Factores que intervienen en el procesamiento del semen bovino durante su congelación

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FACTORES QUE INTERVIENEN EN EL PROCESAMIENTO DEL SEMEN 
BOVINO DURANTE SU CONGELACION* 
Martha Aguirre M. 
Steven Anderson 
Ernesto Huertas V." 
1. INTRODUCCION 
Aunque el manejo del semen en la especie bovina 
está bastante conocido, existe todavia la discusión 
referente al momento óptimo de Ilevar a cabo la 
congelación. 
Es asi como Cragle y Myers (1954) encontraron 
que el semen presentaba una movilidad aceptable al 
estar diluido en soluciones de citrato de sodio que 
oscilaban de 2,4% a 3,3% y con una concentración 
de glicerol del 4,5% al 8% para tiempos de equili-
brio de 6,5 a 16 horas. Por otro lado Graham etal. 
(1957) encontraron diferencias significativas 
(P 	0,05) al emplear semen congelado con perlodos 
de equilibrio de 4 a 12 horas y con un no retorno 
(N.R.) sobre 75 dIas de 63,4% y 67,8%, respectiva-
rnente, mientras que el N.R. al inseminar con semen 
congelado a las 8 horas de equilibrio del glicerol fue 
de 65,2%. No se presentaron diferencias en fertili-
dad entre las 8 y 12 horas de equilibrio, ni entre las 
4 y las 8 horas. 
Nagase (1972) obtuvo buenos resultados al con-
getar semen en pellets con un tiempo de equilibrio 
que iba de 3 a 10 horas sin encontrar diferencias. 
Con este trabajo Se trató de determinar el mo-
mento óptimo para la congelación del semen, reali-
zando análisis antes y después de la congelación, en 
diferentes etapas del perlodo de equilibrio, después 
de la adición de la segunda parte del diluyente que 
contenIa el glicerol. Se estableció una comparaciOn 
entre la técnica de congelación usual a las 22 horas, 
contra tiempos de equilibrio menores. El momento 
inapropiado de la congelación puede conducir a una 
reducción en la fertilidad de las muestras, ya que 
ocasiona alteraciones en las condiciones fIsicoqufmi-
cas del semen. 
Es asi como Pace y Graham (1970) observaron 
un aumento progresivo en la liberación de Ia enzirna 
intracelular Transaminasa Glutámica Oxaloacética 
(G.O.T.) a través de las horas de equilibrio y encon-
traron una correlación entre la cantidad total de 
G.O.T. en el medio extracelular y la fertilidad (r = 
0,21) signiflcativamente (P( 0.05), to cual indicó que 
las células espermáticas que contienen altas canti-
dades de G.O.T. tienen una elevada capacidad fertili-
zante, y a su vez está en relación directa con la 
concentración de la muestra (1960). 
Saacke y Marshall (1968), empleando la cobra-
ción de Giemsa, encontraron varias deformaciones 
de los acrosomasde acuerdo a su grado de deterio-
ración. Pero aclararon que la relación de Ia morfolo-
gIa acrosómica y su alteración con la fertilidad po-
tencial, movilidad e inmovilidad o muerte celular, 
como una consecuencia de alteración, deben ser 
entendidas con mayor claridad antes que el papel de 
esta estructura en la fertilización pueda ser comple-
tamente evaluado. 
2. MATERIALES Y METODOS 
2.1. ORIGEN Y MANEJO DEL SEMEN. 
Se trabajd con 3 toros Holstein, 1 Normando y 1 
San Martinero, cuyas edades fluctuaban entre 3 y 5 
afios, en el Centro Experimental de Tibaitatá, situa-
do a 2.550 m.s.n.m., con temperatura media de 
13°C y humedad relativa del 7617c. 
Los animales fueron mantenidos en pastoreo 
sobre praderas con pasto kikuyo y un suplemento 
de concentrado. 
ContribuciOn del Programa de Fisiolog(a Animal (Division de Ciencias Animales) del Instituto Colombiano Agropecuario, 
CA. 
Respectivamente: Bióloga, Laboratorio de IneminaciOn, ICA Tibaitatâ, Apartado Aéreo 151123; Medico Veterinario, 
Ph.D., Técnjco de la Earten Americana, Bogota, D.E, y Medico Veterinario Zootecnista, Ph.D., Técnico del ICA hasta 
1975. 
Revista ICA, Bogota (Colombia) Vol. XIII. No. 3. pp. 551 . 558 Septiembre 1978. CK ISSN 0018.894. 
551 
Los eyaculados se colectaron en el Centro de 
Inseminación Artificial del ICA, una vez por semana 
a cada animal, empleándose para tal práctica la 
vagina artificial. 
Las muestras de semen se mantuvieron a 37°C 
por 5 a 10 mmutos, tiempo en que se efectuaba el 
análisis de concentración, empleando un espectrofo-
tómetro Baush and Lomb; también se analizaron el 
porcentaje de movilidad y el porcentaje de esperma-
tozoides vivos para determinar rápidamente la calidad 
de las muestras recolectadas. 
El semen se diluyó en relación de 1:4 con una 
solución isotónica previamente calentada a 37°C, a 
base de citrato de sodio dihidratado 2,9% (ply): 
yema de huevo 20% (v/v), penicilina (1.000 UI/cc) 
y estreptomicina (1,000 mg/cc). La temperatura de 
esta mezcla se llevó a 5°C en 2,5 horas y a esa 
temperatura se le agregó la otra porción de diluyen-
te que coritenfa glicerol al 10% para obtener en el 
volumen final una concentración del 5%. 
El semen se mantuvo a 5°C durante 25 horas y 
se congelo en pellets sobre hielo seco (anhIdrido 
carbónico sólido) a diferentes horas del tiempo de 
equilibrio del glicerol: 1H, 2H, 3H, 4H, 5H y 22 
horas. Los pellets se descongelaron en baflo maria a 
37°C. 
Las muestras se analizaron en el transcurso del 
descenso de temperatura de los 37°C, a los 5°C 
antes de la adición de la segunda porción del dilu-
yente y luego, su comportamiento pre y post conge-
latorio en las horas de equilibrio anteriormente men-
cionadas. 
tras de semen colocadas sobre láminas portaobjetos 
previamente calentadas a 37°C. 
2.2.2. Porcentaje de células vivas. 
La tinciOn diferencial de vivos y muertos em-
pleando la coloración de Blom a base de Eosina y 
Nigrosina, es usada para una determinación general 
de la habilidad de las células para retardar la infu-
sión de las moléculas de colorante, pero menos 
usual para determinar la integridad de La membrana. 
Los espermatozoides que están vivos son imper-
meables a la Eosina y por lo tanto no presentan 
coloración alguna a nivel de la cabeza, mientras que 
los muertos se hacen permeables a ella y su cabeza 
toma una coloración rojiza. La Nigrosina sirve tan 
solo como medio de contraste. 
2.2.3. Transaminasa glutämica 
oxatoacética. 
Su actividad se midiO colorirnétricainente. Esta 
enzima cataliza el proceso de transaminación en el 
cual el grupo amino del aminoácido es transferido 
reversiblemente a un ácido ct-ceto y el grupo a-ceto 
es también transferido al aminoácido original. En 
este análisis se emplearon el ácido aspártico y el 
ácido a-cetoglutárico como substratos para determi-
nar la formaciOn del ácido oxaloacético (Henry, 
1969). 
2.2. METODOS DE EVALUACION. 
Se realizaron 1.440 análisis en 20 muestras de 
semen cuyos parámetros fueron los siguientes: por-
centaje de movilidad, porcentaje de células vivas, 
tinción acrosómica y el nivel de la enzima mtracelu-
lar transaminasa glutámica oxaloacética (G.O.T.) en 
el medio extracelular. Cada uno de estos exámenes 
por separado no da una estimación exacta de La 
calidad de la suspension espermática debido a las 
limitaciones de cada análisis; sin embargo, la combi-
nación de las 4 da una probabilidad analItica de la 
supervivencia de las células espermáticas y su capaci-
dad fecundante. 
2.2.1. Movilidad. 
Mide la efectividad del metabolismo que se ileva 
a cabo en la pieza media o parte central del esper-
matozoide y da como producto final la energIa en 
forma de Trifosfato de Adenosina (ATP) que em-
plea cada célula para sus movimientos. 
En un análisis microscópico que indica la relaciOn 
de espermatozoides que presentan un movimiento 
progresivo, contra aquellos que se encuentran quie-
tos o que se mueven en otros sentidos. Se determi- 
nO al observar a! microscopio (100 X 	) las mues- 
COOH COOH COOH COOH 
H=C—NH2 C0 H=C—NH2 C0 
CH2 	4 CH2 G,O.T. 	CH2 	+ CH2 
COOH CH2 CH2 COOH 
COOH 	COOH 
Acido 	Acido 	Acido 	Acido 
Aspdrtico Cetoglutarico Glutámico Oxaloacético 
Las muestras de semen fueron centrifugadas so-
bre un gradiente de centnfugaciOn discontinuo de 
glucosa, cuya densidad era mayor que la del dilu-
yente seminal y menor que la de los espermatozoi. 
des. 
Las células espermáticas pasaban a través del 
gradiente sin daflo y al Ilegar al final del tubo 
liberaban su enzimasolo dentro de la soluciOn de glu-
cosa, mientras que el diluyente permanecIa en la su-
percie (Brawn, 1971). 
El suero (glucosa + enzima) se incubó con a-
cetoglutarato por un periodo de tiempo dado. 
La reacción entonces se paraba por la adicón de 
la dinitro fen ilhidrazina, la cual se unIa con el a.ce- 
552 
toglutarato restante para asI formar una dinitrofenil-
hidrazona. 
El crecimiento en densidad representó el descen-
so en cetoglutarato del cual se calculó su actividad. 
2.2.4. MorfologIa acrosómica. 
Se prepararon lániinas con la coloración de Giem-
sa, la cual pet-mite determinar la morfologIa acro-
sómica. Las enzimas fertilizantes, hialuronidaza y las 
proteolIticas "Tripsina como enzima" están normal-
mente .contenidas en et acrosoma. A medida que la 
célula espermática va en su proceso celular catabóli-
co seguido del dano celular, el acrosoma empieza a 
deteriorarse. Sobre la base de este proceso, los es-
permatozoides se catalogaron dentro de tres grupos 
(Saacke and Marshall, 1968): 
- TIPO I: Espermatozoides vivos caracterizados por 
una capa acrosómica intacta y uniformemente 
coloreada. 
- TIPO II: Células que mostraban desintegracián o 
alteraciones del acrosoma, COfl acumulaciones de 
colorante en él o aquellos que mostraban la pre-
sencia de un plato ecuatorial menos coloreado; 
- TIPO Ill: Células que presentaban pérdidas de Ia 
membrana externa o sin retención de la parte 
posterior del acrosoma. 
3. RESULTADOS Y DISCUSION 
En la Tabla 1 Se observan los resultados generales 
de los parámetros medidos, mostrando valores simi-
tat-es en el comportamiento del semen a través del 
tiempo de equilibrio en el estado de precongelación. 
Analizando estadIsticamente la movilidad, porcen-
taje de células vivas, porcentaje de G.O.T. liberada y 
degradación de las células espermáticas se encontró 
que existe una diferencia altamente significativa 
(P 0,01) del semen diluido sin congelar en relación 
con el congelado. No se encontró significancia en ci 
comportamiento del semen en ninguno de los dos 
tratamientos, a través de las horas de equilibrio del 
glicerol. 
La movilidad y ci porcentaje de células vivas, 
mostraron similitud en el comportamiento durante 
las 22 horas de análisis tanto antes como después de 
congelar ya que sus curvas van casi paralelas (Figura 
1). Se encontró que at efectuar la congelación des-
pués de las 4 horas de equilibrio se presenta mayor 
recuperación esperrnática resultando los valores más 
altos en el porcentaje de movilidad y porcentaje de 
espermatozoides vivos a las 4 y a las 22 horas 
respectivamente, donde se reportan valores del 
60,0% de movilidad a las 4 horas y 57,05% de 
espermatozoides vivos a las 22 horas. Estos datos 
concuerdan con los suministrados pot- Sullivan y 
Mixner (1963), quienes analizando movilidad, utili-
zación de azácares y producción de ácido láctico, 
TABLA 1. Resultados generales de dos parámetros medidos. 
Tiem ode - 
Equiltbrio 
Tratamiento % Movilidad % Vivos 
/c G.O.T. 
Transaminasa 
glutámica 
oxaloacética 
Acrosoma 
II III 
1 H Precongelacion 75,25 73,50 58,35 83,30 a 12,50 a 4,20 
Post-congelaciôn 49,50 47,50 75,10 61,80d 28,05e 9,95 
2 H Precongelación 7350 74,10 57,45 82,85 a 13,20 a, b 4,00 
Post-congelacion 55,00 53,90 81,00 70,10 c 22,75 d 6,90 
3H Precongelacion 73,25 71,95 57,15 82.00 a 13,50 a, b 4,50 
Post.congelacion 56,25 54,40 73,65 74,40 b 19,00 c 6,86 
4 H Precongelacion 74,00 73,00 59,70 82,05 a 13,40 a, b 4,50 
Post-congelación 60,00 56,10 72,50 72,85 b, c 19,95 c 7,20 
5 H 
Precorigelacián 73,50 71,75 57,50 79,85 a, b 14,35 a, b 6,0 
Post-congelación 55,50 53,45 75,35 70,75 C 21,50 C 7,70 
22 H 
Precongelacion 68,75 67,85 61,30 74,80a, b 17,75 b, c 7,60 
Post-congelaciôn 52,25 57,05 75,50 66,05 c, d 26,20d, e 9,10 
Promedios de los valores obtenidos a 10 largo del tiempo de equilibrio, Se encontró diferencia altaniente significativa (P \( 0,01) 
entre el semen sin congelar y el congelado, asi como por la prueba de Duncan se hallaron diferencias en la morfologia de los 
acrosomas (Tipo I y tipo II), tal como lo demuestran las letras. 
553 
%M0vILIDAD 
C', 
0 > 
> 
Cl, 
LU 
0 
N 
0 
LU 
CL 
Cl, 
LU 
>- 
0 
0 
-J 
> 
0 
LU 
0 
el 
90 
 
50 
PRECONGELACION 
-- POSTCONGELACION 
I 
22 H 
 
IN 	 2H 	 311 	 411 	 511 
TIEMPO DE EQUILIBRIO 
FIGURA 1. Movilidad y porcentaje de células vivas. 
encontraron que un perIodo de equilibrio para glice-
rol de dos horas fue significativamente inferior 
(P . 0,01) que a las 5, 12 ó 18 horas. No encontra-
ron diferencias en Ia evaluación Ilevada a cabo a Ia 
primera hora y a las 24 horas. (Estos resultados 
fueron independientes de los rnétodos de adición de 
yema de huevo o del perIodo de almacenamiento 
del semen). 
El análisis por G.O.T. (Figura 2) mostró en el 
perIodo precongelatorio un aumento lento pero 
progresivo, mientras que después de congelar las 
muestras, se observaron picos correspondientes a 
una mayor liberación de enzirnas a las 2 y 22 horas. 
Estos valores dan a entender que aunque se obser-
yen cifras de inovilidad y porcentaje de células vivas 
aceptables del 55% y 53,9% y de 52,25% y 57,05% 
para las 2 y 22 horas, respectivamente, se presenta 
una liberación de enzima del 81' y del 75,501?'r, on 
cada uno de los casos, pero no fue estadIsticamente 
significativo. De acuerdo con los estudios realizados 
por Pace y Graham (1970), los datos anteriores 
indican quc at efectuar la congclación on cualquiera 
de estas horas dani como rcsultado una baja proba-
bilidad de fertilización. 
Sin embargo, at congelar el semen a las 4 horas 
del tiempo de equilibrio se obtuvo el porcentaje niás 
bajo (72,50%) de GOT. on el medic extracelular 
(Tabla 1) y no fue significativo. Estos resultados 
concuerdan con los obtemidos por los autores men-
cionados antcriorrncnte, quienes no encontraron 
diferencias significativas (P ( 0,05) at dejar el semen 
en equilibrio por 3, 5, 8, 13 y 23 horas al realizar 
análisis de G.O.T., pero observaron un aumento 
progresivo en la liberación de Ia enzima. 
En el análisis de los cambios sufridos por los 
espermatozoides a nivel individual de su acrosoma 
(Figura 3), para el tipo I se encontró diferencia 
altamente signiflcativa (P 	0,01) entre los 2 trata- 
mientos entre 22 horas de tiempo de equilibrio 
antes de Ia congelación con respecto a las otras 
horas del mismo tratamiento. Mientras que con la 
prueba de Duncan no se encontró significancia entre 
los acrosornas que se observaron a las 5 y 22 horas 
precongelaciOn con 3 y 4 horas post-congelacidn. 
Con la congelación a Ia 1 y 22 horas de equilibrio 
se encontró el mayor dano espermático, ohserván-
dose disminuciones significativas del 21,50% y del 
8,75%, respectivamente (Tabla 1), sobre los valores 
correspondientes a dichas horas on la precongela-
ción. 
Los espermas parcialmente afectados (Tipo II) 
aumentaron en un 15,55%, un 9.55% y un 8,451_Xc al 
realizar Ia congelación a la 1, 2 y 22 horas, respecti-
vamente: resultados que fueron altaniente signifIcati-
vos respecto a las primeras horas de equilibrio pre-
congelación cuando no hubo mayor daio acrosómi-
co. Entre tanto, en las congelaciones efectuadas a 
las 2— 4-5 horas no se encontró diferencia significa-
tiva en los acrosomas parciahnente dañados que se 
encontraron a las 5 y 22 horas preconge[ación 
(Tabla 1). 
Comparando los datos pre y post congelatorio, se 
concluyO que son estad Isticaniente significativos 
para esta prueha (P 0,05), mientras que la niortali-
dad o dano total de las células espermáticas (Tipo 
III) 110 presentó diferencias (P \( 0.01) y su mayor 
incremcnto ocurrió durante la primera y segunda 
horas. 
RESUMEN 
En este trahajo se persiguid determinar el mo-
mento óptimo para la congciación del semen, se 
realizaron 1.440 anãlisis en muestras provenientes de 
3 torus iloistein, un Normando y un San Martinero, 
estudiándose todos los esiados dc la operación de 
congelacion, desde que se agregd at semen la solu-
ciOn isotónicade citrato dc sodio, yema de huevo, 
antibidticos y después de Ia adición del diluyente 
glicerolado a intervalos de una hora pre y post-con-
gelaciOn, haciéndose el examen Imal a las 22 horas. 
Sc midieron: movilidad, proporción vivus/moer-
tos. morfologia del acrosoma y liberación de la 
enzima intracelular Transaminasa glutãrnica-Oxalo-
acética (G.O.T.). Dc estos paránietros se obtuvo una 
medida de supervivencia espermatica adecuada. La 
mortalidad espermatica precongelacion alcanzó un 
máximo a las 22 horas, pero su supel-vivencia des-
pués de la congelación alcanzó los valores más altos 
a las 4 y 22 horas y el minimo a la primera hora 
del perIodo de equilibrio. El an5lisis de G.O.T. 
nlostró la mayor liberación de enzinla at congelar a 
las 2 horas y el menor valor al congelar a las 4 
horas Sill ser estadisticaniente significativo con res-
pecto a las otras horas de congelación. El menor 
daflo acrosómico so obtuvo al congelar a las 3 horas. 
A las 4 horas se ohservó el mayor porcentaje de 
niovilidad. 
SUMMARY 
Factors affecting bovine semen processing during 
the freezing phase. 
In this work we tried to find the better moment 
for the freezing and so we did-1440 analisis from 3 
1-lolstein bulls, I Normandy and I San Martinero. 
All the steps in the freezing process were studied, 
since the adition of part of the extender to the raw 
semen and at one hour intervals before the freezing 
and post-thawing after de adition of the glicerolated 
extender. Tile final exam was made at 22 hours of 
the equilibration time. 
The parameters studied were motility, percentaje 
of live-dead sperms. acrosome morphology and the 
release of the intracelular glutamie oxaloacetic Iran-
saminase (G.O.T.) enzyme. The higest sperm morta-
lity in the prefreezing stage was at 22 hours, but 
555 
LI] PRECONGELACION 
LI] POST CONGELACION 
75,55 	
7550
- 
67,50 
5H 	 2 2 H 
73,65 	 72,50 
	
57. IS II 
	 J 
I 	 I 
	
3H 	 4H 
TIEMPO DE EQUILIBRIO 
IH 
	
2 H 
75,10 
FIGURA 2. Análisis por G.O.T. 
U) 
0 
49 
Iz 
a 
50 
F I Espermas sin acrosomas dañados (Tipo I) 	 Precongelación 
Daño espermñtico Tipo II 
	
A Postcongelación 
DaFic espermàtico Tipo III 
IH 2H 3H 
A 
4H 
CO A 
5H 
A 
22 H 
TIEMPO DE EQUILIBRIO 
i-fl 
(P 
FIGURA 3. Análisis de dos car-nbios sufridos por los espermatozoicles a nivel individual de su acrosoma, 
the survival after thawing gave the best results at 4 
and 22 hours and the minimun values at the first 
hour of the equilibration period. 
The G.O.T. analisis showed the higest release of 
the enzyme when semen was frozen at 2 hours and 
the minor value at 4 hours, but it was not statisti-
cally significant with the other hours of freezing. 
The minimum acrosomic damage was obtained 
during the freezing at 2 hours and at 4 hours and it 
was observed the higest percentaje of motility. 
6. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 
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558