TECNICAS EN BIOLOGIA MOLECULAR Y CELULAR

Vista previa del material en texto

LA CONFERENCIA DE ASILOMAR
Los rápidos avances en la tecnología del DNA recombinante 
a principios de la década de 1970 proporcionaron a los investi-
gadores la capacidad de “cortar y pegar” el DNA de diferentes 
organismos, como los virus y las bacterias, por primera vez. 
Aunque era evidente el potencial investigativo para tal manipu-
lación del DNA, muchos científicos estaban preocupados por 
los posibles riesgos que esta nueva tecnología representaba 
para la salud humana y el medio ambiente. En respuesta, un 
grupo de investigadores dirigido por el bioquímico de Stanford 
Paul Berg pidió una moratoria voluntaria internacional sobre los 
experimentos con el DNA recombinante en 1974. Al año si-
guiente, Berg y otros organizaron una conferencia internacio-
nal en el Centro de Conferencias Asilomar en Pacific Grove, 
California, para abordar las preocupaciones con respecto al 
uso de la tecnología del DNA recombinante. La Conferencia de 
Asilomar de 1975 reunió a 140 biólogos moleculares, aboga-
dos, funcionarios gubernamentales y periodistas con el apoyo 
de los Institutos Nacionales de Salud y la Academia Nacional 
de Ciencias. Durante varios días, los asistentes discutieron (y 
argumentaron sobre) los riesgos potenciales asociados con di-
ferentes tipos de experimentos y los métodos para minimizar al 
máximo estos riesgos. Al final de la reunión, se llegó a un 
C
A
P
Í
T
U
L
O
18
B O S Q U E J O D E L C A P Í T U L O
 18.1 El microscopio óptico
 18.2 Microscopía de campo brillante 
y de contraste de fase
 18.3 Microscopía de fluorescencia (y 
técnicas relacionadas basadas 
en la fluorescencia)
 18.4 Microscopía electrónica de 
transmisión
 18.5 Preparación de las muestras pa-
ra microscopía electrónica
 18.6 Microscopía electrónica de ba-
rrido
 18.7 Microscopía de fuerza atómica
 18.8 El uso de radioisótopos
 18.9 Cultivo celular
 18.10 El fraccionamiento de los conte-
nidos de una célula por centrifu-
gación diferencial
 18.11 Purificación y caracterización de 
proteínas mediante cromatogra-
fía líquida en columna
 18.12 Determinación de proteínas: in-
teracciones de las proteínas
 18.13 Caracterización de las proteínas 
mediante electroforesis en gel 
de poliacrilamida
 18.14 Caracterización de las proteínas 
por espectrofotometría
 18.15 Caracterización de las proteínas 
mediante espectrometría de ma-
sas
 18.16 Determinación de la estructura 
de las proteínas y los complejos 
multisubunitarios
 18.17 Fraccionamiento de los ácidos 
nucleicos
 18.18 Hibridación del ácido nucleico
 18.19 Síntesis química del DNA
 18.20 Tecnología del DNA recombi-
nante
 18.21 Amplificación enzimática del 
DNA por PCR
 18.22 Secuenciación de DNA
 18.23 Bibliotecas de DNA
 18.24 Transferencia de DNA en las 
células eucariotas y en los em-
briones de mamíferos
 18.25 Edición genética y silencia- 
miento
 18.26 El uso de los anticuerpos
Técnicas en biología 
molecular y celular
(continúa)
Una ilustración de la proteína Cas9, la endonucleasa de DNA guiada 
por RNA que se utiliza en la edición del genoma basado en CRISPR. 
La proteína Cas9 (púrpura) se asocia con un RNA guía (columna ver-
tebral púrpura con bases blancas) y explora a lo largo del DNA genó-
mico en busca de un segmento de DNA (cadena principal azul con 
bases blancas) que coincida con el RNA guía. Cuando encuentra esta 
coincidencia, divide el DNA en ese punto.
18
.1 
E
l m
ic
ro
s
c
o
p
io
 ó
p
tic
o
693acuerdo para levantar la moratoria y permitir que la investiga-
ción continuara con un conjunto de restricciones definidas. Las 
pautas establecidas en la reunión de Asilomar fueron adopta-
das por el NIH al año siguiente.
Más recientemente, el desarrollo de las nuevas tecnologías 
que allanan el camino para la edición del genoma humano ha 
llevado a los investigadores a considerar la posibilidad de 
convocar una reunión similar a la histórica conferencia de 
Asilomar. De particular preocupación ética es el potencial de 
las técnicas de edición del genoma para ser utilizadas en la in-
geniería genética de embriones humanos. En una carta a 
Science publicada en abril de 2015, un grupo de investigado-
res dirigido por Jennifer Doudna (Universidad de California, 
Berkeley) ha pedido una prohibición global de las modificacio-
nes del genoma en las células germinales humanas y un au-
mento de las discusiones con el público sobre la edición del 
genoma. La carta también convoca a una reunión de investiga-
dores, especialistas en ética, abogados y público para que se 
consideren los méritos y riesgos de la edición del genoma, y 
para recomendar las políticas donde se necesiten.
18.1 El microscopio óptico
Debido al tamaño muy pequeño de la materia objeto de análisis, 
la biología celular y molecular depende más del desarrollo de 
nuevos instrumentos y tecnologías que cualquier otra rama de la 
biología. En consecuencia, es difícil aprender sobre la biología 
celular y molecular sin conocer también sobre la tecnología que 
se requiere para recopilar los datos. En este capítulo, estudiare-
mos los métodos más utilizados en este campo sin sumergirnos 
en los detalles o las muchas variaciones que se emplean. Estos 
son los objetivos del presente capítulo: describir las formas en 
que se utilizan las técnicas seleccionadas y proporcionar ejemplos 
de los tipos de informaciones que se pueden aprender utilizando 
estas técnicas. Comenzaremos con el instrumento que permitió a 
los biólogos descubrir la existencia misma de las células, y pro-
porcionar el punto de partida para toda la información que se ha 
presentado en este texto.
Los microscopios son instrumentos que producen una ima-
gen ampliada de un objeto. La FIGURA 18-1 muestra los compo-
nentes más importantes de un microscopio óptico compuesto. 
Una fuente de luz, que puede ser externa al microscopio o incor-
porarse en su base, ilumina la muestra. El lente del condensador 
en el portaobjeto recoge los rayos difusos de la fuente de luz e 
ilumina la muestra con un cono pequeño de luz brillante que 
permite que se vean partes muy pequeñas de la muestra después 
de la ampliación. Los rayos de luz enfocados en la muestra por el 
lente del condensador son luego recogidos por el lente objetivo 
del microscopio. En este punto, tenemos que considerar dos con-
juntos de rayos de luz que entran en el lente objetivo: el que la 
muestra ha alterado y el que no tiene alteración (FIGURA 18-2). El 
último grupo consiste en la luz del condensador que pasa direc-
tamente al lente objetivo, formando el fondo de luz del campo 
visual. El primer grupo de rayos de luz emana de muchas partes 
de la muestra y forma la imagen de la muestra. Estos rayos de luz 
son enfocados por el lente objetivo para formar una imagen real 
y ampliada del objeto dentro de la columna del microscopio (figu-
ra 18-1). La imagen formada por el lente objetivo se utiliza como 
Lente ocular
Muestra
Lente objetivo
Fuente de luz
Lente del condensador
FIGURA 18-1 Diagrama seccional a través de un microscopio óptico 
compuesto; es decir, un microscopio que tiene un lente objetivo y un len-
te ocular.
Lámpara
Plano de la muestra
Lente objetivo
Distancia focal
del lente objetivo
( ) Rayos de luz que forman la imagen.
( ) Luz del fondo del campo.
Plano del foco
de la fuente de luz
Plano del foco
de la imagen
2α
FIGURA 18-2 Caminos tomados por los rayos de luz que forman la ima-
gen de la muestra y aquellos que forman la luz del fondo del campo. 
Los rayos de luz de la muestra se enfocan en la retina, mientras que los 
rayos del fondo están desenfocados, produciendo un campo difuso bri-
llante. Como se verá más adelante en el texto, el poder de resolución del 
lente objetivo es proporcional al seno del ángulo. Las lentes con mayor 
poder de resolución tienen distancias focales más cortas, lo que significa 
que la muestra se encuentra más cerca del lente objetivo cuando se en-
foca.
C
A
P
ÍT
U
L
O
 18
 
T
é
c
n
ic
a
s
 e
n
 b
io
lo
g
íam
o
le
c
u
la
r y
 c
e
lu
la
r
694 un objeto mediante un segundo sistema de lente, el lente ocular, 
para formar una imagen ampliada y virtual. Un tercer sistema de 
lentes ubicado en la parte frontal del ojo usa la imagen virtual 
producida por el lente ocular como un objeto para producir una 
imagen real en la retina. Cuando se gira la perilla de enfoque del 
microscopio óptico, la distancia relativa entre la muestra y el len-
te objetivo cambia, permitiendo que la imagen final se enfoque 
exactamente en el plano de la retina. La ampliación total obteni-
da por el microscopio es el producto de los aumentos producidos 
por el lente objetivo y el lente ocular.
Resolución
Hasta este punto, hemos considerado sólo la ampliación de un 
objeto sin prestar atención a la calidad de la imagen producida, 
es decir, la medida en que los detalles de la muestra se conservan 
en la imagen. Suponga que está mirando una estructura en el 
microscopio utilizando un lente objetivo de potencia relativamen-
te alta (por ejemplo, 63�) y un lente ocular que magnifica la ima-
gen del lente objetivo cinco veces más (un ocular de 5�). 
Supongamos que el campo está compuesto de cromosomas y es 
importante determinar el número presente, pero algunos de ellos 
están muy juntos y no se pueden distinguir como estructuras se-
paradas (FIGURA 18-3a). Una solución al problema podría ser 
cambiar los oculares para aumentar el tamaño del objeto que se 
está viendo. Si cambiara el ocular de 5� a 10�, lo más probable 
es que aumente su capacidad para determinar el número de cro-
mosomas presentes (figura 18-3b) porque ahora ha extendido la 
imagen de los cromosomas producidos por el lente objetivo sobre 
una parte mayor de su retina. Cuantos más fotorreceptores pro-
porcionen información sobre la imagen, más detalles podrán ver-
se (FIGURA 18-4). Sin embargo, si cambia a un ocular de 20�, no 
es probable que vea detalles adicionales, aunque la imagen sea 
más grande (figura 18-3c), es decir, ocupa más superficie reticular. 
El cambio de ocular no proporciona información adicional debido 
a que la imagen producida por el lente objetivo no posee ningún 
detalle extra para ser ampliado por el aumento de la potencia del 
lente ocular. El segundo cambio en los oculares proporciona sólo 
un aumento vacío (como en la figura 18-3c).
La calidad óptica del lente objetivo se mide por la extensión a 
la cual los detalles finos presentes en una muestra pueden ser 
discriminados o resueltos. La resolución alcanzada por un mi-
croscopio está limitada por la difracción. Debido a la difracción, 
la luz que emana de un punto en la muestra nunca se puede ver 
como un punto en la imagen, sino sólo como un pequeño disco. 
Si los discos producidos por dos puntos cercanos se superponen, 
los puntos no se pueden distinguir en la imagen. Por tanto, el 
poder de resolución de un microscopio se puede definir en térmi-
nos de la capacidad de ver dos puntos vecinos en el campo visual 
como dos entidades distintas. El poder de resolución de un mi-
croscopio está limitado por la longitud de onda de la iluminación 
según la ecuación
d = 
0.61 �
n sen α
donde d es la distancia mínima que deben separarse dos puntos 
en la muestra para lograr la resolución, � es la longitud de onda 
de la luz (527 nm se usa para la luz blanca), y n es el índice de 
refracción del medio presente entre la muestra y el lente objetivo. 
Alpha (α) es igual a la mitad del ángulo del cono de luz que entra 
en el objetivo, como se muestra en la figura 18-2. Alpha es una 
medida de la capacidad de captura de luz del lente y está directa-
mente relacionada con su apertura.
El denominador de la ecuación en la columna 1 se llama aper-
tura numérica (N. A., numerical aperture). La apertura numérica es 
una constante para cada lente, una medida de sus cualidades pa-
ra captar la luz. Para un objetivo que está diseñado para su uso en 
el aire, la N.A. máxima posible es 1.0 porque el seno del ángulo 
máximo posible de 90° es 1 y el índice de refracción del aire es 
1.0. Para un objetivo diseñado para sumergirse en aceite, la N.A. 
máxima posible es aproximadamente 1.5. Como regla general, el 
aumento máximo útil de un microscopio óptico oscila entre 500 
y 1 000 veces la apertura numérica del lente objetivo que se utili-
za. Los intentos de ampliar la imagen más allá de este punto pro-
ducen una ampliación vacía y la calidad de la imagen se deteriora. 
Se logra una gran apertura numérica usando lentes con una dis-
tancia focal corta, lo que requiere que el lente se coloque muy 
cerca de la muestra.
Si sustituimos la mínima longitud de onda posible de la ilumi-
nación y la mayor abertura numérica posible en la ecuación ante-
rior, podemos determinar el límite de resolución del microsco-
pio óptico convencional. Cuando se realizan estas sustituciones, 
se obtiene un valor ligeramente inferior a 0.2 μm (o 200 nm), que 
es suficiente para resolver los organelos celulares más grandes, 
como los núcleos y las mitocondrias. Por el contrario, el límite de 
resolución del ojo desnudo, que tiene una apertura numérica 
de unos 0.004, es de aproximadamente 0.1 mm.
Además de estos factores teóricos, la capacidad de resolución 
también se ve afectada por fallos ópticos o aberraciones. Hay siete 
aberraciones importantes, y son las desventajas que deben supe-
rar los fabricantes de lentes para producir los lentes objetivos 
cuyo poder de resolución real se acerque a los límites teóricos. 
Los lentes objetivos están hechos de una serie compleja de len-
tes, en lugar de una sola lente convergente, para eliminar estas 
aberraciones. Una unidad del lente ofrece normalmente la am-
pliación requerida, mientras que las otras compensan los errores 
en el primer lente para proporcionar una imagen general corre-
gida.
c)b)a)
FIGURA 18-3 Ampliación frente a la resolución. La transición desde a) a 
b) proporciona al observador una mayor ampliación y resolución, mientras 
que la transición de b) a c) proporciona sólo incremento de la ampliación 
(ampliación vacía). De hecho, la calidad de la imagen en realidad se dete-
riora a medida que la ampliación vacía aumenta.
Fotorreceptor estimulado
Fotorreceptor no estimulado
FIGURA 18-4 El poder de resolución del ojo. Una ilustración muy esque-
mática de la relación entre la estimulación de los fotorreceptores del indi-
viduo (izquierda) y la escena resultante que uno percibiría (derecha). El 
diagrama ilustra el valor de hacer que la imagen caiga sobre un área sufi-
cientemente grande de la retina.
695
18
.2
 
M
ic
ro
s
c
o
p
ía
 d
e
 c
a
m
p
o
 b
rilla
n
te
 y
 d
e
 c
o
n
tra
s
te
 d
e
 fa
s
e
Visibilidad
En el lado más práctico de la microscopía, además de los límites 
de la resolución, está el tema de la visibilidad, que se refiere a los 
factores que permiten que un objeto sea realmente observado. 
Esto puede parecer una cuestión trivial; si un objeto está allí, debe 
verse. Considere el caso de una gota de vidrio transparente. En 
la mayoría de las condiciones, contra la mayoría de los fondos, la 
gota es claramente visible. Sin embargo, si se cae una gota de vi-
drio en un vaso de aceite de inmersión con el mismo índice de 
refracción que el vidrio, la gota desaparece de la vista porque ya 
no afecta a la luz de ninguna manera obvia que sea diferente del 
fluido del fondo. Cualquiera que haya pasado algún tiempo bus-
cando una ameba puede apreciar el problema de la visibilidad 
cuando usa el microscopio óptico.
Lo que vemos a través de una ventana o un microscopio son 
aquellos objetos que afectan la luz de forma diferente que su fon-
do. Otro término para la visibilidad en este sentido de la palabra 
es el contraste, o la diferencia de aspecto entre las partes adya-
centes de un objeto o entre un objeto y su fondo. La necesidad del 
contraste se puede apreciar al considerar las estrellas. Mientras 
que un cielo nocturno claro puede llenarse de estrellas, el mismo 
cielo durante el día aparece desprovisto de cuerpos celestes. Las 
estrellashan desaparecido de la vista, pero no han desaparecido 
del cielo. Ya no son visibles contra el fondo mucho más brillante.
En el mundo macroscópico, examinamos los objetos haciendo 
que la luz caiga sobre ellos y luego observamos la luz que se refle-
ja en nuestros ojos. En contraste, cuando usamos un microscopio, 
colocamos la muestra entre la fuente de luz y nuestros ojos y ve-
mos la luz que se transmite a través del objeto (o más propiamen-
te, difractada por el objeto). Si tomamos un objeto y entramos a 
una habitación con una fuente de luz, y luego sostenemos el ob-
jeto entre la fuente de luz y nuestro ojo, podremos apreciar parte 
de la dificultad en tal iluminación; se requiere que el objeto exa-
minado sea casi transparente, es decir, translúcido. Ahí radica 
otro aspecto del problema: los objetos “casi transparentes” pue-
den ser difíciles de ver.
Una de las mejores maneras de hacer que un espécimen fino 
y translúcido sea visible bajo el microscopio es teñirlo con un 
tinte que absorbe sólo ciertas longitudes de onda dentro del es-
pectro visible. Las longitudes de onda que no se absorben se 
transmiten al ojo, lo cual hace que el objeto teñido aparezca colo-
reado. Diferentes tintes se unen a diferentes tipos de moléculas 
biológicas y, por tanto, estos procedimientos no sólo aumentan la 
visibilidad de la muestra, sino que también pueden indicar en 
qué parte de las células o tejidos se encuentran diferentes tipos 
de sustancias. Un buen ejemplo es la tinción de Feulgen, que es 
específica para el DNA, lo que favorece la aparición de cromoso-
mas coloreados bajo el microscopio (FIGURA 18-5). Un problema 
con las tinciones es que generalmente no se pueden usar con las 
células vivas; por lo general son tóxicas, así como sus condicio-
nes, o las tinciones no penetran en la membrana plasmática. La 
tinción de Feulgen, por ejemplo, requiere que el tejido se hidroli-
ce en ácido antes de aplicar la tinción.
18.2 Microscopía de campo brillante 
y de contraste de fase
Los diferentes tipos de microscopios ópticos utilizan diferentes 
tipos de iluminación. En un microscopio de campo brillante, el 
cono de luz que ilumina la muestra se ve como un fondo brillante 
contra el cual se debe contrastar la imagen de la muestra. La mi-
croscopía de campo brillante es ideal para muestras de alto con-
traste, como secciones teñidas de tejidos, pero puede no propor-
cionar una visibilidad óptima para otras muestras. En las 
siguientes secciones, consideraremos varios medios para hacer 
que las muestras sean más visibles en un microscopio óptico.
Microscopio óptico de campo brillante
Las muestras que se observarán con el microscopio óptico se di-
viden ampliamente en dos categorías: fijaciones enteras y por 
secciones. Una fijación entera es un objeto intacto, vivo o muer-
to, que puede consistir en un organismo microscópico entero, 
como un protozoo o una pequeña parte de un organismo más 
grande. La mayoría de los tejidos de las plantas y los animales son 
demasiado opacos para el análisis microscópico a menos que se 
examinen como un corte o sección muy delgada. Para preparar 
una sección, primero se mueren las células sumergiendo el teji-
do en una solución química, llamada fijador. Un buen fijador 
penetra rápidamente en la membrana celular e inmoviliza todo su 
material macromolecular de modo que la estructura de la célula 
se mantenga lo más cerca posible del estado vivo. Los fijadores 
más comunes para el microscopio óptico son soluciones de for-
maldehído, alcohol o ácido acético.
Después de la fijación, el tejido se deshidrata por transferen-
cia a través de una serie de alcoholes y, generalmente, luego se 
incorpora en la parafina (cera), que proporciona el soporte mecá-
nico durante el corte. La parafina se utiliza como medio de inclu-
sión porque se disuelve fácilmente con los disolventes orgánicos. 
Los portaobjetos que contienen las secciones de parafina adhe-
rentes se sumergen en tolueno, que disuelve la cera, dejando la 
porción delgada de tejido unida al portaobjetos, donde se puede 
teñir o tratar con los anticuerpos u otros agentes. Después de la 
tinción, se monta un cubreobjetos sobre el tejido utilizando un 
medio de montaje que tiene el mismo índice de refracción que el 
portaobjetos de vidrio y el cubreobjetos.
Microscopio de contraste de fase
Las muestras pequeñas y no teñidas, como una célula viva, pue-
den ser muy difíciles de ver con un microscopio de campo brillan-
te (FIGURA 18-6a). El microscopio de contraste de fase hace 
que los objetos altamente transparentes sean más visibles (figura 
18-6b). Podemos distinguir diferentes partes de un objeto porque 
afectan a la luz de manera diferente entre sí. Una base para tales 
diferencias es el índice de refracción. Los orgánulos celulares es-
tán formados por diferentes proporciones de varias molécu- 
las: DNA, RNA, proteína, lípidos, carbohidratos, sales y agua. Las 
regiones de composición diferente probablemente tengan dife-
rentes índices de refracción. Normalmente, tales diferencias no 
FIGURA 18-5 La tinción de Feulgen. Este procedimiento de tinción es es-
pecífico para el DNA tal como lo indica la localización del tinte en los cro-
mosomas de esta célula de la raíz de la cebolla que estaba en la metafase 
de la mitosis en el momento en que se fijó. 
FUENTE: Ed Reschke.
C
A
P
ÍT
U
L
O
 18
 
T
é
c
n
ic
a
s
 e
n
 b
io
lo
g
ía
 m
o
le
c
u
la
r y
 c
e
lu
la
r
696
pueden ser detectadas por nuestros ojos. Sin embargo, el micros-
copio de contraste de fase convierte las diferencias en el índice de 
refracción en diferencias de intensidad (brillo relativo y oscuri-
dad), que son visibles para el ojo. Los microscopios de constraste 
de fase logran este resultado 1) separando la luz directa que in-
gresa al lente objetivo de la luz difractada, la cual emana de la 
muestra y 2) provoca que los rayos de luz de estas dos fuentes 
interfieran entre sí. El brillo relativo o la oscuridad de cada parte 
de la imagen refleja la forma en que la luz de esa parte de la 
muestra interfiere con la luz directa.
Los microscopios de contraste de fase son más útiles para exa-
minar componentes intracelulares de células vivas a una resolu-
ción relativamente alta. Por ejemplo, la motilidad dinámica de las 
mitocondrias, los cromosomas mitóticos y las vacuolas se puede 
seguir y registrar con estas ópticas. Simplemente observar la for-
ma en que las partículas diminutas y las vacuolas de las células se 
golpean de forma aleatoria en una célula viva transmite una exci-
tación sobre la vida que es inalcanzable al observar las células 
muertas y teñidas. El mayor beneficio derivado de la invención 
del microscopio de constraste de fase no ha estado en el descubri-
miento de nuevas estructuras, sino en su uso diario en los labora-
torios de investigación y docencia para observar las células de 
una manera más reveladora.
El microscopio de contraste de fase tiene desventajas ópticas 
que resultan en la disminución de la resolución, y la imagen sufre 
de halos y sombreados que se producen cuando existen cambios 
bruscos en el índice de refracción. El microscopio de constraste 
de fase es un tipo de microscopio de interferencia. Otros tipos de 
microscopios de interferencia minimizan estos artefactos ópticos 
al lograr una separación completa de los haces directos y difrac-
tados utilizando caminos para la luz y prismas complejos. Otro 
tipo de sistema de interferencia, llamado contraste de interferencia 
diferencial (DIC, differential interference contrast), o a veces interfe-
rencia de Nomarski por su desarrollador, entrega una imagen que 
tiene una aparente calidad tridimensional (figura 18-6c). El con-
traste en la microscopía DIC depende de la tasa de cambio del 
índice de refracción en una muestra. Como consecuencia, los bor-
des de las estructuras, donde el índice de refracción varía en una 
distancia relativamente pequeña, se ven con un contraste espe-
cialmente bueno.
18.3 Microscopía de fluorescencia 
(y técnicasrelacionadas basadas 
en la fluorescencia)
En las últimas décadas, el microscopio óptico se ha transformado 
de un instrumento diseñado principalmente para examinar sec-
ciones de tejidos fijos a uno capaz de observar los eventos dinámi-
cos que ocurren a nivel molecular en las células vivas. Estos avan-
ces en la formación de imágenes de las células vivas han sido 
posibles, en gran medida, gracias a las innovaciones en la micros-
copía de fluorescencia. El microscopio de fluorescencia permite a los 
espectadores observar la ubicación de ciertas moléculas (llamadas 
fluoróforos). Los fluoróforos absorben fotones de una longitud de 
onda específica y liberan una parte de la energía en longitudes 
de ondas más largas, un fenómeno llamado fluorescencia. La fuen-
te de luz en un microscopio de fluorescencia produce un haz de 
luz que viaja a través de un filtro, que bloquea todas las longitudes 
de onda, excepto aquellas capaces de excitar el fluoróforo. El haz 
de luz monocromática se enfoca en la muestra que contiene el 
fluoróforo, que se excita y emite luz de una longitud de onda visi-
ble enfocada por el lente objetivo en una imagen que puede ser 
vista por el espectador o capturada digitalmente usando un dispo-
sitivo de carga acoplada (CCD, charge-coupled device).
Hay muchas formas diferentes en que las moléculas fluores-
centes pueden usarse en biología celular y molecular. En una de 
sus aplicaciones más comunes y antiguas, un fluoróforo orgánico 
relativamente pequeño (como la rodamina o la fluoresceína) se 
une de forma covalente (conjugado) a un anticuerpo para producir 
otro fluorescente que se puede usar para determinar la ubicación 
de una proteína específica dentro de la célula. Esta técnica se lla-
ma inmunofluorescencia y se ilustra mediante una micrografía en la 
figura 9.5. La inmunofluorescencia se analiza con más detalle en 
la sección 18.26. Las proteínas marcadas fluorescentemente tam-
bién pueden usarse para estudiar procesos dinámicos tal como 
ocurren en una célula viva. Por ejemplo, un fluoróforo se puede 
unir a una proteína celular, como actina o tubulina, y la proteína 
marcada fluorescente se inyecta en una célula viva (como en la 
figura 9.20). Los fluoróforos también se pueden usar para localizar 
las moléculas de DNA o RNA que contienen secuencias de nu-
cleótidos específicas como se ilustra en la figura 10.20. En otros 
ejemplos, los fluoróforos se han utilizado para estudiar los tama-
FIGURA 18-6 Una comparación de las células vistas con diferentes ti-
pos de microscopios ópticos. Micrografías ópticas de un protista ciliado 
como se observa bajo la óptica de campo brillante a), contraste de fase b) 
y contraste de interferencia diferencial (DIC, differential interference con-
trast) (o Nomarski) c). El organismo es apenas visible bajo la iluminación 
del campo brillante, pero se ve claramente bajo contraste de fase y mi-
croscopía DIC.
FUENTE: (a-c) Micrografías de M. I. Walker/Photo Researchers, Inc.
c)
a)
b)
18
.3
 
M
ic
ro
s
c
o
p
ía
 d
e
 flu
o
re
s
c
e
n
c
ia
 (y
 té
c
n
ic
a
s
 re
la
c
io
n
a
d
a
s
 b
a
s
a
d
a
s
 e
n
 la
 flu
o
re
s
c
e
n
c
ia
) 
697ños de las moléculas que pueden pasar entre las células (véase la 
figura 7.30), como indicadores del potencial transmembrana (véa-
se la figura 5.21) o como sondas para determinar la concentra- 
ción de Ca2+ libre en el citosol (véase la figura 15.27). El uso de los 
fluoróforos sensibles al calcio se discute en la página 614.
En todos los ejemplos discutidos en el párrafo anterior, las 
biomoléculas se han vuelto fluorescentes al conjugarlas química-
mente con un fluoróforo sintético. Pero también hay moléculas 
fluorescentes de forma natural. Los humanos probablemente se 
hayan preguntado por miles de años por qué las medusas y algu-
nos otros organismos marinos brillan en la oscuridad. No fue 
hasta principios de la década de 1960 que Osamu Shimomura 
descubrió que cierta especie de medusa (Aequorea victoria) debe 
su carácter luminiscente a la presencia de proteínas fluorescen-
tes, como la aequorina y la proteína verde fluorescente (GFP, green 
fluorescent protein), que fue capaz de purificar y analizar. A prin-
cipios de la década de 1990, Douglas Prasher, Martin Chalfie y 
sus colegas clonaron el gen que codifica la GFP y mostraron que 
la proteína fluorescente podría incorporarse genéticamente y ex-
presarse en otro organismo. Este estudio preparó el escenario 
para el uso de la GFP en el estudio de la distribución espacial y 
temporal de las proteínas en las células vivas. A diferencia de la 
mayoría de las otras proteínas fluorescentes, GFP no requiere un 
cofactor adicional para absorber y emitir la luz; en su lugar, el 
cromóforo absorbente emisor de la luz se forma por automodifi-
cación (es decir, mediante una reacción autocatalítica) de tres de 
los aminoácidos que componen la estructura primaria del poli-
péptido GFP. En la mayoría de los estudios que emplean GFP, se 
construye un DNA recombinante en el que la región codificante 
del gen GFP se une a la región codificante del gen para la proteí-
na en estudio. Este DNA recombinante se usa para transfectar las 
células, que luego sintetizan una proteína quimérica que contiene 
la GFP fluorescente fusionada a la proteína en estudio. El uso de 
la GFP para estudiar el tránsito a través de la membrana se anali-
za en la sección 8.2. En estos diversos protocolos experimentales, 
las proteínas marcadas participan en las actividades normales de 
la célula, y su ubicación puede seguirse microscópicamente para 
revelar las actividades dinámicas en las que participa la proteína 
(véanse las figuras 8.4 y 9.22).
El estudio de la imagen de la célula viva a menudo puede ser 
más informativo mediante el uso simultáneo de variantes de GFP 
que exhiben diferentes propiedades espectrales. Las variantes de 
la GFP que fluorescen en tonos de azul (BFP, blue FP), amarillo 
(YFP, yellow FP) y cian (CFP, cyan FP) fueron generadas por Roger 
Tsien de la Universidad de California, San Diego, a través de la 
mutagénesis dirigida del gen GFP. Además, una proteína te-
tramérica fluorescente roja con una relación distante (DsRed) ha 
sido aislada de una anémona de mar. Las variantes monoméricas 
de DsRed (por ejemplo, mBanana, mTangerine y mOrange), que 
emiten fluorescencia en una variedad de colores distinguibles, 
también se han generado mediante experimentos de mutagénesis 
en el laboratorio de Tsien. El tipo de información que se puede 
obtener utilizando esta colorida “paleta” de variantes de GFP se 
ilustra mediante el estudio representado en la FIGURA 18-7, en el 
que los investigadores generaron cepas de ratones cuyas neuro-
nas contenían proteínas fluorescentes de diferentes colores. 
Cuando un músculo de uno de estos ratones se expuso quirúrgi-
camente, los investigadores pudieron observar las interacciones 
dinámicas entre las neuronas de diversos colores y las uniones 
neuromusculares que están inervadas (consúltese la figura 4.56 
para ver un dibujo de este tipo de unión). Observaron, por ejem-
plo, como ramas de una neurona coloreada con CFP compitieron 
con ramas de una neurona coloreada con YFP para el contacto 
sináptico con el tejido muscular. En cada caso, encontraron que, 
cuando dos neuronas compiten por la inervación de diferentes 
fibras musculares, todas las ramas “ganadoras” pertenecen a una 
de las neuronas, mientras que todas las ramas “perdedoras” per-
tenecen a la otra neurona (figura 18-7b). Las micrografías en la 
FIGURA 18-8 proporcionan otro ejemplo de cuánto se puede 
aprender sobre la dinámica espacial y temporal de los eventos 
celulares usando dos (o más) proteínas fluorescentes espectral-
mente distintas. En este caso, la estrategia de marca dual ha per-
mitido a los investigadores seguir los movimientos simultáneos 
de dos proteínas diferentes en tiempo real a medida que ocurren 
dentro de los límites de un solo orgánulo celular. Otro ejemplo se 
describe en las vías experimentales en la sección8.18.
Las variantes de GFP también han sido útiles en una técnica, 
llamada transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (o 
Förster) (FRET, fluorescence (or Förster) resonance energy transfer), 
que puede medir las distancias entre los fluoróforos en el rango de 
la nanoescala. Por lo general, la FRET se emplea para medir los 
cambios en la distancia entre dos partes de una proteína (o entre 
dos proteínas separadas dentro de una estructura más grande). La 
FRET puede usarse para estudiar dichos cambios a medida que 
ocurren in vitro o dentro de una célula viva. La FRET se basa en el 
hecho de que la energía de excitación se puede transferir de un 
grupo fluorescente (un donante) a otro grupo fluorescente (un 
aceptor), siempre que los dos grupos estén muy cerca (de 1 a 10 
nm). Esta transferencia de energía reduce la intensidad de la fluo-
rescencia del donante y aumenta la intensidad de la fluorescencia 
del aceptor. La eficiencia de la transferencia entre dos grupos fluo-
rescentes que se unen en sitios estratégicos en una proteína dismi-
nuye de forma brusca a medida que aumenta la distancia entre los 
dos grupos. Como resultado, la determinación de los cambios en 
la fluorescencia de los grupos donadores y aceptores que se pro-
duce durante un proceso celular proporciona una medida de los 
cambios en la distancia entre ellos en diversas etapas del proceso. 
Esta técnica se ilustra en la FIGURA 18-9, donde dos variantes di-
ferentes de GFP (marcadas como ECFP y EYFP) se han unido co-
valentemente a dos partes diferentes de una proteína cinasa de-
pendiente de cGMP (PKG, cGMP-dependent protein kinase). En 
ausencia del cGMP unido, los dos fluoróforos están demasiado 
separados para que se produzca la transferencia de energía. La 
unión del cGMP induce un cambio conformacional en la proteína 
que lleva a los dos fluoróforos lo suficientemente cerca para que 
FIGURA 18-7 Uso de variantes de GFP para seguir las interacciones di-
námicas entre las neuronas y sus células blanco in vivo. a) Una porción 
del cerebro de un ratón con dos neuronas fluorescentes de colores dife-
rentes. Estos ratones se generan al aparearse animales transgénicos cu-
yas neuronas están marcadas con una u otra proteína fluorescente. b) 
Microfotografía de fluorescencia de partes de dos neuronas, una etiqueta-
da con YFP y la otra con CFP. Las flechas indican dos uniones neuromus-
culares diferentes en dos fibras musculares diferentes en las que la rama 
axonal marcada con YFP ha superado a la rama marcada con CFP. La ter-
cera unión está inervada por el axón marcado con CFP en ausencia de 
competencia. 
FUENTE: a) Cortesía de N. Kasthuri y J. W. Lichtman, Facultad de Medicina 
de la Universidad de Washington; b) De N. Kasthuri y Jeff W. Lichtman, 
Nature 424: 429, 2003, Fig. 4A. Reimpreso con permiso de Macmillan 
Publishers Ltd.
b)a)
C
A
P
ÍT
U
L
O
 18
 
T
é
c
n
ic
a
s
 e
n
 b
io
lo
g
ía
 m
o
le
c
u
la
r y
 c
e
lu
la
r
698
revelar los cambios en los niveles de cAMP después de la unión de 
un neurotransmisor con su receptor de superficie. 
Después de un periodo de excitación por una fuente de luz, la 
mayoría de los fluoróforos alcanzan un estado en el que ya no 
pueden emitir fluorescencia, esto es, que ellos experimentan un 
fotoblanqueo. Si bien en ocasiones esto se considera una desven-
taja para muchos experimentos, el fotoblanqueo ha demostrado 
ser útil para una técnica conocida como recuperación de la fluo-
rescencia después del fotoblanqueo (FRAP, fluorescence recovery 
after photobleaching). FRAP se utiliza para estudiar la tasa de re-
cambio proteico en las células vivas, y fue analizada junto con el 
movimiento de las proteínas de la membrana (figura 4.27). FRAP 
también se ha utilizado ampliamente para estudiar el recambio 
de la proteína en el citoesqueleto. Para llevar a cabo un experi-
mento FRAP centrado en la tubulina, una célula se inyecta con 
tubulina acoplada a un colorante fluorescente o se induce para 
que exprese GFP-tubulina. Usando un microscopio equipado con 
un láser que se puede enfocar en una pequeña región de la célula, 
la fluorescencia de la tubulina en esa región se blanquea con el 
rayo láser (FIGURA 18-10). Luego es posible seguir la muestra a lo 
largo del tiempo y medir la recuperación de la señal fluorescente 
en la zona decolorada (figura 18-10).
Otra innovación en la microscopía de fluorescencia ha sido el 
desarrollo de software que se puede utilizar para examinar gran-
des cantidades de imágenes y calificarlas para diversas caracterís-
ticas. Estas tecnologías automatizadas han sido particularmente 
útiles para el estudio de los fenotipos de células que han sido so-
metidas a una biblioteca de diferentes siRNA, buscando genes 
que codifiquen las proteínas que están involucradas en un proce-
so celular particular, como el transporte a través de las membra-
nas (sección 8.2) o la mitosis (figura 18-51). Además, el software 
también se ha desarrollado para rastrear el movimiento de las 
proteínas fluorescentes en las células vivas identificando y “si-
guiendo” de forma automática una mancha fluorescente específi-
ca que aparece en numerosas estructuras en las series de tiempo. 
Otra innovación reciente en la microscopía de fluorescencia 
cae bajo el título de microscopía multifotónica, en la que los fluo-
róforos presentes en las células se excitan mediante la absorción 
simultánea de dos o más fotones de longitud de onda más larga. 
Cuanto más larga sea la longitud de onda del fotón, menos su 
energía (que hace que sea menos destructivo para las células ilu-
minadas y para el fluoróforo absorbente) y mayor es su poder de 
penetración. Usando la microscopía multifotónica, los investiga-
FIGURA 18-8 Uso de la fluorescencia de do-
ble marcador para seguir los eventos dinámi-
cos dentro de los orgánulos de las células vi-
vas. Las cisternas de Golgi de una célula de 
levadura en ciernes no están organizadas en 
pilas distintas como en la mayoría de las célu-
las eucariotas, sino que están dispersas dentro 
del citoplasma. Cada una de las estructuras 
ovales de colores brillantes es una cisterna in-
dividual cuyo color se debe a la localización 
de las moléculas proteicas marcadas fluores-
centemente. Una cisterna que parece verde 
contiene una proteína marcada con GFP (Vrg4) 
involucrada en las primeras actividades de 
Golgi, mientras que una cisterna que parece 
roja contiene una proteína marcada con DsRed 
(Sec7) involucrada en las actividades tardías 
de Golgi. Esta serie de micrografías revela la 
composición proteica de las cisternas indivi-
duales durante un periodo de aproximadamen-
te 13 minutos (el tiempo transcurrido se indica 
en la esquina inferior izquierda). La punta de 
flecha blanca y la flecha blanca señalan dos de 
estas cisternas a lo largo del tiempo. Estas dos 
cisternas se muestran por sí mismas en las fi-
las inferiores de las micrografías. Se puede ob-
servar a partir de esta serie que la composi-
ción proteica de una cisterna individual cambia 
con el tiempo de una que contiene proteínas 
“tempranas” de Golgi (verde) a una que contiene proteínas “tardías” de 
Golgi (roja). Estos hallazgos proporcionan soporte visual directo para el 
modelo de maduración cisternal discutido en la sección 8.8. 
FUENTE: De Eugene Losev et al., Cortesía de Benjamin S. Glick, Nature 441: 
1004, 2006, Fig. 3A. Reimpreso con permiso de Macmillan Publishers Ltd.
FIGURA 18-9 Transferencia de energía de resonancia de la fluorescen-
cia (FRET, fluorescence resonance energy transfer). Este diagrama es-
quemático muestra un ejemplo del uso de la tecnología FRET para seguir 
el cambio en la conformación de una proteína (PKG) después de la unión 
a cGMP. Las dos pequeñas proteínas fluorescentes en forma de barril, 
CFP mejorado (ECFP, enhanced CFP) y YFP mejorado (EYFP, enhanced 
YFP), se muestran en su color fluorescente. En ausencia de cGMP, la exci-
tación de ECFP con luz de 440 nm conduce a la emisión de luz de 480 
nm de la proteína fluorescente.Después de la unión a cGMP, un cambio 
conformacional en PKG pone a las dos proteínas fluorescentes lo suficien-
temente cerca para que ocurra la FRET. Como resultado, la excitación del 
donante de ECFP con luz de 440 nm conduce a la transferencia de ener-
gía al aceptador de EYFP y a la emisión de luz de 535 nm del aceptador. 
Las versiones mejoradas de estas proteínas tienen una mayor intensidad 
de fluorescencia y tienden a ser más estables que las moléculas de pro-
teína originales. 
FUENTE: De Moritoshi Sato y Yoshio Umezawa, Analytical Chemistry 72: 
5924, 2000. © 2000 American Chemical Society.
ocurra la FRET, que también se puede usar para seguir muchos 
otros procesos, incluido el plegamiento de las proteínas o la aso-
ciación y disociación de los componentes dentro de una membra-
na. La separación de las colas citoplásmicas de las subunidades de 
integrina después de la activación por talina (figura 7.13) es un 
ejemplo de un evento que ha sido estudiado por la FRET. La figu-
ra 15.8 muestra un ejemplo inicial en el que se utilizó FRET para 
440 nm
440 nm480 nm
+ 2 cGMP
– 2 cGMPPKG
EYFP EYFP 535 nm
ECFP
CatCat
R�1–47 R
�
1–
47
FRET
PKG
ECFP cGMP
18
.3
 
M
ic
ro
s
c
o
p
ía
 d
e
 flu
o
re
s
c
e
n
c
ia
 (y
 té
c
n
ic
a
s
 re
la
c
io
n
a
d
a
s
 b
a
s
a
d
a
s
 e
n
 la
 flu
o
re
s
c
e
n
c
ia
) 
699
dores pueden rastrear los movimientos de las proteínas fluores-
centes que están presentes al menos a 200 μm de profundidad 
dentro de un tejido vivo. Un ejemplo del uso de este enfoque se 
puede ver en la figura 17.11, donde se observan las células inmu-
nes marcadas con fluorescencia a medida que se mueven dentro 
de un ganglio linfático extirpado.
Microscopía confocal de escaneo láser
El uso de las cámaras digitales y el procesamiento de las imágenes 
en las computadoras ha llevado a un renacimiento del microsco-
pio óptico en las últimas dos décadas. También lo ha hecho el 
desarrollo de un nuevo tipo de microscopio óptico. Cuando una 
célula completa o una sección de un órgano se examina con un 
microscopio óptico estándar, se observa la muestra a diferentes 
profundidades al cambiar la posición del lente objetivo girando 
la perilla de enfoque. Cuando se hace esto, diferentes partes de la 
muestra entran y salen del foco. Pero el hecho de que la muestra 
contenga diferentes niveles de enfoque reduce la capacidad de 
formar una imagen nítida, porque esas partes de la muestra que 
están encima y debajo del plano de enfoque interfieren con los 
rayos de luz de esa parte que se encuentra en el plano del enfo-
que. A finales de la década de 1950, Marvin Minsky, del Instituto 
de Tecnología de Massachusetts, inventó un nuevo instrumento 
revolucionario llamado microscopio confocal que produce una 
imagen de un plano delgado situado dentro de un espécimen mu-
cho más grueso. En la FIGURA 18-11a) se muestra un diagrama 
esquemático de los componentes ópticos y las trayectorias de la 
luz dentro de una versión moderna de un microscopio confocal de 
barrido láser. En este tipo de microscopio, la muestra se ilumina 
con un rayo láser finamente enfocado que escanea rápidamente a 
través de esta y a una profundidad única, iluminando sólo un 
plano delgado (o “sección óptica”) dentro de la misma. Como se 
indica en la figura 18-11a), se usan microscopios confocales con 
óptica de fluorescencia. Como se describió anteriormente, la luz 
incidente de onda corta es absorbida por los fluoróforos en una 
muestra y reemitida a una longitud de onda más larga. La luz 
emitida por la muestra se enfoca en un sitio dentro del microsco-
pio que contiene una abertura estenopeica. Por tanto, la apertura 
y el plano iluminado en la muestra son confocales. Los rayos de 
luz emitidos desde el plano iluminado de la muestra pueden pa-
sar a través de la abertura, mientras que cualquier luz que pueda 
emanar desde arriba o desde abajo de este plano no puede parti-
cipar en la formación de la imagen. Como resultado, puntos fuera 
del foco en la muestra se vuelven invisibles.
La figura 18-11b) contiene las micrografías de un núcleo de 
célula única tomada en tres planos diferentes dentro de la mues-
tra. Es evidente que los objetos que salen del plano de enfoque 
tienen poco efecto sobre la calidad de la imagen de cada sección. 
Si lo desea, las imágenes de secciones ópticas separadas se pue-
den almacenar en una computadora y fusionarse entre sí para 
reconstruir un modelo tridimensional del objeto completo.
Microscopía de fluorescencia 
de súper resolución
En 2014, Eric Betzig, W.E. Moerner y Stefan Hell recibieron el 
Premio Nobel de Química por el desarrollo de la microscopía de 
Preblanqueo Posblanqueo = 0 seg
t = 300 seg t = 500 seg
c)
b)a)
Preblanqueo Blanqueador
Blanqueador t = 0 seg
Posblanqueador, t = 300 seg
Posblanqueador, t = 500 seg Recuperación mediante translocación
de microtúbulos
Recuperación a través
de nuevos microtúbulos
Recuperación a través de la
dinámica de los microtúbulos
FIGURA 18-10 El estudio del citoesqueleto usando FRAP. a) Una célula 
que expresa GFP-tubulina incorpora la tubulina fluorescente en su matriz 
de microtúbulos. Cuando un láser se enfoca en un cuadro de la matriz, la 
fluorescencia se blanquea (t = 0 seg). Con el tiempo, la fluorescencia se 
recupera en la zona decolorada. b) La recuperación de la fluorescencia 
puede provenir de diferentes propiedades de los microtúbulos. Es muy 
probable que las propiedades dinámicas de los microtúbulos contribuyan 
a la recuperación de la fluorescencia. Alternativamente, si los nuevos mi-
crotúbulos fluorescentes crecen desde el centrosoma, pueden crecer ha-
cia la zona decolorada. Finalmente, es posible que un microtúbulo de 
translocación fluorescente pueda moverse a través de la zona decolorada 
y verse allí en el momento de la observación. c) Micrografías de un experi-
mento FRAP realizado en células interfásicas (que no se dividen) que ex-
presan GFP-tubulina. Dos células de lado a lado se blanquearon en la re-
gión en cuadro con un láser, y se obtuvieron imágenes de las células a lo 
largo del tiempo. La señal de la fluorescencia en la región blanqueada se 
recupera durante el transcurso del experimento. 
FUENTE: Cortesía de Claire Walczaw y Rania Rizk.
C
A
P
ÍT
U
L
O
 18
 
T
é
c
n
ic
a
s
 e
n
 b
io
lo
g
ía
 m
o
le
c
u
la
r y
 c
e
lu
la
r
700
fluorescencia de súper resolución. Se señaló en la sección 18.1 
que el límite de resolución del microscopio óptico es de aproxi-
madamente 200 nm debido a las propiedades de difracción de la 
luz. Durante la última década, se han desarrollado varias técnicas 
ópticas complejas que permiten a los investigadores localizar las 
proteínas marcadas fluorescentemente a resoluciones en las dece-
nas de nanómetros. Varias de estas técnicas de súper resolución 
se basan en el descubrimiento de que una cierta mutación del 
polipéptido GFP convierte la proteína en una molécula fotoacti-
vable (PA-GFP, photoactivatable-GFP). Esta GFP mutante perma-
nece esencialmente no fluorescente hasta que se activa con luz 
violeta. Estudios posteriores han ampliado el número de proteí-
nas fluorescentes fotoactivables disponibles y han llegado al de-
sarrollo de proteínas fotoconmutables, cuya emisión de fluores-
cencia a una longitud de onda particular puede encenderse y 
apagarse con pulsos de luz. Consideraremos brevemente sólo una 
de las técnicas de súper resolución, llamada STORM (stochastic 
optical reconstruction microscopy: microscopía de reconstrucción 
óptica estocástica), que utiliza proteínas fluorescentes fotocon-
mutables. STORM permite a los investigadores localizar una sola 
molécula fluorescente dentro de una resolución de menos de 20 
nm. En esta técnica, una muestra que contiene uno o más fluoró-
foros fotoconmutables se ilumina con pulsos de luz de longitudes 
de onda apropiadas, lo que tiene el efecto de activar y desactivar 
la fluorescencia de las moléculas marcadas. Durante cada ciclo de 
iluminación, la mayoría de las moléculasmarcadas permanecen 
oscuras, pero una pequeña fracción de ellas se activan al azar. 
Estas moléculas fluorescentes activadas individuales aparecen co-
mo manchas que, debido a las propiedades de difracción de la 
luz, tienen varios cientos de nanómetros de ancho. El centro de 
cada punto, que representa la ubicación real del único fluoróforo 
responsable de emitir la luz, se puede determinar con gran preci-
sión. Este proceso se repite para varios ciclos de imágenes, pro-
duciendo una gran cantidad de coordenadas que representan las 
ubicaciones de muchos de los fluoróforos en la muestra. El análi-
sis de estas coordenadas permite a los investigadores reconstruir 
una imagen de súper resolución del campo de visión. El marcado 
aumento en la resolución que se puede lograr con la técnica de 
súper resolución STORM frente a la de una técnica de fluorescen-
cia convencional es evidente comparando la imagen de la FIGURA 
18-12a) con las de las figuras 18-12b y c).
Microscopía de fluorescencia 
mediante hoja de luz
En los últimos años, la microscopía de fluorescencia mediante 
hoja de luz ha ganado popularidad como una técnica que permite 
la obtención de imágenes no invasivas de muestras tridimensio-
nales grandes, a menudo de embriones enteros u organismos 
como el pez cebra, durante largos periodos. En este método, un 
láser de excitación se enfoca en una lámina delgada y plana que 
ilumina la muestra a lo largo de un plano perpendicular al ángulo 
de observación. Esto permite la excitación de los fluoróforos sólo 
a la profundidad observada sobre un plano completo (en lugar de 
sólo en un punto, como en imágenes confocales), dando como 
resultado una disminución del fotodaño y una mayor velocidad 
de adquisición de las imágenes.
En 2014, Eric Betzig y otros anunciaron una nueva técnica, 
llamada microscopía de hoja de luz de celosía, que ilumina las 
muestras utilizando múltiples hojas de luz ultrafinas, que permi-
FIGURA 18-11 Microscopía de fluorescencia confocal de barrido láser. a) 
Las trayectorias de luz en un microscopio de fluorescencia confocal. La 
luz de la longitud de onda corta (azul) es emitida por una fuente de láser, 
pasa a través de una pequeña abertura y se refleja en un espejo dicroico 
(un tipo de espejo que refleja ciertas longitudes de onda y transmite a 
otros) en un objetivo y se enfoca en un punto del plano de la muestra. Los 
fluoróforos en la muestra absorben la luz incidente y emiten luz de mayor 
longitud de onda, que puede pasar a través del espejo dicroico y enfocar-
se en un plano que contiene una abertura estenopeica. La luz luego pasa 
a un tubo fotomultiplicador que amplifica la señal y se transmite a una 
computadora que forma una imagen procesada y digitalizada. Se evita 
que los rayos de luz que se emitan desde arriba o debajo del plano óptico 
en la muestra pasen a través de la abertura estenopeica y, por tanto, no 
contribuyen a la formación de la imagen. Este diagrama muestra la ilumi-
nación de una sola mancha en la muestra. Diferentes sitios dentro de este 
plano se iluminan por medio de un proceso de escaneo láser. El diámetro 
de la abertura estenopeica es ajustable. Cuanto menor es la apertura, más 
delgada es la sección óptica y mayor es la resolución, pero la señal es 
menos intensa. b) Micrografías de fluorescencia confocal de tres seccio-
nes ópticas separadas, cada una de 0.3 μm de espesor, de un núcleo de 
levadura teñido con dos anticuerpos diferentes marcados fluorescente-
mente. El anticuerpo fluorescente rojo ha teñido el DNA dentro del nú-
cleo, y el anticuerpo fluorescente verde ha teñido una proteína de unión 
de los telómeros que se localiza en la periferia del núcleo.
FUENTE: a, b) De Thierry Laroche y Susan M. Gasser, Cell 75: 543, 1993, 
Cell by Cell Press. Reproducido con permiso de Cell Press en el formato 
de reutilización en un libro/libro de texto a través de Copyright Clearance 
Center y con el permiso de Elsevier.
b)
Abertura iluminadora
Abertura estenopeica
Espejo dicroico
Plano focal
a)
Muestra
Lente objetivo
Computadora
Fotomultiplicador
Laser
18
.4
 
M
ic
ro
s
c
o
p
ía
 e
le
c
tró
n
ic
a
 d
e
 tra
n
s
m
is
ió
n
701
ten la generación de imágenes en 3D de una muestra biológica 
viva durante largos periodos con una alta resolución espacio tem-
poral con un mínimo de fotoblanqueo y fotodaño (FIGURA 18-13). 
Por ejemplo, esta técnica permite a los investigadores visualizar la 
localización subcelular de una proteína de interés en un embrión 
de mosca o de gusano en intervalos de subsegundos. La capaci-
dad de recopilar imágenes de alta resolución en 4D (tres dimen-
siones y el tiempo) ya ha dado lugar a numerosas observaciones 
novedosas en una variedad de sistemas. Con un desarrollo conti-
nuo y un uso más generalizado, se anticipa ampliamente que la 
microscopía de hoja de luz de celosía proporcionará numerosos 
conocimientos sobre cómo los procesos moleculares dinámicos 
ocurren en las células vivas.
18.4 Microscopía electrónica 
de transmisión
Las micrografías electrónicas que se muestran en este texto fue-
ron tomadas por dos tipos diferentes de microscopios electróni-
cos. Los microscopios electrónicos de transmisión (TEMs, transmis-
sion electron microscopes) forman imágenes que usan electrones 
que se transmiten a través de una muestra, mientras que los mi-
croscopios electrónicos de barrido (SEMs, scanning electron microsco-
pes) utilizan electrones que rebotan en la superficie de la muestra. 
Todos los comentarios en esta sección del capítulo se refieren al 
uso del TEM; el SEM se discute por separado en la sección 18.6.
El microscopio electrónico de transmisión puede proporcio-
nar una resolución mucho mayor que el microscopio de luz. Esto 
se ilustra fácilmente comparando las dos fotos en la FIGURA 18-14, 
que muestran las imágenes de las secciones adyacentes del mis-
mo tejido con el mismo aumento usando una luz o un microsco-
pio electrónico. Aunque la foto en la figura 18-14a) está cerca del 
límite de resolución del microscopio de luz, la foto en la figura 
18-14b) es una micrografía electrónica de muy baja potencia. El 
gran poder de resolución del microscopio electrónico deriva de 
las propiedades de onda de los electrones. Como se indica en la 
ecuación de la sección 18.1, el límite de resolución de un micros-
copio es directamente proporcional a la longitud de onda de la 
luz iluminadora: cuanto más larga es la longitud de onda, más 
pobre es la resolución. A diferencia de un fotón de luz, que tiene 
una longitud de onda constante, la longitud de onda de un elec-
trón varía con la velocidad a la que viaja la partícula, que a su vez 
depende de la tensión de aceleración aplicada en el microscopio. 
Esta relación está definida por la ecuación
donde � es la longitud de onda en angstroms y V es el voltaje de 
aceleración en voltios. Los TEM estándar operan con un rango de 
voltaje de 10 000 a 100 000 V. A 60 000 V, la longitud de onda de 
un electrón es de aproximadamente 0.05 Å. Si esta longitud de 
onda y la apertura numérica alcanzable con el microscopio óptico 
FIGURA 18-12 Rompiendo el límite de resolución del microscopio de luz. a) Una micrografía de fluorescencia convencional de una porción de una célu-
la de mamífero cultivada con microtúbulos marcados en las fosas recubiertas con clatrina verde y en rojo. Con este alto nivel de ampliación, la imagen 
aparece pixelada. Además, la superposición entre las dos marcas fluorescentes produce un color naranja, lo que sugiere que las dos estructuras están in-
terconectadas. b) Una micrografía de STORM de “súper resolución” de un campo similar que muestra los microtúbulos y las fosas recubiertas de clatrina 
claramente resueltas y separadas espacialmente entre sí. (c) Una vista ampliada de una porción de la parte b. (La discusión de esta y otras técnicas de sú-
per resolución se pueden encontrar en Nature 459: 638, 2009; Ann. Rev. Biochem. 78: 993, 2009; Cell 143: 1047, 2010; J. Cell Biol. 190: 165, 2010; y J. 
Cell Sci. 124:1607, 2011).
FUENTE: De Mark Bates et. al., Cortesía de Xiaowei Zhuang, Science 317:1752, 2007; © 2007. Reproducido con permiso de AAAS.
a)
)
Clatrina
Microtúbulos
b) c)
FIGURA 18-13 Células vivas de tipo neutrófilo obtenidas mediante micros-
copía de hoja de luz de celosía y representadas digitalmente.
FUENTE: Cortesía de Lillian Fritz-Laylin, Thomas Goddard, Graham Johnson 
y R. Dyche Mullins, UCSF.
� = 2150/V
C
A
P
ÍT
U
L
O
 18
 
T
é
c
n
ic
a
s
 e
n
 b
io
lo
g
ía
 m
o
le
c
u
la
r y
 c
e
lu
la
r
702
fueran sustituidos en la ecuación en la página 701, el límite de 
resolución sería de aproximadamente 0.03 Å. De hecho, la reso-
lución alcanzable con un microscopio electrónico de transmisión 
estándar es aproximadamente dos órdenes de magnitud menor 
que su límite teórico. Esto se debe a la grave aberración esférica 
de las lentes de enfoque de electrones, que requiere que la aper-
tura numérica de la lente sea muy pequeña (generalmente entre 
0.01 y 0.001). El límite práctico de resolución del TEM estándar 
está en el rango de 3 a 5 Å. El límite real al observar la estructura 
celular es más típicamente en el rango de 10 a 15 Å.
Los microscopios electrónicos consisten principalmente en 
una columna cilíndrica alta y hueca a través de la cual pasa el haz 
de electrones y una consola que contiene un panel de cuadrantes 
que controlan electrónicamente la operación en la columna. La 
parte superior de la columna contiene el cátodo, un filamento de 
alambre de tungsteno que se calienta para proporcionar una fuen-
te de electrones. Los electrones se extraen del filamento caliente y 
se aceleran como un haz fino por el alto voltaje aplicado entre el 
cátodo y el ánodo. El aire se bombea fuera de la columna antes de 
la operación, produciendo un vacío a través del cual viajan los 
electrones. Si no se eliminara el aire, los electrones se dispersarían 
prematuramente por la colisión con las moléculas del gas.
Al igual que un haz de rayos de luz puede ser enfocado por 
una lente de vidrio esmerilado, un haz de electrones cargados 
negativamente puede ser enfocado por lentes electromagnéticas, 
que están ubicadas en la pared de la columna. La intensidad de 
los imanes está controlada por la corriente que se les proporcio-
na, que está determinada por las posiciones de los distintos diales 
de la consola. En la FIGURA 18-15 se muestra una comparación de 
los sistemas de lentes de un microscopio óptico y electrónico. Las 
lentes del condensador de un microscopio electrónico se colocan 
entre la fuente de electrones y la muestra, y enfocan el haz de 
electrones en la muestra. Esta se apoya en una rejilla metálica 
delgada y pequeña (3 mm de diámetro) que se inserta con unas 
pinzas en el soporte de la rejilla, la cual, a su vez, se introduce en 
la columna del microscopio.
Debido a que las distancias focales de las lentes de un micros-
copio electrónico varían dependiendo de la corriente suministra-
da a ellas, una lente objetiva proporciona el rango completo de 
ampliación que proporciona el instrumento. Al igual que en el 
microscopio óptico, la imagen del lente objetivo sirve como obje-
to para un sistema de lente adicional. La imagen proporcionada 
por el lente objetivo de un microscopio electrónico sólo se magni-
fica unas 100 veces, pero a diferencia del microscopio óptico, hay 
suficiente detalle presente en esta imagen para ampliarla 10 000 
veces más. Al alterar la corriente aplicada a las diferentes lentes 
del microscopio, los aumentos pueden variar de aproximadamen-
te 1 000 veces a 250 000 veces. Los electrones que han pasado a 
través de la muestra se enfocan en una pantalla fosforescente si-
tuada en la parte inferior de la columna. Los electrones que gol-
pean la pantalla excitan una capa de cristales fluorescentes, que 
emiten su propia luz visible, la cual es percibida por el ojo como 
una imagen de la muestra.
La formación de las imágenes en el microscopio electrónico 
depende de la dispersión diferencial de los electrones por parte 
a)
b)
FIGURA 18-14 Una comparación entre la información contenida en las 
imágenes tomadas por un microscopio óptico y electrónico con un au-
mento comparable de 4 500 veces el tamaño real. a) Una fotografía del 
tejido muscular esquelético que se había incrustado en el plástico, se sec-
cionó a 1 μm, y se fotografió con un microscopio de luz bajo un lente obje-
tivo de inmersión en aceite. b) Una sección adyacente a la utilizada para la 
parte que se cortó a 0.025 μm y se examinó bajo el microscopio electróni-
co con un aumento comparable al de a. La imagen resultante muestra un 
aumento de resolución de 100 a 200 veces. Note la diferencia en los deta-
lles de las miofibrillas musculares, las mitocondrias y el capilar que contie-
ne un glóbulo rojo. Mientras que el microscopio óptico no puede propor-
cionar ninguna información adicional a la de a, el microscopio electrónico 
puede proporcionar mucha más información, produciendo imágenes, por 
ejemplo, de la estructura de las membranas individuales dentro de una pe-
queña porción de una de las mitocondrias (como en la figura 5.22).
FUENTE: a) y b) Cortesía de Douglas E. Kelly y M. A. Cahill.
Lámpara Filamento
Microscopio óptico Microscopio electrónico
Lente del
condensado
Lente
objetivo
Lente ocular
o del
proyector
Pantalla de visualización
con imagen final
Imagen
intermedia
Muestra
FIGURA 18-15 Una comparación de los sistemas de lentes de un mi-
croscopio óptico y un microscopio electrónico.
FUENTE: Reimpreso desde Alan W. Agar, Principles and Practice of 
Electron Microscope Operation, Elsevier/North-Holland, 1974. Usado con 
permiso de Elsevier Ltd.
18
.5
 
P
re
p
a
ra
c
ió
n
 d
e
 la
s
 m
u
e
s
tra
s
 p
a
ra
 m
ic
ro
s
c
o
p
ía
 e
le
c
tró
n
ic
a
703de la muestra. Considérese un haz de electrones emitido por el 
filamento y enfocado en la pantalla. Si no hubiera ninguna mues-
tra presente en la columna, la pantalla estaría iluminada de ma-
nera uniforme por el haz de electrones, produciendo una imagen 
uniformemente brillante. Por el contrario, si una muestra se colo-
ca en la trayectoria del haz, algunos de los electrones chocan con 
los átomos de la muestra y se dispersan. Los electrones que rebo-
tan en la muestra no pueden pasar a través de la pequeña abertu-
ra en el plano focal posterior del lente objetivo y, por tanto, se 
pierden como participantes en la formación de la imagen.
La dispersión de los electrones por parte de la muestra es 
proporcional al tamaño de los núcleos de los átomos que la for-
man. Debido a que el material insoluble de las células consiste en 
átomos con un número atómico relativamente bajo —carbón, oxí-
geno, nitrógeno e hidrógeno— el material biológico posee muy 
poca capacidad intrínseca para dispersar los electrones. Para au-
mentar la dispersión de los electrones y obtener el contraste re-
querido, los tejidos se fijan y se tiñen con soluciones de metales 
pesados (que se describen a continuación). Estos metales pe- 
netran en la estructura de las células y se complejizan de modo 
selectivo con diferentes partes de los orgánulos. Las partes de una 
célula que se unen al mayor número de átomos metálicos permi-
ten el paso del menor número de electrones. Cuantos menos elec-
trones se enfoquen en la pantalla en un punto determinado, más 
oscuro será ese punto. Las fotografías de la imagen se hacen le-
vantando la pantalla de visualización y permitiendo que los elec-
trones golpeen una placa fotográfica en posición debajo de la 
pantalla. Debido a que las emulsiones fotográficas son directa-
mente sensibles a los electrones, tanto como lo son a la luz, una 
imagen de la muestra se puede grabar directamente en la pelícu-
la. En los últimos años, la película ha sido reemplazada en gran 
parte por las técnicas de la imagen digital. La mayoría de los TEM 
modernos utilizan la detección de electrones indirectos, los cua-
les se convierten en fotones que luego pueden ser detectados por 
un sensor CCD, creando una imagendigital.
18.5 Preparación de las muestras 
para microscopía electrónica
Al igual que con el microscopio óptico, los tejidos a examinar en 
el microscopio electrónico deben fijarse, incrustarse y seccionar-
se. La fijación del tejido para microscopía electrónica (FIGU- 
RA 18-16) es mucho más crítica que para la microscopía óptica 
porque las secciones están sujetas a un escrutinio mucho mayor. 
Un fijador debe detener la vida de la célula sin alterar demasiado 
la estructura de esta. A nivel de la resolución del microscopio 
electrónico, el daño relativamente menor, como la inflamación de 
la mitocondria o la rotura del retículo endoplásmico, se vuelve 
muy evidente. Para obtener la fijación más rápida y el menor da-
ño celular, se fijan y se incrustan trozos muy pequeños de tejido 
(menos de 1.0 mm3). Los fijadores son sustancias químicas que 
desnaturalizan y precipitan las macromoléculas celulares. Los 
productos químicos que tienen tal acción pueden causar la coagu-
lación o precipitación de los materiales que no se encontraban 
dentro de las estructuras en la célula viva, lo que lleva a la forma-
ción de un artefacto. El mejor argumento de que una estructura 
particular no es un artefacto es la demostración de su existencia 
en las células fijadas de una variedad de formas diferentes o, me-
jor aún, no fijadas en absoluto. Para ver las células que no se han 
fijado, el tejido se congela rápidamente y se utilizan técnicas es-
peciales para revelar su estructura (véase criofijación y replica-
ción de fractura por congelación, descritas más adelante). Los fi-
jadores más comunes para la microscopía electrónica son el 
glutaraldehído y el tetróxido de osmio. El glutaraldehído es un 
compuesto de carbono con un grupo aldehído en cada extremo 
de la molécula. Los grupos aldehído reaccionan con los grupos 
amino en las proteínas y reticulan las proteínas en una red inso-
luble. El osmio es un metal pesado que reacciona principalmente 
con los ácidos grasos que conducen a la preservación de las mem-
branas celulares.
Una vez que el tejido se ha fijado, el agua se elimina por des-
hidratación en alcohol, y los espacios de los tejidos se llenan con 
un material que sostienen el tejido seccionado. Las exigencias de 
la microscopía electrónica requieren que las secciones sean muy 
delgadas. Las secciones de cera cortadas para la microscopía óp-
tica rara vez son más delgadas que aproximadamente 5 μm, 
mientras que las secciones para microscopía electrónica conven-
cional son mejores cuando se cortan a menos de 0.1 μm (equiva-
lente en espesor a aproximadamente cuatro ribosomas).
Los tejidos que se deben seccionar para microscopía electró-
nica generalmente se incorporan en resinas epóxicas. Las seccio-
nes se cortan llevando lentamente el bloque de plástico hacia 
abajo a través de un filo muy cortante (figura 18-16) hecho de vi-
drio tallado o de una cara de diamante finamente pulida. Las 
secciones que salen del borde de la cuchilla flotan sobre la super-
ficie de una cubeta de agua que está contenida justo detrás del 
borde de la cuchilla. Luego, las secciones se recogen con la rejilla 
de muestra de metal y se secan sobre su superficie. El tejido se 
tiñe haciendo flotar las rejillas en las gotas de soluciones de los 
metales pesados, principalmente acetato de uranilo y citrato de 
plomo. Estos átomos de metales pesados se unen a las macromo-
léculas y proporcionan la densidad atómica requerida para dis-
persar el haz de electrones. Además de las tinciones estándar, las 
secciones de los tejidos pueden tratarse con anticuerpos marca-
dos con metal u otros materiales que reaccionan con moléculas 
específicas en la sección del tejido. Los estudios con anticuerpos 
generalmente se llevan a cabo en tejidos incrustados en las resi-
nas acrílicas, que son más permeables a las moléculas grandes 
que las resinas epóxicas.
Criofijación y el uso de muestras congeladas
Las células y los tejidos no tienen que fijarse con productos quí-
micos e incrustarse en resinas plásticas para que se puedan obser-
var con el microscopio electrónico. De forma alternativa, las célu-
las y los tejidos se pueden congelar rápidamente. Así como un 
fijador químico detiene los procesos metabólicos y preserva la 
estructura biológica, también lo hace la congelación rápida, lo 
que se denomina criofijación. Debido a que la criofijación logra 
estos objetivos sin alterar las macromoléculas de la célula, es me-
nos probable que conduzca a la formación de artefactos. La prin-
cipal dificultad con la criofijación es la formación de cristales de 
hielo, que crecen hacia afuera desde los sitios donde se produce 
la nucleación. A medida que crece un cristal de hielo, destruye los 
frágiles contenidos de la célula en la que se desarrolla. La mejor 
manera de evitar la formación de los cristales de hielo es congelar 
la muestra tan rápidamente que los cristales no tengan tiempo 
para crecer. Es como si el agua estuviera congelada y aún perma-
neciera en su estado líquido. Se dice que el agua en este estado 
está “vitrificada”. Hay varias técnicas empleadas para lograr tales 
tasas de congelación ultrarrápidas. Las muestras más pequeñas se 
sumergen normalmente en un líquido de muy baja temperatura 
(como el propano líquido, con punto de ebullición de –42°C). Las 
muestras más grandes se tratan mejor con congelación a alta pre-
sión. En esta técnica, la muestra se somete a una alta presión hi-
drostática y se pulveriza con chorros de nitrógeno líquido. La alta 
presión reduce el punto de congelación del agua, lo que reduce la 
velocidad de crecimiento de los cristales de hielo. 
Es posible que no piense que un bloque de tejido congelado 
sería de mucha utilidad para un microscopista, pero se pueden 
seguir una cantidad sorprendente de métodos para visualizar la 
estructura celular congelada en el microscopio óptico o electróni-
co. Por ejemplo, después de una preparación adecuada, un blo-
que de tejido congelado se puede seccionar con un microtomo 
C
A
P
ÍT
U
L
O
 18
 
T
é
c
n
ic
a
s
 e
n
 b
io
lo
g
ía
 m
o
le
c
u
la
r y
 c
e
lu
la
r
704
especial de una manera similar a la de un bloque de tejido de 
parafina o plástico. Las secciones congeladas (criosecciones) se 
pueden preparar para su examen bajo la luz o bajo un microsco-
pio electrónico. Las secciones congeladas son particularmente 
útiles para estudios sobre las enzimas, cuyas actividades tienden 
a desnaturalizarse mediante fijadores químicos. Debido a que las 
secciones congeladas se pueden preparar mucho más rápidamen-
te que las secciones de parafina o de plástico, los patólogos a 
menudo las emplean para examinar la estructura microscópica de 
los tejidos extraídos durante la cirugía. Como resultado, la deter-
minación de si un tumor es maligno se puede hacer mientras el 
paciente todavía está en la mesa de operaciones.
Las células congeladas no tienen que ser seccionadas para re-
velar la estructura interna. La figura 1.11 muestra una imagen de 
la delgada región periférica de una célula intacta que se había 
estado arrastrando sobre la superficie de una rejilla de microsco-
pio electrónico un instante antes de que se congelara rápidamen-
te. A diferencia de la micrografía electrónica estándar, la imagen 
de la figura 1.11 tiene una tridimensionalidad, como la muestra 
en sí misma, porque fue generada por una computadora y no di-
rectamente por una cámara. Para obtener la imagen, la computa-
dora alinea un gran número de imágenes digitales bidimensiona-
les de la célula que se capturan a medida que la muestra se inclina 
en ángulos definidos con respecto al eje del haz de los electrones. 
La reconstrucción computacional tridimensional se llama to- 
mograma y la técnica se llama tomografía crioelectrónica (crio-ET, 
cryoelectron tomography)1. La crio-ET, que fue desarrollada por 
Wolfgang Baumeister del Instituto Max Planck en Alemania, ha 
revolucionado la forma en que las estructuras intracelulares de 
tamaño nanométrico se pueden estudiar en las célulasno fijadas, 
Pequeña muestra de
tejido (1 mm3) colocado
en el fijador (por
ejemplo, glutaraldehído)
Tejido colocado
en un segundo
fijador (por
ejemplo, OsO4)
Etanol
al 70%
Etanol
al 95%
Deshidración
Etanol
al 100%
Óxido de
propileno
Infiltración en una
solución de
medio de inclusión
de plástico (por
ejemplo, Epon
sin polimerizar)
Tejido incrustado
en medio plástico
contenido en un vial
Lavar Lavar
Bloque 
de tejido
Ultramicrotomo
El tejido se corta en secciones de aproximadamente
100 nm de espesor a medida que el bloque se mueve
hacia abajo a través del borde afilado de un cuchillo
de vidrio o diamante. Las secciones flotan en un
recipiente de agua justo detrás del filo del cuchillo
Vista de primer plano de
las secciones en una cinta
que flota en un canal
La rejilla EM contiene secciones listas para
ser teñidas con metales pesados, colocadas
en un soporte de rejilla y examinadas en
el microscopio electrónico
Las secciones son teñidas
El plástico en el vial se polimeriza
en un bloque sólido con tejido
en el borde inferior del bloque
El bloque que contiene el tejido se
recorta para preparar el seccionamiento
Rejilla
Filo del
cuchillo
Gota de tinte
de los metales
pesados
ol
0%%
Ó
p
ol
%
ió
Etano
al 100
ado
do
r
O )
E
al
tanol
 70%
E
al
D hid
Etano
l 95%
hid
Lavar
FIGURA 18-16 Preparación de una muestra para la observación en el microscopio electrónico.
1 Esta técnica es similar en principio a la tomografía axial computarizada 
(exploraciones CAT), que utiliza una multitud de imágenes de rayos X toma-
das desde diferentes ángulos del cuerpo para generar una imagen tridimen-
sional. Afortunadamente, la maquinaria utilizada en la tomografía radioló-
gica permite que la fuente de rayos X y el detector giren, mientras el 
paciente puede permanecer inmóvil.
705
18
.5
 
P
re
p
a
ra
c
ió
n
 d
e
 la
s
 m
u
e
s
tra
s
 p
a
ra
 m
ic
ro
s
c
o
p
ía
 e
le
c
tró
n
ic
a
 
completamente hidratadas y congeladas. La crio-ET también pue-
de utilizarse para examinar la organización tridimensional de las 
estructuras presentes in vitro, como lo ejemplificado por la re-
construcción de un polisoma aislado en el acto de traducción que 
se muestra en la figura 11.50b). La crio-ET, que puede ofrecer una 
resolución de unos pocos nms, proporciona un puente importan-
te entre los mundos celulares y moleculares. Más adelante en esta 
sección y en la sección 18.16 se analizan otros dos enfoques que 
requieren el análisis microscópico de las muestras congeladas: la 
replicación de fracturas por congelación y el análisis de partículas 
individuales.
Tinción negativa
El microscopio electrónico también es adecuado para examinar 
materiales particulados muy pequeños, como virus, ribosomas, 
enzimas de múltiples subunidades, elementos del citoesqueleto y 
complejos de proteínas. Las formas de las proteínas individuales 
y de los ácidos nucleicos también pueden resolverse siempre que 
se preparen para tener un contraste suficiente con su entorno. 
Una de las mejores maneras de hacer visibles estas sustancias es 
emplear procedimientos de tinción negativa en los que se acu-
mulan depósitos de metales pesados en todas partes en una rejilla 
de muestra, excepto donde las partículas están presentes. Como 
resultado, la muestra se destaca por su brillo relativo en la panta-
lla de visualización. Ejemplos de muestras teñidas negativamente 
se presentan en las figuras 2-41a) y 18-17a).
Proyección de sombras
Otra técnica para visualizar partículas aisladas es hacer que los 
objetos proyecten sombras. La técnica se describe en la FIGU- 
RA 18-18. Las rejillas que contienen las muestras se colocan en 
una cámara sellada, que luego se evacua mediante una bomba de 
vacío. La cámara contiene un filamento compuesto de un metal 
pesado (generalmente platino) junto con carbono. El filamento se 
calienta a alta temperatura, lo que hace que se evapore y deposite 
una capa metálica sobre las superficies accesibles dentro de la 
cámara. Como resultado, el metal se deposita en las áreas que 
enfrentan al filamento, mientras que las superficies opuestas de 
las partículas y del espacio de la rejilla a su sombra permanecen 
sin recubrir. Cuando se ve la cuadrícula en el microscopio electró-
nico, las áreas en sombra aparecen brillantes en la pantalla de vi-
sualización, mientras que las regiones revestidas de metal apare-
cen oscuras. Esta relación se invierte en la placa fotográfica, que 
es un negativo de la imagen. La convención para ilustrar las mues-
tras sombreadas es imprimir una imagen negativa en la que la 
partícula aparece iluminada por una luz blanca brillante (corres-
pondiente a la superficie recubierta) con una sombra oscura pro-
yectada por la partícula (figura 18-17b). La técnica proporciona un 
excelente contraste y produce un efecto tridimensional.
Replicación por congelación y fractura 
y grabado por congelación
Como se señaló anteriormente, varias técnicas de microscopía 
electrónica se han adaptado para trabajar con tejidos congelados. 
La ultraestructura de las células congeladas se ve a menudo utili-
zando la técnica de replicación por congelación y fractura, 
que se ilustra en la FIGURA 18-19 y se demuestra en el tutorial 
experimental del capítulo 7. Se colocan pequeños trozos de tejido 
en un pequeño disco metálico y se congelan rápidamente. Luego, 
el disco se monta en un escenario frío dentro de una cámara de 
vacío, y el bloque de tejido congelado es golpeado por el filo de 
una cuchilla. El plano de fractura resultante se extiende desde el 
punto de contacto, dividiendo el tejido en dos pedazos, no como 
la forma en que una hoja de hacha divide un pedazo de madera 
en dos. Considere lo que podría ocurrir cuando un plano de frac-
tura se propaga a través de una célula que contiene una variedad 
de orgánulos de diferente composición.
FIGURA 18-17 Ejemplos de muestras teñidas negativamente y con som-
bra de metal. Micrografías electrónicas de un virus del cascabeleo del ta-
baco después de una tinción negativa con fosfotungstato de potasio a) o 
de sombra con cromo b).
FUENTE: a-b) Cortesía de M. K. Corbett.
a)
b)
Cámara de
evacuación
Rejilla de
muestra
Evaporación del metal
del alambre de platino
FIGURA 18-18 Procedimiento utilizado para la proyección de la sombra 
como medio para proporcionar contraste en el microscopio electrónico. 
Este procedimiento se usa a menudo para visualizar partículas pequeñas, 
como los virus que se muestran en la figura anterior. Las moléculas de 
DNA y RNA a menudo se hacen visibles mediante una modificación de es-
te procedimiento conocido como sombreado giratorio en el que el metal 
se evapora en un ángulo muy bajo mientras se gira la muestra.
C
A
P
ÍT
U
L
O
 18
 
T
é
c
n
ic
a
s
 e
n
 b
io
lo
g
ía
 m
o
le
c
u
la
r y
 c
e
lu
la
r
706 Estas estructuras tienden a causar desviaciones en el plano de 
fractura, ya sea hacia arriba o hacia abajo, dando a la fractura 
elevaciones de cara, depresiones y crestas que reflejan los contor-
nos del protoplasma atravesado. En consecuencia, las superficies 
expuestas por la fractura contienen información sobre el conteni-
do de la célula. El objetivo es hacer visible esta información. El 
proceso de replicación logra esto utilizando la zona fracturada co-
mo una plantilla en la que se deposita una capa de metales pesa-
dos. El metal pesado se coloca sobre la superficie recién expuesta 
del tejido congelado en la misma cámara donde se fracturó el te-
jido. El metal se deposita en un ángulo para proporcionar som-
bras que acentúan la topografía local (FIGURA 18-20), como se 
describe en la sección anterior sobre la proyección de sombras.
Luego se deposita una capa de carbono sobre la capa metálica 
para cementar los parches de metal en una superficie sólida. Una 
vez hecho este molde, el tejido que proporcionó la plantilla se 
puede descongelar, extraer y desechar; es la réplica de metal-car-
bono que se coloca en la rejilla de la muestra y se ve en el micros-
copio electrónico.