Comparación de las pruebas de inmunofluorescencia indirecta, fijación del complemento y aglutinación en tarjeta para el diagnóstico de la anaplasmosis bovina

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AN A LIZADO 
COMPARACION DE LAS PRUEBAS DE INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA, 
FIJACION DEL COMPLEMENTO V AGLUTINACION EN TARJETA PARA EL 
DIAGNOSTICO DE LA ANAPLASMOSIS BOVINA* 
Eduardo F. Gonzalez 
Ray F. Long 
Radmjlo A. Todorovic" 
1. INTRODUCCION 
Para ci diagnóstico serológico de la anaplasmosis 
bovina, se utilizan generalmente las pruebas de Fija-
cion del Complemento (FC), Aglutinacióri Capilar 
(AC), Aglutinacion en Tarjeta (AT) y Ia prueba de 
Inmunofluorescencia Indirecta (IFA). (Amerault & 
Roby, 1968; Long et al., 1977; Ristic, 1962). 
Se han descrito algunas ventajas y desventajas de 
estas pruebas serológicas, en donde se hace referen-
cia a su valor práctico y eficiente, como métodos de 
diagnóstico. Sin embargo, no se ha realizado un 
estudio comparativo, con análisis estadIstico, entre 
estas pruebas que determine su sensibilidad y especi-
ficidad, atributos que deben ser conocidos cuando 
se trabaja con cualquier prueba serológica. 
La sensibilidad de una prueba serológica ha sido 
definida como la habilidad de la prueba para dar un 
resultado positivo, cuando Ia muestra en estudio 
corresponde a un individuo infectado. La especifi-
cidad se refiere a la habilidad de la prueba para dar 
un resultado negativo cuando la muestra en estudio 
está libre de la enfermedad que se está investigando 
(Thorner, 1961). La evaluación de la sensibilidad y 
especifIcidad requiere del establecimiento previo de 
un diagnostico para cada individuo que se va a 
investigar y este diagnóstico debe hacerse por otras 
técnicas que no sean serolOgicas. (Gart, 1966). 
El objetivo de este trabajo fue el de evaluar 
estadisticamente las pruebas de IFA, FC y AT con 
el fin de determinar: 
- La sensibilidad y especificidad de cada prueba 
- Su valor como método de diagnóstico en anima-
les que están sufriendo una infección clInica. 
- Su valor como método de diagnóstico para detec-
tar portadores sanos de la enfermedad. 
2. REVISION DE LITERATURA 
La prueba de FC fue utilizada por primera vez 
para ci diagnóstico de anaplasmosis bovina por Mott 
y Gates en 1949, utilizando eritrocitos infectados 
con Anaplasma marginale como antigeno. Posterior-
mente fue modificada y estandarizada por otros 
autores (Mott '& Gates, 1949 Price et al., 1952) 
para ser utilizada como método rutinario de diag-
nóstico de la enfermedad. La misma prueba fue 
adaptada recientemente a la técnica de microtitula-
cián. La prueba rápida de aglutinacion en tarjeta 
(AT) fue descrita por Amerault y Roby en 1968. 
Recientemente se ha descrito una modificación a 
esta técnica (Amerault et al. 1972). La prueba de 
IFA no ha sido mencionada muy ampliamente en la 
literatura ya que es de reciente utilización (Lohr et 
al. 1973; Long et al. 1977). 
Amerault et al. (1968), compararon la prueba de 
AT con la prueba de FC y encontraron un 86% de 
acuerdo en muestras de fincas infectadas y un 99% 
de acuerdo en muestras de fincas libres de la enfer-
medad. En este estudio no se estableció un diagnos-
tico previo de cada animal sino que se utilizó la 
prueba de FC como prueba de referenda. 
Contribución del Proyecto Especial de Hematozoarios del Centro Internacional de Agriculture Tropical (dAT). Apartado 
Aéreo 6713, Cali, Colombia, S.A. 
Respectivamente: Medico Veterinario, M.S. AGROVET LTDA. Apartado Aéreo 277 Palmira. Bacteriólogo y Medico 
Veterinario, Ph.D., Instituto de Medicina Veterinaria Tropical (ITVM). Texas A. & University, College Station, Texas 
77843, U.S.A. 
Revista ICA Bogota (Colombia). Vol. XIII. No. 3 pp. 575- 580 Septiembre 1978. CK ISSN 0018.894. 
575 
Todorovic et al. (1977), compararon la prueba de 
FC con la prueba de AT en 9 terneros infectados 
naturalmente con A. marginale encontrando que los 
anticuerpos a la prueba de FC disminuyen después 
de la infección mientras que los detectados por la 
prueba AT persisten por más tiempo. La misma 
observación fue hecha por Kuttier et al. (1977) al 
comparar Ia prueba de FC con la prueba de IFA 
para el diagnóstico de babesiosis bovina. 
3. MATERIALES Y METODOS 
3.1. PRUEBAS SEROLOGICAS. 
La prueba de fijación del complemento fue reali-
zada de acuerdo a las técnicas descritas por ci 
USDA. 
La prueba rápida de aglutinación en tafleta se 
hizo con los juegos "Brewer" de los Laboratorios 
Hynson, Wescott y Dunning siguiendo la técnica 
descrita por Amerault y Roby (1968). 
Para Ia prueba de IFA se preparó un antIgeno a 
partir de sangre infectada con Anaplas,'na rnarginale 
(30%). Se utilizaron diluciones mInimas del suero de 
1:40 como nivel de sensibilidad y de 1:75 para el 
conjugado anti-gama globulina de acuerdo a la técni-
ca descrita por Long et al. (1977). 
3.2. ANIMALES EXPERIMENTALES. 
Para la determinación de la sensibilidad y especi-
ficidad de las pruebas se utilizaron 130 animales 
tipo Bos taurus; 48 animales de edades entre 6 
meses a 5 afios, nacidos en una zona libre de 
anaplasmosis (Patugó, altitud 3.300 metros) y 82 
animales nacidos en una zona endémica 1e 
anaplasmosis (Valle del Cauca, altitud 1.100 metros) 
con edades entre 6 meses a 2 aflos. Todos estos 
animales habIan sufrido infección clinica o subclIni-
ca por Anaplasma marginale, diagnostico efectuado 
por frotis de sangre hecho periódicamente durante 
dos aflos. 
Para ci diagnostico de infecciones agudas y cróni-
cas Se utilizaron 10 terneros de 8 meses de edad, 
provenientes de una zona libre de anaplasmosis. 
Estos animales fueron Ilevados a unidades de aisla-
miento y mantenidos allI durante ci perIodo de 
estudio (8 meses). 
Un mes después de Ilegados ai CIAT fueron mo-
culados con 2 ml de un estabilizado que contenla 
1,2 x 108 organismos de Anaplasma marginale. Los 
animales fucron sangrados tres veces por semana 
durante ci primer mes y semanalmente a partir del 
segundo mes, una vez, que las parasitemias empeza-
ron a bajar. El muestreo se continuó hasta el sexto 
mes post-inoculación,cuando ci estudio se dio por 
terminado. 
4. RESULTADOS 
Los resultados comparativos de la sensibilidad y 
especificidad para las pruebas de FC, AT e IFA se 
presentan en la Tabla 1. La prueba de IFA demos-
tró ser la más eficiente para detectar animales infec-
tados subclinicamente con anaplasmosis con 97% de 
sensibilidad, seguida por la prueba de AT con 84% y 
la prueba de FC con 79%. Las diferencias entre 
estos valores fueron estadIsticamente significativas a 
favor de la prueba de IFA. Sin embargo, la prueba 
más especifica resultó ser la prueba de FC con 
100% seguida por Ia prueba de AT con 98% y la 
prueba de IFA con 901/,-. Se encontraron diferencias 
estadIsticas significativas a favor de Ia prueba de FC 
cuando se comparó con Ia prueba de IFA. No hubo 
diferencias significativas entre los valores de especifi-
cidad para las pruebas de FC y AT. 
TABLA 1. Comparación de la sensibilidad v especificidad de las pruebas de IFA, FC y AT en 130 muestras de suero. 	Un asterisco 
l) indica diferencias significativas (P 	( 0.05) entre las pruebas. 
Reacción Diagnóstico 	 Total Porcentaje de 
a Ia prueba Positivos 	 Negativos Sensibilidad Especificidad 
IFA 97 90 
Positivos 80 	 5 85 
Negativos 2 	 43 45 
Total 82 	 48 130 
AT 84* 98 
Positivos 69 	 1 70 
Negativos 13 	 47 60 
Total 82 	 48 130 
FC 79 100 
Positivos 65 	 0 65 
Negativos 17 	 48 65 
Total 82 	 48 130 
576 
1:1280 
1:640 
1:320 
1:160 1:160 
- 1:80 - 1:80 
1:40 1:40 
1:20 NEG 
1:10 
1:5 
0FC 
4 	6 	8 	10 	10 	10 	10 	10 	10 	10 	10 
NEG 
 
__ 	 -- 	- 	+-I-4 	++ 	+ 	+ 	-F 	+ 	-F 	+ FC WA (-I-) 
4% • 
.3% 
Cs 
Cs 
2% 
- 1% 
P 
10 
FIGURAl. Comparación de las pruebas de Inmunofluorescencia Indirecta (IFA), FijaciOn del Complemento (FC) y AglutinaciOn en Tarjeta (AT) para el diagnOstico serológico del Anap/asrna 
marginale. Representación gráfica de los promedios de los tltulos y parasitemias. Se indica encima de una cruz )+) el nãmero de animales qua mostraron reacciôn a Ia prueba de AT. 
En la Figura I se muestran los resultados seroló-
gicos comparativos de la inoculaciOn delAnaplasma 
inarginale en 10 terneros. Las parasitemias fueron 
evidentes en frotis de sangre 12 dIas post-inocula-
ción (P1), lo cual coincidió con el aumento de 
titulos de anticuerpos para las pruebas de FC (1:80) 
e IFA (1:80) en todos los terneros inoculados. La 
prueba de AT, empezó a detectar anticuerpos en 4 
animales a los 19 dIas P1 y en todos los 10 terneros 
a los 26 dias P1, cuando las parasitemias iban en 
descenso. La maxima parasitemia de 4% en prome-
dic se obtuvo a los 22 dIas P1, lo cual coincidió con 
los máximos titulos para FC (1:160) e IFA 
(1:1280). A las seis semanas P1 los titulos de IFA 
descend ieron una dilución (1:640) pero se mantuvie-
ron constantes. Sin embargo los titulos para FC 
empezaron a descender hasta niveles muy bajos 
(1:10) a las 10 semanas P1. La prueba de AT mos-
tró aglutinacion positiva en todos los animales ino-
culados hasta el final de este perIodo de observación 
cuando las parasitemias eran entre 0,001 a 002%. 
El promedio de los titulos de anticuerpos en 10 
terneros inoculados con A. marginale para las prue-
bas de FC e IFA, durante el perlodo de las semanas 
4 a 20 post-inoculación se muestra en la Figura 2. 
Un análisis de regresión realizado en los promedios 
de los titulos, expresados como el logaritmo del 
recfproco, mostraron coeficientes significativos de 
regresión para ambas pruebas (Snedecor, 1957). El 
coeficiente de regresión para la prueba de IFA fue 
de —0,04089 y para la prueba de FC fue de 
—0,1897. 
Mientras que la lInea de regresión para la prueba 
de IFA, todavIa permanecfa por encima de los nive-
les de sensibilidad (1:40) al final del perIodo del 
estudio (20 semanas), La lInea de regresión para la 
prueba de FC, paso por debajo de los niveles de 
sensibilidad (1:5) a las 14 semanas P1 y desapareció 
por completo a las 20 semanas. 
La prueba de aglutinación AT aunque no indica-
do en esta gráfica, dio resultados positivos en todos 
los 10 animales en estudio, hasta el final del perfo-
do de observación. 
o Promediotitutos IFA 
Promedlo titulos FC 
0 
b = - 0,04089 
Nivel miflimO de 
sensibilidad a IFA (1:40) 
b = -0,1697 
LI 
'N
Nivel minimo de 
sensibilidad a FC (1:5) 
• 
10 	 12 	 14 	 16 
	
20 
Semanas 
FIGURA 2. Resultados del anâlisis de regresión lineal para los promedios de los titulos de las pruebas de I FA y FC en 10 
terneros infectados artificialmente con Anaplasma marginale. 
578 
5. DISCUSION 
	
tendrian mayor aplicaciOn en areas donde se preten- 
da realizar programas de control o erradicación. 
Los resultados de este estudio indicaron que la 
prueba más sensible para el diagnóstico de anaplas-
mosis en animales infectados clInica o subclInica-
mente es Ia prueba de IFA, mientras que la prueba 
más eficiente para clasificar animales como no infec-
tados es la prueba de FC. Expresando inversamente 
los valores obtenidos coma porcentaje de falsos 
positivos o falsos negativos, encontramos que la 
prueba de FC no da reacciones de falsos positivos 
(0%), mientras que la prueba de IFA da 10% de 
reacciones falsos positivos. Por el contrario Ia prue-
ba de IFA da 3% de reacciones falsos negativos en 
comparación con el alto indice de falsos negativos 
que da la prueba de FC (21%). La prueba de AT 
ocupa un lugar intermedio entre ambas pruebas en 
cuanto at porcentaje de falsos positivos (2%) y fal-
sos negativos (16%) se refiere. 
La disminución de los tItulos de FC poco tiempo 
después de la infecciOn, confirma los hallazgos an-
teriorrnente reportados para esta prueba en el diag-
nóstico de enfermedades hemoparasitarias. Kuttler 
et al. (1977), encontraron que los tftulos para la 
prueba de FC, cuando se utiliza para el diagnostico 
de babesiosis bovina, disminuyen significativamente 
a los 90 dias post-inoculación (P1) mientras que los 
tItulos para Ia prueba de IFA permanecen por enci-
ma de los niveles de sensibilidad hasta 180 dIas P1. 
Todorovic et al. (1977), obtuvieron hallazgos simila-
res at comparar la prueba de FC con la prueba de 
AT, en animales infectados naturalmente con ana-
plasmosis. Los tItulos a la prueba de FC bajaron a 
niveles de trazas a las 14 semanas post-infección, 
mientras que la prueba de AT continuO dando reac-
ciones positivas hasta 40 semanas post-infección. 
Estas diferencias encontradas por estos autores y 
confirmadas en este trabajo indican que los anticuer-
pos detectados por las pruebas de IFA y AT son 
diferentes y más persistentes que los detectados por 
la prueba de FC. Es posible que en condiciones de 
campo, si existe reinfección constante, los anticuer-
pos a la prueba de FC sean estimulados con más 
frecuencia y aumente was su nivel de sensibilidad. 
6. CONCLUSIONES 
Sabre la base de la sensibilidad determinada en 
este trabajo, las pruebas ideales para el diagnástico 
de anaplasmosis bovina, son las pruebas de IFA y 
AT, to cual indica que estas pruebas deben ser las 
de elección cuando se trate de realizar estudios de 
prevalencia con fines epidemiologicos. 
Aunque el diagnóstico de anaplasmosis, en casos 
agudos, no ofrece mayor dificultad por frotis de 
sangre coloreado con Giemsa, las pruebas de IFA y 
FC podrIan utilizarse para confirmar la infección, 
teniendo en cuenta el incremento de los anticuerpos 
que se presenta en las infecciones agudas. 
Las pruebas de FC y AT por su alta especificidad 
RESUMEN 
Las pruebas de Inmuno—Fluorescencia Indirecta 
(IFA), Fijación del Complemento (FC) y Aglutina-
don en Tarjeta (AT) fueron coniparadas estadistica-
mente en un total de 380 muestras de suero obteni-
das de animales libres y experimentalmente infecta-
dos con Anaplasma marginale. 
Se encontró que Ia prueba de IFA es la más 
sensible para detectar animales infectados con ana-
plasmosis (96%) seguida por la prueba de AT (84%) 
y la prueba de FC (79%). La prueba was especIfica 
fue la de FC (100%), seguida por la prueba de AT 
(989) y la prueba de IFA (90%). Se encontraron 
diferencias significativas entre las sensibilidades de 
las pruebas de IFA con AT y FC y entre las especi-
ficidades de IFA y FC. (P ( 0,05). 
Un análisis de regresión lineal realizado en los 
promedios de los titulos de IFA y FC de 10 terne-
ros infectados experimentalmente con A. rnarginale, 
durante un perlodo de 20 semanas mostrO coeficien-
tes significativos de regresiOn para ambas pruebas. 
La lInea de regresión de los tItulos para la prueba 
de FC paso por debajo de los niveles de sensibilidad 
a las 14 semanas P1, mientras que la lInea de regre-
sión para los tItulos de IFA aOn permanecia por 
encima del nivel de sensibilidad al final del perfodo de 
observación. La prueba de AT tambin detectO anti-
cuerpos hasta el final del perIodo de observación (20 
semanas P1). 
Los resultados de este estudio indican que las 
pruebas de IFA y AT tienen mayor aplicación en 
estudios de prevalencia cuando se desea detectar 
portadores sanos de anaplasmosis. Las pruebas de 
FC y AT por su alta especificidad tcndrIan mayor 
valor en areas donde se pretendan realizar programas 
de control o erradicación. 
SUMMARY 
Comparison among the indirect inmunofluorescence 
test, complement fixation test, and card aggluti-
nation test in the diagnosis of bovine anaplasmosis. 
Indirect fluorescent antibody test (IFA), comple-
ment fixation test (CF) and card agglutination test 
(CT) were statistically compared in 380 serum 
samples obtained from free animals and experimen-
tally infected with Anaplasma marginale. 
It was found that IFA test was most sensitive for 
detection of animals infected with anaplasmosis 
(961k), followed by the CT test (84%) and the CF 
test (79%). The most specific test was the CF test 
(100%), followed by the CT test (98%) and the IFA 
test (90%). Significant differences were found when 
579 
the IFA sensitivity was compared with the CF and 
CT sensitivities and when the specificities of IFA 
and CF tests were compared. 
A linear regression analysis performed on the 
average IFA and CF titers of 10 artifitially infected 
calves with A. marginaleduring a 20 week period, 
showed significant regression coeficients for both 
tests. The regression line for the CF titers decreased 
below the sensititvity threshold at 14 weeks FL, 
while the regression line for the IFA titers was still 
above the sensitivity threshold 20 weeks P1, the last 
period tested. The card test was still detecting anti-
bodies at the end of the observation period. 
The results of this work indicated that IFA and 
CF test are valuable tests in prevalence studies when 
it is important to detect cronic carriers of anaplas-
mosis. Because of their high specificity the CF and 
CT test would be more valuable in anaplasmosis 
control or eradication programs. 
9. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 
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580