Evaluación de la capacidad fertilizante In-Vitro del semen de toros San Martinero y Brahman

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Evaluacion de Ia capacidad fertilizante
In-Vitro del semen de toros San Martinero
Iv Dranman
Héctor Obondo Correo I
Olgo Lucía Luque Benovides )
Rodrigo Mortírtez Sarmtento l
esde t empo atrás, inveligadores colombianos como Castro ( | 979),
Hernández ( 198l) y flartínez, y col ( 1983) han enfatzado en as
ventalas reproductvas de los bo',, nos criolios, obten das grac as a
<u a'gc l.e"-rDo de ¿d¿nr¿cic- qá. ce 4--,u "ios) " "s dilc lc'
condicrones medic ambientales de trópico co ombiano, y que se
manifleslan en una mayor fert lidad, cuando se ccmparan con las de
otros toTos de ra¡as IntrodLrc da5
f r - ^ r ^ 1 , . ñ , . s , ' r c . " " , 
- . r e - r ¿ l o z o c i e m a m [ e . - . , e - i n c -
paz de lenilzar os ovocitos inr¡ed atamente son eyacuiados, debe
Pd\¿ DO'U^ pe JCO Ce (20dr l-r O^ q. e Ol L e nO "-lJtr er- e er
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Materiales J- mérodos
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: Zoolecnisla Ejcrci.ta Prlt ticulal
3 Zoolecnislat ltvesligodor L orpoita-
Semen
Se obtuvo de seis toros san mafttnero y sers toros
ora-r^,l¿r'. La ec¿d ce éslos ¿nima'es oscrló enL'e 5 y 7
años. El semen se congefó con un difuyente a base de
Tris-g cina, En cada pq lla de 0.5 m, se incorporaron
| 00 m llones de espermatozo des y sólo se utilizaron
las pq llas que a su descongelación presentaron una
movilidad espermática igual o superior a 40olo.
Para a capactación y lavado de espermatozoides
se usó medio TALP y eldía de su uso, se Le suplementó
con 0. I mlvl/ml de piruvato, 100 U,l,/ml de penicil na
y 3 m I de albúmina de suero bovino (BSA, por su
s gla en ingles)fracción V En un tubo cónico que contenía
I ml del medio TALP suplementado, se depositó en el
fondo el contenido de una pajtlla y se deló incubando
durante 2 horas a 39"C con aire y 57o de CO', humedad
relativa alta. Al cabo de éste período se extmlo 0.85 ml
del sobrenadante y se transfirió a otro tubo que contenía
5 ml de medjo TALP suplementado, se homogenizó la
mezcla en un agtador automático (vortex) e nmed ata-
mente después se centrifugó a 320 g/10 minutos, luego
se eliminó e sobrenadante por voicarniento de tubo y
el precptado se resuspendió en 5 ml de medio TALB
se homogenizó y se centrifugó por segunda vez, el pre-
ciprtado se diluyó en 0,5 ml de medio TALP y se hzo e
recuento espermático en una cámam de neubauen Se
adicionó medio TALP para que cada 2 m contuveran
25.000 espermatozoldes, vo umen que se adicionaría a
cada gota con célu as del cúmulos con ovocrtos (COCs)
y también se adic onaría 2 ml de soiución de hepar na a
los niveles de 2, 5 y lO pg/ml que se establecieron pam
este estudio. (Pansh, et al 988).
Ovocitos
Se obtuvieron de ovarios de vacas recién sacrifcadas en un
matadero que distaba 5 km del laboratoro. Los ovarios
se lavaron con soluc ón salinafsiológica (SSF) precalentada
a 30 35'C y se transpodaron en termos que contenían
SSF a a misma temperatura antes mencionada, En el labo-
r¿torio se les hizotres lavados así: l) con SS[ 2) con alcohol
a 757o y 3) con SSF A cada ovario se e aspiró (con agula
G lB) los folículos, cuyo diámetro varía entre 2 y B mm.
Posteriormente el ovario se codó en dos m tades y sobre
la superficie de cada hemiovario se pasó un instrumento
con | 0 cuchillas separadas entre sí por 2mm, (Hamano,
et, a 1993), este procedimiento se hizo dentro de calas
de petrí desechab es (diámetro 9 cm), que contenían
medio de madur¿ción, luego se colocaron los complejo
ovocito cúmulos, (COCs) que tuvierzn más de 2 capas
compactas de células del cúmulos (fgun l). Estos COC,
se lavaron 3 veces con medio TL-Hepes suplementado
con Piruvato ( | I mM/ml), penici ina ( 100 U,l/ml) y BSA (3
mg/ml). Los COCs se cultir,aron en 50 ml (10 l5COCs
por gota) de medio | 99, sales de Earle's (Gibco ab Grand
lsland, NY-USA), sup ementado con l07o de suero de
vacaen estro, | | ml'1/mlde Piruvato,0.02 mg/mlde FSH,
0.02 mg/m de LH g I mg/ml de 7 beta estmdiol. La
madur¿ción de édos ovocrtos se hizo durante un período
de74 a)7 horas a 39oC, cubieftos con aceite mineml,
humedad relativa alta y 5olo de CO- . Después los COCs,
se tranlrieron a 46 ml de medio llrodeJactato (Sirard, y
col 1988) suplementando con piruvato, BSA y penicilina
a las mismas concentraciones mencionadas antes, a cada
gota se e adicionó 2 ml de solución con espetmatozoides
y 2 ml de solucón de heparina.
Heparina
Se establec eron tres concentraciones 2, 5 y l0 ¡rg/ml
de heparina, Las gotas que contenían los COCs, esper-
matozoides y heparina se cubrieron con ace te mrneral
y se incubaron durante l5 7 horas a 39oC, humedad
relativamente alta y 5o/o de CO, en aire, Después de
éste período de fertil ización, las células del cúmu os y los
espermatozoides adheridos se removieron del ovocito
por agitacíón (vortex), luego ios ovocitos se montaron
en láminas porlaobjetos, se fijaron con ácdo acétco:
etanol (3: l )ysetñeroncon orceina(Si rardyel l9BB).
Los ovocitos que se consideraron fertilizados fueron
aque los en os cuales se observaron: dos pronúcleos
(fguras 2 y 3), un pronúc eo y una cola de esperma-
tozoide dentro del c toplasma del ovocito, nnás de dos
pronúcleos y más de una cabeza de espermatozoides
descondensados y asociados a colas dentro de cito
plasma de ovocito que se registraron ccmo fedilización
pol ispérmica, ( Saek, y co l , 1995) .
Analisis estadísticos
Se empleó un diseñofactora 3X2 (concentraciones de
heparina x raza), se util zó aná isis de varianza de modelo
|neal gereral de SAS. cor- 3 'epeticio.e: ooT rdza y se
establecieron las diferencias por Duncan a (p < 0.05)
(Stee y Torrie, | 990).
Resultados
Capacidad fertilizante ifr-vitro del semen
bouino
Según 1o razo: El semen proveniente de la raza cr olla
co ombiana san maftiner¿, superó significativamente
(p < 0.05) en 10.77o la capacidad fed lrzadora de
ovoctos de matadero a la mza cebuina brahman:
SY:49.7o/o Vs Br:39.07o (Tabla | )
Según el taro: La eva uación de a capacidad de pene-
tracón espermát ca de cada uno de los toros de
una misma raza, util izando 0 pglml de heparina,
reveló que no existen diferenc as entre los toros de
la misma raza (tabla 2)
Efecto rle Ia concentracion de heparina
sobre la Jertilizacion in-vitro r,lel semen
bouino
Al analizar las tres concentrac ones de heparina (2, 5
y 0 pdm ) que se adicionaron al med o de feftil iza-
ción en que se encontraban los ovocitos (COC'.), se
determinó un aumento signrlicativo (p < 0.05) en los
porcentajes de fertil ización al incrementarse la dos s de
hepar na: 34.3a/o, 47.7o/o y 56.\a/o respectivamente, o
cual permite recomendar como concentrac ón óptrma
la de | 0 mg/ml, para ser usada en fe rfilizac ón irt-vitro,
cuando se emplee semen de razas SM (Bos tcurus) y
Br (8os indrcus) .
-d po isperm.a. o¡e se ore.erró fue B.9olo er p'o
med o, pero no hubo diferencias entre las tres dosis de
heparina ni entre razas, ni se detectó n ingu na tendencia
defn da (Tab a 3),
TABLA 1. Evalu¿ción de la capacidad fe¡tilizante (ln-V¡tro) del semen bovino
de las razas S¿n Martrnera y Brahman
' Diferencias significativas (p < 0.05)
Dalo! de lres repel¡c¡ofiel
TABLA 2. Clasificación de los toros por su capacidad fertilizedora de ovocitos (ln-Yítro)
con Heparina a 10 [rg/ml.
TABLA 3. Efecto de la concentración de heparina sobre la fertilización ln-Vitro con seme¡
de ras razas San Martinera y Brahman-
Datos de lres repeticiones.
" 
b : Diferencias significati,,tds (p < 0.05)
Datos de lr$ repeticio es.
Discusión
Raza
La penetración espermática en ovocitos, in-vitro fue
superior en la raza san martinera (Bos louruit 49.Jo/o
que en la brahman (8os lndlcus): 39.0%, Estos resul-
tados están corrobo os con los repoftados in-vivo
por Hemández ( | 983); l '4artínezycol( | 983) y Castro
( | 979), quienes encontraron mayor natalidad en vacas
cebú apareadas con toros san madinero que con toros
cebú y por el trabajo de Obando y Holguin (2003),
quienes induciendo la reacción acrosómica in-vitro,
demostraron también la superioridad de la raza san
martinera frente a la Cebú.
Tbros
No se encontraron, diferencias de penetración esper-
mática entre los toros de una misma r¿za como sí se
repoda en la literatur¿ (Hillery 1990; Oliveira, | 994;
Saeki 1995, Lobo 1999 y col ). Sin embargo, Obando y
Holguín (2003) con la inducción de la reacción acrosó-
mica in-vitro y la misma concentración de heparina ( | 0
¡Lg/ml)y semen de san martinero y Cebú, edablecieron
dferencias entre toros de la misma mza.
Hepañna
Las tres concentr¿ciones de heparina p, 5 y l0 pglm)
que se adicionaron a las gotas que contenían los ovocitos
BRAHI"IAN (Bos indicus)SANMARTINERO (Bos tcurus).
y espermatozoides aumentaron Proporcionalmente los
porcentales de ferti izacón tanto en la r¿za san maftinera
(39.9a/o, 5a.4o6 y 62.61V), como en la raza bruhman
(30.7Vo: 36,7"/o y 5l.Ao/a), sin embargo, Chacón, y col
2003, usando nive es de heparina de 7, 4, 6,I y l0 m{
ml con semen gyr no obtuvieron una tasa de fertilización
directamente proporcionala ladosis de hepar na, logrando
la mejor respuesta con 6 ug/ml : 85,47o. (p < 0.05). Esta
drversidad de resuitados hace énfasis paraque se determine
el nivel óptimo de hepar na a usar en cada mza.
Polispennict
En éste estud o se encontró que os ovocitos fertilizados, que
presentaron polispermia nofueron inf uenciados pcr la raza
ni por la dosis de heparina en forma signficativa, en cambio,
Fukui, y co1 ( | 990) y Sacki, y col ( 1995), encortraron que
al aumentar la concentr¿ción de heparina se aumentaba la
polispermia sin afectar ei porcentaje de ferti ización.
Los porcentaje de pol spermia de éste estudio de
6.8 a l2.Bo/o, están por encima de los encontrados por
Chacón, y col (2003), que osc laron entre ,6 a 5,60lo
con semen de gyr, pero s m lar al obtenido por De
- Bem ( 990): 7.5 a l2o/o (Figura 5),
Conclusiones
. La penetración espermática en ovocrtos de matadero
fue superior 0.7o/o en la raza san martinem (8os
tdurus) que en la raza brahman (Bos indrcus).
La concentración de heparina
la fertilizac ón in vitro es óptima
manrnera y oTanman.
La presencia de polisperm a en
lizados fue independiente de la
nepar na y ce ra raza,
de l0 pglml para
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los ovocitos ferti-
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	Resultados.
	Discusion.
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	Bibliografia.