Determinacion de proteinas

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PRÁCTICA No. 2
DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS.
MÉTODO DE BIURET
Determinación de proteínas. 
Método de Biuret
Objetivo
Aprender a manejar el método de Biuret para determinar las proteínas, además de saber determinar el pH sobre las proteínas de la leche, y observar las características de cada procedimiento e identificación-interpretación.
Marco teórico
COLORIMETRÍA: Es la ciencia que estudia la medida de los colores y que desarrolla métodos para la cuantificación del color, es decir la obtención de valores numéricos del color.
PUNTO ISOELECTRICO: Todas las macromoléculas de la naturaleza adquieren una carga cuando se dispersan en agua. Una característica de las proteínas y otros biopolímeros es que la carga total que adquieren depende del pH del medio.
Así, todas las proteínas tienen una carga neta dependiendo del pH del medio en el que se encuentren y de los aminoácidos que la componen, así como de las cargas de cualquier ligando que se encuentre unido a la proteína de forma covalente (irreversible).
Corresponde al valor donde la molécula tiene la misma cantidad de cargas positivas que negativas presentando una carga neta de 0 y la proteína presenta su máxima posibilidad para ser precipitada ya que las partículas se agregan.
Para calcularlo se deben utilizar los pKa.
(Los pKa a considerar para esta ecuación, en una tabla de pH, son los que contienen a la especie química con carga igual a cero, cuando tienen más de un pKa).
Las moléculas complejas, tales como las proteínas, se combinan con los iones hidrógeno y con otros iones presentes en la disolución, dando lugar a la carga neta de la molécula. A la concentración de iones hidrógeno, o al pH, para el cual la concentración del ion híbrido de una proteína es máxima y el movimiento neto de las moléculas de soluto en un campo eléctrico es prácticamente nulo, se le denomina punto isoeléctrico.
CASEINA: La leche contiene vitaminas (principalmente tiamina, riboflavina, ácido pantotéico y vitaminas A, D y K), minerales (calcio, potasio, sodio, fósforo y metales en pequeñas cantidades), proteínas (incluyendo todos los aminoácidos esenciales), carbohidratos (lactosa) y lípidos. Los únicos elementos importantes de los que carece la leche son el hierro y la vitamina C.
Las proteínas se pueden clasificar de manera general en proteínas globulares y fibrosas. Las proteínas globulares son aquellas que tienden a agregarse en formas esferoidales y no establecen interacciones intermoleculares como son los puentes de hidrógeno (característicos de las proteínas fibrosas) siendo solubilizadas en suspensiones coloidales.
En la leche hay tres clases de proteínas: caseína, lacto albúminas y lacto globulinas (todas globulares).La caseína es una proteína conjugada de la leche del tipo fosfoproteína que se separa de la leche por acidificación y forma una masa blanca. Las fosfoproteinas son un grupo de proteínas que están químicamente unidas a una sustancia que contiene ácido fosfórico. En la caseína la mayoría de los grupos fosfato están unidos por los grupos hidroxilo de los aminoácidos serina y treonina. La caseína en la leche se encuentra en forma de sal cálcica(caseinato cálcico). La caseína representa cerca del 77% al 82% de las proteínas presentes en la leche y el 2,7% en composición de la leche líquida.
La caseína está formada por alpha(s1), alpha(s2)-caseína, ß-caseína, y kappa-caseína formando una micela o unidad soluble. Ni la alfa ni la beta caseína son solubles en la leche, solas o combinadas. Si se añade la kappa caseína a las dos anteriores o a cada una de ellas por separado se forma un complejo de caseína que es solubilizado en forma de micela. Esta micela está estabilizada por la kappa caseína mientras que el alfa y la beta son fosfoproteínas que precipitan en presencia de iones calcio.
BIURET: El Reactivo de Biuret es aquel que detecta la presencia de proteínas, péptidos cortos y otros compuestos con dos o más enlaces peptídicos en sustancias de composición desconocida.
Está hecho de hidróxido potásico (KOH) y sulfato cúprico (CuSO4), junto con tartrato de sodio y potasio (KNaC4O6·4H2O). El reactivo, de color azul, cambia a violeta en presencia de proteínas, y vira a rosa cuando se combina con polipéptidos de cadena corta. El Hidróxido de Potasio no participa en la reacción, pero proporciona el medio alcalino necesario para que tenga lugar.
Se usa normalmente en el ensayo de Biuret, un método colorimétrico que permite determinar la concentración de proteínas de una muestra mediante espectroscopía ultravioleta-visible a una longitud de onda de 560 nm (para detectar el ión Cu2+).
ACIDO ACÉTICO: El ácido acético, o su forma ionizada, el acetato, es un ácido que se encuentra en el vinagre, siendo el principal responsable de su sabor y olor agrios. Su fórmula es CH3-COOH (C2H4O2). De acuerdo con la IUPAC se denomina sistemáticamente ácido etanoico.
Es el segundo de los ácidos carboxílicos, después del ácido fórmico o metanoico, que sólo tiene un carbono, y antes del ácido propanoico, que ya tiene una cadena de tres carbonos.
El punto de fusión es 16.6 °C y el punto de ebullición es 117.9 °C	
ACETATO DE SODIO: El acetato de sodio, (también llamado, etanoato de sodio) es la sal de sodio del ácido acético. Es un producto químico económico producido en cantidades industriales para una amplia gama de uso.
Planteamiento del problema
Sabemos que las proteínas se pueden cuantificar por medio de los métodos de Biuret, Bradford y BCA , además de que la determinación de concentración es una muestra biológica la cual nos sirve para el diagnostico de enfermedades. Suponemos que si se realiza adecuadamente las soluciones, podremos realizar adecuadamente la curva de calibración así como el punto isoeléctrico, por lo tanto nos planteamos el siguiente problema ¿Cómo podemos cuantificar las cantidades de proteínas de la muestra sin que se salga del rango?
Material
	Cristalería
	Reactivos
	Probeta de 50 ml
	Agua destilada
	Gradilla 
	Solución de ácido acético 0.1 N 
	 2 pipetas de 10 ml
	Solución de acetato de sodio 0.1N 
	3 pipetas de 5 ml 
	Solución de caseína
	Pipeta de 1 ml 
	(concentración 4 mg/ml)
	12 Tubos de 15 x 100 
	Reactivo de Biuret 50 ml.
	vaso de precipitados de 100 ml
	leche en polvo descremada
	12 tubos de 16 x 150 
	
	1 balanza granataria 
	
	Papel para film para 10 tubos 
	
	centrífuga clínica
	
	Plumón permanente
	
	2 espectrofotómetros
	
	4 celdas 
	
	Escobillón para lavar tubos
	
	Masking tape
	
	Jabón y franela para limpiar
	 
Estrategia Metodológica
Nuestra estrategia metodológica se dividió en 4 fases. En la primera se hizo una preparación de una serie de tubos con solución amortiguadora de acetatos, para determinación del punto isoeléctrico. En la segunda se llevo a cabo la preparación de la leche, para posterior uso. En la tercera se elaboro lo del punto isoeléctrico de la leche; y por último, se llevo a cabo la interpretación de la prueba antes hecha mediante el método de Biuret y se limpio el material.
	
Para la primera fase se rotularon 6 tubos con números consecutivos, posteriormente se adiciono a cada tubo las soluciones ácido acético y acetato de sodio como se relatara a continuación: en el primer tubo (1) se le añadió 5ml de ácido acético, el tubo dos se le añadió 4ml de ácido acético y 1ml de acetato de sodio, se continuo con el tubo tres en el cual se añadió 3ml de ácido acético y 2ml de acetato de sodio, el tubo cuatro le añadimos 2ml de ácido acético y 3ml de acetato de sodio, el penúltimo tubo(5) se le agrego 1ml de ácido acético y 4ml de acetato de sodio, para finalizar con el tubo 6 al cual se le añadió 5ml como en el tubo uno, pero ahora de acetato de sodio (solución amortiguadora de acetatos).
Para la segunda se llevo a cabo la preparación de la leche, la cual consistió en disolver 6 gr de leche en polvo descremada, con 50 ml de agua destilada en un vaso de precipitados de 100 ml, para continuar, en un tubo de ensaye de 16 x 150 mm se agrego 2 ml de la leche rehidratada preparada comose indicó anteriormente, la cual se tomo con una pipeta, y se añadió 8 ml de agua destilada (medida con la probeta), y se agito por inversión. La leche se encuentra diluida (1:5), la cual posteriormente se utilizara (Fase tres). 
En la tercera fase se realizo el punto isoeléctrico de la leche diluida en el fase dos, se añadió 1 ml de la leche diluida (1:5) a cada tubo (6) de solución amortiguadora que se preparo en la fase 1, se mezclo de nuevo por inversión y se dejo reposar por 10 minutos (se observaron como grumos, ese era el punto isoeléctrico), se centrifugo los tubos a 2500 r.p.m. durante 10 minutos. Se separo el sobrenadante y se coloco en tubos limpios. 
Para la cuarta y última fase se llevo a cabo la determinación de las proteínas por medio del método de Biuret, en primer lugar en una gradilla se colocaron 11 tubos de 16 x 150 mm, los cuales se rotularon; uno de ellos como número cero, el cual llevaba los reactivos para calibrar el espectrofotómetro (blanco de reactivos o testigo), los tubos siguientes (4) llevaban números consecutivos del 1 al 4 y los restantes (del 1 al 6) se rotularon con el número que correspondía a los sobrenadantes obtenidos por centrifugación como se indicó en la fase 3, para continuar se añadió a cada tubo los reactivos para determinar proteínas en la curva de calibración (tubos I a IV) y en los sobrenadantes (tubos 1 a 6) de acuerdo a lo indicado en la siguiente tabla:
 CURVA DE CALIBRACIÓN TUBOS PROBLEMA 
	Tubo 
	0 
	I 
	II 
	III 
	IV 
	V 
	1 
	2 
	3 
	4 
	5 
	6 
	Solución Patrón 
4 mg/ml 
	0 ml 
	0.2 ml 
	0.4 ml 
	0.6 ml 
	0.8 ml 
	1 ml 
	0 
	0 
	0 
	0 
	0 
	0 
	Sobrenadante 
	0 
	0 
	0 
	0 
	0 
	0 
	0.5 
	0 
	0 
	0 
	0 
	0 
	Sobrenadante 
	0 
	0 
	0 
	0 
	0 
	0 
	0 
	0.5 
	0 
	0 
	0 
	0 
	Sobrenadante 
	0 
	0 
	0 
	0 
	0 
	0 
	0 
	0 
	0.5 
	0 
	0 
	0 
	Sobrenadante 
	0 
	0 
	0 
	0 
	0 
	0 
	0 
	0 
	0 
	0.5 
	0 
	0 
	Sobrenadante 
	0 
	0 
	0 
	0 
	0 
	0 
	0 
	0 
	0 
	0 
	0.5 
	0 
	Sobrenadante 
	0 
	0 
	0 
	0 
	0 
	0 
	0 
	0 
	0 
	0 
	0 
	0.5 
	Agua 
	1 ml 
	0.8 ml 
	0.6 ml 
	0.4 ml 
	0.2 ml 
	0 ml 
	0.5 ml 
	0.5 ml 
	0.5 ml 
	0.5 ml 
	0.5 ml 
	0.5 ml 
	Reactivo de Biuret (ml) 
	4.0 ml a todos los tubos 
Hipótesis
Si realizo adecuadamente las soluciones de acetatos, para determinación del punto isoeléctrico y además llevo a cabo bien el procedimiento de la leche, entonces podremos realizar el método de Biuret y llevar a cabo la realización de la curva de calibración bien.
Si no realizo adecuadamente las soluciones de acetatos, para determinación del punto isoeléctrico y además llevo a cabo bien el procedimiento de la leche, entonces no podremos realizar el método de Biuret y llevar a cabo la realización de la curva de calibración bien.
Resultado
Al usar el espectrofotómetro, los valores que se obtuvieron (D.O) están registrados en la siguiente tabla:
	Tubo
	I
	II
	III
	IV
	1
	2
	3
	4
	5
	6
	D.O
	0.020
	0.031
	0.052
	0.063
	0.021
	0.004
	0.006
	0.005
	0.022
	0.023
	Mg. De Proteína
	0.8
	1.6
	2.4
	3.2
	0
	0
	0
	0
	0
	0
Calcula el contenido proteico de los tubos I al IV de acuerdo al volumen empleado de la solución en estándar de caseína y colócalos en el eje X.
Coloca los valores de O.D. obtenidos para cada uno de estos tubos en el eje Y, y traza la curva correspondiente.
Interpolación de datos
Formulas.
	Y= contenido proteico
	m = pendiente
	b = constante
	x = absorvancia
	· La absorvancia son los valores que muestra el espectrofotómetro.
y= m x+ b
 Σ x · y - Σ x · Σ y
m = n
 Σ x2 - (Σ x)2 
 n
b= y - x m
 Σ x y – Σ x · Σ y 
	 n
R =
√ Σ x2 – (Σ x)2 · √ Σy2 – (Σy)2
 n
	Y
	X
	X*Y
	X2
	Y2
	0.020
	0.8
	0.016
	0.64
	0.0004
	0.031
	1.6
	0.0496
	2.56
	0.000961
	0.052
	2.4
	0.1344
	5.76
	0.002704
	0.063
	3.2
	0.2016
	10.24
	0.003969
	Ʃ 0.166
	Ʃ 8
	Ʃ 1344.2675
	Ʃ 19.2
	Ʃ 0.008034
	
(Ʃy)2 = 0.027556
	
(Ʃx)2 = 64
	
ȳ = 0.00665
	
ẋ = 2
 Σ x · y - Σ x · Σ y
m = n
 Σ x2 - (Σ x)2 
 n
 
 1344.2675 - (0.166) (8)
m = 4 
 19.2 - 64 
 4
 1344.2675 – 0.332 1343.9355
m = = = 419.9798
 19.2 – 16 3.2
y= m x+ b
y1= (0.0525) (0.020) + (-0.0385)
y1= -0.03745
y2 = (0.0525) (0.031) + (-0.0385)
y2 = -0.0368725
y3 = (0.0525) (0.052) + (-0.0385)
y3 = -0.03577
y4 = (0.0525) (0.063) + (-0.0385)
y4 = -0.0351925
 Σ x y – Σ x · Σ y 
	 n
R =
 √ Σ x2 – (Σ x)2 · √ Σy2 – (Σy)2
 n
1344.2675– (8) (0.166) 
	 4
R =
 √19.2 – (64 / 4) · √0.008034– (0.027556/ 4)
 
 1344.2675 – 0.332
R =
 √ 3.2 √ 0.001145
 1344.2675 – 0.332
R =
 (1.788854382) (0.03383784863)
 1344.2675– 0.332
R =
 0.0605309838
 1343.9355
R = = 22202.43941
 0.0605309838
Valores de O.D. de los tubos 1-6 , en el cual se calculo la cantidad de proteína presente en cada sobrenadante.
	Proteína
	mg/ml
	mg/100ml
	Sobrenadante 1
	(0.021) (5) = 0.105
	(0.105) (100) =10.5
	Sobrenadante 2
	(0.004) (5) = 0.02
	(0.004) (100) =2
	Sobrenadante 3
	(0.006) (5) = 0.03
	(0.006) (100) = 3
	Sobrenadante 4
	(0.005) (5) = 0.025
	(0.005) (100) = 2.5
	Sobrenadante 5
	( 0.022) (5) = 0.11
	(0.022) (100) = 11
	Sobrenadante 6
	(0.023) (5) = 0.115
	(0.023) (100) = 11.5
 Haciendo uso de la ecuación de Heenderson Haselbach se calcula el pH del tubo donde observaste la mayor precipitación de caseína.
pH = pK + log [A-]/[AH] Ecuación de Heenderson Haselbach.
 
pK de acido acético = 4.76
log [A-]/[AH] = log 2ml/5ml = log 0.4 = -0.3979
 pH = pK + log [A-]/[AH] = 4.76 +(-0.3979) = 4.3621
Conclusión
De acuerdo a los resultados que se observan en dicha práctica, Si realizo adecuadamente las soluciones de acetatos, para determinación del punto isoeléctrico y además llevo a cabo bien el procedimiento de la leche, entonces podremos realizar el método de Biuret y llevar a cabo la realización de la curva de calibración bien.
Consideramos que esta investigación nos lleva a proponer que, con el experimento realizado con anterioridad para la elaboración de dicho reporte, nosotros vamos aprender la separación de una proteína (caseína) a partir de una disolución de leche, esta proteína es muy importante, la cual forma el 80% de las proteínas en la leche de vaca, y como fue aceptada la hipótesis quiere decir que el trabajo se realizo bien dicha practica, porque los resultados obtenidos en los tubos de concentración de caseína y los sobrenadantes fueron óptimos.
En el caso de los tubos con concentración de caseína denominados del I al IV, estos tubos nos sirvieron para determinar la curva demostrada en los resultados.
Las implicaciones para la vida cotidiana de este estudio nos va a servir para nuestro estudio en la carrera elegida, porque nos puede servir para el diagnostico de enfermedades, les sirve a los doctore, químicos, veterinario, etc.
Bibliografía
1) Miller D.D. 2001. Química de Alimentos, Manual de Laboratorio. Limusa Wiley, México.
2) Garritz and Chamizo J. A. Tu y la química, “Ácidos y bases”, Edición 1, publicado por: Pearson Prentice hall 2001, 808 páginas.
3) Peña Díaz Antonio, Bioquimica, Edición 3, publicado por: Pearson Educatión, 1998
4) Bradford MM (1976): A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72: 248-254.
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PRÁCTICA No. 2
 
DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS.
 
MÉTODO DE BIURETDeterminación de proteínas. 
 
Método de Biuret
 
 
 
 
 
 
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PRÁCTICA No. 2 
DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS. 
MÉTODO DE BIURET 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Determinación de proteínas. 
Método de Biuret