Practica N13 - Bioquimica

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PRÁCTICA -TALLER FOTOSÍNTESIS
RELACIÓN DE EXPERIMENTOS
1. Fosforilación fotosintética
OBJETIVOS.
1. Procesar las lecturas obtenidas en el aparato de Warburg para obtener la producción
de oxígeno en microlitros en el tiempo de lectura
2. Conocer la manera como se hacen los cálculos para encontrar la relación P/O en cada
momento en que se hace la lectura del experimento de fosforilación
3. Interpretar adecuadamente los resultados presentados en el experimento
MANOMETRÍA
Los métodos manométricos permiten estudiar los procesos bioquímicos en general o
reacciones bioquímicas en particular en donde se consumen o se producen gases, como el
caso de la respiración celular, la fotosíntesis, la oxidación de los ácidos grasos, etc., para
hablar de procesos o como el caso de la Descarboxilación del piruvato, la hidrólisis de la
urea, etc, para hablar de reacciones. El proceso o la reacción se lleva a cabo en un vaso
cerrado conectado a un tubo manométrico que contiene un líquido y cuya variación de nivel
permitirá medir cuantitativamente los cambios gaseosos producidos. Los aparatos diseñados
para hacer estas determinaciones se denominan respirómetros y uno muy usado es el de
Warburg.
Aparato de Warburg.
Consiste de un manómetro graduado en milímetros, que se adapta a un frasco por medio de
una superficie perfectamente esmerilada. Durante la operación, el frasco, unido al manómetro
, es colocado en un baño de agua a temperatura constante y con agitación permanente para
mantener la temperatura uniforme en toda la masa de agua. El baño dispone de un termostato
muy sensible que contribuye a evitar variaciones en la temperatura mayores a 0.05°C. Resulta
fundamental mantener la temperatura muy constante para la exactitud de las medidas.
El manómetro es un tubo de vidrio en U, cuyas dos ramas tienen aproximadamente 30 cm de
longitud y un calibre interior de aproximadamente 1 mm. La extremidad inferior está
conectada a un reservorio de goma que contiene el líquido manométrico. La rama del
manómetro que comunica con el frasco tiene además una prolongación que posee una llave
que permite abrir o cerrar el sistema; la otra rama del manómetro queda abierta.
El frasco es de forma cónica, esmerilado interiormente para hacer conexión con el tubo
manométrico. En su centro tiene una copa cilíndrica para colocar álcali concentrado,
destinado a absorber el CO2 que pudiera formarse en el curso del experimento. El frasco
también tiene un brazo lateral cuyo fin es contener reactivos que deben ser mezclados con
aquellos del compartimiento principal para dar inicio a la reacción.
Las variaciones que pudieran producirse en la lectura del manómetro independientes del
consumo o producción de gases en el experimento, como aquellas derivadas de pequeñas
variaciones externas en la presión o en la misma temperatura de los sistemas, se corrige con
la operación de otro sistema (frasco-manómetro) que es denominado como termo barómetro
(TB). Este sistema contiene en su frasco un volumen de agua igual al del líquido en donde
ocurre la reacción y se hacen sus lecturas al mismo tiempo que la de los otros sistemas. Las
lecturas del TB se sumará o restará de la correspondiente al sistema experimental para
obtener la lectura neta que sólo corresponde a la originada por el consumo o producción de
gases en el proceso o reacción estudiada.
Cada sistema tiene una constante para medir el consumo de oxígeno (KO2) o la producción
de CO2 (KCO2). Estas constantes son muy prácticas ya que basta multiplicar la lectura neta
del manómetro del sistema experimental, por su valor, y obtener según el caso, el consumo de
oxígeno en μL o la producción de CO2 en μL, en el tiempo de estudio.
CONSTANTES DEL SISTEMA CERRADO.
A partir de algunos datos experimentales y aplicando la ecuación de los gases perfectos, se ha
determinado una constante para medir consumo o producción de oxígeno (KO2) ; o para
medir consumo o producción de CO2 (KCO2) ; estas constantes resultan de mucha utilidad ya
que basta multiplicar la altura de variación en el termo barómetro (h) por su valor y obtener el
consumo o producción del gas en microlitros.
El valor del K se estima con la aplicación de la siguiente fórmula :𝑂
2
𝐾𝑂
2
= 
𝑉𝑔 𝑥 273𝑇 + 𝑉𝑓 𝑥 α 𝑂2
10
Donde :
- Vg es el volumen del gas en el manómetro
- T es la temperatura de incubación en grados absolutos
- Vf es el volumen del líquido en el frasco
- es el coeficiente de solubilidad del oxígeno a la temperatura de trabajoα𝑂
2
EXPERIMENTO 1.
FOSFORILACIÓN FOTOSINTÉTICA
Utilizar los resultados obtenidos en un experimento de fotofosforilación para hacer cálculos
de la producción de oxígeno y del consumo de fosfato e interpretarlos adecuadamente.
Procedimiento utilizado para la obtención de los resultados publicados
a) Una suspensión de cloroplastos de espinaca en un tampón adecuado, y 0,2 ml de
K2HPO4 (40 mM) se colocaron en el compartimiento principal de 2 frascos de
Warburg
b) Al frasco de Warburg 2, se añadió 0,2 ml de ADP 50 mM
c) El volumen de ambos frascos ( 1 y 2 ) fue llevado hasta 2,8 ml con agua destilada
d) Al brazo lateral de cada frasco de Warburg se añadió 0,2 ml de K3Fe(CN)6 y en la
copa central de cada frasco de Warburg se midió 0,2 ml de KOH al 40%
e) Cerrados cada sistema manométrico (manómetro y frasco), se procedió a su
equilibrio, estando el baño a 16 oC. A esta temperatura, el coeficiente de solubilidad
del oxígeno es 0,034
f) Junto a los dos sistemas manométricos experimentales también se incubo el termo
barómetro (TB), que contenía agua destilada en el mismo volumen que cada uno de
los sistemas experimentales
g) Luego de 10 minutos de equilibrio, se procedió a hacer las lecturas (tiempo cero) en
los sistemas experimentales y en el termobarómetro.
h) Luego se inclinó el frasco para permitir que el ferrocianato pase la nave principal del
frasco de Warburg y se iluminó la preparación para dar inicio a la reacción
i) Las lecturas se hicieron en los tiempos que se indican en la Tabla que se presenta a
continuación, donde también están los valores encontrados.
TIEMPO TB FRASCO 1 FRASCO 2
0’ 100 110 105
3’ 100 117 118
6’ 101 124 130
9’ 100 129 142
15’ 101 143 163
21’ 101 152 175
24’ 102 157 178
Determinación de Fosfato.
a) Un duplicado del frasco 1 y otro del frasco 2 fueron medidos e incubados en las
mismas condiciones que los anteriores ; con el objeto de hacer la estimativa del
fosfato consumido en los diferentes momentos de lectura.
b) Se agitaron en el mismo baño que los anteriores y en los momentos en que se hacía la
lectura en ellos, en estos últimos se retiraron alícuotas para hacer la determinación de
fosfato por un método colorimétrico.
c) Para la determinación se detuvo la reacción con ácido tricloroacético al 5%, se filtró
la preparación y en el filtrado libre de proteínas se añadió molibdato de amonio y
posteriormente reactivo reductor. La intensidad de la coloración (azul) obtenida, fue
estimada en un fotocolorímetro.
d) La cantidad de fosfato inorgánico ( en micromoles ), presente en cada tiempo y en
cada uno de los frascos, fue la siguiente.
TIEMPO FRASCO 1 FRASCO 2
0’ 10.1 9.90
3’ 10.0 8.80
6’ 9.8 7.50
9’ 10.1 6.25
15’ 9,5 4.88
21’ 10.0 3.00
24’ 9.9 2.80
Resultados:
1. Utilizando las lecturas manométricas y siguiendo las indicaciones del instructor, llene
la tabla que se presenta en la página siguiente.
2. Para efecto de cálculo de KO2, tenga en cuenta que los volúmenes del frasco y del
manómetro hasta el punto de inicio del líquido manométrico, fueron respectivamente
16,8 ml y 16,5 ml para los sistemas 1 y 2.
Tiempo
(min.)
TERMO
BARÓMETRO
FRASCO 1
CLOROPLASTOS
KO2 = 1.60
FRASCO 2
CLOROPLASTOS +
ADP
KO2=1.57
L.B. C L.B. C L.N. L.B. C L.N.
0’ 100 -- 110 -- -- 105 -- --
3’ 100 0 117 7 7 118 13 13
6’ 101 -1 124 7 6 130 12 11
9’ 100 +1 129 5 6 142 12 13
15’ 101 -1 143 14 13 163 21 20
21’ 101 0 152 9 9 175 12 12
24’ 102 -1 157 5 4 178 3 2
Cálculo de KO2 paracada frasco.
 𝐾𝑂2
𝐹1
=
16.8 𝑚𝑙× 273289 +3𝑚𝑙×0.034
10 = 1. 60
 𝐾𝑂2
𝐹2
=
16.5 𝑚𝑙× 273289 +3𝑚𝑙×0.034
10 = 1. 57
3. En el espacio, Calcular los microlitros de oxígeno liberados por hora en el sistema 1 y
en el sistema 2
Sistema 1: 24 min____180 µ𝐿
60 min____x x =→ 180 µ𝐿/ℎ
Sistema 2: 24 min____278,68 µ𝐿
60 min____x x =→ 278. 86 µ𝐿/ℎ
4. Haga los cálculos correspondientes y complete la siguiente tabla:
TIEMPO
(minutos)
Micro Átomos de oxígeno
desprendidos
Micromoles de fosfato consumidos
- ADP + ADP - ADP + ADP
0’ --- --- --- ---
3’ 1 1 0.1 1.1
6’ 1.86 3.36 0.3 2.4
9’ 2.71 5.19 0 3.65
15’ 4.57 7.99 0.6 5.02
21’ 5.86 9.67 0.1 6.9
24’ 6.43 9.95 0.2 7.1
5. Utilizando los datos obtenidos en el sistema 2 ( + ADP ), haga los cálculos y complete
la siguiente tabla.
Tiempo
( Minutos )
3 6 9 15 21 24
RELACIÓN
P / O
1.1 0.70 0.69 0.62 0.70 0.70
6. Utilizando papel milimetrado haga un gráfico que relacione producción de oxígeno y
consumo de fosfato ( eje vertical ) versus tiempo ( eje horizontal ).
Use la misma escala para la producción de oxígeno (micro átomos) y para el consumo
de fosfato (micromoles). Tome en cuenta los datos de ambos sistemas.
INTERROGANTES.
1. Para que se añade el K3Fe (CN )6 ?
Se añade ferricianuro de potasio para que se dé inicio a la fotosíntesis, ya que éste es
el aceptor final de electrones.
2. ¿Qué destino tiene el fosfato consumido en el sistema 2 ?
Mientras se da la fotosíntesis, se da un gradiente de protones, ésta gradiente hace que
el ATP sintasa permita el paso de protones desde el lumen tilacoidal hacia el estroma
generando gran cantidad de energía, que permite la condensación del ADP y fosfato
inorgánico (Pi) para la formación de ATP. Sabiendo ello, el fosfato consumido en el
sistema 2 tiene como destino formar ATP.
3. ¿Está ocurriendo la fase en la oscuridad en los experimentos presentados?
Fundamente su respuesta.
En los experimentos presentados no está ocurriendo en la oscuridad, ya que los
fotones son indispensables para la excitación de la clorofila, pasar de un estado basal
a niveles de energía superiores y de ese modo dar lugar a una serie de reacciones de
óxido reducción con el único fin de generar energía para la síntesis de ATP y
posteriormente NADPH+H, sí es acíclico.
4. ¿Qué explicación le merece el que haya una importante producción de oxígeno
en el sistema 1 ?
Comparando al sistema 1 con el sistema 2, efectivamente hay producción de oxígeno
(O2), sin embargo éste es menor que el sistema 2, debido a que el sistema 1 no
contiene el sustrato ADP, el cual favorece y hace que sea más eficiente la producción
de O2.
5. Con los datos presentados puede señalar cuántos sitios de fosforilación existen en
la cadena de transporte fotosintético de electrones ?. Fundamente su respuesta.
En la cadena de transporte de electrones, la fosforilación solo ocurre en un sitio que se
llama ATP-sintasa, ésta es una enzima transmembranal de la tilacoide en los
cloroplastos de las células vegetales, que tiene como función principal utilizar la
energía almacenada por la gradiente de contracción para añadir fosfato inorgánico (Pi)
al ADP y formar ATP.
6. Haga un esquema de la cadena fotosintética transportadora de electrones e
indique los lugares de síntesis de ATP.
El ATP es sintetizado en la cadena REDOX que se forma entre el Fotosistema II(
P680) y el Fotosistema I(P700), a nivel de Complejo Cytb/f