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23.4.3 Células hospedadoras
En la mayor parte de los casos, las células hospedadoras son
bacterias seleccionadas para presentar las mejores propieda-
des de captación, selección y multiplicación de ADN recom-
binante. Entre los huéspedes eucarióticos, las levaduras ocu-
pan un lugar importante por ser organismos unicelulares, y
fáciles de manejar y multiplicar a gran escala en el laborato-
rio. También se realizan clonaciones en células vegetales,
pero las células animales son las de mayor interés en ciencias
biomédicas. 
Existen diversos métodos de transfección de células ani-
males en cultivo, como la coprecipitación del ADN recombi-
nante con fosfato cálcico, la permeabilización de las células
con impulsos eléctricos (electroporación), el uso de com-
puestos orgánicos (p. ej. lipofectamina), la utilización de
virus eucarióticos como vectores, y la microinyección de
ADN en el núcleo celular. No obstante, la introducción de
ADN es más delicada en células de eucariotas que en proca-
riotas. Su cultivo es más complejo, pudiéndose manejar en
número muy inferior al del caso de las bacterias. Además, la
replicación del vector con independencia de los cromosomas
de la célula hospedadora es problemática, por lo que suele
ser necesario utilizar vectores que permitan la integración
estable del ADN foráneo en los cromosomas del huésped. 
La integración al azar del ADN recombinante en el geno-
ma de la célula hospedadora puede resultar perniciosa para
dicha célula por alterar el funcionamiento normal de genes
esenciales. A pesar de ello, la introducción y expresión de
genes en células eucarióticas es cada vez más frecuente e,
incluso, se han desarrollado vectores de expresión que pue-
den multiplicarse transitoriamente con independencia de los
cromosomas del huésped (replicación episomal), o integrar-
se de forma estable en los mismos para dirigir la expresión
permanente de la proteína codificada por el inserto. 
23.5 SECUENCIACIÓN DE ADN
La determinación de la secuencia de nucleótidos del ADN, o
secuenciación, es una de las técnicas más importantes de
análisis del genoma. La secuenciación permite, entre otras
cosas:
— Deducir la secuencia de aminoácidos de las proteínas
codificadas por los genes y, en algunos casos, su posi-
ble función por comparación con la secuencia de
otras proteínas de función conocida.
— Identificar mecanismos de regulación de los genes,
por localización de secuencias diana para factores de
transcripción.
— Determinar la causa molecular de enfermedades
hereditarias, al identificar mutaciones por compara-
ción de la secuencia del gen implicado, procedente de
pacientes, con la del gen normal.
— Identificar mutaciones esporádicas en pacientes con
enfermedades genéticas adquiridas, como la mayor
parte de los cánceres.
— Elaborar métodos para la detección rápida de indivi-
duos portadores de un gen mutado, o de un virus.
Existen dos técnicas de secuenciación que se han desarrolla-
do en paralelo y simultáneamente. La técnica de Maxam-
Gilbert se basa en la degradación química selectiva del ADN,
y en la separación electroforética y el análisis del tamaño de
los fragmentos obtenidos. Aunque igualmente eficaz, esta téc-
nica se utiliza mucho menos que la técnica de Sanger, deno-
minada de terminación de cadena, y basada en las propieda-
des de la ADN polimerasa. Esta enzima copia un ADN
monocatenario, a partir de un cebador, añadiendo el desoxi-
rribonucleótido entrante al hidroxilo del anillo de desoxirri-
bosa del extremo 3’ de la cadena creciente (véase el Cap. 19).
La enzima reconoce como sustratos los derivados didesoxi de
los nucleótidos, pero cuando incorpora uno de ellos a una
cadena creciente, la elongación resulta imposible, porque el
nucleótido en el extremo 3’ no posee el grupo hidroxilo para
atacar a un nuevo nucleótido entrante. Así, se produce una
terminación de la síntesis en la posición correspondiente a la
entrada del derivado didesoxi (Fig. 23-8). 
En la técnica de Sanger, se producen cuatro reacciones
independientes. Cada una incluye el ADN molde, el cebador,
los cuatro desoxirribonucleótidos (uno de ellos marcado
radiactivamente con 32P o 35S) y una determinada cantidad de
uno de los derivados didesoxi. Este derivado compite con el
nucleótido correspondiente, de forma que cuando debe ser
añadido por la polimerasa, una proporción determinada de
las cadenas crecientes incorpora el análogo didesoxi y termi-
na su elongación. Se producen fragmentos cuyo tamaño
corresponde a la distancia del sitio de comienzo de la sínte-
sis hasta la posición de terminación, y que indican la presen-
cia del nucleótido didesoxi utilizado en esa posición. Los
fragmentos obtenidos se separan por electroforesis en fun-
ción de su tamaño, en geles de poliacrilamida de alta resolu-
ción, y se detectan por autorradiografía. 
La escalera de secuenciación resultante, leída en sentido
ascendente (de menor a mayor tamaño), corresponde a la
secuencia complementaria de la de la hebra inicial, en senti-
do 5’→3’, a partir de la cual se deducen las de la hebra pro-
blema y la proteína que codifica. La técnica de Sanger se ha
automatizado, recurriendo a nucleótidos modificados que se
detectan por su fluorescencia. Esta variante se ha aplicado a la
secuenciación total del genoma humano (véase el Cap. 24).
410 | Genoma, patología molecular y terapia génica
23 Capitulo 23 8/4/05 11:43 Página 410
	BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR (...)
	CONTENIDO
	PARTE II: BIOLOGÍA Y PATOLOGÍA MOLECULAR
	SECCIÓN V GENOMA, PATOLOGÍA MOLECULAR Y TERAPIA GÉNICA
	23 ANÁLISIS MOLECULAR DEL GENOMA
	23.4 VECTORES Y GENOTECAS
	23.4.3 Células hospedadoras
	23.5 SECUENCIACIÓN DE ADN