Aplicación de las técnicas moleculares para diagnóstico de las enfermedades porcinas en Colombia

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Iombia-
J. D. Mogollón G., M. A. Rincón M., G. Arbeláez.5, Ruz, S, de Lo Roso y A. M. Loro 
**
Introducción
I diagnóstico preciso es de gran impodancia en la salud y en la producciÓn
porcina. Para diseñar panes apropiados de tratamiento, de prevención
y control, el productor y los profesionales deben identlficar y detectar
fl$.$){Fl corTectamente los agentes patógenos que están afectando una población
Dorcina determinada. Es conveniente que los profesionales del sector porcícola y los
productores se enteren de las nuevas tendencias en el mundo sobre eJ uso de los métodos
moleculares para el diagnóstico de las enfermedades porcinas, Las técnicas de biología
molecular se han conveftido desde mediados de los años 80 en herramientas necesarias
en los laboratorios de diagnóstico en medicina veterinaria y medicina humana. Fstas
técnicas moleculares están basadas en el análisis y detección del genoma (ácidos nucleicos)
de los agentes patógenos. Se trata de detectar fmgmentos del genoma (genes) bacteriano
o viral (agentes infecciosos) en los tejidos del animal infectado
que haya r-ue'to. o en l¿s secreciones, exL,dados o sangt e
de animales vivos pero que tienen la enfermedad (orina,
secreción nasal, plasma sanguíneo, semen). Como se
puede deducir entonces, no se requiere aislar el
agente infeccioso en un medio especial.
Los métodos tradiciona es de diagnóstico,
como son la serología (detección de anticuerpos
contra un agente infeccioso en particular), o el
aislamiento (identificación de un vjrus o una bacteria
en medio de cultivo o un cultivo celular), son de
gran ayuda para la medicina porcina, pero tienen las
siguientes limitaciones:
* Contribución del Laboratorio ¡uaci¡¡nal de D@gnóstico Veterinario lnst¡tuto Colombiaüo
Agropecuario, ICA, Awla El Dorado No. 42-42 BogotLi
** Médicos veteriIarios y Bacteriólogas, Convenio ICA-ACP/FNP A'4 29743 Bogotá, Colonbia
r 30
> Son muy lentos; en ocasiones se necesitan semanas
o meses para obtener un resultado.
z La e ' ic¿cia de estos mé'odos para de-ecLar ur
anlmal positivo infectado es bala (baja sensibi idad)'
en general
> I <Los .rétodo5 trzdicior¿les requieren ster'.pre qJe
las muestras sean frescas y siempre se necesita un
limitado rango de rnuestras.
) En ocasiones no permiten identiflcar organismos
que son demas ado fast diosos pam su aislamiento y
-^^ f - - - - i ¡ ^ A l -^^A.+ , - -
En contraste. el trabajo de diagnóstico con las
técn cas moleculares basadas en la detección de ácidos
nucleicos tiene varias ventalas:
! La composición de ácido desoxirribonuclelco ADN
(1ucreótioos) v¿ra enlre las oierentes esoeces fs
caro que hoy en día se pueden estab ecer dLferencias
entre las especres tomando como Dase la secuenc a
de as bases de nucleótidos (elementos bés cos que
constituyen un ácido nucleico) en el genoma.
) Es obvio, además, que todos los te j idos de un
organ smo t enen a misma composic ón de bases;
no importa el teldo u órgano de donde se tome la
muestra, la composición será siempre la misma.
F La composic ón de Las bases no varía con la edad,
la nutrición o el medio amb ente donde esté el
an mal o el hombre; el ADN (base de los genes)
es un e lemento estable e
nvariab e.
F nr¡nÁ<ín ¡la ¡ nra<cntc
revis ón es describir en forma
general las ap icac iones más
relevantes de los métodos moie
culares para el diagnól co de las
enfermedades de los porcinos y
vislumbrzr las perspectivas de su
uso en Colomb a.
Actualmente, en los abora
torios de diagnóstico en med
cina veter inar ia (Tabla l ) los
exámenes que usa la b ología
molecular nc uyen:
) La detección específica de
fragmentos del genoma
(genes) de un agente infec-
cioso, por n¡edio de la l"eacción en cadena de la
polimerasa (PCR).
) La identificación precisa de patógenos (agentes
infecciosos), por medio de la secuenciación (nucleó
tidos).
) Detecc ón de genes de resistenc a a las enferme-
dades y anál is is de maTcadores genét lcos Para
mejoran- iento genér ico erra especie Dorctna
(resistenc a a la flebre aftosa, meiorar tamaño de
camada, etc.).
Reacción en Caden¿t de Ia Polímerasa (PCR)
Desde cuando en l983 Kary lYul is desarro l ló la
Reacc ón en Cadena de la Polimerasa o PCR, por sus
siglas en inglés, esta técnica de b ología molecu ar se
ha converl do en herramienta bás ca y rutinaria en los
laboratorios de diagnóst co. Por su descubrimiento,
este nvest gador fue seleccionado para el Premio
Nobel en Química. La PCR es un método s imple
que permite amplificar (in vrtro en el laboratorio)
un segrnento ( f ragmento de un gene) de ác do
nucle ico ADN,
La reacción en cadena de la pol imerasa es a
tendencia del futuro inmediato en e diagnóstico en
med c ina porc ina, porque t iene mejor sensib i l idad
ipuede detec-ar l 'a'ta | 0 mio oorganismos en una
muestra), especfcidad (baja posibildad de anjmales
negativos) y arapdez, puesto que elexamen se puede
Tabla 1 .
Lista parcial de las enfermedades porcinas que se pueden diagnosticar por medio
de la Reaccrón en Cadena de lu Po|merasu (PCR, por' sus srglas en inglés)
competar en pocas horas. Adenrás, se puede usar
cualquier tipo de muestra para dentifcar un agente
patógeno (virus, baderia o parásito) o los genes del
huésped (cerdo).
La PCR consis te en la ampl i f cac ión del ADN
comprendido entre dos secuencias conocidas (regiones
previamente reconocrdas). Se construyen dos ceba
dores (o inic adores). Secuencias coftas de ADN que
rodean (l mitan) la reg ón a ser amplificada.
Es evidente entonces que se requiere identifcar la
secuencia de ADN con el frn de construir os cebadores
especificos, En contraste, no es necesano conocer a
secuenc a que está s endo amplificada. La reacción en
cadena es una repet crón de 25 a 35 veces (cíclica) la
reacc ón de ampificación del ADN,
Esta reacción necesita de tres pasos con tempera-
turas drst ntas:
. Una separación de las cadenas de ADN del virus o
bacteria a d agnosticar, a94"C:
. O t r a d e h i b r i d a c i ó n , e n a q u e s e j u n t a n o s
cebadores con as secuencras especificas de ADN
(hibridizan) a una temperatura que varía según la
naturaleza de los cebadores;
' Y por últ mo, una e ongac ón de la cadena de ADN
a partir de los cebadores, a 72"C.
En la Figura I se puede apreciar una descripcrón
esquemática del proceso de la reacción de PCR.
L a r e a c c i ó n ) e ' l e v ¿ ¿ c a b o e n u r ¿ n á q J i n a
computarizada que se llama termociclador, Esta máquina
cambia la tempemtura en cada fase durante os cic os
determinados. Los componentes principales de la
reacc ón de PCR son los sigu entes: el ácido nucleico de
la muestra (ADN extraído de la muestra, por elemplo
de tejidos como amígdala, bazo), os cebadores (primers
o iniciadores), nucleótidos (unidades básicas a partir
de las cuaies se sintetiza el ADN), una enzima, la taq
po|merasa (enzima que s ntetza el ADN) y una so ución
buffer. La taq polimerasa es una enzima que t ene la
característica de ser termo resistente, y puede soportar
os camb os de temperatura durante las disintas fases
de a reacción en cadena.
En la reaccrón, e l producto de cada c ic lo se
conviede en el sustrato (a base) para el próximo.
Al final de la reacción se obtiene una cantidad de
producto suficiente para poder ser detectado mediante
fluorescencia.
La detección rutinaria de los productos de PCR
se hace mediante un proceso de electroforesis en un
gel de agarosa (matriz física para m gración del ácido
nuclerco). En estos geles de agarosa se ponen, en
pequeños pozos, unas cantidades muy pequeñas de
los productos de PCR. (Este gel está rodeado de
un tampón buffer que fac lita e/ paso de la corriente
eléctrica). Cuando se aplica a corriente eléctrica a1 gel
de agarosa, el ácido nuceco mrgra del polo postivo
hacia e l po lo negat ivo, S mul táneamente con la
muestra que se está examinando, se pone un patrón
de ADN de peso molecular conoc do. que permite
determinar el tamaño de fragmento o segmento de
ADN amplificado. Una vez las muestras de campo
han mrgrado en el gel, seprocede a su observación
con luz u travioleta para detectar si la reacción fue
positiva o negativa.
FgLrra Re p €senta.iór esq uemátrca de la 1écn .a de Reacc ón en Cadena de a Poi me |¿sa (PCR)
Aplicación de Ia reacción en cadena
de Ia polimerasa (PCR), para Ia
detección de bacterias
Diagnóstico de la rinitis atrófica progresiua
producida por Pasteurella multocida
toxigénica.
La Posteurello multocido-es un habitante normal de
apamto respiratorio anter or de los cerdos. Eda bacteria
es un germen gramnegativo que tiene dos serotipos
capsulares (variedades): el tipo A y e D. Solo algunas
cepas de P multocrdo son capaces de producir una
rox in¿, es decr sor Loxigénicos: esLds Toxin¿s son
responsables de ia rinitis atrófica progresiva de 1os
cerdos. Esta loli. ']a destrLye los correles n¿s¿es. /
leva a manifestaciones clínicas tales como deformación
de la cara, hemorragia nasal y lagrmeo permanente;
como la toxina se absorbe en e1 organismo y se afeCra
el hígado y el riñón, el lechón pierde peso y demora
más días en salir al mercado. Desde el punto de vista
clínico es rmpoftante distinguir las cepas toxigénicas
de las no toxigénicas, para demolrar su presencia en
una granja afectada,
Existen vados métodos para estabiecer a presencia
de cepas toxSénicas: orueb¿ de f l lSA, prreoa de
citoxicidad en cultivos celulares y la PCR. Las cepas
toxigénicas tienen en el genoma (cromosoma) un gen
que codifica para la toxina (gene tox A), a cual tiene
un peso de 45 kd.
Cuando se trata de a s ar las cepas toxigénrcas de
P multocida de h sopos nasales en medios se ectivos,
se tienen diflcultades por la contaminaclón tan severa
de la cavidad nasal; por esta razón la técnlca de PCR
es muy apropiada.
Usando hisopos nasales de cerdos de granjas
infectadas es posible detectar un fragmento de 846
pares de bases del gene toxA, por medio de ia prueba
de PCR. La aplicación de esta técnica para determ nar
la prevalenca de cepas toxigénicas de P multocido
puede ser úti1 para establecer os componentes de
complelo respiratorio porcino (neumonía anzoótica),
en una granla en part cular
Deteccíón de Mycoplasma hyopneumoniae a
partir de bisopos nasales
Mycapls5.n6 hyoDr.eunon,oe es uno de lo. ¿ge'ltes
patógenos involucrados en la neumonía enzoótica (hoy
en dia el término más popular es complejo resprratorio
porcino). Ei cultivo de este microorganrsmo es difícil
y poco sensible. Otras técnicas disponibles son muy
laboriosas y costosas, como la inmunofluoTescenc a
directa en tráquea y bronquios de animales afectados,
Estas técnicas no funcionan b en en estados crónicos de
l¿ er"er redad. po'que l'"y pocos lrrcroo-g¿n smos,
Hoy en día se reconoce que e l contro l de
compeJo resprratono porc ino puede ser posibe
mediante vacunación, medicacrón y cambios en el
manejo, pero se requiere determinar con precisión
el momento en que ocuTre la enfermedad en el ciclo
de producción, para lograr efectivrdad en cualquier
intervención de campo,
La seroroSra es ra untcd Tec ' rca que se poo.a
ap icar en animales v ivos para estudios de mico
plasmosis porc na. Es út i para hacer estudios de
poblac ones en una granja porc na, para averiguar el
momento de infecc ón. Es irnpodante saber que la
seroconversrón (aparición de anticuerpos después
de la infección) es tardía; entre 4 y 8 semanas en
infecciones de campo. Esto constituye un problema,
ñ , , a c 1 ^ ñ , o r o c , , l ¡ : , . É _ i s o o e l e r m n a r e
rnomento de la infeccón por serología para esta-
biecer una medida de control eflc¿¡2.
Recientemente se diseñó una reacción de PCR
capaz de detectar el microorganismo d rectamente a
partir de hisopos nasales: el PCR convenciona, donde
se amplfica un determinado segmento del genoma
del Mycoplosmo utilizanclo un solo par de cebadores
(inic adores) a partir de muestras de pulmón de cerdos
infectados, donde el microorganismo está en gran
número. Sin embargo, esta técnica es insuficiente para
detectar pocos mycopasmas en la nariz cuando se
usan hisopos nasales. Por esta razón se usa hoy en día
un PCR que se llama an dado, más sensible porque
usa un par de cebadores ( in ic iadores) adiconales
que están rncluidos dentro de secuenclas del prime:
segmento amp ificado. De esta manera se utilizan dos
amp ficaciones consecutvas empleando dos pares
distintos y espec e específlcos dist ntos (Frgura 2)
En a Figura 3 se puede observar el resultado
comparatvo de la ap icacrón de los perfiles serológicos
y e PCR an dado para Mycoplosma. Se trata de una
granja de dos sitros con | ,200 madres y con un sistema
de manejo "todo dentro, todo fuera", a parlir del
precebo hasta finalización. Los cerdos comienzan a
toser a as | 6 semanas de edad. Se usa un programa de
vacunac ón a las 5 y 7 semanas de edad (Figura 3).
I
FrgJr. r 2 Rerresertacón e3qLer¡átca de PCf¡rrdado
* Tomado de Calsamiglid ei a1 1999
Fgul? 3. Aptlca.ió¡ de ros perf es sero ógicos y deteccón del M¡'coplasua por PCF
Por los estudios de laborator o hechos por
Calsamigla et dJ, se pudo observar que cuando los
lechones entran después del destete o el precebo y
la línea de fina ización, pocos animales son positvos
a Mycaplasma por PCR, pero el número de lechones
positivos a PCR empieza a aurnentar signif cativamente
con la edad, hasta alrededor de a edad
en la cua los cerdos tosen más (16 a
I semanas) . Los ant icuerpos contra
Mycoplosma que se observaron por la
prueba de ELISA hasta las l4 semanas
se deben quizás a la vacunación, Pero
la seroconvers ón debida a infección de
campo se encontró so lo a la edad de
B sen-¿n¿s. Se puede concru ' r cue e l
número de cerdos positivos por PCR se
incrementó notoriamente entre las l4 y
¿s r6 se-ndnas de eo¿o, lo ¡¡a ,ugiere
que éste sería el monnento óptimo para
la ap icación de os ant blóticos en forma
estrategrca.
Uso de la PCR para la evaluación
ante mortem de cerdos
afectados por Ileitis
La enteropat ía pro l i ferat iva po rc tn a
(EPP) es una enfermedad de distribuciÓn
m u n d i a J e n l o s c e r d o s . L a s f o r m a s
subagudas y crónicas se han asociado
con tasas de crecimiento reducido y dLarrea, casl
siempre con problemas entre las ó y 20 semanas de
edad; las formas agudas ocurren con diarrea severa
y anemia en cerdos de l2 a 30 semanas o más
El agente causa se ha ldentiflcado como Lcwsoni,r
¡ntracelludearis.
100
90
80
70
9nn
'6
O a ^
fI JV
"- 40
30
20
10
0
'10 14 18
Edad semanas
Este m croorganismo es una bacteria intracelular
y para su crecimlento en e laboratorio requiere de
cul t ivos celu ares y su cul t ivo toma hasta 6 días;
por tanto, es un método laborioso. Para propósitos
de d iagnóst ico y estudios epidemiológicos de la
enfermedad, se están usando dos técnicas en an males
vivos, para establecer ia presencia de la enfermedad
en una gran1a: la reacc ón en cadena de a po imerasa
para detectar la Lowsonio en materia fecal de animales
enfermos y Ia prueba de inmunofluorescencia ndtrecta
para la detección de antcuerpos (defensas contra
Lavrsonio) en animales infectados.
En el caso de ia PCR, en la matera fec¿l se pueden
detectar hasta l0r bacterias por gramo de heces. Con
esta técnica se puede amplificar un fragmento de 3l9
pares de bases del ADN de la Lor¡¡onlo. Con esta técnica
se demostró que la el mlnación de la bacteria en la materia
fecal es cklica y que agunos cerdos nfectados pueden
no eliminarla aunque el ileon (intefino delgado) esté bien
colonizado, Esta información es valiosa para iniciar os
pldnes de lrdta'nrerto con .redicac.ón eÍraleg,c¿.
Diagnóstíco del uirus de la peste porcina
clásica por medio cle la PCR
La peste porcina clás ca (PPC) es probablemente una
de las enfermedades infecciosas más impoftantes de
los cerdos domésticos. La enfermedad pertenece a a
iista A de a Ofc na Internacional de Epizootias, OlE, y
por tanto es exc uyente para el comercio internacional
de porc nos y sus productos,
Los programas de erradicación de la enfermedad
requieren de la caracterización del virus c rculante
en e l campo por medio de técnlcas moleculares.Para tal efecto, se hace la reacción en cadena de la
pol merasa para detectar a presenc a de infecctones
v ' ra le ' congéni las pe-s:srentes. Coro n,es. r¿s se
utiJzan amígdala, bazo, ganglios linfáticos y en general
tej dos rnfo dest el vrustambién se puede detectar en
el sernen de animales infectados.
Las regrones del genoma viral más estudiadas son
la región 5' no traduclda (NTR) y a proteína estructural
F2 (gp 55) Cor es.e metodo se p. rece iderr -ca-
un fragmento del genoma de /50 pares de bases en
la región 5 no trasladada a (NTR) y de l90 pares
de bases en a regón E2. La información obtenida a
C¿TdcTeflZdT las (eDdS . i¡ (U a1-es de pPC er el Carpo
permtte establecer estrategias adecuadas para su
control y erradicación.
Detección del virus del síndrome
reproductivo y respifatorio porcino (PRRS)
Es una enfermedad infecciosa de gran impacto econó-
mico. debdo a que causa alteraciones reproductvas
que incluyen nacimiento de prematuros, incremento
en el número de modinatos, momias. nacidos débiles,
severa enfermedad respiratoria en cerdos destetos e
incremento en las infecciones respiratorias secundarias
en los cerdos de fnalizaclón.
En Colombia, los estud os de reactvidad serológica
y e l a s lamiento de cepas v i ra les de campo han
demostrado que la infección se halJa ampi amente
dispersa en el país.
Para la detección del virus en los tejidos, el suero
y el semen de anrmales infectados se utiliza la técnica
de RT-PCR. En Colombia se ha usado este método
p¿ra ca-aclerrldT los aisiamlentos v'-ales ce campo.
Se arpli 'c" :n rragrenro del ger^ora pene^ec e.rte
al ma'co de lectu a rORr) 5. el fragrnerro es de 7l6
pares de bases (Fgura 4).
l4ediante este estudio se concluyó que en e país
crrculan cepas de orgen ameTicano que pos blemente
ingresaron al país con anima es importados. El patrón
genético de ias cepas de campo estudiados es muy
cercano a a cepa vacuna ATC 2332, sugirendo que
han ocurndo mutaciones del virus vacunal circulante.
Se piensa que la movilización de animales vacunados
y la ntroducción de reproductores que estuvieron
en contacto contribuyeron a la determinación de la
enfermedad. Es ir¡poftante destacar de este trabajo
que 80o/o de las cepas aisladas y caracterzadas del
vrus de PRRS en nuestro país provienen de granjas
no vacu¡adas; por tanto, se puede inferir que los
an males de reemplazo que entraron a esas granjas
habían estado en contacto con cercos vacunaoos
o infectados con cepas provenientes del prototipo
amer icano. Se encontraron también más de dos
cepas circulando en una granja y causando problemas
rep'ociuctivo5, pLes e v r,s ,e detectó po PCq e'r
tejdos fetales de casos de campo.
Es evidente que esta técn ca es muy valiosa para
el conocimiento eptdemiológico de esta enfermedad
en el pars,
Conclusiones
Ld reac,:tó'r en cadena oe l¿ oolrrer¿sa (DCR) se e$á
constituyendo en un método estándar para la detección
t( -
ur
L l i
o.l
ft
¡
rápida de virus y bacterias en muestrzs de campo Ex ste
todavía mucha preocupación en los países en desarro lo
por el colo de estas Pruebas. Afortunadamente cada
vez se desarrollan reactivos menos costosos y cada día
a ter'rira es "nás sensiiva y ráoida. :i se compd a con
otros métodos de d agnóstco,
Su ¡so en ld Po'crLu'TUr¿ roderna es und necesi
dad; por elemplo, en la demostración de a efectividad
de elim nación de agentés infecc osos de Pob aclones
nfectadas (erradicación), en la detecciÓn de agentes
infeccicsos que causen aborto (fetos descomPuestos
1234 5 6 7 I910 11 12
' , , , , 716 pb
difíciles de trabajar por otros métodos), o el monltoreo
de semen para detectar a presencia de vrus como
el PRRS, o ¿ oPC. o l¿ p ese.lctd ce oocteri,rs cor.l o
Brucello o Leptosliro.
Es posible que en el futuro se puedan hacer
chequeos de una misma muestra para la detecc Ón
d e g r u p o s o p a n e l e s d e a g e n t e s r e s P r a t o r l o s ,
entéricos o reproductivos. Es indudable que estas
metodologías serán de gran apoyo para e dlagnos
t ico, prevención, contro l y erradicac ión de las
enfermedades porcinas.
I
:
I
	 
	Introduccion.
	Aplicacion de la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), para la deteccion de bacterias
	Conclusiones.