Practica N 2 - Ciclo de Krebs

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PRACTICA Nº 2
CICLO DE KREBS
RELACIÓN DE EXPERIMENTOS
1. Determinación del consumo de oxígeno (Manometría)
2. Determinación del consumo de piruvato (Colorimetría)
INTRODUCCIÓN
Cuando la glucosa se degrada por la vía glicolítica se obtiene como producto final piruvato o
lactato. En condiciones aeróbicas, la etapa siguiente en la degradación de la glucosa, es la
descarboxilación oxidativa del piruvato a nivel mitocondrial, para formar acetil CoA, el cual
puede oxidarse hasta CO2 y H2O en una vía metabólica llamada ciclo de Krebs, ciclo de los
ácidos tricarboxílicos o ciclo del ácido cítrico el cual funciona en estrecha relación con la
cadena respiratoria mitocondrial. Es necesario remarcar que el acetil CoA no sólo proviene
del metabolismo de los carbohidratos, sino que también se forma durante la beta oxidación de
los ácidos grasos o en la oxidación de algunos aminoácidos.
El ciclo de Krebs se realiza en las mitocondrias y está íntimamente ligado a la cadena
respiratoria; este hecho tiene importancia metabólica por que los hidrógenos provenientes de
las oxidaciones producidas en el ciclo de Krebs, son captados por los transportadores de la
cadena respiratoria para llevarlos hasta el oxígeno molecular que se reduce y forma agua.
Como consecuencia se produce 1.5 ó 2.5 moléculas de ATP por cada proceso oxidativo.
Durante el ciclo de Krebs ocurre esencialmente lo siguiente: Un compuesto de 4 átomos de
carbono (oxalacetato), se condensa con el acetato (acetil CoA) para dar lugar a un ácido
tricarboxílico de 6 átomos de carbono (citrato). Un isómero de éste el isocitrato es
descarboxilado y oxidado para dar un cetoácido de 5 carbonos (alfa ceto glutarato), el cual a
su vez es descarboxilado oxidativamente para formar un ácido dicarboxílico de 4 carbonos
(succinato). A partir del succinato se regenera oxalacetato a través de reacciones en las que
ocurren dos oxidaciones.
En esta práctica se utilizará un homogenizado de hígado como fuente de enzimas, y se
demostrará el requerimiento de varios cofactores para un buen funcionamiento
del ciclo. Como en este proceso de oxidación de Piruvato, el oxígeno es reducido hasta agua,
el ciclo de Krebs será estudiado:
1. Midiendo el consumo de oxígeno mediante el empleo de un método manométrico.
2. Midiendo los micromoles de Piruvato consumidos, mediante un método colorimétrico
Experimento 1
Determinación del consumo de oxígeno.
La integración del ciclo de Krebs y la cadena respiratoria mitocondrial va a originar que el
oxígeno sea reducido y convertido en agua, produciéndose un consumo neto de este gas,
consumo que puede ser medido mediante el uso del respirómetro de Warburg.
Fundamento del respirómetro de Warburg.
El frasco de Warburg que contiene el sustrato, cofactores y el homogenizado de hígado, en
cuyo medio se quiere medir el consumo de oxígeno, es colocado en baño de agua a
temperatura constante. Estando cerrado el frasco y en comunicación con el manómetro, el
consumo de oxígeno determinará una disminución de la presión del sistema, lo cual se
evidencia por un desnivel del líquido manométrico presentes en las columnas. ( el
funcionamiento del respirómetro de Warburg así como los cálculos respectivos ya fueron
indicados en la práctica de Fotosíntesis: Bioquímica I ) .
Procedimiento.
Se preparan 6 frascos de Warburg; en la copa central de cada uno de ellos medir 0.4 ml de
KOH al 20 % y colocar un fragmento de papel filtro plegado en “acordeón”. Luego en el
compartimiento principal de cada frasco medir los siguientes reactivos:
1 2 3 4 5 6
ATP 0.01 M 0.4 ml 0.4 ml ---- 0.4 ml 0.4 ml 0.4 ml
MgSO4 0.02 M 0.3 ml 0.3 ml 0.3 ml ---- 0.3 ml 0.3 ml
NAD 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml ---- -----
Sustrato * ---- 0.6 ml 0.6 ml 0.6 ml 0.6 ml 0.6 ml
Buffer fosfato 0.1 M pH
7.3
0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml
H2O 0.7 ml 0.1 ml 0.5 ml 0.4 ml 0.2 ml ----
Fluoroacetato ---- ---- ---- ---- ---- 0.1 ml
Homogenizado de hígado
**
2.0 ml 2.0 ml 2.0 ml 2.0 ml 2.0 ml 2.0 ml
* El sustrato contiene 5 volúmenes de piruvato de sodio 0.1M y un volumen de fumarato de
sodio 0.01M.
** El homogenizado de hígado se obtuvo al homogeneizar en frío durante 2 minutos, hígado
de rata en ayunas con 9 volúmenes de sacarosa 0.25 M de buffer tris 0.02 M pH 7.4.
Preparar además un frasco termo barómetro (TB) que debe contener 4 ml de agua destilada
para corregir o compensar los cambios de presión y temperatura durante el experimento.
Equilibrar los sistemas por 10 minutos sin cerrar la llave de los manómetros, permitiendo el
libre intercambio gaseoso con el medio ambiente. Cerrar luego la llave de los manómetros y
la llave lateral de los frascos de Warburg y hacer la lectura cada 15 minutos.
Expresión de resultados
- Confeccionar una Tabla o Cuadro y anotar las lecturas obtenidas cada 15 minutos para
cada sistema.
- Convertir las lecturas obtenidas en ml de oxígeno consumido en una hora para cada
uno de los sistemas.
- Interpretar los resultados para cada sistema.
CUADRO DE RESULTADOS:
(Completar el siguiente cuadro, realizando los cálculos respectivos)
Tiempo
TB
1
KO2=0.96
2
KO2=1.03
3
KO2=0.94
4
KO2=1.00
5
KO2=0.89
6
KO2=0.88
0’ 183 295 297 289 278 274 275
10’ 184
234 205 250 230 220 250
20’
186 211 120 220 185 170 229
30’
185 182
40
299 190 135 130 200
40’
188 136 206 173 100 100 185
50’
188 113 135 155 65292 80 165
60’
186 92 48 50 275 65 145
Consumo de
oxígeno
en ml / 60’
192 520.15 221.84 227 183.34 111.76
Consumo de
Piruvato
en mMoles
0 13.685 3.615 3.720 3.957 0.512
Sistema 1: Los resultados muestran que hubo un mínimo consumo de oxígeno, asimismo, no
hubo consumo de piruvato, puesto que al no contener el sustrato con piruvato de sodio 0.1 N
y Fumarato 0.1 N, las enzimas tuvieron que reemplazar estos activadores de enzimas con el
homogenizado de hígado. Sin embargo, este no fue suficiente para que el piruvato sea
degradado.
Sistema 2: Este sistema tuvo el mayor consumo de oxígeno y piruvato, ya que contaba con
todos los reactivos necesarios para que el Ciclo de Krebs funcione de forma óptima.
Sistema 3: Para este sistema, hubo consumo de oxígeno y piruvato pero no fue completo como en
el sistema 2, puesto que en el sistema 3 no se añadió ATP, el cual es importante para la activación
de las enzimas del Ciclo de Krebs.
Sistema 4: En este sistema hubo un bajo consumo de piruvato, esto puede ser causado por la
ausencia del MgSO4, el cual es necesario para la enzima Isocitrato Deshidrogenasa y una de las
principales enzimas reguladoras del Ciclo de Krebs.
Sistema 5: Este sistema presentó un bajo consumo de oxígeno y de piruvato, ya que al no tener
NAD, dificulta el transporte de los H+ hacia la cadena respiratoria mitocondrial.
Sistema 6: Por último, este sistema fue el que tuvo el menor consumo de oxígeno y piruvato,
puesto que no contaba con NAD igual que el sistema 5, y además, se le agregó Fluoroacetato, el
cual es conocido por ser un inhibidor de la aconitasa, haciendo que el citrato se acumule.
2. Determinación de los micromoles de piruvato consumidos.
Fundamento.
El piruvato reacciona con la 2,4-dinitrofenil hidrazina, dando lugar a la formación de una
hidrazona que en medio alcalino toma una coloración pardo oscura, cuya absorbancia se mide
en el fotocolorímetro.
Procedimiento.
Al finalizar el experimento de la medición del consumo de oxígeno se abren todas las llaves
de los manómetros y frascos Warburg. Luego se trasvasa el contenido del compartimento
principal de cada frasco a tubos de prueba numerados del 1 al 6.
A parte preparar en tubos de prueba los sistemas 1, 2 y 6 (que están marcados con º ) donde el
tubo 1° sirve de blanco; los tubos 2° y 6° sirven de estándares.
Luego con los 8 tubos ( 1 – 6 después de haber medido el consumo de oxígeno; y los sistemas
basales 1, 2 y 6 ) se procede de la siguiente manera:
- Medir en tubos de prueba 2 ml del contenido de cada tubo
- Añadir 18 ml de ATCA al 5 % . Mezclar. Dejar en reposo por 5 minutos y filtrar.En otros tubos medir respectivamente:
- 0.4 ml de cada filtrado.
- 0.6 ml de agua destilada.
- 1.0 ml de 2,4-dinitrofenilhidrazina, dejar 20 minutos en reposo.
- Añadir 10 ml de NaOH al 10 %. Dejar en reposo por 5 minutos.
- Leer con filtro verde.
Tubo 1°: 0.038 Tubo 2°: 0.612 Tubo 6°: 0.605
Absorbancia de los tubos del 1 al 6 :
1: 0.038 2: 0.088 3: 0.471 4: 0.467 5: 0.458 6: 0.589
Calcular el Factor de calibración:
Tubo
1
Tubo
2
Tubo
6
Tubo
1
Tubo
2
Tubo
3
Tubo
4
Tubo
5
Tubo
6
Abs
bruta 0.038 0.612 0.605 0.038 0.088 0.471 0.467 0.458 0.589
Abs
neta - 0.574 0.567 0 0.050 0.433 0.429 0.420 0.551
Fc - 26.132 26.455 - - - - - -
Factor de calibración: 26.294
Calcular los micromoles de piruvato consumidos en cada sistema:
Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6
μmoles de piruvato
encontrados 0 1.315 11.385 11.280 11.043 14.488
μmoles de piruvato
consumidos 0 13.685 3.615 3.720 3.957 0.512
1: 0 2: 13.685 3: 3.615 4: 3.720 5: 3.957 6: 0.512
INTERROGANTES:
1. ¿Qué es el ciclo de Krebs, qué importancia tiene y en qué lugar de la célula
ocurre? (Grecia)
El ciclo de Krebs también conocido como el ciclo tricarboxílico o ácido cítrico es una
serie de reacciones químicas que se dan en las mitocondrias de los organismos
aerobios con el objeto de producir coenzimas reducidas utilizadas para la síntesis de
ATP en la cadena transportadora de electrones. Tal como se mencionó, su importancia
radica en que este ciclo es el mayor productor de coenzimas que impulsan la
producción de ATP en la cadena respiratoria. Además, proporciona precursores para
la biosíntesis de proteínas y ácidos nucleicos, así como también dirigen el exceso de
energía hacia la biosíntesis de ácidos grasos para el almacenamiento de los mismos.
[1]
2. Haga el balance energético del Ciclo de Krebs asociado a la cadena respiratoria
mitocondrial para un mol de acetil CoA. (Valentina)
Cadena Respiratoria Mitocondrial
Ciclo de Krebs (para un
mol de acetil CoA)
1 ATP
3 NADH
1 FADH
1 ATP→1 ATP
3 (2.5 ATP)→7.5 ATP
1 (1.5 ATP)→1.5 ATP
10 ATP
3. ¿Qué finalidad tiene la preparación del sistema termo barómetro? (Grecia)
La preparación del sistema termo barómetro tiene la finalidad corregir los cambios de
presión y temperatura durante la experimentación.
4. ¿Qué finalidad tiene en la presente práctica, el empleo de KOH en el
compartimiento central de cada frasco Warburg ? (Grecia)
El empleo de KOH en el compartimiento tiene como finalidad absorber el CO2 que se
produce en frasco Warburg durante la reacción.
5. Qué es el KO2 (Grecia)
El KO2 es una constante que se usa con el fin de medir la producción o consumo de
oxígeno. Hallar esta constante resulta de mucha utilidad, puesto que solo basta con
multiplicar la altura de la variación en el instrumento (termo barómetro) por su valor y
obtener el consumo o producción de este gas, tal como se muestra en la siguiente fórmula,
donde Vg es el volumen del gas en el manómetro, T es la temperatura de incubación en
grados absolutos, Vf es el volumen del líquido en el frasco y αO2 es el coeficiente de
solubilidad del oxígeno a la temperatura de trabajo. [2]
6. Explicar la relación que existe entre el consumo de oxígeno y el funcionamiento
del ciclo de Krebs. (Daniela)
La relación que existe entre el consumo de oxígeno y el funcionamiento del ciclo de
Krebs, es que mediante la respiración celular, el ácido pirúvico se oxida en CO2 y
H2O en presencia de oxígeno, se desarrolla y eso dará origen a dos etapas, el ciclo de
Krebs y la cadena respiratoria, en el caso de las células eucariotas el ciclo de krebs
tiene lugar en la matriz de la mitocondria en presencia de oxígeno, donde existe
consumo de oxígeno para que pueda funcionar el ciclo de Krebs. [3]
7. ¿Cuál es la razón de que el sustrato contenga fumarato? (Paola)
El sustrato contiene fumarato, ya que cuando este ingresa a la matriz mitocondrial es
atacado por las enzimas fumarasa y malato deshidrogenasa mitocondrial para formar
oxalacetato, el cual es un compuesto importante en el Ciclo de Krebs, junto al Acetil
CoA, producto del ataque del piruvato por las enzimas del Complejo de la Piruvato.
8. ¿Qué inhibidores del ciclo de Krebs conoce Ud.? . ¿Dónde actúan? (Daniela)
El ciclo de Krebs tiene 3 inhibidores clásicos los cuales son: Fluoracetato, Arsenito,
malonato.
- Fluoracetato (flúor acetil CoA): Va a reaccionar con el oxalacetato
produciendo fluorocitrato, pero la aconitasa no lo reconoce y se paraliza el
ciclo.
- El Arsenito: Inhibe todos aquellos compuestos multienzimáticos que usan
lipoamida como coenzima, y en el caso del ciclo el que usa lipoamida es el
complejo enzimático de α –cetoglutarato deshidrogenasa. También usa
lipoamida que también es inhibida por el arsenito (dentro de la mitocondria)
pero no hace parte del ciclo. El arsenito inhibe piruvato deshidrogenasa, α –
cetoglutarato deshidrogenasa, alfa cetoácidos de cadena ramificada
deshidrogenasa, piruvato deshidrogenasa, Fluoroacetato + Acetil CoA,
FluroacetilCoA, Fluoroacetil CoA + Oxalacetato, Fluorocitrato Inhibidor
mortal de la aconitasa.
- Malonato: Es inhibidor competitivo de la succinato deshidrogenasa también
es inhibidor de la respiración celular, porque se une al sitio activo de la
succinato deshidrogenasa en el ciclo del ácido cítrico, pero no reacciona,
compitiendo con el succinato. Estructura química del ion malonato. [4]
9. Indique qué vitaminas o derivados de vitaminas se necesitan para la
descarboxilación oxidativa del alfa cetoglutarato. ¿Qué otro ácido relacionado
con el metabolismo de la glucosa sufre igual transformación? (Paola)
Las vitaminas B son vitaminas solubles en agua necesarias como coenzimas para las
enzimas esenciales para la función celular:
- La Tiamina (B1) en su forma activa de Tiamina de Pirofosfato (TPP), es un
cofactor esencial para la descarboxilación oxidativa de los complejos de
cetoácido deshidrogenasa.
- La Riboflavina (B2) es un precursor del FAD, los cuales como grupos
prostéticos son necesarios en la activación de las flavoenzimas, incluidas las
deshidrogenasas.
- La Niacina (B3) es un precursor de los grupos reductores de NAD +,
coenzimas importantes para la enzima alfa cetoglutarato deshidrogenasa.
- El Ácido Pantoténico (B5), es un portador de grupos acilo, necesario para la
formación de la coenzima A y también es esencial para los complejos de alfa
cetoglutarato deshidrogenasa. [5]
El complejo α-cetoglutarato deshidrogenasa es semejante al complejo de la piruvato
deshidrogenasa: tres actividades enzimáticas análogas y las mismas cinco coenzimas:
TPP, NAD +, FAD, ácido lipoico, CoA. [5]
10. Cómo se regula el flujo metabólico del ciclo de Krebs. ¿Qué enzimas regulatorias
intervienen en este proceso y cómo son reguladas? (Daniela)
El flujo metabólico del ciclo de Krebs es reguladas por enzimas y éstas reguladas por
retroalimentación o también conocida como feedback, gracias a la unión alostérica de
ATP, algunas enzimas son reguladas negativamente cuando el nivel de poder reductor
de la célula es elevado, las enzimas que se incluyen son:
● Complejo de la piruvato deshidrogenasa: Sintetiza el acetil-CoA (necesario
para la primera reacción del ciclo) a partir de piruvato ( reacción irreversible),
regulada por inhibición, producto del NADH y acetil-CoA, y modificación
covalente de la enzima por fosforilación.
● Las enzimas citrato sintasa, isocitrato deshidrogenasa y α-cetoglutarato
deshidrogenasa: Son las que catalizan las tres primeras reacciones del ciclo de
Krebs, inhibidas por altas concentraciones de ATP, cortando el ciclo
degradativo cuando el nivel energético de la célula es bueno. [6]
TALLER. (2)
DEFICIENCIA DEL COMPLEJO DE LA PIRUVATO DESHIDROGENASA
INTRODUCCIÓN
El déficit de piruvato deshidrogenasa, es una enfermedad metabólica hereditaria rara, que
pertenece al grupo de los defectos del metabolismo intermediario de los hidratos de carbono
asociados con acidosis (estado metabólico en el que existen cantidades anormalesde cuerpos
cetónicos) láctica
CASO CLÍNICO
Un niño de 9 años de edad fue llevado a la clínica acompañado de sus padres. Su madre se
quejaba de que el niño en otra ocasión, se comportó de forma rara, caminando y hablando
como si hubiese estado borracho. Ella afirmaba que desde que el niño tenía 16 meses de edad,
éste había experimentado problemas similares en forma intermitente. Estos episodios a
menudo ocurrían después de un estado febril, fatiga y otras tensiones y pasaban en cualquier
momento desde unas pocas horas hasta más de tres semanas. Los ataques ocurrían entre dos a
seis veces por año y otros síntomas asociados incluían: volubilidad, movimientos retorcidos,
debilidad, respiración rápida y un fino sarpullido papular sobre la nariz y mejillas, pero no
https://es.wikipedia.org/wiki/Poder_reductor
https://es.wikipedia.org/wiki/Piruvato_deshidrogenasa
https://es.wikipedia.org/wiki/Reacci%C3%B3n_irreversible
https://es.wikipedia.org/wiki/Citrato_sintasa
https://es.wikipedia.org/wiki/Isocitrato_deshidrogenasa
https://es.wikipedia.org/wiki/Alfa-cetoglutarato_deshidrogenasa
https://es.wikipedia.org/wiki/Alfa-cetoglutarato_deshidrogenasa
https://es.wikipedia.org/wiki/Adenos%C3%ADn_trifosfato
todos los síntomas estuvieron siempre presentes. Los síntomas y su severidad eran variables
con cada ataque. Durante los últimos episodios severos, el niño fue capaz de asistir al colegio,
sin embargo, el ataque más severo redujo su capacidad de caminar y tuvo que descansar en
cama.
No hubo historia prenatal sobre abuso de drogas, alcohol o tabaco. La madre experimentó
adecuada nutrición y ganancia de peso durante el embarazo y no se identificó ninguna
enfermedad transmitida sexualmente ni exposición a toxinas. Tampoco se registró historia de
rasgos anormales, injurias en la cabeza, anoxia o infecciones perinatales, ni hubo historia
familiar de consanguinidad ni desórdenes de movimiento.
Excepto por las exacerbaciones agudas de la enfermedad, la vida del niño fue normal, pues él
disfrutaba montando su bicicleta y tocando el piano. Asistía al colegio regularmente y a pesar
particularmente de su mala escritura, él se mantenía insistente física y académicamente.
Al momento de la admisión al hospital, el niño no se quejaba de alguna lesión en la cabeza,
dificultad auditiva, fluidez nasal, náuseas, vómito, diarrea, ni dolor abdominal, pero si se
quejaba de visión doble, debilidad muscular, incoordinación y un sarpullido facial.
El niño tenía una talla de 1.37 m y un peso de 32 Kg, se mostró afebril, con respiración
rápida, taquicardia y caminada temblorosa al momento de ser examinado. Movimiento de
ojos irregulares, pero sin movimientos rápidos involuntarios. Sus pupilas fueron dilatadas y
reaccionaban lentamente a la luz.
Una extensa evaluación médica y estudios de laboratorio revelaron elevados niveles de ácido
láctico en sangre 3,8 mM (VN: 0,5-2,2 mM) y piruvato sanguíneo 0,36 mM (VN: 0,03-0,08
mM) pero la relación Lactato/Piruvato sérica 10/1 es normal. El único aminoácido cuya
concentración en suero se encontró elevada fue la alanina. La Glucosa sanguínea, niveles de
insulina plasmáticos, cetonas y la osmolaridad del suero fueron normales. Además la prueba
de tolerancia a la glucosa y los niveles de glucosa sanguínea en el ayuno fueron normales. El
pH sanguíneo fue de 7,3 (VN: 7,35-7,45). El Pco2 de 30 mm de Hg (Normal 33-38 mm de
Hg), la concentración de bicarbonato de 18 mM (Normal 22-30 mM) asimismo, el piruvato
en orina estuvo elevado a 0,21 – 0,32 mmol/día (Normal: 0,04-0,08 mmol/día), así como
también la excreción de alanina urinaria a 1,496-1,568 umoles/día (Normal: 60-500
umoles/día); ningún otro aminoácido o ácido orgánico estuvo anormal en el suero y orina.
Una biopsia de músculo esquelético, reveló un incremento en gotas de lípidos, pero no se
observó fibras rojas rasgadas características de ciertas mutaciones del DNA mitocondrial.
Finalmente, el análisis del fluido cerebro- espinal reveló también elevados niveles de lactato
3.4 mM (Normal: menor de 2,2 mM) y piruvato 0,35 mM (Normal: menor a 0,15 mM) con
una relación de Lactato/Piruvato de 10 normal. Ninguna otra anormalidad en el fluido cerebro
espinal fue observada.
BASES BIOQUÍMICAS Y MOLECULARES
Para comprender las consecuencias neurológicas y metabólicas de la deficiencia del
Complejo de la Piruvato Deshidrogenasa (PDHC) es necesario considerar:
- El metabolismo del piruvato en humanos.
- El rol central del complejo de la Piruvato Deshidrogenasa en el metabolismo de los
carbohidratos, lípidos y aminoácidos
- Dependencia del Sistema Nervioso Central de glucosa y producción aeróbica de
energía.
El Piruvato es derivado ya sea de la glicolisis o del catabolismo de aminoácidos. Así, el
piruvato derivado de la glicolisis es convertido en acetil CoA en la mitocondria vía la PDHC.
En general, esta vía opera cuando los niveles intracelulares de acetil CoA, ATP, NADH son
bajos. El Acetil CoA generado por la PDHC es responsable por mucho, del ATP generado por
la cadena de transporte de electrones. El piruvato, derivado del esqueleto carbonado de
aminoácidos, es carboxilado por la enzima mitocondrial piruvato carboxilasa, produciendo
oxalacetato. Este es el primer paso en la gluconeogénesis, lo cual ocurre exclusivamente en
hígado y riñón. La gluconeogénesis es apoyada por la b-oxidación de los ácidos grasos donde
el acetil Coa derivado ingresa al ciclo de Krebs mitocondrial y genera ATP, economizando así
glucosa, derivada primariamente de gluconeogénesis para ser usada por el sistema nerviosos
central durante el estado de ayuno. Además el piruvato puede ser enzimática y
reversiblemente convertido ya sea en lactato por Lactato deshidrogenasa o alanina por
transaminación.
Una deficiencia de la actividad enzimática de PDHC, limita severamente la cantidad de acetil
CoA aprovechable para el ciclo de Krebs, reduciendo la cantidad de NADH y FADH2,
producidos por esta vía, lo cual reduce la cantidad de ATP por Fosforilación oxidativa de la
cadena respiratoria mitocondrial. El cerebro tiene una constante demanda de ATP que es
obtenido fundamentalmente por metabolismo aeróbico vía ciclo de Krebs y Fosforilación
oxidativa. Además el Sistema Nervioso Central depende exclusivamente de glucosa, a través
de la glicolisis y de PDHC para aportar acetil CoA para el ciclo de Krebs. En contraste los
tejidos periféricos pueden usar una variedad de sustratos como combustible para el ciclo de
Krebs en lugar de glucosa (ácidos grasos, cuerpos católicos). Sin embargo, frente a un ayuno
prolongado el cerebro puede adaptarse a usar cuerpos cetónicos para una fracción
significativa de sus requerimientos energéticos. En los niños bien nutridos con deficiencia de
PDHC la mayor fuente de combustible sigue siendo glucosa (la acumulación de lactato y no
la producción de cuerpos cetónicos sería responsable de la acidosis metabólica observada en
la deficiencia de PDHC). Esta dependencia de la glucosa es la base para los efectos de la
deficiencia de PDHC sobre el sistema nervioso central. En una persona con deficiencia de
PDHC, el piruvato es producido por glicolisis, pero este se acumula debido a su incapacidad
de ingresar al ciclo de Krebs. El sistema nervioso central pasa a un estado de ayuno por
sustratos para el ciclo de Krebs. La situación es más complicada por los mecanismos
homeostáticos periféricos que mantienen los niveles de glucosa normales. Por ejemplo, el
catabolismo del glucógeno hepático por la glucógeno fosforilasa es directamente estimulado
por una caída en los niveles de glucosa séricos. Si la cetogénesis es inhibida, el cerebro es
privado de un sustrato alternativo. Sin un adecuado suplemento de energía para el cerebro, la
disfunción del sistema nervioso central se pone de manifiesto bajo la forma de movimientos,
intento de temblor y otras anormalidades. Algo del piruvato acumulado es reducido a lactato
o transaminado a alanina. Así los niveles de lactato piruvato y alaninase incrementan en
fluidos corporales.
El PDHC es la principal fuente de compuestos de dos carbonos que entran al ciclo de Krebs
cuando la glucosa es abundante. Esta actividad es regulada por inhibición por producto y por
cambios en su estado de fosforilación. Los productos de la reacción catalizada por PDCH
(acetil Co A y NADH) inhiben su propia producción, mientras que los sustratos (piruvato,
NAD + y CoA) activan el complejo. Por tanto, con una relación NAD +/NADH o CoA/Acetil
CoA incrementada también se incrementará la actividad de PDHC. Este complejo se inactiva
cuando es fosforilado y se activa cuando se desfosforila. Niveles altos de NAD +, CoA y
piruvato inactivan a la PDHC Kinasa e impiden así la fosforilación de PDHC. En cambio
calcio y magnesio activan a la PDHC fosfatasa. La cual a su vez activa a PDHC. En general
el Complejo Piruvato Deshidrogenasas PDHC, es activo cuando glucosa está siendo usada
para producción de ATP y es inhibida durante la beta oxidación de los ácidos grasos, cuando
NADH y acetil CoA mitocondriales están elevados. Finalmente, insulina y catecolaminas
activan a la PDHC en tejido adiposo y músculo cardiaco respectivamente.
El complejo de la piruvato deshidrogenasa está formado fundamentalmente por múltiples
copias de 3 componentes o enzimas:
- E1 o piruvato descarboxilasa, que es la que tiene mayor significación funcional
- E2 o dihidrolipoil transacetilasa
- E3 o dihidrolipoil deshidrogenasa
En los últimos años se ha descrito un cuarto componente de la piruvato deshidrogenasa, la
proteína X cuyas funciones se están precisando.
Este complejo enzimático es importante en todos los tejidos con actividad metabólica y juega
un papel fundamental para un correcto desarrollo del cerebro, puesto que éste, en condiciones
normales, obtiene la energía que necesita para su funcionamiento de la oxidación aeróbica de
la glucosa.
El déficit de piruvato deshidrogenasa es la causa más frecuente de acidosis láctica
primaria.Se ha descrito con mayor frecuencia en varones, pero también se detectan formas
severas de enfermedad en mujeres. No presenta predominio étnico.
Se caracteriza por una marcada variabilidad tanto por las manifestaciones y signos clínicos
como por los datos del laboratorio. El espectro clínico es amplio y va desde la acidosis
neonatal severa y fatal, a la presencia de alteración neurológica crónica en ausencia de
acidosis sistémica.
Se han descrito diferentes clasificaciones en función de la subunidad que se afecte y de las
manifestaciones clínicas predominantes.
Se distinguen tres tipos, en función de la subunidad que presente el déficit:
1. El déficit de la subunidad E1, es el más grave, de inicio neonatal y se asocia a una
acidosis láctica mortal, lesiones quísticas en la sustancia blanca y agenesia (desarrollo
defectuoso, o falta de alguna parte de un órgano) del cuerpo calloso. Los niños
mayores, por lo general varones, pueden presentar una acidosis menos severa, con
mayor actividad enzimática y ataxia (carencia de la coordinación de movimientos
musculares) con las dietas ricas en hidratos de carbono; la inteligencia puede ser
normal y los pacientes presentan rasgos faciales característicos similares a los del
síndrome alcohólico fetal.
2. El déficit de la subunidad E2, es extraordinariamente raro, se ha descrito un caso
asociado a retraso mental muy profundo.
3. El déficit de la subunidad E3, se comporta como un cuadro de acidosis láctica típica y
se caracteriza por vómitos, irritabilidad, letargia (carencia de energía), hipotonía (tono
anormalmente disminuido del músculo), crisis convulsivas, ataxia, movimientos
oculares anormales, atrofia (disminución de volumen y peso de un órgano) óptica y
coma. Puede existir retraso psicomotor (retraso en la adquisición de las habilidades
que requieren la coordinación de la actividad muscular y mental).
Independientemente de la subunidad que se afecte, la tendencia actual es a diferenciar tres
formas clínicas:
1. Forma neonatal severa. Es la más grave y suele deberse al déficit de la subunidad
E1, codificada por un gen ligado al cromosoma X, por lo que la enfermedad afecta
predominantemente a los varones. Se asocia a la acidosis, grave y refractaria al
tratamiento, afectación neurológica muy severa, falleciendo los niños por lo general
antes de los seis meses de vida.
2. Forma infantil. De comienzo más tardío con clínica de retraso psicomotor y acidosis
láctica moderada, pudiendo en unas ocasiones progresar hacia un síndrome de Leigh y
en otras hacia una afectación cerebral crónica con lesión de los ganglios basales.
3. Forma atáxica. Suele presentarse como episodios agudos de ataxia tras la ingesta de
carbohidratos en sujetos sin retraso mental.
Clínicamente la acidosis láctica se debe sospechar ante la presencia de la llamada respiración
de Kussmaul (respiraciones profundas y suspirosas) que si no se corrige puede dar lugar a
deterioro de la conciencia progresivo hasta llegar al coma, insuficiencia (fracaso funcional)
respiratoria, colapso cardiovascular, insuficiencia renal y muerte.
Se debe sospechar esta enfermedad en todo caso de afectación neurológica precoz de causa
desconocida, especialmente si además presentan anomalías del sistema nervioso central
(sistema formado por el encéfalo y la médula espinal) o acidosis láctica.
El diagnóstico de sospecha se basa en la clínica, los datos de laboratorio y las pruebas de
imagen, especialmente la resonancia magnética nuclear con espectroscopia para demostrar la
presencia de lactato en el cerebro.
Los niveles séricos basales de lactato, normales o ligeramente aumentados se elevan
bruscamente tras las pruebas de sobrecarga con glucosa. Existe normalidad de la relación
lactato – piruvato y ausencia de cuerpos cetónicos.
El diagnóstico se confirma determinando la actividad de la enzima, fundamentalmente en
cultivo de fibroblastos pero también en el tejido hepático, músculo esquelético o cardíaco y
riñón. Es posible realizar el diagnóstico prenatal.
La enfermedad carece de tratamiento efectivo. Se recomienda una dieta cetogénica,
especialmente en los casos que presentan ataxia desencadenada por la ingesta de
carbohidratos; esta dieta aumenta el porcentaje de energía, alrededor del 75% del aporte
calórico, obtenido de las grasas. También puede resultar útil el tratamiento con dicloroacetato
y existen ciertos casos que mejoran con tiamina, por lo que se recomienda hacer siempre un
intento de tratamiento con esta sustancia o asociando ambas.
Se hereda como un rasgo genético de marcada heterogeneidad. En la mayoría de las
ocasiones las mutaciones se localizan en el gen responsable de la subunidad E1, PDHA1, que
está ligado al cromosoma X (Xp22.1-p22.3), pero también pueden existir mutaciones en los
genes responsables de la subunidad E2 y E3, habiéndose identificado los genes que codifican
esas subunidades en el brazo largo del cromosoma 7 (7q31-32) y en el brazo corto del
cromosoma 11 (11p13).
INTERROGANTES
1. Además de su descarboxilación oxidativa para rendir acetil CoA, ¿qué otras vías
de utilización tiene el piruvato y qué importancia tienen? (Paola)
El destino del piruvato que se formó en la glucólisis puede variar dependiendo de las
condiciones ambientales:
- En condiciones aeróbicas se producirá una oxidación completa. (Acetil CoA).
- En condiciones anaeróbicas puede seguir una fermentación y producir: lactato
o etanol.
a) Fermentación láctica: En la fermentación láctica el piruvato es reducido a
lactato por la lactato deshidrogenasa. Esta reacción permite regenerar la
cantidad suficiente de NAD+ para que la glucólisis siga funcionando, al
menos durante un período corto de tiempo en situaciones en las cuales el
suministro de oxígeno se ve reducido, como en células musculares que se
contraen rápidamente cuando están expuestos a ejercicio intenso que presenta
una demanda energética elevada. Asimismo, tiene una enorme importancia
industrial ya que está implicadaen la elaboración de una gran cantidad de
productos derivados principalmente de la leche, como: yogures y quesos. [7]
b) Fermentación alcohólica: En la fermentación alcohólica se dan dos
reacciones consecutivas: la primera implica la descarboxilación del piruvato
por la enzima piruvato descarboxilasa, que utiliza como factor el pirofosfato
de tiamina y, posteriormente, el producto se reduce a etanol por acción de la
alcohol deshidrogenasa. Este tipo de fermentación se da sobre todo en
levaduras y en algunos tipos de bacterias y tiene igualmente un interés
industrial elevado, puesto que está implicada en la elaboración de bebidas
alcohólicas como: la cerveza y el vino, y también en la fabricación de pan. [7]
2. ¿Qué vitaminas intervienen en la reacción catalizada por la piruvato
deshidrogenasa? ¿Cuál es la función de cada una de ellas? (Grecia)
Para el complejo piruvato descarboxilasa intervienen 5 cofactores, 4 de ellos son
vitaminas hidrosolubles.
a) Pirofosfato de tiamina: es la forma activa de la vitamina B1 que actúa como
grupo prostético de la enzima piruvato descarboxilasa.
b) FAD: es la forma activa de la riboflavina (B2), actúa como grupo prostético de
la enzima dihidrolipoil descarboxilasa.
c) NAD: es la forma activa de la niacina, vitamina B3, quien actúa como grupo
prostético soluble de la enzima dihidrolipoil descarboxilasa. [8]
d) Coenzima A: es la forma activa del ácido pantoténico y actúa junto con el
ácido lipoico. Son grupos prostéticos de la segunda enzima dihidrolipoil
transacetilasa que participan en la transferencia de un grupo acetilo. [8]
3. Qué otra reacción similar a la catalizada por PDHC conoce usted. ¿Qué
importancia tiene? (Valentina)
E=1 Piruvato deshidrogenasa:
Cataliza la reacción de descarboxilación oxidativa del piruvato utilizando como
cofactor la tiamina difosfato
El piruvato se descarboxila y el fragmento de 2 carbonos se transfiere al anillo de
tiofeno, formándose el hidroxil etil TPP.
Dihidrolipoil transacetilasa:
En la transferencia desde E1 a E2, el hidroxi-etilo se oxida a acetilo, a la par que el
puente disulfuro de la lipoamida se reduce a dihidro-lipoamida, aunque como ésta
resulta acetilada, el producto es acetil-hidro-lipoamida.
Transferencia del acetilo desde la E2-hidro-Lipoamida a la CoA-SH El grupo acetilo
de la acetil-lipoamida (enlace tio-acilo) se transfiere a la CoA-SH, para formar
Acetil-S-CoA .La Lipoamida queda reducida como Dihidro-lipoamida.
Dihidrolipoil deshidrogenasa:
Cataliza la reacción de oxidación del NADH a NAD reduciendo al mismo tiempo la
dihidroxili lisina unida a una proteína -lisina .esta enzima utiliza como factor el FAD.
En la subunidad E3 se oxida el lipoico y los 2e- reduce el FADa FADH2 . Finalmente
el FADH2 se oxida, reduciendo el NAD + a NADH+H+.
4. ¿Cuál es el objetivo de utilizar piruvato radioactivo para medir la actividad de
PDHC? La marca debe estar en C-1 o puede estar en cualquiera de los carbonos
del piruvato? (Valentina)
La marca debe empezar en el C-1 del piruvato debido a que la reacción el grupo de
carbonos del piruvato libera CO2 y poder dar la modificaciones, llegando a reducir a
NADH, grupo acetilo se transfiere a coenzima A y acetil CoA.
5. ¿Tiene alguna idea de cómo hacer el diagnóstico perinatal de la deficiencia de la
enzima sin recurrir al estudio del DNA? (Daniela)
● Amniocentesis: Se extrae líquido amniótico del útero para llevar a cabo el
análisis. El líquido amniótico es el líquido que rodea y protege al bebé durante
el embarazo, contiene células fetales y diversas proteínas. [9]
6. ¿Cuál es el fundamento de utilizar una dieta rica en grasa en el tratamiento de
esta deficiencia? (Grecia)
La dieta rica en grasa o también conocida como dieta cetogénica se caracteriza por
tener una elevada concentración de grasas e hidratos de carbono en menor cantidad,
los cuales tiene el objeto de producir cuerpos cetónicos que van a tener un efecto de
sedante y de esa forma controlar las crisis epilépticas. [10]
7. ¿Se ha ensayado en el tratamiento de la deficiencia de PDH la utilización del
dicloroacetato? ¿Qué fundamento tiene su empleo? (Vyctoria)
Si. El empleo del dicloroacetato se basa en sus efectos positivos sobre la lactoacidosis
y la reactivación del PDH. Según fuentes, el dicloroacetato puede aumentar la
actividad del PDH en dos mecanismos: en el primero, el dicloroacetato inhibe a las
piruvato deshidrogenasas quinasas, las cuales, regulan la actividad de las PDH y la
inactiva mediante la fosforilación reversible de la subunidad E1a, y como
consecuencia, las PDC se mantienen activas en su estado catalíticamente activo no
fosforilado y los niveles de lactato disminuye. [11] Como segundo mecanismo de
activación del complejo, el dicloroacetato estabiliza el complejo enzimático y
disminuye su velocidad de degradación. [11] Por otro lado, se hace referencia también
a que puede aumentar la estabilidad del polipéptido E1a mutante, mejorando la
actividad residual de PDH. [12]
Por otro lado, según Stacpoole [13] menciona que varias investigaciones se ha
demostrado que el efecto del dicloroacetato ocurre en casi todos los tejidos, ya que
este atraviesa fácilmente la barrera hematoencefálica (transporte hacia el encéfalo) y
otras membranas plasmáticas, llegando así a casi todas las partes del cuerpo. Aun así,
no se sabe específicamente en qué tipo de pacientes o en qué edades se puede utilizar,
ya que se han reportado ciertos efectos secundarios, como la neuropatía periférica que
consiste en cierta debilidad muscular en algunas partes del cuerpo.
8. ¿Es recomendable el uso de tiamina? ¿Qué podría comentar respecto a la
administración de carnitina? (Vyctoria)
La tiamina es un cofactor de enzimas implicadas en el funcionamiento del PDH, y
además es un suplemento que está incluido en el manejo de la enfermedad, no es la
cura, pero sí ayuda a su activación y mejora de los pacientes. Su falta en el organismo
puede generar otras enfermedades, como la encefalopatía de Wernicke-Korsakoff.
[14] ya que la carnitina transporta los ácidos grasos hacia las mitocondrias para
obtener energía, puedo decir que sería una opción interesante de poder reducir el
exceso de ácido láctico en el organismo y poder generar la energía necesaria a falta
del complejo de la piruvato deshidrogenasa, ya que, al utilizar las grasas, se puede
transformar energía en lugar de degradar los azúcares en exceso. De igual forma,
sería necesario implementar una dieta adecuada para el paciente que contenga cierta
cantidad de ácidos grasos, además de una rutina de deporte para fortalecer los
músculos a falta de las grasas.
9. ¿En qué cromosoma está localizado el gen de E1 (Piruvato descarboxilasa?
(Daniela)
Se encuentra localizado en el gen PDP1 (pyruvate dehydrogenase phosphatase
activity subunit 1 –PDP1-), situado en el brazo largo del cromosoma 8 , codifica la
proteína piruvato deshidrogenasa fosfatasa 1, las mutaciones en el gen PDP1 presenta
son poco frecuente. [15]
10. ¿Por qué el sistema nervioso central es dependiente de la glicolisis y del ciclo de
Krebs para la producción de energía? ¿Cómo es afectado por la deficiencia de
PDHC? (Vyctoria)
Porque el sistema nervioso, al igual que cualquier otra parte de nuestro cuerpo,
necesita energía para trabajar y desarrollar bien sus funciones. Se sabe que el cerebro
es el órgano que consume más energía en el cuerpo debido a los procesos de
información y la actividad sináptica de las neuronas que genera un gasto alto de
energía, por lo que, a través de las vías metabólicas es que puede seguir funcionando
[16]. Ante la deficiencia de PDHC el cerebro no se basta con energía, y, en
consecuencia, no puede llevar a cabo correctamente sus funciones, ocasionando que
los pacientes se sientan mareados o atontados.
11. ¿Por qué el estrés así como las infecciones, empeoran el cuadro de deficiencia por
PDHC? (Vyctoria)
El estrés debilita el sistema inmunológico y crea una vulnerabilidad en el organismo,sobre todo en el estrés prolongado. Se sabe que ante estas situaciones desesperantes,
crónicas y/o prolongadas, se produce una liberación de hormonas como la
coticotropina, que genera a su vez la producción de noradrenalina entre otras
hormonas, que llevan a la persona a un estado de irritabilidad y depresión. Estos
efectos negativos pueden afectar gravemente el organismo, sobre todo cuando ya se
tiene una enfermedad como la deficiencia por PDHC. Ante la falta de energía, el
cerebro no trabaja bien, y con la depresión encima puede llevar al paciente a empeorar
aún más, o si debido a la baja de glóbulos blancos se adquiere otra enfermedad, el
organismo no tendría la energía necesaria para contrarrestarlo. Es por ello, que el
estrés no es recomendable para personas con ciertas enfermedades, puesto que, puede
empeorar. [17]
REFERENCIAS
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