Ajuste de la técnica de cultivo de linfocitos T para la obtención de cromosomas en ovinos de pelo en condiciones mínimas de laboratorio

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AJUSTE DE LA TECNICA DE CULTIVO DE LINFOCITOS T PARA 
LA OBTENCION DE CROMOSOMAS EN OVINOS DE PELO EN 
CONDICIONES MINIMAS DE LABORATORIO 
Jorge Eduardo Gallo B. 
RESUMEN 
En ias instalaciones del Centro de Diagnostico del Instituto Colombiano Agropecuario 
(lCA), en lbagué (Tolima), localizado a 1.200 msnm, con temperatura media de 	y 
humedad relativa del 70111C.: se ajustó Ia técnica del cultivo de linfocitos ovinos, con el 
propOsito de obtener cromosomas aptos para estudios citogenéticos clásicos que preten-
den la evaluación de Ia distaricia genética entre las principales variedades de ovinos de 
pelo explotadas en Ia regiOn. Se utilizaron condiciones mInimas de laboratoria reempla-
zándose el uso de Ia cabina de flujo laminar por medidas asépticas fisicas (mechero 
3unsen) y quimicas (desinfecciOn con etanol). 
Se recomienda para el cultivo el uso de 5 centImetros cCibicos de medio rpmi, enriqueci-
do con 1 centimetro de suero fetal bovino, adicionado de 0.2 cc. De solución de uso diario 
de phitohemaglutinina P. 
El periodo de incubaciôn óptimo fue de 66 horas, 20 minutos antes del plazo menciona-
do, se adicionan 0.1 cc de Colcemid. 
La muestra debe someterse por 20 minutes a la acción de la solución hipotônica Los 
procesos restantes son semejantes a los reportados por Ia literatura nacional e interna-
conal. 
E Proyecto "CaracterizaciOn citogenética 
del ovino colombiano de pelo"; pretende de-
terminar y evaluar heteromorfismos 
cromosOmicos que permitan estimar Ia dis-
tancia genética entre los diferentes grupos 
raciales explotados en los departamentos 
del Tolima y Huila. 
Para el cumplimiento de este objetivo se 
debe aiustar Ia técnica de cultivo de 
_infocitos; pues a pesar de reportar Ia lite-
ratura suficientes variaciones sobre esta 
écnica aolicada a mamIferos y 
especificarnente a ovinos domésticos, debe 
considerarse que éstas presentan una alta 
variabilidad en su respuesta frente a dife-
rentes condiciones ambientales, altos re-
querimientos de equipos y altos costos de 
implementaciOn. 
En respuesta a esta problemática, se de-
sarroUaron dos experimentos en las insta-
laciones del Centro de DiagnOstico del Ins-
tituto Colombiano Agropecuarlo (ICA) en 
bagué (Tolima) el cual se iocaliza a una 
altura de 1200 metros sobre el nivel del mar, 
con temperatura media de 25C y hume-
dad relativa del 70%. 
Los resultados obtenidos ajustan Ia tAcni-
ca oe cultivo de linfocitos ovinos mediante 
Ia variación del volumen de medio de culti-
vo, Ia determinaciOn de Ia concentraciOn 
Optima y tiempo de acciOn de mitogeno, 
tiempo de incubaciOn y tiempo de acciOn 
de Ia soluciOn hipotOnica y Ia coichicina. 
M.V.Z. investigadoradjunto, C.I. Nataima, Regional 6, Corpoica 
49 
REVISTA N414, Primer Semestre 1997 
Este ajuste permite disminuir el costo de 
implementaciOn de Ia técnica, incrementar 
a eficiencia de la utilizaciOn del tiempo del 
investigador y obtener material adecuado 
para los estudios citogenéticos. 
Los resultados concuerdan con los repor-
tes revisados de Ia literatura nacional e in-
ternacional sobre concentraciOn de 
mitogeno, tiempo de incubaci6n, tiempo de 
acciOn de Ia colchicina y Ia soluciOn 
hipotónica y demuestra Ia factibilidad de 
utilizar menores volémenes de medio de 
cultivo y un mInimo equipo de laboratorio, 
con resultados semejantes a los reporta-
dos por Ia literatura. 
REVISION DE LITERATURA 
La citogenética es una ciencia hIbrida que 
trata de correlacionar los procesos celula-
res, especialmente aquellos de los 
cromosomas, con fenómenos genéticos. 
MCFeelIy 1990, define a esta ciencia, como 
el estudio de Ia morfologia y fisiologla de 
los cromosomas. 
La citogenética se ha aplicado en diversos 
campos; como Ia filogenetica, el estudio de 
anomalias del desarrollo, monstruosidades, 
disfunciôn reproductiva, pruebas de pater-
nidad y se convierte en Ia entrada lOgica 
del conocimiento de Ia estructura y funciOn 
del DNA, su manipulación y potencialida-
des. (McFeelly, 19901. 
Long, Susan en Mc Feelly 1990, indica que 
los estudios citogenéticos pueden realizar-
se a partir d células en tres estados: el 
interfásico, el mitótico y el meiOtico. 
La técnica más utilizada es el cultivo de 
linfocitos, cuyo procedimiento modal mph-
ca Ia toma de una muestra aproximada de 
un centimetro cübico de sangre periférica. 
Ia cual puede ser sembrada cornleta o 
separando Ia fracción blanca par media de 
técnicas quim!cas o fisicas (Yunis, 1974). 
El ambiente en que se desarrolla el cultivo 
se basa en Ia disolución en un media de 
una sustancia promotora del crecimiento 
(suero fetal); un promotor de la division 
celular (mitogeno) y supresores del creci-
miento microbiano (antibiOticos y 
antimicOticos) (Ehdridge, 1985). 
Bueno, 1991; Hare, 1979; y otros autores; 
enfatizan Ia importancia de Ia desinfecciOn 
de equipos, esterilizaciOn en materiales y 
asepsia del procedimiento. 
Para la toma de Ia muestra se recomienda 
una muy buena desinfecciOn del area a fun-
cionar. En general se utilizan tubos al Va-
do impregnados en heparina sOdica; y se 
escoge un vaso periférico de fácil acceso 
(ejemplo vena yugular) (Alvarez y Pineda, 
1993). 
La muestra debe Ilevarse al laboratorio en 
condiciones de refrigeraciOn. Henao y 
GOmez recomiendan Ia recolecciOn de 2-
10 cc y comentan observaciones persona-
las que han permitido cultivos viabies en 
bovinos, porcinos, equinos y bOfalos hasta 
24 noras después de Ia toma; siempre y 
cuando se efectOe un correcto proceso de 
ref rigeraciOn (Henao, 1993). 
El crecimiento celular puede ser inducido y 
mantenido en medios sintéticos de cultivo; 
estos medios se adquieren comercialmen-
te y consisten básicamente en una mezla 
de aminoácidos y sales balanceadas. Los 
medios más comunes son ei TC-199 , el 
Mc Coy's, 5A, Ham'sf-lO, M.E.M y el RPMI. 
(Eldridge, 1985). 
Generalmente Ia preparaciOn del media 
implica su solubilizaciOn, la esterilizaciOn 
fIsica, gracias al paso a través de una mom-
brana de 20 micras y el establecimiento de 
un ph de 7,2-7,4 (Manual: DIFCO 1990). 
El suero fetal se utiliza como fuente suple-
mentaria de proteinas y su acciOn se deno-
ta en un incremento del 10-250/,'Cl oe Ia mob-
tiplicaciOn celular (Verma Y, 1985). 
5c 
GALLO J., Técnica de cultivo de linfocitos Ten ovinos 
Se obtiene a nivel de mataderos procedente 
de fetos, sienda inactivado al sameterlo a 
temperaturas de 562 por 30 minutos y es-
terilizado por medios fisicos. Otros autores 
comentan la bondad del uso del suero de 
Neonato. o el suero autolago. 
En general la recomendación de 
suplementaciOn oscila entre un 10-20% del 
total de media a utilizar en cada cultivo 
(McFeelly, 1990; Roonev CzepuHcowski, 
1987; Verma & Babu. 1985: Yunis, 1974). 
En el cultivo debe garantizarse una corn-
pleta esterilidad en equipos. reactivos y 
gran asepsia en los procedimientos de 
muestreo y siembra. Para lograr este re-
querimiento, se adiciona al media de culti-
vo sustancias antimicrobianas coma la 
penicillina, a estreptomicina y un fungicida. 
La recomendacibn modal indica agregar 
100 U.I. penicilina 100 microgramos de 
estreptomicina y 25 microgramos de 
fungizone por cada centImetro de media a 
preparar (Edridge, 1985). 
Los mitógeaos rnás utilizados son las 
Phitohemaglutininas; las cuales son 
mucoprateinas obtenidas a partir del frijol 
rojo (Phaseolus vulgaris); y utilizados ni-
cialmente gracias a su actividad aglutinan-
te. Como mitágeno, se conoce que Ia acti-
vidad de Ia Phitohemaglutinina A (PhA), es 
exclusiva sobre los linfocitos T, lo mismo 
que otros mitógenos como el Pokeweed tipo 
1, 2, 3 y 4 (PKW) y Ia concanavalina (Con 
A). 
Otras pratelnas coma Ia Con A-5, inducen 
Ia transformación y duplicaciOn de los 
linfacitos B. 
La posolagia recamendada para el usa 
coma rnitógeno de Ia Phitohemoglutinina 
pomedia 59 Ug/mI de media (Alvarez y 
Pineda. 1993). 
E proceso de siembra se inicia con Ia des-
infeccion con Etanol a 70% de cabina de 
fiUja laminar; se enciende con 12 horas deantelaciOn Ia luz ultravioleta, disponiendo 
los materiales de vidria a utilizar. Cumpli-
do el plaza, se debe apagar la luz 
ultravioleta; se preparan los medios y se 
adiciona 1-2 cc de sangre campleta; por 
cada frasco de cultivo de 10cc. (Henao, 
1993). Eldridge, 1985 recomiendadispaner 
Ia incubaclora a 39,1C, con un perloda de 
cultivo de 66 a 72 haras. Veinte minutos 
previas a Ia finalizacián del perfoda de cul-
tivo, se adicianan 0,1cc de cotchicina a de 
colcernid y se mantiene en Ia incubadora 
(McFeelly, 1990). 
Cumplido ei perlodo He cultivo. Se 
centrifuqan a 1200 rpm por 10 minutos, se 
descarta el sobrenadante y Se le adicianan 
8 centimetras de solución hipotónica KCL 
0,075 M procediéndose a incubar por 20 
minutos, luega de este plaza se adiciona 1 
cc de soluciOn fijadora Carnoy, se 
hamogeniza y centrifuga a 1200 rpm por 
10 minutos. Posteriormente se pracede a 
adicianar 5 cm de soluciOn fijadora Carnoy, 
humogenizar y refrigerar de 4-7C por 30 
minutos. Se centrifuga, se adiciona fijador 
(8 cc) y se pracede asI por 3 a 4 veces con 
periodos de acción del fijador de 15 a 5 
minutos (Alvarez y Pineda, 1993; Buena, 
1991; Henao, 1993). 
Buena, 1991, recomienda lavar las lámi-
nas previamente por 30 minutos en etanol, 
15 minutos en metanol y pasarlas con 
Carnoy, fratándolas energéticamente con 
un trapa Iimpio que no desprenda fibras y 
cambiándola entre cada pase, después 
guardarlas en cajas preferiblemente en un 
congelador. Para el gatea debe tomarse Ia 
lámina con una pinza y desp render Ia gota 
a través de una pipeta pasteur a una altura 
minima de 30 centImetros. 
Caidas 4-5 gatas por Iámina se procede a 
flamear Ia misma para conseguir el des-
prendimiento de los alcohales en forma de 
vapor (Abadia, 1990; Henao, 1993). 
51 
REVISTA 	 Primer Semestre 1997 
La lámina una vez lista es dispuesta para 
observaciOn bajo campo oscuro, donde se 
visualizará su calidad; y luego se procede-
rá a las tinciones y bandeos del caso, se-
gun sea Ia necesidad y Ia técnica elegida 
(Bueno 1991; Henao, 1993). 
MATERIALES V METODOS 
Población a muestrear 
Se seleccionaron 28 ovinos colombianos 
de pelo, del cruce Sudan por Etiope, hem-
bras y de 1 a 2 años de edad, pertenecien-
tes a Ia granja El Palmar, ubicada en el 
Municipio de Venadillo (Tolima) y propie-
dad de Ia Secretaria de Desarrollo del De-
partamento. 
Los muestreos sangulneos se realizaron 
durante el año de 1995 en el primer se-
mestre. 
Materiales y equipos 
En general, se utilizaron equipos corrien-
tes de laboratorio con una variación como 
Ia no utilizacián de cabina de flujo laminar 
que fue reemplazada por el trabajo con 
mechero bunsen y desinfección estricta del 
area de cultivo, con etanol al 70%. 
El proceso se realizO en las instalaciones 
del Centro de Diagnástico de Ibagué. 
Método 
Se determinô el comportamiento de éstos 
a variaciones en el volumen total de rnedio 
(10cc Vs 5cc); el efecto de 3 niveles de 
Phitohemaglutinina F (0,1-0,2-0,3); y 3 pe-
riodos de incubación (60 horas, 66 horas y 
72 horas). 
También se evaluO el efecto de 2 perIodos 
de soluciOn hipotOriica y de colcemid (20 
minutos Vs 60 mimutos). 
Técnica de Laboratorio 
Se utilizaron los procedimientos generales 
recomendados por varios autores e incor-
porándose pequenas variaciones. tales 
como: 
Freparación previa de los medios, con 
24 horas de antelación y guardados en 
Ia incubadora. Este procedimiento per-
mitia detectar fallas en Ia asepsia y 
desinfecciOn antes de implementar el 
cultivo. 
Dentro de las técnicas de campo 
implementadas, Ia toma de Ia mues-
tra se realizO con jeringa desechable 
de 5cc y aguja No. 20, desinfectando 
el area de Ia vena yugular con produc-
tos yodados 6 etanol al 70%. 
Siembra de icc por cada frasco de 
cultivo aplicado directamente de Ia je-
nnga y con camblo previo de Ia aguja. 
Variables de Respuesta 
El efecto de los tratamientos se evidenciO 
mediante Ia medición del Indice mitótico, 
el conteo del nümero de metafases, nUme-
ro de metafases incompletas y Ia propor-
ciOn de las mismas. 
El Indice mitótico, se obtiene a partir de Ia 
siguiente relaciOn: 
I.M. = Mitosis (No.) X 100 
Células Totales 
Se evaluaron 100 campos nor cada trata-
me ntc 
Método EstadIstico 
Se utilizó un diseno completo al azar con 
arreglo factorial 2 X 3 X 3, donde el primer 
factor (A) correspondiO al volumen, contan-
do con dos niveles:a1 = volumen de 5 cm y 
a2 = 10cm. 
52 
GALLO J., Técnica de cultivo de lirifocitos Ten ovinos 
El segundo factor (B) fueron los niveles de 
mitogeno (Phitohemaglutinina) donde se 
consideraron 3 niveles; b1 = 0.1cc, b2 = 0.2cc 
y b3 = 0.30. El tercer factor (C) fue el tiem-
po de incubaciOn, doride el nivel Cl fue igual 
a 60 horas, el 02 = 66 horas y el C = 72 
horas. Para probar el efecto del tiempo do 
Coichicina y solución hipotónica, se utilizó 
una prueba de 1", con base en el muestreo 
de 10 animales y a implementacion de dos 
cultivos por animal. 
R ES U LTA DOS 
Análisis de varianza del arreglo factorial 
En Ia tabla No. 1 se presentan los valores 
obtenidos y su respectiva desviaciOn 
standart. 
TABLA 1. 	i,dices mitóticos riedios, Jesv;aciones standart obtenidos al evaluar 2 nivees de volumen. 
3 niveles de mitogeno y 3 perIodos de incubación. 
Volumen Nrvel 
Mitogeno 
Periodo 
Incubación (horas) 
IndiceMitótico 
Medio 
tndiceMitótico 
D.S. 
0,1 60 0.826 0,11 
0.1 66 222 0,10 
0.1 72 216 0.15 
cc 0,2 60 2.26 0,05 
0.2 66 2,53 0.15 
0.2 72 2,23 1.15 
0.3 60 2.23 0,2 
0,3 66 2,03 0.05 
0,3 72 2,6 0,1 
0,1 	 60 0,73 0,1 
0.1 	 66 2,23 0,11 
0,1 	 72 2,06 0.11 
1 CC (.0. 	 60 2.3 0.1 
2,53 .25 
	
0.2 	 . . 
	
0,3 	 00 
2,16 
2,2 
0,2 
0,17 
0.3 	 1 	66 2,08 0,05 
0,3 	 72 2,03 0.05 
En ia tacla 2 pucde coservarse ns cuadra-
dos medios v niveles de probabilidad para 
as variables independientes volumen 
Phitohemagiutinina y tiempo de ncubaión 
a partir de las variables dependiente mdi-
ce mitótico. El modelo general es altamen-
te significativo, denotándose un coeficien-
te de deteminaciOn elevado (0.94), con un 
promedlo general del indice mitOtico de 
2,05. A partir de este análiss, se ooserva 
quo 00 se detectarcn diferencias estadisti-
cas entre los volumenes de rnedio evalua-
dos, ni entre as interacciones volumen por 
concentración de Phitohemoglutinina p, vo-
lumen por tiempo de incubaciOn y volumen 
por Phitohemoglutinina por tiempo de 
incubación. 
TABLA2. 	El efecto del volumen. Ia corlcentración de mitógeno y el tiempo de incuoación sobre 
el Indice mitótico obtenido en cultivos de linfocitos ovinos. 
Fuente GL* Suma de Cuadrado F Pr> F 
cuadrados medio 
Periodc do incubaciOn (Pi) 1 449074 0.02449074 1.27 -0.2672 
Fitohemaglutinina(Fhm) 2 861111 1.85430556 96.16 0.0001 
VxFhm 2 675926 0.00337963 0.18 -0.8399 
PertodoincubaciOn (Pi) 2 621111 1.27310556 66.02 0.0001 
VxPi 2 635926 0.01817963 0.94 -0.3990 
Fhm x Fl 4 297778 1.42324444 73.81 0.0001 
VxFhmxPi 4 394074 0.00348519 0.18 -0.9469 
53 
REVISTAN66#4, Primer Semestre 1997 
La tabla 3 nos muestra ios rangos crIticos 	Phitohemaglutinina. El mayoindice 
y las diferencias establecidas mediante Ia 	mitótico se observO cuando se utilizaron 
prueba de Duncan. para la variable 0,2cc del mitOgeno Phitohemaglutinina p. 
TAI3LA3 	Prueba de Duncan para Ia variable Indice mitôtico obtenido segün el nivel de 
Phitohemaglutinina evaluada. 
Agrupamiento 
Duncan* Media n Nivel de Fhm 
A 2.3389 18 0.2 
B 2.1278 18 0.3 
C 1.7083 18 0.1 
*Medias con Is misma letra no son significativamente diferentes 
La tabla 4 nos enseña los rangos criticos y 
las diferencias establecidas mediante Ia 
prueba de Duncan, para la variable mdc-
oendiente tiempo de incubaciOn. El mayor 
indice se determinó a las 66 horas y ci 
menor a las 60 horas. 
La deterrninación de Ia existencia de 
interacciones altamente significativas, obli-
ga a Ia evaluaciOn de sus tendencias me-
diante un análisis de regresián. 
TABLA 4. Prueba de Duncan para Ia variable indice mitótico obtenidosegün el periodo de incubacián 
evaluado. 
Agrupamiento 
Duncan* Media n Nive1 de Fhm 
A 2.2706 18 66h 
B 2.1444 18 72h 
C 1.7600 18 60h 
Medias con la misma letra no son sgniticativamente diferentes. 
Ariálisis de Regresión 
La detecciOn de una interacciOn altamente 
significativa entre los niveles de mitógeno 
(Phitohemaglutinina) y el tiempo de 
incubaciOn obligan a determinar el tipo de 
dependencia entre estas variables. Una ma-
nera de establecer esta relaciOn es a tra-
yes del análisis de regresiOn. 
Se evaluaron las regresiones lineales sim-
pIes y polinomiales para los niveles de 
mitógeno (0,1 - 0,2 - 0,3 cc) en donde se 
determinb un modelo altamente significati-
vo para el nivel 1 (0,1 cc), con un coefi-
ciente de determinaciOn del 67%. 
54 
GALLO J., Técnica de cultivo de linfocitos T en ovinos 
En Ia tabla 5, puede apreciarse los valores 
estimados para los respectivos parámetros 
de la ecuación; en donde explorar Ia res-
puesta cuadrática de los niveles de 
mitógeno (Phitohemaglutinina); se determi- 
nO un modelo altamente significativo para 
el nivel 1 (0,1 cc), en donde el valor dcl 
coeficiente de determinaciOn, alcanzaba el 
97,47%. 
TABLA5. Análi&s de regresión lineal simple para las variables interactuantes Fhm y Pit. 
Modelo 	Nivel FHm* F Prob>F Intercepto Pi R2 
(a) (b) 
1 0.1 32.5 0.0001 -5.64 0.11 0.67 
2 0.2 0.489 0.4945 2.79 -0.007 0.02 
2 0.3 1.678 0.2136 2.67 -0.008 0.09 
Fhm: FitohemaqIunnna 	Pi: Periodo de incubaciOn 
En la tabia 6, se presentan los parámetros estimados para esta regresiOn. 
Tabla6. 	Análisis de regresión cuadrática para las variables interactuantes 
Phitohemaglutinina por perIodo de incubación. 
P i\'!odeio 	Nivel 'FHrnl Vir F Pro>F Intercepto *pj 
(bi) 	(b2) 
R2 
1 0.1 288.7 0.0001 -99.5 2.97 -0.021 0.97 
2 0.2 7.927 0.0045 -32.3 1.06 -0.008 0.51 
3 0.3 2.734 0.0972 16.71 -0.43 0.003 0.26 
Fhm: Fitohemaglutinina 	*Pi: Perodo de incubaciOn 
Pruebas de "t." 
El efecto del tiempo de acciOn de Ia 
coichicina (colcemid), y de Ia soluciOn 
hipotónica (KCL 0.07 M) se determiná me-
diante Ia comparacián de medics de ias 
"ariabies respuestas, nürnero de metafases 
completas y nümero de metafases noorn-
pletas. También se evalud la prcporciOn de 
metafases incompletas; se determinO que 
no existe diferencia entre las variables ova-
uadas. 
DISCLJSION 
Equipo de Iaboratorio 
Mediante el ajLlste de Ia técnica, se deter-
rninó la posibilidad de suprimir el uso de Ia 
cabina de flujo laminar, la cual se utiliza 
corno una herramienta tendiente a facilitar 
as condiciones asépticas en ci cultivo 
(Abadia, D. Gast, P. 1960; Bueno, 1991: 
E!dridge, 1985; Hare, 1979; I.S.C.N.D.A., 
1989). 
55 
REVISTAN6Ø*6, Primer Semestre 1997 
La cabina fue reemplazada por una desin-
fección a fondo del area de trabajo median-
te el uso de etanol comercial al 700/o. La 
siembra se acompañó del uso de dos me-
cheros de Bunsen y el aislamiento del cuar 
to designado para el cultivo. Esta posibili-
dad habia sido explorada en el laboratork 
de citogenetica de la Facultad de Medicina 
Vetednaria de Ia Universidad Nacionai de 
Bogota en 1991. 
Toma de Ia muestra 
En general se siguieron las recomendacic,-
nes de diferentes autores, efectuándose 
una variación ünicamente en el uso de tu-
bos heparinizados al vaclo. Estos fueron 
reemplazados porjeringas desechables con 
capacidad de 5 centImetros cübicos, pre-
paradas mediante Ia adición de una fina 
capa de heparina comercial diluida en Ia 
proporciOn 1 :2 y adicionando a cada jerin-
ga 0.3 centimetros aproximadamente. 
Eldridge recomienda utilizar 143 unidades 
de heparina por cada tubo al vaclo, tenien-
do en cuenta que un exceso de este 
anticoagulante disminuye Ia viabilidad del 
cultivo celular (McFeelly 1990). 
Procedimiento de Cultivo 
En general, se siguieron las recomendacio-
nes de Bueno 1991 y Henao 1993. Se sem-
bró aproximadarnente un centImetro de 
sangre completa detenléndose el proceso 
de fijación cuando el botón celular preseri-
taba un aspecto limpio, lo cual requeria un 
promedio de 3 pases. 
Volumen del medio 
El análisis estadIstico no detectó diferen-
cia entre los indices mitoticos al utilizar 5 
centimetros o 10 centImetros totales de 
medio de cultivo. El promedio para el vo-
lumen menor fué de 2.07 y para el mayor 
de 2.03. 
La utilización de volimenes reducidos de 
medio de cultivo ha sido una práctica poco 
comUn, sin embargo, Bueno, 1991 reco-
mienda procesar Ia muestra total en dos 
frascos separados con volümenes de 5 
centimetros que se unen en el momento 
de Ia cosecha.. No se conocen evaluacio-
nes de los contenidos individuales. 
Los indices mitóticos contenidos al utilizar 
5 centimetros totales de medio son seme-
jantes a ios hallados por Perilla, 1994, en 
bovinos : cuando al utilizar el mitogeno 
fitohemaglutinina P ccn volümenes de 10 
cc de medio, encontró indices mitóticos que 
oscilaban entre 0.83 y 2.27. 
Estos resultados indican Ia factibilidad de 
emplear voiümenes reducidos de medio, 
disminuyendo los costos de cada cultivo, y 
obteniéndose cultivos viables, aptos para 
el estudio citogenético. 
Coiicentración de mitoqeno 
El mayor Indice mitótico, se determinO al 
utilizar 0.2 cc de phitohemaglutinina P en 
una concentraciOn de 14 microgramos por 
centImetro ciibico de cultivo establecido. 
Los indices mitóticos encontrados mues-
tran una media de 2.33, siendo más altos 
que los reportados por Perilta en bovinos, 
at utilizar Ia misma concentración. 
Alvarez, 1992 utilizã concentraciones con-
siderablemente màs altas para el cultivo 
de lint ocitos ovnos; recomendando Ia util-
zación de 59 rng de phitohemoglutinina por 
cada centimetro de cultivo y realizando 
cultivos de 10 cc de volumen totaL 
Al parecer Ia reducción del volumen de 
medio y de concentración de fitohema-
glutinina P establece un equilibrio que no 
es tOxico a las células y hace viable el cul-
tivo. 
Los resultado obtenidos permiten recomen-
dar niveles inferiores de fitohemaglutinina 
56 
'3ALLO J., Técnica de cultivo de linfocitos T en ovinos 
que los ofrecidos por Henao, Bueno, Verma 	metafases incompletas o poliploides y Ia 
y Babü y Roone y Czepulkowski. 	 proporciOn de las mismas. 
Periódo de incubación 
El análisis estadisUco permifirla la recornen-
daciOn de incubar los cultivos por 66 ho-
ras, ya que en éstos fué donde se abtuvie-
ron los mayores indices mitOticos (2.27 en 
promedio). En general, varios autores re-
comiendan perlodos de cultivos que osci-
Ian entre las 60 y72 horas. (Eld ridge, 1985; 
McFeelly, 1990; Rooney Czepulicowski, 
1987). 
El perIodo de incubaciOn presentO una 
interacción importante con el nivel de 
fitohernaglutinina, el cual al ser analizado, 
presentO el mejor ajuste al determinarse 
una relaciOn de tipo cuadrático entre el ni-
vel de 0.1 cc del mitogeno y el perlodo de 
incubaciOn. Al observar las predicciones 
basadas en las ecuaciones en los periodos 
experimentados, se detectaron mayores in-
dices a las 66 horas de incubaciOn. El ma-
yor ajuste en la interacciOn del menor nivel 
de mitogeno (0.1 cc) podrIa indicar Ia posi-
bilidad de utilizar este nivel en cultivos p05-
teriores; sin embargo el análisis individual 
del efecto del mitogeno sobre el Indice 
mitOtico señala claramente el segundo ni-
vel como un nivel Optima y de mayor res-
puesta. 
El efecto cuadrático determinado eviden-
cia un decrecimiento de los indices 
mitoticos al prolongar el perlodo de 
incubaciOn, To cual concuerda con 10 repor-
tado por Yunis, 1974; Eldridge, 1985 yotros 
(Buena, 1991; l-lenao 1993; McFeelly, 1990; 
Rooney Czepulicowski, 1987). 
Efecto de Ia exposición a Colcemid 
El análisis estadistico no detecta diferen-
cias entre el efecto de Colcemid por 20 
minutos o por 60 minutos, respecto al nO-
mero de metafases por conteo, nOmero en 
Un exceso de Colchicina o de Colcemid, 
hubiese producido un acortamiento exce-
sivo de los cromosomas, el cual fue sola-
mente ocasional o provocado seguramen-
te por el efecto del reactivo sabremetafases 
en periodos tempranos de Ia mitosis 
(McFeelly, 1990). 
La insuficiencia de este inhibidor del huso 
mitotico se hubiera detectado gracias a Ia 
apariciOn de la endoreduplicación. En este 
fenômeno, el huso mitOtico es inhibido par-
cialmente y Ia persistencia de algunas fi-
bras ocasionan la no separaciOn de los 
cromosomas presentándose mitosis con un 
ntmero superior al diploide, segOn Ta can-
tidad de cromosomas que hayan quedado 
unidos. Este fenOmeno no se detectO en 
ninguno de los cultivos. 
La baja incidencia de estos fenOmenos y 
los resultados del análisis estadIstico per-
miten establecer que Ia concentraciOn y el 
tiempo de exposiciOn al reactivo son Opti-
mos y que debido a Ia necesidad de incre-
mentar Ia eficiencia en el uso del tiempo 
del investigador, seria recomendable utili-
zar el me nor tiempo de exposiciOn. 
Efecto de Ia solución hipotónica 
El análisis estadistico no detectO diferen-
cias entre el efecto del cloruro de potasio 
0.07 M actuando por 20 minutos ó por 60 
minutos. El efecto se considerO al deter-
minar el nUmero de metafases por contea, 
el nOmero de metafases incompletas y la 
praporciOn de las mismas. 
El exceso de cloruro de potaslo en cancen-
traciOn o perIodo de acciOn ocasionarla un 
rompimiento brusco de las cOlulas mitOticas 
provocando Ia dispersiOn de los 
cromosomas contenidos y por tanto Ia de-
tecciOn de cromosomas salitarios y mitosis 
57 
REVISTA N4 .Ø'4, Primer Semestre 1997 
con un nümero inconstante de 
cromosomas. Una deficiencia de Ia solu-
ciOn hiootOnica provocaria Ia presencia de 
mitosis con un gran nümeo de 
cromosomas sobreimpuestos 0 amontona-
dos que no permiten el anälisis citogenético. 
La no detecciOn de estos fenOmenos y los 
resultados del análisis estadistico, perm-
ten establecer que la concentración y tiem-
po de exposición al reactivo son óptimos y 
que debido a la. necesidad de incrementar 
Ia eficiencia en el tiempo de dedicación del 
laboratorista, seria recomendable el uso del 
perlodo de exposición de 20 minutos. 
Proceso de cosecha, goteo y tinciOn 
Se siguieron las recomendaciones de Bue-
no, 1991 y Henao. 1993. No se encontra-
ron dificultades en su aplicabilidad. 
Los conteos coinciden con los ha!lazgos de 
Alvarez y Fineda 1993, y permiten Ia 
implementaciOn de las técnicas corrientes 
de bandeos cromosomicos. 
CONCLUSION ES 
El uso de 5 centImetros cübicos to-
tales de medio de cultivo no ocasio-
na diferencias estadisticas en Ia can-
tidad y calidad de Ia mitosis estudia-
d as. 
Los mayores indices mitóticos 
(X = 2.33), se obtuvieron al utilizar 
0.2 cc del mitógeno Phitohe-
maglutinina P en solucián de uso dia-
rio: (14 microgramos/cc). 
El periodo de incubación optima fue 
el de 66 horas, donde se obtuvo tin 
Indice mitOtico medio de 2.27. 
No existe diferencia estadistica en-
tre los periodos de exposiciOn de 20 
minutos y 60 minutos a los reactivos 
Colcemid y Ia soluciOn hipotOnica, 
obteniéndose mitOsis de buena call- 
dad para estudios de citogenética cIa-
sica. 
Se reconfirmO el ndmera diploide del 
ovino colombiano de pelo (ovis aries 
variedad sudan X variedad etiope) 2n 
= 54. 
RECOMENDACONES 
Teniendo en cuenta, que se trabaja con el 
minima de refinamientos técnicos, es per-
tinente advertir que deben extremar las 
medidas de seguridad con el propOsito de 
evitar accidentes con agentes contaminan-
tes que podrIan danar reactivos vitales, 
costosos y propiciar pOrdida de tiempo. 
A Ia luz de Ia establecido en esta serie de 
experimentas, se recomienda utilizar para 
el cultivo de infocitos ovinos, el siguiente 
protocolo 
Preparación del medio para siembra con 
24 horas de antelación y en el orden re-
ferido. 
* 5ccrpmi1640 
* 	Suero fetal bavino al 20% (icc) 
* 	0.2 cc ae phitohemaglutinina P solu- 
ciOn diana 
* 	Guarder en incubadora a 37 00, no 
utilizar si se observan entubiamientos 
a cambios drásticos de color. 
Toma de Ia muestra 
Jeringa desechable de 5 cc conte- 
niendo 0.3 cc de heparina sOdica 
(liquernine R) en diluciOn 1 :2. 
DesinfecciOn quimica (Etanol al 70%) 
del area a puncionar. 
Ref rigeraciOn de la muestra (2-4 cc) ; 
sin que se ponga en contacto directo 
con el medio refrigerante (hielo). 
58 
GALLO J., Técnica de cultivo de linfocitos T en ovinos 
Siembra 	 lentamente tratando de obtener una 
mezcla perfecta. Si es necesario, 
* 	LimpiezaydesinfecciOnprofundadel 	golpear suavemente al fondo del 
area de trabajo. 	 tubo; agregar 8 centimetros más do 
solución Carnoy, agitando permanen- 
* 	Control de corrientes de aire. 	 temente. 
* 	Usa de 2 mecheros Bunsen (1 a cada * 	Dejar en reposo por 30 minutos a tern- 
lado) peratura de 4-7 o (nevera). 
* 	Gambia de aguja a lajeringa Centrilugar a 1000 rpm por 10 minu- 
tos 
* 	Flameado do tapas y boca de fras- 
cos do cultivo. * 	Desechar el sobrenadante 
* 	AdiciOn de 1 centimetro do sangre, * 	Agregar 8 cc de soluciôn Carnoy, 
flameado de boca del frasco y tapa- mezciando de tal forma que no se 
do. produzcan 	grumos 	o 
compactaciones. 
* 	incubación a 37 2C por 66 horas. 
Dejar reposar por 15 minutos en ne- 
Cosecha vera; repetir el proceso, dejando en 
reposo por 5 minutos. La fijaciOn es- 
* 	20 minutos previo al cumplimiento do tará completa cuando el baton tenga 
las 66 horas de cultivo, se adiciona- aspecto traslucido. 
ran 0.1 cc de soluciOn comercial de 
Colcemid ; mezclar con movimientas 
suaves. E! goteo 
* 	A las 66 horas se pasará el conteni- 
do del frasco a tubos de punta cOnica * 	Preparar las láminas lavándolas por 
y se centrifugara por 10 minutos a 30 minutos en metanol, 15 en etanol 
1.000 revoluciones. y 5 minutos en soluciOn Carnoy. 
* 	Mediante el uso de pipetas Pasteur; * 	Ordenar las láminas y colocarlas en 
se desechará el sobrenadante. un congeiador. 
'. 	Adicionar al botOn obtenido previa- * 	Disponer el botOn celular con una 
mente, 8 centimetros do solución cantidad relativa de soluciOn Carnoy 
hipotOnica (KCI 0.07M). (1-2 cc) y dejar caer 4-5 gotas por 
iámina, desde una aitura de 1 m. 
Se recomienda adicionar inicialmen- Dejar secar. 
te 2 centimetros y mezclar con movi- 
mientos suaves. Dejar en incubado- * 	Guardar láminas en caja para los 
ra por 20 minutos. bandeos. 
* 	Centrifugar a 1000 rpm por 10 minu- * 	Efectuar la coloraciOn normal con 
tos, desechar sobrenadante. Giemsa segOn ci método de Bueno 
* 	Adicionar 1 cc do soiución Carnoy, (3) y Henao (7). 
59 
REVISTAN44ZM4, Primer Semestre 1997 
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