Manual de Bioquimica

Bioquímica I

Henry Castillo

12/9/2023

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Bioquímica I

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Universidad Nacional Autónoma de Honduras en el Valle de Sula
Departamento de Química
Lic. En Química Industrial

San Pedro Sula, Cortes
Mayo 2016
Brayan Rosales
Segunda Versión

Manual De Laboratorio De Bioquímica
LQI-335

Contenido
1. Formato De Entrega De Reportes De Laboratorio ............................................................. 1
2. Determinación experimental del pKa del ácido fosfórico en el punto del tampón fosfato.
...................................................................................................................................................... 4
3. Factores que afectan la actividad enzimática ......................................................................... 8
4. Degradación enzimática de polisacáridos ............................................................................ 15
5. Aislamiento de la caseína de la leche .................................................................................... 19
6. Extracción e Identificación del glucógeno .......................................................................... 23
7. Determinación de almidón y glucosa en alimentos ............................................................ 26
8. Estudio del bombeo de protones por levaduras; efecto de los inhibidores de la cadena
de transporte de electrones y de los desacoplantes. .......................................................... 30
9. Hidrólisis ácida del almidón y extracción e identificación de las lecitinas y el colesterol a
partir de la yema de huevo de gallina. ................................................................................... 33
10. Extracción del ADN de un plátano. ..................................................................................... 43
11. Fotosíntesis: Reacción de Hill ............................................................................................... 48

Formato De Entrega De Reportes De Laboratorio

1. Portada
Con libertad de elección con respecto del formato, pero donde no debe faltar el nombre de la práctica,
del estudiante, de la clase y la sección a la cual pertenece, número de grupo y fecha de realización de la
práctica.
2. Objetivos generales
Los que se encuentran plasmados en la práctica de laboratorio.

3. Resumen de la práctica realizada.
En este apartado debe resumirse el trabajo experimental que se llevó a cabo en el laboratorio para
cumplir los objetivos previamente establecidos. Deben excluirse las partes que no fueron realizadas, y
solamente colocar lo que se tomó en consideración al momento de hacer la experiencia. También incluye
los resultados obtenidos de forma muy sintetizada. No debe cometerse el error de colocar conclusiones
ni análisis en esta parte del reporte. Cualquier modificación a la que haya sido sometida la práctica
original, debe ser considerada.
Nota: aquí no se coloca teoría. Solamente se resumen TODAS las actividades realizadas durante la
práctica y sus resultados más importantes.
4. Procedimiento experimental y resultado.
Escritos en tiempo pasado y en tercera persona (se preparó (o se prepararon), se pesó (o se pesaron), se
colocó (o se colocaron), etc.). Debe escribirse el procedimiento exacto que se realizó en el laboratorio,
tomando en consideración cualquier modificación que haya sufrido la práctica original. De la misma
manera, se debe ser fiel a los reactivos utilizados, las concentraciones de los mismos, etc. Es decir, si se
utiliza un reactivo diferente al que se planeaba emplear, debe explicarse al respecto. Aquí pueden
colocarse fotografías, dibujos, esquemas o cualquier tipo de imágenes de los resultados obtenidos. Si hay
tablas de resultados, también se sitúan aquí. Los resultados deben ir plasmados junto con el paso
correspondiente del procedimiento experimental (solamente si este paso tiene resultados para mostrar).
Por EJEMPLO:
1. Verter rápidamente los 10 ml de la disolución más concentrada de yodato de potasio al
Erlenmeyer que contiene bisulfito y almidón, agitar y al mismo tiempo poner en

funcionamiento el cronómetro. Detener el cronómetro cuando aparece la
disolución de color azul y ANOTAR el tiempo transcurrido.

RESULTADO: no se observaron cambios inmediatos al mezclar ambas soluciones, sin embargo el
color azul apareció al cabo de un tiempo. Se observó que este tiempo varió a medida se varió la
concentración de la solución de yodato de potasio. (Colocar fotografías o dibujos que ilustren la
descripción).

2. Repetir la operación con las otras concentraciones de yodato y reunir los datos en una
tabla:
Tiempo de reacción según concentración de yodato
Concentración yodato (M) Tiempo (segundos) 1/tiempo (segundos-1)

RESULTADO: (Colocar la tabla de resultados).
NOTA: AQUÍ SI SE ESCRIBE EL PROCEDIMIENTO REALIZADO PASO POR PASO, DE
FORMA MUY DETALLADA. EN TIEMPO PASADO, PORQUE YA SE REALIZÓ.
5. Cálculos, gráficos, etc. (Si los hay)
En este apartado se desarrollarán todos los cálculos necesarios para elaborar las conclusiones, si los hay.
Los gráficos (si los hay), pueden ser hechos a mano (en papel milimetrado, log-log, etc.) o en el
computador, y luego plasmados en el reporte. No debe olvidarse nombrar correctamente cada gráfico y
señalar a qué tabla corresponde.
6. Análisis de resultados (esta parte es indispensable)
Intentar explicar científicamente el porqué de CADA UNO de los resultados obtenidos, de los
fenómenos observados, de los cálculos y de los gráficos, ayudándose del fundamento teórico, de las
explicaciones en el laboratorio y de pequeñas investigaciones (en libros, en el internet, etc.). Así, si hay
cambios de color, investigar por qué ocurrió, si hay producción de gases, si se vieron diferencias en las
velocidades de una reacción, o si se vio que una reacción no ocurrió, o para cualquier fenómeno
observado, investigar la explicación científica.
EJEMPLO:

Al mezclar el hierro en limaduras con la solución de sulfato de cobre (II) se observó un cambio de
coloración de azul a verde de la solución del sulfato de cobre pentahidratado y una acumulación de un
precipitado rojizo en el fondo del recipiente. Esto es debido a la reacción redox entre el Fe sólido y el ion
Cu+2, que forma Fe+2 de color amarillo verdoso y Cu sólido rojizo… etc.
7. Conclusiones
Las conclusiones son parte muy importante de una experiencia de laboratorio. En este apartado se
comprueba si los objetivos del desarrollo de la práctica fueron alcanzados. Aquí es posible:
 Enunciar teorías, leyes o fenómenos que se han comprobado mediante la experimentación.
 Llegar a una decisión, un juicio o una solución después de haber reflexionado sobre un asunto.
 Realizar deducciones o inducciones a partir de los resultados obtenidos.
 Sacar una conclusión por medio de un razonamiento, a partir de una situación anterior o de un
principio general.
 Razonar sacando una proposición nueva de una o más proposiciones dadas.
EJEMPLOS:
 Al disminuir la temperatura, la velocidad de la reacción entre el yodato y el bisulfito también disminuye. Así,
puede inducirse que, en general, la temperatura afecta directamente la velocidad de una reacción. Esto se pudo
comprobar haciendo…

 El benceno es insoluble en agua debido a que posee una naturaleza apolar. Fue posible comprobar este hecho al
mezclar benceno con agua, dando como resultado una mezcla heterogénea.

NOTA: Si en la práctica hay preguntas que contestar, responderlas en las secciones
correspondientes. Si es una pregunta de análisis, responderla en análisis de resultados. Si la
pregunta pide un esquema o dibujo, colocarla en resultados. Si se piden cálculos, colocarlos en
la sección de cálculos. Si se piden reacciones, colocarlas en análisis de resultados también.

Práctica No. 1:
Determinación experimental del pKa del ácidofosfórico en el
punto del tampón fosfato.

Objetivos:
1. Elaborar una curva de valoración para el ácido fosfórico mediante una valoración
potenciométrica.
2. Identificar la zona del tampón fosfato en la curva de valoración.
3. Determinar el pKa del ácido fosfórico en la zona del tampón fosfato de forma gráfica y
comprarlo con el valor teórico.
4. Estudiar la importancia del tampón fosfato en la regulación del pH intracelular y asociarla
con el pka del tampón fosfato.
Fundamento teórico
En los organismos vivos se están produciendo continuamente ácidos orgánicos que son
productos finales de reacciones metabólicas, catabolismo de proteínas y otras moléculas
biológicamente activas. Mantener el pH en los fluidos intra y extracelulares es fundamental
puesto que ello influye en la actividad biológica de las proteínas, enzimas, hormonas, la
distribución de iones a través de membranas, etc… La manera en que podemos regular el pH
dentro de los límites compatibles con la vida son: 1) los tampones fisiológicos y 2) la eliminación
de ácidos y bases por compensación respiratoria y renal. Los tampones fisiológicos son la
primera línea de defensa frente a los cambios de pH de los líquidos corporales, entre los que
destacan: el tampón fosfato, el tampón bicarbonato y el tampón hemoglobina.
El pH de los medios biológicos es una constante fundamental para el mantenimiento de los
procesos vitales. La acción enzimática y las transformaciones químicas de las células se realizan
dentro de unos estrictos márgenes de pH. En humanos los valores extremos compatibles con la
vida y con el mantenimiento de funciones vitales oscilan entre 6,8 y 7,8; siendo el estrecho
margen de 7,35 a 7,45 el de normalidad. También en el trabajo de laboratorio, es imprescindible
el mantenimiento de un pH para la realización de muchas reacciones químico-biológicas. Los

sistemas encargados de evitar grandes variaciones del valor de pH son los denominados
“amortiguadores, buffer, o tampones”. Son por lo general soluciones de ácidos débiles y de sus
bases conjugadas o de bases débiles y sus ácidos conjugados. Los amortiguadores resisten tanto
a la adición de ácidos como de bases.
En algunos organismos vivos existen tampones orgánicos e inorgánicos. Los tampones
orgánicos son las proteínas y aminoácidos y el tampón hemoglobina.
Los inorgánicos son el tampón bicarbonato y el tampón fosfato.
Tampón carbónico/bicarbonato
Está constituido por H2CO3 y HCO3 - . Aunque su valor de pK (6,1) está algo alejado del pH
fisiológico de la sangre (7,4), es un sistema muy eficaz debido a que: 1) La relación HCO3 - /
H2CO3 es muy alta (20/1), lo que le proporciona una alta capacidad tampón frente a los ácidos;
2) es un sistema abierto, con lo que el exceso de CO2 puede ser eliminado por ventilación
pulmonar de manera rápida; y 3) además, el HCO3 - puede ser eliminado por los riñones
mediante un sistema de intercambio con solutos.
Tampón fosfato
A pH fisiológico, las especies del fosfato con capacidad de tamponar son H2PO4 - y HPO4 2-
ya que su valor de pK es de 6,8. Así pues, para el tampón fosfato: pH = 6,8 + log HPO4 2- /
H2PO4 - A pH fisiológico de 7,4, la concentración de HPO4 2- (un 80%) es 4 veces superior a
la de H2PO4 - (un 20%). Así pues, el tampón fosfato es un sistema muy eficaz para amortiguar
ácidos. La concentración de fosfato en la sangre es baja (2 mEq/L) por lo que tiene escasa
capacidad de tamponar si lo comparamos con otros tampones (ej el bicarbonato). En cambio, a
nivel intracelular, las concentraciones de fosfato son elevadas lo que le convierte en un tampón
eficiente. Las grandes cantidades de fosfato dentro de las células corporales y en el hueso hacen
que el fosfato sea un depósito grande y eficaz para amortiguar el pH.
El sistema amortiguador de fosfato actúa en el citoplasma de las células y consiste de:

H2PO4- ↔ H+ + HPO42-

Está constituido por dos aniones poliatómicos en la sangre, éstos son el fosfato dihidrogenado,
H2PO4-, y el fosfato hidrogenado, HPO4-2.

El fosfato dihidrogenado, es un ácido débil y el fosfato hidrogenado es su base conjugada;
por lo tanto, se establece el siguiente equilibrio:

Cuando se agrega un ácido este equilibrio se desplaza hacia la izquierda, lo cual produce más
H2PO4-.

Cuando se agrega una base este equilibrio se desplaza hacia la derecha, lo cual produce más
HPO4-2.

El sistema amortiguador de fosfato es más eficiente a un pH cercano a su pKa de 6.86, por lo
que resiste cambios en el pH desde 5.86 hasta 7.86, por tanto, es muy efectivo para los sistemas
biológicos que realizan reacciones alrededor de pH 7.0. En los mamíferos por ejemplo el pH
extracelular y de la mayoría de los compartimientos citoplásmicos está en el intervalo de 6.9 a
7.4.
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
1. Llenar una bureta con NaOH (ac) de 0.1 M hasta 0.
2. Verter 20 ml de H3PO4 0.1 M en un beaker de 250 ml.
3. Colocar un agitador magnético dentro del beaker y colocar este sobre el agitador. Encender.

4. Sumergir el electrodo del pH -metro - sin que toque las paredes ni el fondo del vaso - sin que
lo toque el agitador magnético - diluir con agua destilada si fuese necesario.
5. Verter NaOH (ac) en volúmenes fijos y anotar pH para cada volumen según se explica a
continuación:
Anotar el pH inicial. Este será el pH cuando el volumen de NaOH añadido sea 0. Luego añadir
8 ml de NaOH 0.1 N y anotar este pH (asegurarse que la agitación sea constante). Seguir
anotando el pH para cada volumen según el siguiente cuadro:
Datos para la curva de valoración del ácido fosfórico
mL de
NaOH
0.1
añadidos
pH mL de
NaOH 0.1
añadidos
pH mL de NaOH
0.1 añadidos
pH mL de NaOH
0.1 añadidos
pH
1 15 29 43
2 16 30 44
3 17 31 45
4 18 32 46
5 19 33 47
6 20 34 48
7 21 35 49
8 22 36 50
9 23 37 51
10 24 38 52
11 25 39 53
12 26 40 54
13 27 41 55
14 28 42 56
Con los datos obtenidos, construir una curva de valoración para el ácido fosfórico (un gráfico
del pH en función de los ml de NaOH añadidos). Identificar en este gráfico las zonas buffer y
el pKa del ácido en cada una de sus disociacione

Practica No.2
Factores que afectan la actividad enzimática

Objetivos
• Comprobar la reacción sobre el peróxido de hidrógeno por acción de la enzima
catalasa, presente en tejidos animales y vegetales determinando los productos de
reacción.
• Estudiar algunos factores que afectan la actividad enzimática, como la temperatura,
el pH, la concentración del sustrato y de la enzima y la presencia de inhibidores.
• Confrontar los conocimientos teóricos adquiridos en clases con las actividades
experimentales en el laboratorio.

MARCO TEORICO
El término cinética enzimática implica el estudio de la velocidad de una reacción catalizada por
una enzima y los efectos que pueden tener factores como los inhibidores. Uno de los principales
estudios que se realizan en una enzima es medir el efecto en la velocidad de la reacción cuando
se modifican las concentraciones del sustrato y se mantienen constantes la concentración de
enzima, el pH, la fuerza iónica del medio, la temperatura, entre otros.
Se evalúa la influencia de estos factores en la reacción catalizada por enzimas con la finalidad de
determinar los intermediarios en una reacción y el papel que juegan en la reacción enzimática, es
decir, para predecir mecanismos de reacción. Es esencial entender estos mecanismos para
desarrollar nuevas herramientas moleculares, por ejemplo, para combatir enfermedades en las
que se conoce a la enzima que la produce. También es usual medir la actividad enzimática con
diferentes sustratos para entender su especificidad o bien, medir la actividad de la enzima de
diferentes tejidos u organismos para entender cómo las diferenciasen actividad están
relacionadas con la función y/o la fisiología del organismo del que proceden.

Los enzimas son biomoléculas especializadas en la catálisis de las reacciones químicas que tienen
lugar en la célula. Son muy eficaces como catalizadores ya que son capaces de aumentar la
velocidad de las reacciones químicas mucho más que cualquier catalizador artificial conocido, y
además son altamente específicos ya que cada uno de ellos induce la transformación de un sólo
tipo de sustancia y no de otras que se puedan encontrar en el medio de reacción.
FACTORES QUE AFECTAN A LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
Diferentes factores ambientales pueden afectar a la actividad enzimática. Destacaremos dos: el
pH y la temperatura.
EFECTO DEL pH: El pH es otro factor que influye en la actividad enzimática, debido a que
el pH influye en la ionización de los grupos funcionales de los aminoácidos que forman la
proteína enzimática. Cada enzima realiza su acción dentro de un determinado intervalo de pH,
dentro de este intervalo habrá un pH óptimo donde la actividad enzimática será máxima. Por
debajo del pH mínimo o por encima del pH máximo el enzima se inactiva ya que se desnaturaliza.
En la mayoría de las enzimas el pH óptimo está próximo a la neutralidad, aunque hay
excepciones.
La mayoría de los enzimas presentan un pH óptimo para el cual su actividad es máxima; por
encima o por debajo de ese pH la actividad disminuye bruscamente.
Este efecto se debe a que, al ser los enzimas de naturaleza proteica, al igual que otras proteínas,
se desnaturalizan y pierden su actividad si el pH varía más allá de unos límites estrechos. De ahí
la conocida importancia biológica de los sistemas tampón.
En la mayor parte de los casos el pH óptimo está próximo a la neutralidad, en consonancia con
el pH intracelular, pero existen enzimas con pH óptimo muy diverso según sea el pH del medio
en el que habitualmente actúan (los enzimas proteolíticos del jugo gástrico tienen pHs óptimos
próximos a 2 ya que este es el pH de dicho jugo). Por último existen algunos enzimas a los que
el pH no afecta en absoluto.
EFECTO DE LA TEMPERATURA: Al igual que ocurre con la mayoría de las reacciones
químicas, la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas se incrementa con la
temperatura. La variación de la actividad enzimática con la temperatura es diferente de unos

enzimas a otros en función de la barrera de energía de activación de la reacción catalizada. Sin
embargo, a diferencia de lo que ocurre en otras reacciones químicas, en las reacciones catalizadas
por enzimas se produce un brusco descenso de la actividad cuando se alcanza una temperatura
crítica. Este efecto no es más que un reflejo de la desnaturalización térmica del enzima cuando
se alcanza dicha temperatura.
La Temperatura influye en la actividad enzimática. En general por cada 10ºC que aumente la
temperatura la velocidad de la reacción aumenta de 2 a 4 veces. Esta regla se cumple hasta que
la temperatura alcanza un valor máximo (T° óptima) donde la actividad es máxima. Esto se debe
a que al aumentar la T° aumenta el movimiento de las moléculas y, por tanto aumenta la
probabilidad de encuentro entre el S y el E.
Si la T° aumenta por encima de la T° óptima, disminuye e incluso cesa la actividad enzimática
debido a que la enzima se desnaturaliza. Cada enzima posee una T° óptima, en las enzimas
humanas suele estar alrededor de 37ºC. Los animales poiquilotermos debido a que carecen de
mecanismos para regular la Tª corporal, se ven obligados a hibernar en la estación fría pues la
actividad de sus enzimas debido a las bajas temperaturas es muy baja.

INHIBIDORES: Son compuestos químicos que se unen al enzima, en distintos puntos del
mismo y disminuyen o incluso impiden su actividad. Estos compuestos pueden ser de distintos
tipos: iones, moléculas orgánicas y a veces el producto final de la reacción. A la acción que
realizan se la denomina inhibición. La inhibición puede ser:
·Inhibición irreversible: Cuando el inhibidor impide permanentemente la actividad enzimática,
bien porque se une de forma permanente con grupos funcionales importantes del centro activo
o bien porque altera su estructura. A estos inhibidores se les denomina venenos y a la inhibición
que realizan se la denomina envenenamiento del enzima. Ej. La penicilina que inhibe las enzimas
que sintetizan la pared bacteriana. El ion cianuro actúa sobre la citocromo oxidasa (enzima
respiratorio).
·Inhibición reversible: El inhibidor se une al enzima de forma temporal mediante enlaces débiles
e impide el normal funcionamiento del mismo, pero no la inutiliza permanentemente.

Puede ser de dos tipos:
Competitiva: El inhibidor es similar al sustrato y se puede unir al centro activo del enzima
impidiendo que lo haga el sustrato. Es decir ambos, inhibidor y sustrato compiten por unirse al
centro activo del enzima. La acción suele anularse aumentando la concentración del sustrato
No competitiva: El inhibidor no compite con el sustrato, puede actuar de 2 formas:
-Sobre el enzima, uniéndose a él en un lugar diferente al centro activo y modificando su
estructura lo que dificulta que el enzima se pueda unir con el sustrato.
-Sobre el complejo E-S uniéndose a él y dificultando su desintegración y por lo tanto la
formación de los productos.
MATERIALES Y REACTIVOS

 Tubos de ensayo
 Vasos de precipitado de 250 ml
 Estufa
 Agitadores
 Papel tornasol o indicador de pH
 Ácido clorhídrico 0.1 N
 Hidróxido de sodio 0.1 N
 Mortero y mango
 Hígado de res
 Papa cruda
 Cuchilla
 Solución de peróxido de hidrógeno
 Cebada en remojo
 Hielo
 Almidón


Procedimiento Experimental

Acción de la temperatura en la
catalasa de la papa e hígado:

Macerar un trozo de papa en 15 ml de
agua y recoger el extracto.

Tubo 1: 5 ml de Extracto de papa e
hígado + 3 ml de Peróxido de
hidrógeno al 3%

Tubo 2: 5 ml de Extracto de papa e
hígado + hielo= temperatura de 5°c+
3 ml de Peróxido de hidrógeno al 3%

Tubo 3: 5 ml de Extracto de papa e
FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMATICA
Repetir el procedimiento anterior
reemplazando la papa por hígado.

Realizar las anotaciones respectivas y
analizar los resultados.

Influencia del pH en la acción de la
catalasa de la papa:

Macerar un trozo de papa en 15 ml de
agua y recoger el extracto.

Tubo 1: 5 ml de Extracto de papa + 2
ml de ácido clorhídrico al 0.1N + 3 ml
de Peróxido de hidrógeno al 3%

Tubo 2: 5 ml de Extracto de papa + 2
ml de solución de hidróxido de sodio
+ 3 ml de Peróxido de hidrógeno al
3%

FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMATICA
Realizar las anotaciones respectivas a
la toma de pH con papel indicador y
analizar los resultados.

INFLUENCIA DE LA SUPERFICIE DE LA MUESTRA DEL HÍGADO EN
SU ACCIÓN ENZIMÁTICA
Porción de hígado 1: Macerar + 3 ml
de Peróxido de hidrógeno

Porción de hígado 2: Dividir en
trozos + 3 ml de Peróxido de
hidrógeno

Comparar las reacciones de los dos
montajes.

Practica No.3
Degradación enzimática de polisacáridos

Objetivos
 Reconocer la degradación enzimática que se produce en el almidón por actividad de la
amilasa.
Los carbohidratos o polisacáridos son compuestos que tienen importantes funciones
estructurales y de energía en los seres vivos. Tanto su digestión como movilización (degradación
de polisacáridos de almacenamiento) comportan una ruptura secuencial de unidades de
monosacáridos de los extremos no reductores de los polímeros de glucosa. El metabolismo de
los carbohidratos se produce de maneras diferentes,por ejemplo en las plantas no se produce
una digestión (con pocas excepciones), las plantas sintetizan tanto monosacáridos como
polisacáridos de almacenamiento de energía mediante la fotosíntesis, mientras que en los
animales obtienen carbohidratos al ingerirlos de la dieta, también los animales pueden sintetizar
carbohidratos como el glucógeno (polisacárido de almacenamiento de energía) a partir de sus
unidades monomericas de glucosa.
La digestión de los carbohidratos comienza una vez que los alimentos son introducidos en la
boca, aquí comienza un proceso llamado hidrólisis el cual se lleva a cabo mediante la división
de una molécula de agua del medio por medio de un ácido. El hidrógeno del agua se une al
oxigeno del extremo de una de las moléculas de azúcar; el OH se une al carbono libre del otro
residuo de azúcar. Como resultado de esta reacción, se tiene la liberación de un monosacárido.
Este proceso es realizado por las enzimas amilasas de la saliva (también encontradas en tejidos
vegetales y jugos pancreáticos), ya que producen un ácido que es el que causa la ruptura de la
molécula de agua logrando así reducir los polisacáridos hasta unidades más simples como
oligosacaridos y monosacaridos, a continuación estos pasan al intestino donde se produce otra
hidrólisis de los carbohidratos restantes por las amilasas pancreáticas que tienen una actividad
mayor que las amilasas de la saliva cuya actividad es limitada por su rápida inactivación por la

acidez gástrica, como productos se obtienen más monosacáridos que pasan a través la pared
intestinal, para posteriormente llegar al torrente sanguíneo para finalmente ingresar al interior
celular por medio de proteínas que se localizan en la membrana celular. Este proceso es aplicable
generalmente para muchos polisacáridos por la acción de los ácidos diluidos producto de las
enzimas.
El almidón es el carbohidrato de reserva más abundante en los tejidos vegetales. Se encuentran
en grandes cantidades de tubérculos y semillas de cereales y leguminosas. Este polisacárido
contiene alrededor de un 20% de una fracción insoluble en agua llamada amilosa y un 80% de
una fracción soluble denominada amilopectina. Ambas fracciones están constituidas por
unidades de -D-glucosa su diferencia estructural es que la primera está formada por cadenas
lineales de glucosa con enlaces (1-4) y la segunda son cadenas lineales (1 4) y ramificadas
(1 6) de glucosa.
En los animales la digestión del almidón empieza en la boca con la acción de la -amilasa que
se secreta en la saliva. Esta enzima cataliza la hidrólisis de la cadena lineal (amilosa) y la ramificada
(amilopectina) del almidón, rompiendo enlaces -(1 4) interiores (endoamilasa) para formar
una mezcla de dextrinas (oligosacaridos entre estos están la amilodextrina, eritrodextrina,
acrodextrina y maltodextrina), Sin embargo esta enzima solo degrada parcialmente la
amilopectina, porque no es capaz de romper los enlaces (1 6) que se encuentran en los puntos
de ramificación (la amilosa es transformada totalmente mientras que la amilopectina se conserva
en un 40-45% sin hidrolizar). Para continuar su degradación en el intestino es necesaria la acción
de una “enzima desramificante”, la (1 6)-glucosidasa esta tiene la acción de exponer un
grupo nuevo de ramificaciones con enlaces (1 4), que pueden ser atacadas por la -amilasa,
hasta alcanzar una nueva serie de ramificaciones con enlaces (1 6). El resultado final de la
acción secuencial de estas dos enzimas es la degradación completa del almidón obteniendo
glucosa

En los vegetales se encuentra también -amilasa y -amilasa (en granos de cereales), esta enzima
ataca enlaces (1 4) pero no puede catalizar la hidrólisis de los enlaces (1 6) y por lo tanto
no cataliza la hidrólisis completa de la amilopectina.

Es igual de importante mencionar que la -amilasa requiere un activador como el cloruro sódico
y es sensible a pH ácidos, es inactiva a un pH aproximadamente de 3.3, su rango óptimo de
acción es a pH entre 5-7, por otro lado la -amilasa no requiere de un activador, y es menos
estable al calor que la primera, su pH optimo es de 4.5.
La hidrólisis del almidón se puede demostrar por la aparición de D-glucosa (azúcar reductor), el
cual puede ser detectado con los reactivos de Benedict, Fehling y otros el reactivo de Benedict
está constituido por una disolución de sulfato de cobre II, citrato de sodio y carbonato de sodio.
Al tratar al azúcar con estos reactivos experimentan una reacción de oxidación. El cobre II en
disolución acuosa, de color azul se reduce a cobre I, el cual precipita como oxido de cobre I de
color rojo. Otra manera de demostrar la hidrólisis del almidón es por la desaparición del color
azul característico de la prueba del yodo-yoduro
Reactivos Y Materiales
1. Saliva
2. Solución de almidón al 5%
3. Lugol
4. Solución de HCl al 5%
5. Solución de NaOH al 5%
6. Hielo y agua caliente
7. Materiales
8. Gradilla
9. Seis tubos de ensayo
10. Termómetro
11. Papel indicador universal o pHmetro
12. Gotero
13. Vaso de precipitado
14. Mechero
15. Trípode
16. Malla de asbesto

Procedimiento
1. Coloque 3.0 mL de solución de almidón y 2 gotas de saliva en tres tubos de ensayo
previamente marcados A, B y C.
2. Determine el pH en cada tubo, utilizando un pHmetro o papel indicador universal.
Registre los resultados.
3. Agregue al tubo A 1.0 mL de ácido clorhídrico al 5%; al tubo B 1.0 mL de NaOH al 5%;
y al tubo C 1.0 mL de agua.
4. Prepara un baño María con una temperatura de 37 ºC y coloque los tres tubos de ensayo
durante 10 minutos.
5. Retire los tubos de ensayo del baño María y añada cinco gotas de lugol a cada uno.
Registre los cambios de color, olor, temperatura, etc.
6. En otros tres tubos de ensayo, previamente marcados como D, E y F, adicione tres mL
de almidón y dos gotas de saliva, a cada uno.
7. Durante diez minutos coloque el tubo D en hielo, el tubo E en el baño María a 37 ºC y
el tubo F en agua hirviendo.
8. Retire los tubos de ensayo D, E y F de las anteriores condiciones y agregue cinco gotas
de lugol a cada uno. Registre todos los cambios que observe.
Análisis
1. ¿En qué situación se registró la mayor actividad enzimática y como la evidencia?

Practica No.4
Aislamiento de la caseína de la leche

Objetivos
1. Conocer el método para la extracción cuantitativa de la caseína.
2. Reconocer algunas de las propiedades de las proteínas.
3. Caracterizar las proteínas mediante reacciones específicas de coloración y calentamiento.
Introducción
Las proteínas son moléculas que desempeñan un gran número de funciones en las células de
todos los seres vivos, pues por un lado forman la estructura básica de los tejidos, y por otro,
desempeñan funciones metabólicas y reguladoras, como es el caso de las enzimas. Dada la
creciente preocupación por el deterioro de los recursos naturales y el efecto adverso sobre el
medio ambiente, las enzimas han ganado interés, pues gracias a ellas es posible degradar
contaminantes, y por lo tanto son la base de procesos hoy en día muy utilizados, como es la
biorremediación, entre otros. En este orden de ideas, antes de comprender el funcionamiento
de las enzimas, debemos tener claras las propiedades de las proteínas.
En el trabajo en Bioquímica, la precipitación y purificación de proteínas es una actividad usual
se basa en un principio muy simple.
En términos generales, cualquier factor físico o químico que modifique la interacción con el
disolvente de la proteína, disminuirá su estabilidad en disolución y provocará su precipitación.
Así, la precipitación total o parcial de la envoltura acuosa, la neutralización de las cargas o la
ruptura de puentes de hidrógeno facilitará la agregación molecular y provocará la precipitación.
Esta precipitaciónsuele ser consecuencia de un fenómeno llamado desnaturalización mediante
el cual la proteína pierde su estructura de orden superior (secundaria, terciaria, cuaternaria)
quedando la cadena polipeptídica reducida a un polímero sin ninguna estructura tridimensional.

Para fines de esta práctica se precipitarán por agentes químicos y/o físicos la albúmina, de la
clara de huevo, y la caseína de la leche.
La caseína está presente en una concentración de aproximadamente 35g/l y no es un compuesto
simple sino una fosfoproteina que resulta de la mezcla heterogénea de sus componentes
proteicos.
Las proteínas son solubles principalmente por los residuos de aminoácidos polares cargados que
establecen interacciones con el agua. Cualquier agente que rompa estas interacciones
proteína/agua disminuirá la solubilidad de la proteína y precipitará. Un cambio en el pH de la
solución altera el estado iónico de la proteína pudiendo
llevarla a un estado neutral (punto isoeléctrico) en el que
la carga de la proteína es neutra y la solubilidad es mínima. Las moléculas de proteína neutras no
se repelen eléctricamente y tienen a agregarse precipitando.Teniendo en cuenta este principio, es
Equipo
 pHmetro
 Vasos de precipados de 100 ml
 Vaso de precipitado de 250 ml
 Estufas y mallas de asbesto
 Agua destilado
 Termómetro de 0 a 100ºC
 Embudo de Buchner
 Papel filtro
 Bomba de vacío
 Tubos de ensayo
 Gradilla
 Pinza para tubo de ensayo
 Vaso de precipitado de 250 ml
 Plancha de calentamiento

Reactivos
 Leche
 Amortigador de acetato de
sodio (0.2 ml/l, pH 4.6)
 Etanol (95%)
 Eter o cloroformo
(inflamable)
 Clara de huevo
 Agua destilada
 Formaldehído
 Acido sulfúrico
concentrado
 Acido acético diluido

posible separar la caseína ajustando el pH de la leche a 4.8, su punto isoeléctrico. La caseína es
también insoluble en alcohol lo cual permite remover grasa de las preparaciones.
Procedimiento Experimental
Aislamiento de la caseína de la leche:
En un vaso de precipitados de 100 ml vierta 25 ml de leche entera y caliéntela a 40ºC.
Aparte, caliente también 25 ml de solución amortiguadora de Acetato de Sodio.
Agregue los 25 ml de Acetato de Sodio a los 25 ml de leche agitando lentamente. Verifique el
pH de la solución con el pHmetro, su valor debe ser de aproximadamente de 4.8.
Deje reposar la mezcla anterior durante 5 min antes de filtrarla por medio de la muselina.
Para realizar la filtración, ponga muselina sobre la soba de un beacker y comience a agregar la
mezcla lentamente. Simultáneamente se debe ir lavando el precipitado con agua destilada.
Recupere el precipitado, el cual se encuentra sobre la muselina, y suspéndalo ahora en 10 ml de
etanol en otro beacker.

La suspensión obtenida debe ser filtrada en el embudo de Buchner. Para esto es indispensable
que antes de acercarse al embudo tenga ya mezclados 5 ml de éter con 5 ml de etanol, y que
tenga aparte otros 12 ml de éter. Tanto el éter como el etanol serán utilizados para lavar la
suspensión.
Durante la filtración, lave primero con la mezcla de éter-etanol, y luego con el éter solo. Después
de este lavado secar al vacío y con una espátula recoja el precipitado y póngalo sobre un vidrio
de reloj. El éter se evaporará.
El peso de caseína recuperada será publicado por el monitor en la puerta del laboratorio. Este
dato debe usarse para calcular el porcentaje de recuperación de proteína. Es indispensable anotar
el número del vidrio de reloj que le fue entregado para que luego pueda sacar de la lista el peso
de su proteína.

Reacción coloreada del formaldehído para proteínas:
Prepare una solución (1:4) de clara de huevo diluida en agua destilada.
En un tubo de ensayo ponga 2 ml de solución de clara de huevo y agregue 1 gota (0.5ml) de
formaldehído.
Enseguida, agregue por las paredes del tubo 1ml de Ácido Sulfúrico concentrado (H2SO4).
Coagulación por calentamiento:
Prepare una solución (1:4) de clara de huevo diluida en agua destilada.
En un tubo de ensayo ponga 2 ml de solución de clara de huevo y agregue dos gotas de ácido
acético diluido (1ml).
Sumerja el tubo de ensayo en un baño maría hasta observar algún cambio.
Retire el tubo de ensayo, déjelo enfriar y anote las observaciones.
Repetir este mismo procedimiento, pero utilizando triptófano en vez de albúmina.
Coagulación por acción del alcohol:
Transferir aproximadamente 1ml de clara de huevo a un tubo de ensayo y adicione 3.5 ml de
etanol al 95%.
Anote sus observaciones.
CUESTIONARIO
1. Qué función cumple el buffer o amortiguador de Acetato de Sodio?
2. Qué metodología se podría emplear para extraer proteína de tejidos?
3. Qué propiedades de las proteínas se pueden verificar a partir de esta práctica?
4. Aparte de la caseína que otras proteínas tiene la leche?
5. Qué relación podría tener esta práctica con el impacto ambiental

Practica No.5
Extracción e Identificación del glucógeno

Objetivo.
Extraer e identificar el glucógeno de dos distintos tejidos (hígado y músculo) de Oreochromis
niloticus.

Introducción.
El glucógeno es el polisacárido de reserva más importante en las células animales. Al igual que
la amilopectina, el glucógeno es un polímero con subunidades de glucosa unidas por enlaces
(α1→4) y ramificaciones del tipo (α1→6), pero el glucógeno está más ramificado (una
ramificación cada 8 a 12 residuos) y es más compacto que el almidón. El glucógeno es
especialmente abundante en el hígado, donde puede llegar a representar el 7% de su peso;
también se encuentra en el músculo esquelético. Algunos gránulos de glucógeno contienen
también, íntimamente unidos, los enzimas responsables de su síntesis y degradación.
Puesto que cada rama de estos termina con un azúcar no reductor (que no posee carbono
anomérico libre), estos polímeros tienen tantos extremos no reductores como ramas, pero
únicamente un extremo reductor. Cuando el glucógeno se emplea como fuente de energía las
unidades de glucosa son eliminadas de una en una a partir de los extremos no reductores. Dada
la naturaleza ramificada de la amilopectina y el glucógeno, los enzimas degradativos (que actúan
en los extremos no reductores) pueden trabajar simultáneamente en muchos extremos,
aumentando la velocidad de conversión del polímero en monosacáridos (Lehninger et al, 2005).
La D- glucose es el principal combustible de la mayoría de organismos y ocupa una posición
central en el metabolismo. Es relativamente rica en energía potencial; su oxidación completa a

dióxido de carbóno y agua transcurre con una variación de energía libre estándar de -2.840
kJ/mol. Almacenando la glucosa en forma de polímero de elevada masa molecular, una célula
puede apilar grandes cantidades de unidades de hexosa al tiempo que mantiene una osmolaridad
citosólica relativamente baja. Cuando aumenta de una manera súbita las necesidades energéticas
de la célula, la glucosa se puede liberar rápidamente a partir de estos polímeros de
almacenamiento intracelular (Lehninger et al, 2005).
En el glucólisis (del griego glykys, que significa “dulce” y lysis, que significa “romper”) lo que
sucede es que se degrada una molécula de glucosa en una serie de reacciones catalizadas
enzimáticamente, dando dos moléculas de piruvato. Durante la secuencia de reacciones parte de
la energía libre cedida por la glucosa se conserva en forma de ATP. La glucólisis fue la primera
ruta metabólica elucida y es probablemente la que se conoce mejor, mientras que la
gluconeogénesis es la síntesis de la glucosa a partir del piruvato y el lactato. Para la síntesis de un
mol de glucosa son necesarios 4 moles de ATP y 2 moles de GTP (ó ITP) a partir de 2 moles de
piruvato y/o lactato. El camino que lleva la glucogenesis es básicamente el inverso del del
glucólisis excepto por 3 pasos específicos entrela glucosa y glucosa-6-fosfato, fructosa-6-fosfato
y fructosa-1,6-bifosfato, and fosfoenolpiruvato (PEP) y piruvato. Esta tiene su lugar
principalmente en el hígado y su misión es proporcionar glucosa para exportarla a otros tejidos
cuando se han agotado otras fuentes de glucosa. (Hayashi, 2008).

Procedimiento Experimental
1. A partir de un pez (Oreochromis niloticus) sacrificados obtener muestras de hígado y musculo,
enseguida pesar por duplicado 1.5 g de hígado y 3 g de músculo.
2. Homogeneizar las muestras de tejidos con 4 ml de KOH al 30%.
3. Calentar los homogenizados en un baño de agua a ebullición por 15 minutos, agitar
ocasionalmente.
3. Centrifugar los homogenados a 3000 rpm por 5 minutos, separar la capa de sobrenadante y
colocarla en tubo de ensayo, añadir 6 ml de etanol y agitar.
4. Reposar los tubos con la mezcla en baño de hielo por 5 minutos.

5. Centrifugar los tubos 5 minutos a 3000 rpm, desechar el sobrenadante y separar el glucógeno
precipitado.
6. Hidrólisis ácida del glucógeno: Al precipitado de glucógeno obtenido añadir 1 ml de H2SO4
5N y calentar en baño de agua a 100°C por 25 minutos. Usar lentes de seguridad y proceder con
suma precaución en esta etapa para evitar salpicaduras de ácido.
7. Al término de la hidrólisis enfriar los tubos, adicionar 2 ml con agua destilada a cada tubo y 3
gotas de fenolftaleína, añadir gota a gota NaOH 5N con agitación hasta el vire del indicador (pH
8 o superior).
8. Identificación del contenido de glucosa en el hidrolizado de glucógeno: Colocar 0.5 ml del
hidrolizado de glucógeno y añadir 0.5 ml de Cu2SO4 1%, la presencia de glucosa se denota por
la aparición de turbidez debido a la insolubilidad del Cu2O formado.

Práctica No.6
Determinación de almidón y glucosa en alimentos

Objetivos
 El objetivo de esta práctica es que los alumnos determinen si ciertas muestras de
alimentos contienen o no el polisacárido almidón.
¿Qué es el almidón?
El almidón es un polisacárido formado, como la celulosa, por la
condensación de miles de moléculas de glucosa (en concreto los
monómeros son unidades de α-D-glucopiranosa) medianteenlace
glucosídico.
Contiene dos tipos de polisacáridos distintos: la amilosa y
la amilopectina. La amilosa presenta una cadena lineal, no
ramificada, formada por unidades de glucosa con enlaces
denominados α-(1 → 4), con una disposición helicoidal de seis monómeros por cada vuelta de
hélice. Por su parte, laamilopectina tiene una cadena lineal base con el mismo tipo de enlace α-
(1 → 4), pero también presenta gran cantidad de ramificaciones (una cada doce monómeros)
con enlace de tipo α-(1 → 6).

Estructura química de la amilosa, polímero lineal presente en el almidón en torno al 25%

Estructura química de la amilopectina, polímero ramificado presente en el almidón en torno a
un 75%
El almidón es la principal reserva energética de los vegetales, por lo que está contenido en gran
cantidad de alimentos, como la patata. Además, constituye una de las principales fuentes de
calorías en la dieta de los seres humanos. Cuando el almidón en frío entra en contacto con un
reactivo denominado lugol (una disolución de yodo (I2) y yoduro de potasio (KI)) toma un color
azul intenso, de modo que aplicar dicha disolución a un alimento es una prueba cualitativa para
determinar si contiene almidón o no. A esta determinación se la denomina, habitualmente, prueba
del yodo.
Fundamento teórico: la prueba del yodo
La prueba del yodo, es decir, la reacción entre el yodo y el almidón, es la que nos permite detectar
la presencia de almidón en algunos alimentos. Esta reacción es el resultado de la formación de
cadenas de poliyoduro (generalmente triyoduro, I3–) que se enlazan con el almidón en las hélices
del polímero. En concreto, es la amilosa del almidón la que se une a las moléculas de
yodo, formando un color azul oscuro, a veces prácticamente negro. La amilopectina no
reacciona apenas con el yodo.

Complejo formado entre el anión triyoduro, presente en el lugol, y
la hélice de la amilosa del almidón

Reactivos
1. Reactivo de lugol
2. Reactivo de Fehling
3. Almidón
4. Solución del glucosa al 2%
5. Agua destilada
6. Un trozo de pan
7. Una papa
8. Un plátano
9. Una manzana
10. Jugo de zanahoria, de durazno y de uva
11. Azúcar de mesa (común)
Procedimiento Experimental
 Prepare una solución disolviendo 0.5 g de almidón en 10.0 mL de agua; para esto utilice
un vaso de precipitado de 50 mL. Tome 5.0 mL de la solución por medio de una pipeta
y añade tres gotas de lugol, por medio de un gotero. Observe el cambio de coloración
de la solución. Este tubo de ensayo debe ser colocado en la gradilla y se debe utilizar
como muestra patrón de referencia.
 Haga un puré con la papa, el plátano o el pan, partiendo o cortando pequeños trozos y
luego triturando; se puede utilizar un mortero para esto.
Para cada muestra utilice un tubo de ensayo diferente, añada 2.0 mL de agua destilada y
agite. Luego adicione tres gotas de lugol y agite. Compare la coloración obtenida para
cada alimento con la muestra patrón. Registre los resultados.
Materiales
1. Pipeta
2. Espátula
3. Gradilla
4. Tubos de ensayo
5. Mortero y pistilo
6. Vasos de precipitados de
50 y de 300 mL
7. Gotero
8. Mechero
9. Trípode
10. Malla de asbesto

 Aliste un baño María y ajuste la temperatura a 50ºC. Adicione 2.0 mL de la solución de
glucosa y adicione 2.0 mL de reactivo de Fehling (1.0 mL de reactivo de Fehling A y 1.0
mL de B). Caliente durante tres minutos.
 Observe los cambios que se producen y guarde esta muestra como patrón.

 Nuevamente, para cada muestra utilice un tubo de ensayo diferente, añada 2.0 mL de
agua destilada y agite. A cada tubo de ensayo adicione 2.0 mL de reactivo de Fehling (1.0
mL de A y 1.0 mL de B). Caliente en el baño María durante cinco minutos. Registre los
cambios y compare con la muestra patrón.
Resultados
 Indique los alimentos que contienen almidón y los que contienen glucosa.
 ¿Es posible ordenar los alimentos con base en su contenido de almidón?
Cuestionario
1. Explica con detenimiento y con tus propias palabras cómo se realiza el procedimiento para
detectar almidón en alimentos.
2. Dibuja e identifica cada uno de los instrumentos de laboratorio empleados.
3. Indica qué tienen en común el almidón y la celulosa.
4. ¿En qué se diferencian la amilosa y la amilopectina?
5. ¿Por qué el almidón toma color azul cuando se pone en contacto con lugol?
6. ¿Crees que esta prueba podría usarse para determinar el grado de madurez de un fruto?
Investiga los posibles usos de la prueba de yodo en la industria alimentaria.

Practica No.7
Estudio del bombeo de protones por levaduras; efecto de los
inhibidores de la cadena de transporte de electrones y de los
desacoplantes.

Objetivos
 Que el alumno relacione el consumo de glucosa con los cambios de pH producidos por
las levaduras.
 Que el alumno describa las vías por las cuales la glucosa genera los cambios de pH.
 Que el alumno interprete el efecto de los inhibidores y los desacoplantes sobre la salida
de protones y la síntesis del ATP.

Marco de referencia.
Las levaduras Saccharomyces cerevisiae son organismos unicelulares que se dividen por gemación.
En común con otras células eucariontes, las levaduras tienen un núcleo en donde reside la
información genética de la célula, mitocondrias en donde se lleva a cabo la síntesis de ATP y un
retículo endoplásmico y aparato de Golgi que se encargan de la síntesis de proteínas cuya
localización final es la membrana plasmática o el exterior.
A nivel de la membrana plasmática, las levaduras tienen una ATPasa de H+ que acopla la
hidrólisis del ATP con el bombeo de protones hacia afuera de la célula. Estaproteína es
semejante desde un punto de vista estructural y funcional a la ATPasa de Na+/K+ de las células
animales y, al igual que la bomba de sodio/potasio, se inhibe con concentraciones micromolares
de vanadato. Como resultado de la actividad de la ATPasa de H+ en la levadura, se genera un
gradiente electroquímico de protones que se utiliza para impulsar el transporte de nutrientes al
interior de la célula, proceso catalizado por sistemas de transporte llamados simportadores o
uniportadores. Para darse una idea de la importancia de esta enzima en la economía celular y en
la energización de la membrana celular, basta decir que la ATPasa de H+ consume hasta un 25
% del ATP que se sintetiza en la célula.
Además de esta ATPasa de H+ de la membrana plasmática, las levaduras tienen otra bomba de
protones en la membrana interna de las mitocondrias, la ATP sintasa, que se encarga de la síntesis

del ATP. En contraste con la enzima de membrana plasmática, el flujo de protones a través de
la ATP sintasa induce la síntesis de ATP. Uno de los inhibidores más efectivos de esta enzima
es la oligomicina.
Así, se puede proponer uno de los muchos ciclos en los que interviene el ATP en la levadura:
por un lado, el ATP se sintetiza en la mitocondria por medio de la ATP sintasa, y a nivel de la
membrana plasmática, la ATPasa de H+ lo hidroliza para bombear protones al exterior de la
célula. El factor común en ambos casos es un flujo de protones a través de la membrana.
Material y Reactivos
• Tres vasos de precipitado de 100 ml.
• Pipetas de 5 y 10 ml.
• Potenciómetro.
• Piceta para enjuagar el electrodo del potenciómetro.
• Levadura (Saccharomyces cerevisiae) 200 mg/ml.
• Solución de glucosa (10%) para una concentración final de
1%.
• Solución de dinitrofenol 40 mmol/l en etanol.
• Solución de azida de sodio 400 mmol/l.
• Agua destilada.

Procedimiento Experimental

Control
1 .Diluir 5 ml de la levadura con 40 ml de agua destilada.
2. Determinar el pH de la solución y repetir la medición dos veces más con intervalos de 3
minutos para obtener la línea basal.
3. Adicionar 5 ml de glucosa a 10 %, agitar y medir el pH.
4. Determinar el pH de la solución cada 5 minutos 4 veces, y luego cada 10 minutos 2 veces más.

Dinitrofenol
1. Diluir 5 ml de la levadura con 40 ml de agua destilada.
2. Añadir por decantación (no pipetear) 0.2 ml de la solución de dinitrofenol 40 mmol/l,
concentración final de 200 μmol/l.
3. Determinar el pH de la solución y repetir la medición dos veces más con intervalos de 3
minutos para obtener la línea basal.
4. Esperar 5 minutos.
5. Repetir los pasos 3 y 4 del experimento control.

Azida
1. Diluir 5 ml de la levadura con 40 ml de agua destilada.
2. Añadir por decantación (no pipetear) 0.5 ml de la solución de azida de sodio 400 mmol/l,
concentración final de 5 mmol/l. Agitar con cuidado.

3. Determinar el pH de la solución y repetir la medición dos veces más con intervalos de 3
minutos para obtener la línea basal.
4. Esperar 5 minutos.
5. Repetir los pasos 3 y 4 del experimento control.
6. Registrar sus datos en la siguiente tabla.

Resultados

pH
Tiempo(min) Glucosa Dinitrofenol Azida De Sodio
0
5
10
15
20
25
30
40

Análisis de resultados
1. Hacer una gráfica de cada uno de los experimentos; utilizar los valores de las lecturas de pH
contra tiempo.
2. Analizar el significado de los cambios de pH en el experimento control, con dinitrofenol como
desacoplante y con azida de sodio.
3. Hacer una relación de las vías que producen estos cambios; tomar en cuenta que las levaduras
poseen una ATPasa de protones en la membrana mitocondrial que se encarga de sintetizar ATP
y que tienen otra ATPasa de protones en la membrana plasmática cuya función es similar a la
bomba de Na+/K+ en las células de los mamíferos.

Cuestionario
1. ¿Cuáles son las fuentes de carbono que usa la levadura?
2. ¿Cuáles son las vías metabólicas que catabolizan a los carbohidratos?
3. ¿En qué consisten la glucólisis y la fosforilación oxidativa?
4. ¿Cuáles son los productos finales del catabolismo de los carbohidratos en las levaduras?
5. ¿Cuáles son los inhibidores de la cadena respiratoria de los sitios I, II y III? Describa su efecto
sobre el consumo de O2 y la síntesis del ATP.
6. ¿Cuál es el mecanismo por medio del cual los protonóforos desacoplan la fosforilación
oxidativa? ¿Describa su efecto sobre el consumo de O2?

Practica No.8
Hidrólisis ácida del almidón y extracción e identificación de las
lecitinas y el colesterol a partir de la yema de huevo de gallina.

OBJETIVOS:
 Realizar una hidrólisis ácido del almidón identificando la naturaleza de sus monómeros.
 Extraer y separar lecitinas y colesterol a partir de la yema de huevo de gallina para su
posterior identificación mediante sus características físicas y la prueba de Liebermann-
Burchard para el colesterol.
FUNDAMENTO TEÓRICO
CARBOHIDRATOS
Los carbohidratos o glúcidos son biomoléculas compuestas por carbono, hidrógeno y oxígeno,
cuyas principales funciones en los seres vivos son el prestar energía inmediata y estructural.
La glucosa y el glucógeno son las formas biológicas primarias de almacenamiento y consumo
de energía; la celulosa cumple con una función estructural al formar parte de la pared de
las células vegetales, mientras que la quitina es el principal constituyente del exoesqueleto de
los artrópodos.
Los carbohidratos cumplen dos papeles fundamentales en los seres vivos. Por un lado son
moléculas energéticas de uso inmediato para las células (glucosa) o que se almacenan para su
posterior consumo (almidón y glucógeno); 1g proporciona 4 kcal. Por otra parte, algunos
polisacáridos tienen una importante función estructural ya que forman parte de la pared
celular de los vegetales(celulosa) o de la cutícula de los artrópodos.
Los carbohidratos se dividen en monosacáridos, disacáridos, oligosacáridos y polisacáridos. Los
glúcidos más simples, los monosacáridos, están formados por una sola molécula; no pueden
ser hidrolizados a glúcidos más pequeños.
Monosacáridos
http://es.wikipedia.org/wiki/Biomol%C3%A9cula
http://es.wikipedia.org/wiki/Carbono
http://es.wikipedia.org/wiki/Hidr%C3%B3geno
http://es.wikipedia.org/wiki/Ox%C3%ADgeno
http://es.wikipedia.org/wiki/Glucosa
http://es.wikipedia.org/wiki/Energ%C3%ADa
http://es.wikipedia.org/wiki/Celulosa
http://es.wikipedia.org/wiki/Pared_celular
http://es.wikipedia.org/wiki/C%C3%A9lulas
http://es.wikipedia.org/wiki/Quitina
http://es.wikipedia.org/wiki/Exoesqueleto
http://es.wikipedia.org/wiki/Artr%C3%B3podo
http://es.wikipedia.org/wiki/Glucosa
http://es.wikipedia.org/wiki/Almid%C3%B3n
http://es.wikipedia.org/wiki/Gluc%C3%B3geno
http://es.wikipedia.org/wiki/Kcal
http://es.wikipedia.org/wiki/Pared_celular
http://es.wikipedia.org/wiki/Pared_celular
http://es.wikipedia.org/wiki/Plantae
http://es.wikipedia.org/wiki/Celulosa
http://es.wikipedia.org/wiki/Cut%C3%ADcula_(artr%C3%B3podos)
http://es.wikipedia.org/wiki/Artr%C3%B3podos
http://es.wikipedia.org/wiki/Mol%C3%A9cula
http://es.wikipedia.org/wiki/Hidr%C3%B3lisis

Los monosacáridos son la principal fuente
de combustible para el metabolismo, siendo
usado tanto como una fuente de energía (la
glucosa es la más importante en la naturaleza) y
en biosíntesis. Cuando los monosacáridos no
son necesitados para las células son
rápidamente convertidos en otra forma, tales
como los polisacáridos.

Disacáridos
Los disacáridos son glúcidos formados por dos moléculas de monosacáridos y, por tanto, al
hidrolizarse producen dos monosacáridos libres. Los dos monosacáridos se unen mediante un
enlace covalente conocido como enlace glucosídico, tras una deshidratación que implica la
pérdida de un átomo de hidrógeno de un monosacárido y un grupo hidroxilo del otro
monosacárido, con la consecuente formación de una molécula deH2O. Algunos disacáridos
comunes son la sacarosa, fructosa, lactosa, maltosa y celobiosa. Los oligosacáridos están
compuestos por tres a nueve moléculas de monosacáridos2 que al hidrolizarse se liberan. No
obstante, la definición de cuan largo debe ser un glúcido para ser considerado oligo o
polisacárido varía según los autores. Según el número de monosacáridos de la cadena se tienen
los disacáridos (como la lactosa), tetrasacárido (estaquiosa), pentasacáridos, etc.
Oligosacáridos
Los oligosacáridos se encuentran con frecuencia unidos a proteínas, formando
las glucoproteínas, como una forma común de modificación tras la síntesis proteica. La
estaquiosa, es un tetrasacárido formado por una glucosa, dos galactosas y una fructosa. Los
polisacáridos son cadenas, ramificadas o no, de más de diez monosacáridos, resultan de la
condensación de muchas moléculas de monosacáridos con la pérdida de varias moléculas de
agua. Su fórmula empírica es: (C6H10 O5)n.
Polisacáridos
http://es.wikipedia.org/wiki/Combustible
http://es.wikipedia.org/wiki/Metabolismo
http://es.wikipedia.org/wiki/Covalente
http://es.wikipedia.org/wiki/Glucos%C3%ADdico
http://es.wikipedia.org/wiki/Gl%C3%BAcido#cite_note-2
http://es.wikipedia.org/wiki/Disacarido
http://es.wikipedia.org/wiki/Tetrasac%C3%A1rido
http://es.wikipedia.org/wiki/Estaquiosa
http://es.wikipedia.org/wiki/Prote%C3%ADnas
http://es.wikipedia.org/wiki/Glucoprote%C3%ADna
http://es.wikipedia.org/wiki/Traducci%C3%B3n_(gen%C3%A9tica)
http://es.wikipedia.org/wiki/Estaquiosa
http://es.wikipedia.org/wiki/Glucosa

Los polisacáridos representan una clase importante de polímeros biológicos y su función en los
organismos vivos está relacionada usualmente con estructura o almacenamiento.
El almidón es la manera en que las plantas almacenan monosacáridos; es una mezcla de dos
polímeros de glucosa, la amilosa y la amilopectina(ramificada).

Los animales usan el glucógeno en vez de almidón el cual es estructuralmente similar pero más
densamente ramificado. Las propiedades del glucógeno le permiten ser metabolizado más
rápidamente, lo cual se ajusta a la vida activa de los animales con locomoción.
La celulosa y la quitina son ejemplos de polisacáridos estructurales. La celulosa forma la pared
celular de plantas y otros organismos y es la molécula orgánica más abundante de la Tierra. La
quitina tiene una estructura similar a la celulosa, pero tiene nitrógeno en sus ramas
incrementando así su fuerza; se encuentra en el exoesqueleto de los artrópodos y en las paredes
celulares de muchos hongos.
Otros polisacáridos incluyen la calosa, la laminarina, la maltodextrina, el xilano y la
galactomanosa.
El almidón
http://es.wikipedia.org/wiki/Pol%C3%ADmero
http://es.wikipedia.org/wiki/Biol%C3%B3gico
http://es.wikipedia.org/wiki/Almid%C3%B3n
http://es.wikipedia.org/wiki/Planta
http://es.wikipedia.org/wiki/Amilosa
http://es.wikipedia.org/wiki/Amilopectina
http://es.wikipedia.org/wiki/Animal
http://es.wikipedia.org/wiki/Gluc%C3%B3geno
http://es.wikipedia.org/wiki/Metabolismo
http://es.wikipedia.org/wiki/Quitina
http://es.wikipedia.org/wiki/Pared_celular
http://es.wikipedia.org/wiki/Pared_celular
http://es.wikipedia.org/wiki/Nitr%C3%B3geno
http://es.wikipedia.org/wiki/Cut%C3%ADcula_(artr%C3%B3podos)
http://es.wikipedia.org/wiki/Artr%C3%B3podos
http://es.wikipedia.org/wiki/Hongos
http://es.wikipedia.org/wiki/Calosa
http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Laminarina&action=edit&redlink=1
http://es.wikipedia.org/wiki/Maltodextrina
http://es.wikipedia.org/wiki/Xilano
http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Galactomanosa&action=edit&redlink=1

El almidón es el principal polisacárido1 de reserva de la mayoría de los vegetales,2 y la fuente de
calorías más importante consumida por el ser humano.
El almidón está constituido por dos compuestos de diferente estructura:
 Amilosa: Está formada por α-D-glucopiranosas unidas por centenares o miles (normalmente
de 300 a 3000 unidades de glucosa) mediante enlaces α-(1 → 4) en una cadena sin ramificar,
o muy escasamente ramificada mediante enlaces α-(1 → 6) . Esta cadena adopta una
disposición helicoidal y tiene seis monómeros por cada vuelta de hélice. Suele constituir del
25 al 30 % del almidón.
 Amilopectina: Representa el 70-75 % restante. También está formada por α-D-
glucopiranosas, aunque en este caso conforma una cadena altamente ramificada en la que
hay uniones α-(1 → 4), como se indicó en el caso anterior, y muchos enlaces α-(1 → 6) que
originan lugares de ramificación cada doce monómeros. Su peso molecular es muy elevado,
ya que cada molécula suele reunir de 2.000 a 200.000 unidades de glucosa.
De todos modos, la proporción entre estos dos componentes varía según el organismo en el que
se encuentre.
Los gránulos de almidón son insolubles en agua fría, pero pueden contener agua al aumentar la
temperatura, es decir los gránulos de almidón sufren el proceso denominado gelatinización .
Durante la gelatinización se produce la lixiviación de la amilosa, la gelatinización total se produce
normalmente dentro de un intervalo más o menos amplio de temperatura, siendo los gránulos
más grandes los que primero gelatinizan.
LÍPIDOS
Los lípidos son un conjunto de moléculas orgánicas(la mayoría biomoléculas) compuestas
principalmente por carbono e hidrógeno y en menor medida oxígeno, aunque también pueden
contener fósforo, azufre y nitrógeno. Tienen como característica principal el
ser hidrófobas (insolubles en agua) y solubles en disolventes orgánicos como la bencina,
el benceno y el cloroformo. En el uso coloquial, a los lípidos se les llama incorrectamente
grasas, ya que las grasas son solo un tipo de lípidos procedentes de animales.
http://es.wikipedia.org/wiki/Almid%C3%B3n#cite_note-1
http://es.wikipedia.org/wiki/Vegetal
http://es.wikipedia.org/wiki/Almid%C3%B3n#cite_note-2
http://es.wikipedia.org/wiki/Amilosa
http://es.wikipedia.org/wiki/Amilopectina
http://es.wikipedia.org/wiki/Ser_vivo
http://es.wikipedia.org/wiki/Solubilidad
http://es.wikipedia.org/wiki/Gelatina
http://es.wikipedia.org/wiki/Lixiviaci%C3%B3n
http://es.wikipedia.org/wiki/Compuesto_org%C3%A1nico
http://es.wikipedia.org/wiki/Biomol%C3%A9cula
http://es.wikipedia.org/wiki/Carbono
http://es.wikipedia.org/wiki/Hidr%C3%B3geno
http://es.wikipedia.org/wiki/Ox%C3%ADgeno
http://es.wikipedia.org/wiki/Azufre
http://es.wikipedia.org/wiki/Nitr%C3%B3geno
http://es.wikipedia.org/wiki/Hidr%C3%B3fobo
http://es.wikipedia.org/wiki/Agua
http://es.wikipedia.org/wiki/Disolvente
http://es.wikipedia.org/wiki/Benceno
http://es.wikipedia.org/wiki/Cloroformo
http://es.wikipedia.org/wiki/Animalia

Los lípidos cumplen funciones diversas en los organismos, entre ellas la de reserva energética
(como los triglicéridos), la estructural (como los fosfolípidos de las bicapas) y la reguladora
(como las hormonas esteroides).
Los lípidos son un grupo muy heterogéneo que usualmente se subdivide en dos, atendiendo a
que posean en su composición ácidos grasos (lípidos saponificables) o no los posean (lípidos
insaponificables).
Los fosfolípidos se caracterizan por poseer un grupo de naturaleza fosfato que les otorga una
marcada polaridad. Se clasifican en dos grupos, según posean glicerol o esfingosina.
LECITINAS
Lecitina es un término genérico para designar a un amplio grupo de lípidos saponificables y con
función de emulgente que se producen de manera natural en tejidos animales y vegetales.
Engloba a cualquier grupo de sustancia grasa (de color amarillo-marronáceas) compuesta de
ácido, colina, ácidos grasos, glicerol, glicolípidos,triglicéridos y fosfolípidos. Por
ejemplo: fosfatidilcolina,fosfatidiletanolamina, y fosfatidilinositol.
La fosfatidilcolina o polienilfosfatidilcolina (también llamada lecitina) es un fosfolípido que,
junto con las sales biliares, ayuda a la solubilización de los ácidos en la bilis.1 Es el componente
más abundante de la fracciónfosfatídica que puede extraerse tanto de yema de huevo, como de
granos desoja mediante extracción mecánica, o química usando hexano los principales
constituyentes de las bicapas lipídicas de las membranas celulares. Además es un componente
de mayor relevancia en la lecitina, y en algunos contextos, los términos se usan como sinónimos.
Sin embargo, el extracto de lecitina está constituido por una mezcla de fosfatidilcolina y otros
compuestos.

http://es.wikipedia.org/wiki/Triglic%C3%A9rido
http://es.wikipedia.org/wiki/Fosfol%C3%ADpido
http://es.wikipedia.org/wiki/Bicapa_lip%C3%ADdica
http://es.wikipedia.org/wiki/Hormona
http://es.wikipedia.org/wiki/Esteroide
http://es.wikipedia.org/wiki/%C3%81cido_graso
http://es.wikipedia.org/wiki/Fosfol%C3%ADpido
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http://es.wikipedia.org/wiki/Glicerol
http://es.wikipedia.org/wiki/Esfingosina
http://es.wikipedia.org/wiki/Colina
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http://es.wikipedia.org/wiki/Glicerol
http://es.wikipedia.org/wiki/Glicol%C3%ADpidos
http://es.wikipedia.org/wiki/Triglic%C3%A9ridos
http://es.wikipedia.org/wiki/Fosfol%C3%ADpidos
http://es.wikipedia.org/wiki/Fosfatidilcolina
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http://es.wikipedia.org/wiki/Sales_biliares
http://es.wikipedia.org/wiki/Bilis
http://es.wikipedia.org/wiki/Fosfatidilcolina#cite_note-Lehninger-1
http://es.wikipedia.org/wiki/Yema_de_huevo
http://es.wikipedia.org/wiki/Soja
http://es.wikipedia.org/wiki/Bicapas_lip%C3%ADdicas
http://es.wikipedia.org/wiki/Membranas_celulares

COLESTEROL
El colesterol es un esterol (lípido) que se
encuentra en los tejidos corporales y en
el plasma sanguíneo de los vertebrados. Se
presenta en altas concentraciones en
el hígado, médula espinal, páncreas y cerebro.
Es
un lípido esteroide, molécula deciclopentanoperhidrofenantreno (o esterano), constituida por
cuatro carboxilos condensados o fundidos, denominados A, B, C y D, que presentan varias
sustituciones:
1. Dos radicales metilo en las posiciones C-10 y C-13.
2. Una cadena alifática ramificada de 8 carbonos en la posición C-17.
3. Un grupo hidroxilo en la posición C-3.
4. Una insaturación entre los carbonos C-5 y C-6.
En la molécula de colesterol se puede distinguir una cabeza polar constituida por el grupo
hidroxilo y una cola o porción apolar formada por el carbociclo de núcleos condensados y los
sustituyentes alifáticos. Así, el colesterol es una molécula tan hidrófoba que la solubilidad de
colesterol libre en agua es de 10−8 M y, al igual que los otros lípidos, es bastante soluble en
disolventes apolares como el cloroformo (CHCl3).
Los lípidos generalmente se encuentran enlazados a proteínas y polisacáridos de los tejidos,
formando complejos con diferentes grados de estabilidad, por lo que para poder romper estos
complejos se requiere el empleo de condiciones de extracción capaces de desnaturalizar o separar
las proteínas o carbohidratos asociados con ellos. El etanol, por ejemplo desnaturaliza proteínas
y separa los complejos de lipoproteínas.
http://es.wikipedia.org/wiki/Esterol
http://es.wikipedia.org/wiki/L%C3%ADpido
http://es.wikipedia.org/wiki/Plasma_(sangre)
http://es.wikipedia.org/wiki/Vertebrata
http://es.wikipedia.org/wiki/H%C3%ADgado
http://es.wikipedia.org/wiki/M%C3%A9dula_espinal
http://es.wikipedia.org/wiki/P%C3%A1ncreas
http://es.wikipedia.org/wiki/Cerebro
http://es.wikipedia.org/wiki/L%C3%ADpido
http://es.wikipedia.org/wiki/Esteroide
http://es.wikipedia.org/wiki/Mol%C3%A9cula
http://es.wikipedia.org/wiki/Ciclopentanoperhidrofenantreno
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http://es.wikipedia.org/wiki/Radical_metilo
http://es.wikipedia.org/wiki/Hidrocarburo_alif%C3%A1tico
http://es.wikipedia.org/wiki/Grupo_hidroxilo
http://es.wikipedia.org/wiki/Polaridad_(qu%C3%ADmica)
http://es.wikipedia.org/wiki/Grupo_hidroxilo
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http://es.wikipedia.org/wiki/Polaridad_(qu%C3%ADmica)
http://es.wikipedia.org/wiki/Molaridad
http://es.wikipedia.org/wiki/L%C3%ADpido
http://es.wikipedia.org/wiki/Cloroformo

Para la separación de las lecitinas en la solución etérea se utiliza acetona ya que las lecitinas,
cefalinas y esfingolipidos son solubles en éter, etanol o cloroformo, pero insolubles en acetona
y por este motivo precipitan de la solución.
Otros lípidos simples se separaran por saponificación con hidróxido de potasio, formando
jabones. En la porción etérea resultante se va a separar el colesterol, ya que este no es material
saponificable. Para su aislamiento se evaporara el éter.

Método de LieberMann-Burchard para determinación de colesterol
Para determinar el colesterol total el método comprende:
Un tratamiento del extracto lipídico con hidróxido de potasio para liberar el colesterol de los
complejos lipoprotéicos y saponificar los ésteres de colesterol.
Una extracción del colesterol en un volumen medio de un solvente orgánico (éter de petróleo o
cloroformo) después de la dilución de la solución alcohólica con agua y después la identificación
del colesterol por medio de la reacción de color de Liebermann Burchard. Ésta reacción se realiza
en general en un medio ácido fuerte constituido por ácido sulfúrico, ácido acético y anhídrido
acético. En la reacción el colesterol sufre una oxidación gradual, formándose en cada etapa una
molécula de colestapolieno que posee un doble enlace adicional con respecto al compuesto del
cual deriva. La etapa inicial de la reacción consiste en la protonacion del grupo OH del colesterol,
con la consiguiente pérdida de agua obteniéndose en ion carbonio 3,5-colestadieno que
constituye el primer paso de la reacción de color. La oxidación secuencial de este ion carbonio
alílico por el SO2- produce un ácido colesta-hexano-sulfónico cromóforo con máximos de
absorbancia a 620 nm.
El anhídrido acético puede condensarse con los grupos hidroxilo de la posición 3 del colesterol,
6 esteroides relacionados produciendo el éster correspondiente. Si el esterol contiene un
insaturacion en la posición 5 ocurrirá una epimerizacion a la forma 3 y una deshidratación con
la formación de un color característico (un azul verdoso que pasa a verde). La reacción sirve
como una prueba específica para los 3-hidroxiesteroides con una insaturacion en la posición 5.

Pesar 1.27 g de yodo. Disolverlos en un poco de alcohol y aforar a 100 ml con agua destilada.
Reactivo de Liebermann Burchard (modificado): enfriar 20 ml de anhídrido acético en un frasco
de vidrio tapado. Añadir 1 ml de ácido sulfúrico concentrado, mezclar bien y mantener frío
durante 9 minutos. añadir 10 ml de ácido acético glacial y llevar la mezcla a temperatura ambiente.
Utilizar el reactivo después de su preparación.
(2 ML anhídrido acético – 4 GOTAS de H2SO4 concentrado).
Parte A. Obtención e identificación de Lecitina y colesterol a partir de la yema de huevo
de gallina
1. Pese un beaker de 250 ml. Rompa un huevo, separe la yema y vacíe en el beaker. Pese la
yema.
2. Añada una mezcla de 50 ml de etanol y 25 ml de éter hasta cubrir totalmente la yema y
agite con una varilla de vidrio para homogenizar bien, con cuidado durante dos minutos.
3. Agregue lentamente y sin dejar de agitar, un volumen de acetona igual al de la mezcla. Se
observará inmediatamente un precipitado.
4. Deje reposar la mezcla por 10 minutos.
5. Filtre sobre un papel filtro humedecido con etanol.
6. Lave el residuo que quedó en el papel de filtro con alcohol etílico bien frío.
7. Deje secar un poco y luego lleve el residuo a la estufa hasta sequedad.
8. Evapore el filtrado lentamente en un baño de vapor.
9. Pese los dos precipitados.
10. Tomar el residuo del filtrado evaporado y agregar 2.5 ml de KOH alcohólico al 33%.Llevar a baño maría a 37-40 °C durante 20 minutos.
11. Enfriar. Adicionar 5 ml de éter de petróleo, mezclando bien. Luego adicionar 2.5 ml de
agua destilada. Agitar vigorosamente. Por 1 minuto. Centrifugar a baja velocidad por
cinco minutos.
12. Tomar la capa etérea y agregar a ésta, después de enfriar, 3 ml del reactivo de
Liebermann-Burchard modificado.

Parte B. Hidrólisis ácida del almidón:

1. Coloque en su gradilla 10 tubos de ensayo y numérelos.
2. Numere por aparte, 10 microtubos de ensayo.
3. En un beaker de 50 ml coloque 25 ml de una solución de almidón al 1%, ya preparada
por el instructor.
4. Añada 10 gotas de ácido clorhídrico concentrado y agite suavemente.
5. Con un gotero tome un poco de esa solución y coloque una gota de ella en el primer
microtubo y 3 gotas en el tubo #1 de la gradilla. Enjuague su pipeta con agua destilada.
6. Encienda el mechero y coloque el beaker con la solución sobre la tela de asbesto para
calentarla hasta que hierva. El hervor debe ser suave. Si es necesario, baje la intensidad
de la llama del mechero.
7. A la gota que puso en el tubo #1 agréguele una gota de yodo. Se debe observar el color
característico del complejo yodo-almidón.
8. Anote el tiempo en que la solución empieza a hervir. En este momento tome con su
pipeta otro poco de la solución y coloque una gota en el microtubo #2 y tres gotas en el
tubo #2. Enjuague el gotero.
9. Agregue, inmediatamente, una gota de solución de yodo al microtubo #2 y observe si la
reacción del complejo yodo almidón comienza a hacerse débil o negativa.
10. A los dos minutos exactos de haber comenzado a hervir la solución repita la operación,
tomando un poco y dejando una gota en el microtubo #3 y el tubo #3. Agregue solución
de yodo al microtubo 3 y enjuague el gotero.
11. Esta operación se repite cada dos minutos hasta que la reacción yodo almidón sea
negativa, es decir que dé el color café del yodo y no el azul del complejo yodo almidón.
12. En ese momento se termina el calentamiento de la solución.
13. Agregue 3 ml de la solución de fehling a todos los tubos que recibieron gotas de la
solución.
14. Con su vaso de precipitados y usando agua destilada, prepare un baño de agua hirviendo.
Cuando el agua esté hirviendo, coloque en él todos los tubos, procurando que no se
derrame agua, para lo cual, desde el principio, llene el vaso solamente hasta un poco más
de la mitad.
15. Espere cinco minutos. Saque todos los tubos y colóquelos en su gradilla de acuerdo a su
numeración. Observe el grado de reducción por la cantidad de precipitado de óxido
cuproso de color rojo ladrillo en cada tubo.

Llene la siguiente tabla con los resultados:
# de
Microtubo
Color del complejo # de tubo Precipitado rojizo
1 1
2 2
3 3
4 4
5 5
6 6
7 7
8 8
9 9
10 10

Practica No.9
Extracción del ADN de un plátano.

Objetivos:
1. Extraer el ADN de un plátano.
2. Comprender cada una de las etapas de extracción del ADN.
FUNDAMENTO TEÓRICO
La extracción consiste en el aislamiento y purificación de moléculas de ADN y se basa en las
características fisicoquímicas de la molécula. El ADN está constituido por dos cadenas de
nucleótidos unidas entre sí formando una doble hélice. Los nucleótidos están integrados por un
azúcar (desoxirribosa), un grupo fosfato y una base nitrogenada (adenina, guanina, timina o
citosina). La unión de los nucleótidos ocurre entre el grupo fosfato y el azúcar, mediante enlaces
fosfodiéster, dando lugar al esqueleto de la molécula. Las bases de cadenas opuestas se unen
mediante puentes de hidrógeno y mantienen estable la estructura helicoidal (Figura 1). Los
grupos fosfato están cargados negativamente y son polares, lo que le confiere al ADN una carga
neta negativa y lo hace altamente polar, características que son aprovechadas para su extracción.
Los grupos fosfato tienen una fuerte tendencia a repelerse, debido a su carga negativa, lo que
permite disolver al ADN en soluciones acuosas y formar una capa hidratante alrededor de la
molécula. Pero, en presencia de etanol, se rompe la capa hidratante y quedan expuestos los
grupos fosfato. Bajo estas condiciones se favorece la unión con cationes como Na+ que reducen
las fuerzas repulsivas entre las cadenas de nucleótidos y permiten que el ADN precipite. Por otro
lado, la carga neta negativa del ADN le permite unirse a moléculas y matrices inorgánicas
cargadas positivamente. En general, los protocolos tradicionales consisten de cinco etapas
principales: homogeneización del tejido, lisis celular, separación de proteínas y lípidos,
precipitación y redisolución del ADN.
Existen diversos métodos de extracción de ADN dependiendo del tejido del cual se extraerá y
los fines del procedimiento, así como la capacidad económica del que lo realiza y el tiempo con

el que éste cuenta. A continuación se describirán las etapas más importantes del proceso de
extracción y algunas de las maneras en cómo se pueden realizar:
Homogeneización del tejido
La homogeneización, mecánica o química, consiste en romper las uniones entre las células para
facilitar la interacción con las soluciones de lisis que ayudan a liberar el material genético.
La homogeneización mecánica incluye el uso de:
Nitrógeno líquido: Este procedimiento consiste en macerar la muestra con nitrógeno líquido,
en un mortero de porcelana, hasta obtener un polvo muy fino. El nitrógeno líquido, congela de
inmediato la muestra y evita que se formen cristales en el interior de la célula que rompen la
estructura celular e inicie el proceso de degradación.

Pistilos u homogeneizadores: Los pistilos disgregan la muestra mediante fricción con la pared
del tubo que contiene la muestra, adicionalmente se puede utilizar algún material abrasivo como
vidrio pulverizado o resinas. El proceso se realiza manualmente, con pistilos plásticos o con
ayuda de dispositivos electrónicos, conocidos como homogenizadores. Es recomendable
adicionar un poco del buffer de lisis antes de iniciar, estas soluciones desnaturalizan a las
proteínas y mantienen estable al ADN.
Homogeneización química
En la homogeneización mediante agentes químicos, la muestra se mantiene en solución a altas
temperaturas en presencia de detergentes, proteasas y agentes caotrópicos que rompen las
uniones entre las células o que incluso pueden perforar la membrana celular. La disgregación
química es recomendable para bacterias, muestras pequeñas de tejidos frescos o sangre. En
tejidos fibrosos es recomendable cortar en fragmentos pequeños para favorecer su disgregación.
Lisis celular
Durante el proceso de lisis las interacciones entre las moléculas que conforman la pared, la
membrana celular y nuclear se modifican o destruyen permitiendo que los ácidos nucleicos se
liberen (Figura 2). Se utilizan soluciones básicas, detergentes o agentes caotrópicos que permiten

disolver la membrana celular, así como inhibidores para inactivar las enzimas que degradan el
ADN. Muchas soluciones de lisis contienen también EDTA, que forma un complejo con los
iones de Mg2+ e impide el funcionamiento de las DNasas (Sambrook et al. 1989). Los
componentes celulares no solubles como el material fibroso y proteínas que permanecen en
solución se separan del ADN por centrifugación. Tanto la homogeneización como la lisis celular
son similares en los protocolos tradicionales y comerciales. Las particularidades del resto de las
etapas se explican, a continuación, independientemente para cada uno de los protocolos.
Protocolo tradicional
Separación de proteínas y lípidos
En esta etapa se separa el ADN de las proteínas y lípidos mediante solventes orgánicos y ciclos
de centrifugación (Figura 2.1A). Se utiliza la fuerte tendencia hidrofilia de los grupos fosfato para
separarlos en