posible para un inserto. Por ello, la clonación de
genes a partir del ADN genómico requiere el aislamiento
previo del ADN (p. ej., por lisis de las células y centrifuga-
ción en gradiente de cloruro de cesio) y su ruptura en frag-
mentos de tamaño adecuado. Casi siempre se realiza una
fragmentación específica mediante endonucleasas de res-
tricción, enzimas presentes en muchas especies bacterianas.
Existen diversos tipos de endonucleasas de restricción,
siendo las de tipo II las más utilizadas para la fragmentación
específica del ADN. Cada endonucleasa de restricción (se
dispone de varios centenares) reconoce una secuencia con-
creta de ADN, generalmente una secuencia palindrómica,
con una longitud de entre cuatro y ocho pares de bases.
Algunas endonucleasas cortan ambas cadenas de ADN den-
tro de la secuencia diana y en posiciones equivalentes, gene-
rando fragmentos con extremos romos sin bases desaparea-
das.
Otras endonucleasas cortan las cadenas en posiciones
alternas, dando lugar a la formación de extremos monocate-
narios con secuencias complementarias, denominados extre-
mos cohesivos (Tabla 23-1). Los fragmentos producidos al
tratar dos moléculas de ADN de diferente procedencia con
una misma endonucleasa que genere extremos cohesivos,
tenderán a asociarse por complementariedad de los extremos
monocatenarios. El tamaño medio de los fragmentos de res-
tricción producidos depende de la frecuencia de la diana en
la molécula de ADN. Para una diana de seis pares de bases,
es algo inferior a 10 kb. Dichos fragmentos pueden separar-
se, en función de su tamaño, por electroforesis en geles de
agarosa (Fig. 23-2). 
La degradación de moléculas pequeñas de ADN (un plás-
mido o un ADN viral) produce un número limitado de frag-
mentos que se localizan como bandas en el gel, por tinción
402 | Genoma, patología molecular y terapia génica
23 Capitulo 23 8/4/05 11:42 Página 402
	BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR (...)
	CONTENIDO
	PARTE II: BIOLOGÍA Y PATOLOGÍA MOLECULAR
	SECCIÓN V GENOMA, PATOLOGÍA MOLECULAR Y TERAPIA GÉNICA
	23 ANÁLISIS MOLECULAR DEL GENOMA
	23.3 MANEJO DEL ADN
	23.3.1 Aislamiento y fragmentación del ADN