BMC Teorica 4

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BMC 
Teórica 4 
El RNA 
Diferencias entre ADN y ARN: 
Nucleótidos: dA, dC, dG y dT Nucleótidos: A, C, G y U 
El RNA es el ácido nucleico más abundante de la célula (aprox hay 10 veces más de RNA 
que de ADN). 
Si bien puede purificarse de manera sencilla, es químicamente inestable: en solución 
acuosa se hidroliza fácilmente. 
El RNA puede adoptar estructuras secundarias y terciarias que aumentan su estabilidad y 
cooperan con la función biológica. 
Existen muchas clases de RNA: 
mRNA: son los intermediarios entre la información del gen y la maquinaria de S! de prot. 
Tienen una vida media muy corta: minutos (en bact) horas (en eucariontes) 
Se denomina Transcriptoma al conjunto de todos los mRNA de una célula. 
El mRNA eucariota se procesa 
antes de ser traducido El mRNA procariota no se procesa 
-La longitud del mRNA define al gen o 
al operón. 
-La proteína define la región codificante. 
-La longitud del RNA precursor (y no el 
mRNA) define al gen. 
-En el gen las regiones codificantes 
están separadas. 
Estructura de los mRNA procariotas: 
Estructuras de los mRNA eucariotas: 
rRNA: son los RNA más abundantes de la célula (Hasta el 80% del total). 
Son componentes de los ribosomas. 
tRNA: Transportan los aminoácidos al ribosoma y garantizan que se unan en el orden 
 especificado por la secuencia nucleotídica del mRNA. 
snRNA: RNA nucleares pequeños. 
Se encuentran en el núcleo y participan del procesamiento de los transcriptos 
primarios para convertirlos en mRNA. 
snoRNA: RNA nucleolares pequeños. Se encuentran en el nucleolo. 
Modifican químicamente a los rRNA. 
miRNA: microRNA 
siRNA: interferentes 
 pequeños 
Son RNAs pequeños que regulan la expresión de genes 
individuales. 
Transcripción del RNA 
Las enzimas responsables de la transcripción 
del ADN a ARN se denominan: 
RNA polimerasas dependientes de DNA 
En los eucariontes hay 3 RNA polimerasas: 
Polimerasa Genes que transcriben 
RNA polimerasa I Genes de rRNA: 28S, 5.8S y 18S 
RNA polimerasa II Genes que codifican proteínas; genes de la mayoría de los 
snRNA y genes de miRNA 
RNA polimerasa III Genes de tRNA, rRNA 5S, snRNA U6 y snoRNA. 
Todas son proteínas con múltiples subunidades (8-12) y una masa molecular >500kDa. 
En las Arqueobacterias hay una sola RNA polimerasa similar a la de eucariontes. 
En las bacterias, hay una sola RNA polimerasa formada por 5 subunidades. La subunidad  
tiene características particulares en cuanto a estructura y función. 
Los cloroplastos tienen una sola RNA polimerasa similar a la de bacterias. 
Las mitocondrias tienen una sola RNA polimerasa, pero formada por una sola subunidad, 
con una masa molecular de 140 kDa, estrechamente relacionada con polimerasas de fagos. 
¿Cómo interaccionan las RNA polimerasas con el ADN para iniciar la transcripción? 
Bacterias 
Eucariontes y Arqueobacterias 
Secuencias de reconocimiento para el origen de la transcripción: el Promotor 
Los promotores en E. coli constan de dos segmentos: secuencia -35 y secuencia -10 
Estas son secuencias consenso, describen el “promedio” de todas las secuencias 
promotoras de E. coli, pero pueden existir pequeñas diferencias. 
promotor Secuencia -35 Secuencia -10 
Consenso 5’-TTGACA-3’ 5’-TATAAT-3’ 
Operón lactosa 5’-TTTACA-3’ 5’-TATGTT-3’ 
Operón Triptofano 5’-TTGACA-3’ 5’-TTAACT-3’ 
La distancia entre los sitios -35 y -10 es crucial para que los sitios conserven la 
separación adecuada para la geometría de la RNA polimerasa. 
En el 90% de los promotores, en el sitio de inicio de la transcripción (posición +1), 
la base es una purina. 
En general: 
Cuando ocurren mutaciones en un promotor determinado, que incrementa la identidad 
con la secuencia consenso de -35 o -10, o que acortan la distancia entre ellas a 17pb, 
aumenta la tasa de transcripción de ese gen. Son mutaciones aceleradoras. 
Las mutaciones lentificadoras, casi siempre disminuyen la semejanza de cualesquiera de 
estos sitios respecto de las secuencias consenso o aumenta la distancia entre ellas a 
más de 17pb. 
Los promotores eucariontes son más complejos: 
Están formados por un promotor central o basal (donde se ensambla el complejo de 
inicio de la transcripción) y uno o más elementos promotores río arriba. 
Secuencia TATA (o -25): consenso 5’-TATAWAAR-3’ (W: A/T y R: A/G) 
Secuencia Inr: consenso en mamíferos 5’-YCANTYY-3’ (Y: C/T) 
Promotor basal para la RNA polimerasa II 
Inicio de la Transcripción 
En un diagrama general, la RNA pol de bacterias y 
las tres RNA pol de eucariontes, realizan los 
siguiente pasos para el inicio de la transcripción: 
Unión en forma directa o a través de proteínas 
accesorias al promotor o región promotora. 
El complejo promotor cerrado se 
convierte en complejo promotor abierto. 
Polimerización de los primeros ribonucleótidos. 
Despeje del promotor: es la verdadera 
finalización de la etapa de inicio. 
Inicio de la transcripción en E. coli: 
Estructura de la RNA pol en E.coli 
La especificidad de secuencia de la RNA-pol por el promotor reside en la subunidad . 
Si la enzima carece de esta subunidad, sólo puede formar uniones laxas e inespecíficas 
con el ADN. 
E.coli tiene muchos factores , cada uno 
de los cuales provoca que la RNApol inicie 
en un conjunto de promotores definidos 
por secuencias específicas -35 y -10. 
El factor  general, el cual se encarga de 
la transcripción de la mayor parte de los 
genes en condiciones normales, es 70. 
Los factores alternativos S, 32, E y 54 
son activados en respuesta a cambios 
ambientales. 
Cada factor  reconoce un promotor por medio de secuencias consenso: 
Inicio de la transcripción en E. coli: 
Mutaciones en la secuencia -35 afectan la capacidad de unión de la RNApol mientras que 
las mutaciones en la secuencia -10 afectan la conversión del complejo promotor cerrado 
a complejo abierto. 
Se establece un contacto directo entre el promotor (secuencia -35) 
y la RNA polimerasa (subunidad ). 
Se forma el complejo promotor cerrado. 
Las subunidades ’ y  rompen los 
puentes de H entre los pares de bases 
dentro de la secuencia -10, formando 
el complejo promotor abierto. 
La RNApol comienza a transcribir 8-9nt. 
Puede haber varias iniciación abortiva. 
Cuando la iniciación es exitosa, se desprende la subunidad  y 
comienza la fase de elongación. 
La RNApol “cambia” de tamaño durante la iniciación: 
Regulación de la 
Iniciación de la Transcripción 
En bacterias, muchos genes están formando parte de un agrupamiento transcripcional, se 
transcribe un solo mRNA policistrónico a partir de un promotor en el cual se regula el inicio 
de la transcripción. 
Control de la T! en operones 
Inducción 
Represión 
Ejemplo de regulación: operón lactosa 
Operón lactosa en ausencia de lactosa: 
Operón lactosa en presencia 
de lactosa: 
El verdadero Inductor es Alolactosa 
El operón lac también tiene una 
regulación positiva: 
Condición Transcripción 
Glucosa (+), lactosa (-) 
Glucosa (+), lactosa (+) 
Glucosa (-), lactosa (+) 
No 
Sí 
Sí +++ 
Regulación del operón triptofano: 
Elongación y Terminación de 
los Transcritos bacterianos 
Elongación 
En bacterias, la transcripción y la 
traducción están acopladas. 
La RNA pol cubre alrededor de 30pb del ADN molde, incluida la burbuja de transcripción 
de 12-14pb dentro de la cual el transcrito en crecimiento está unido a la cadena molde 
de ADN por aprox 8 pares de bases RNA-DNA. 
La polimerasa no sintetiza su transcrito a una velocidad constante, sino que realiza breves 
pausas. 
En la actualidad, se piensa que la transcripción es un proceso discontinuo y que la 
polimerasa efectúa pausas regulares para “elegir” entre continuar la elongación 
(añadiendo más ribonucleótidos al transcrito) o terminarla (disociándose del molde). 
La elección depende de qué alternativa sea más favorable desde el punto de vista 
termodinámico. 
Hay dos tipos de terminadores en E. coli: Terminadores intrínsecos. 
 Terminadores dependiente de Rho. 
Terminadores intrínsecos: son secuencias de ADN donde la cadena molde contiene un 
palíndromo invertido seguido de una serie de nucleótidos desoxiadenosina. 
Cuando se transcribe el palíndromo la 
secuencia de RNA se pliega formando 
una horquilla estable. 
Los pares A-U continuos, son más 
fáciles de desarmar. 
Este apareamiento RNA-RNA es 
favorecido respecto del apareamiento 
RNA-DNA que existe en la burbuja de 
transcripción. 
Además de la cuestión termodinámica, se postula que la horquilla RNA-RNA forma un 
“colgajo” que interactúa con la subunidad  de la RNApol (subunidad catalítica). 
 
Los movimientos de este “colgajo” podrían afectar indirectamente al sitio activo, lo 
que podría causar la ruptura DNA-RNA y la terminación de la transcripción. 
Terminación dependiente de Rho (p) 
De esta manera se libera el transcripto. 
La secuencia rut se encuentra cerca del extremo 3’ 
del RNA naciente. 
La proteína Rho se une a la secuencia rut de la 
cadena de RNA naciente y comienza a 
deslizarse por ella en busca de la RNApol. 
Cuando la RNApol se detiene, por una pausa o 
por una horquilla, Rho la alcanza y como es una 
helicasa, puede romper los pares de bases del 
híbrido DNA-RNA. 
Procesamiento de los RNA bacterianos 
Si bien los mRNA bacterianos no se procesan y son traducidos apenas van siendo 
sintetizados, sí se procesan los rRNA y tRNA 
Los rRNA 16S, 23S y 5S están formando una misma unidad transcripcional (pre-RNA). 
Se requiere de corte con ribonucleasas específicas para liberar los rRNA maduros. 
Los tRNA bacterianos también se transcriben en forma de precursor que debe ser 
procesado por ribonucleasas específicas: 
Los tRNA y rRNA presentan bases modificadas. 
Los rRNA son modificados de dos maneras: 
agregado de un grupo metilo al 2’OH de la 
ribosa y por conversión de la uridina en 
seudouridina. 
Se produce la misma modificación en la misma 
posición de todas las copias de un rRNA, 
incluso al comparar especies. 
Se considera que las bases modificadas median el reconocimiento de tRNA por las 
enzimas que le cargan el aminoácido correcto. 
Degradación de los RNA bacterianos 
El recambio de los mRNAs bacterianos es muy rápido y sus vidas media rara vez duran 
algo más de algunos minutos. 
Los mRNA bacterianos son degradados 
en dirección 3’-5’ 
En bacterias no se ha podido aislar 
ninguna enzima capaz de degradar 
el RNA en dirección 5’-3’ 
Síntesis y procesamiento 
del RNA eucarionte 
Inicio de la transcripción por la RNA polimerasa II 
Inicio de la transcripción por la RNA polimerasa II 
A diferencia de lo que pasa en bacterias, las RNApol de eucariontes no reconocen 
directamente las secuencias promotoras. 
Para los genes transcriptos por la RNApol II, se requieren varias proteínas llamadas 
Factores de Transcripción para la Polimerasa II (TFII). 
TBP: proteína de unión al TATA 
TAF: factores asociados con TBP 
 (son al menos 12 TAFs) 
TFIID 
TBP reconoce y se une a la secuencia TATA. 
Tiene una forma de silla de montar que envuelve 
parcialmente la doble hélice y forma una plataforma 
sobre la que se puede ensamblar el resto del 
complejo de iniciación. 
El contacto inicial con el promotor base se efectúa 
a través de TFIID. 
Después de que TBP se una al promotor central, se forma el complejo de pre-iniciación, 
por reclutamiento de otros GTF. 
La unión de TBP al ADN produce una torsión de 80° en la hélice 
y esto causa que el surco menor en la región de la secuencia 
TATA se ensanche, permitiendo que TFIIB se una al complejo. 
TFIIB hace contacto con el ADN río arriba y río abajo de la 
secuencia TATA. Eso garantiza la posición correcta respecto el 
sitio de inicio de la transcripción por la RNApol II. 
La RNApol II es llevada al complejo de pre-iniciación por TFIIF. 
Al complejo de pre-iniciación se suman TFIIE y TFIIH. 
TFIIH tiene actividad de helicasa, rompe el apareamiento de 
bases en el promotor: lo convierte a su forma abierta. 
La activación del complejo de iniciación requiere la fosforilación del 
dominio C-terminal de la subunidad más grande de la RNApol II. 
Esta fosforilación puede ser realizada por TFIIH o por mediadores. 
Secuencias potenciadoras (enhancer): 
En eucariontes, la regulación de la Transcripción está dada por la unión de proteínas a 
secuencias cortas de ADN en regiones lejanas al promotor basal. 
El inicio de la transcripción depende de la interacción entre los factores generales de 
transcripción y la RNApol II (en el promotor basal) con proteínas reguladoras unidas a 
secuencias regulatorias: 
¿Cómo pueden interactuar con distancias tan grandes? 
¿Cómo pueden interactuar con distancias tan grandes? 
Las proteínas de unión al DNA en eucariotas tienen distintos dominios: 
 Dominio de unión al DNA 
 Dominio de dimerización 
 Dominio de transactivación 
Hélice-giro-hélice Dedo de zinc Cinta-hélice-hélice 
Posibles estructuras de los dominios de unión al DNA: 
Dominios básicos: una hélice  que contiene alto n° de aa básicos (Arg, Ser, Thr) 
El dominio de unión al ADN y el dominio de transactivación son independientes 
Procesamiento de los mRNA eucariontes 
Todos los mRNA eucariontes tienen una caperuza o casquete agregada en el 
extremo 5’. 
La mayoría de los mRNA eucariontes tiene una secuencia poliA en el extremo 3’. 
Muchos de los transcriptos primarios poseen intrones, que deben ser procesados 
(splicing) para dar lugar al mRNA maduro. 
La caperuza se añade en cuanto se ha iniciado la transcripción, el corte y empalme de 
intrones y exones comienza mientras todavía se está sintetizando el transcripto y la 
poliadenilación es una parte inherente del mecanismo de terminación para la RNApol II. 
Qué factores influyen para que ocurra la transición entre el complejo que ha empezado a 
sintetizar RNA (menos de 30nt) y el escape del promotor (la polimerasa se aleja del 
promotor y sintetiza el transcrito) no están del todo claro. 
Pero parece estar relacionado con una fosforilación extra del dominio CTD de la RNApol 
por parte de la kinasa P-TEFb y con el proceso de capping de los transcritos. 
Capping de los mRNA: Ocurre antes de que el transcrito alcance los 30nt de long. 
Gppp pppN 
GpppN 
7-MeGpppN 
Guanililtransferasa 
Guanina 
Metiltransferasa 
Estructura del CAP: 
Elongación de los mRNA eucariontes 
La longitud extrema de los genes eucariontes impone exigencias al complejo de transcripción. 
Además, las RNApol eucariontes deben “negociar” con los nucleosomas que están unidos al 
ADN molde que debe transcribir. 
En el núcleo, las pausas y detenciones de la RNApol son menores debido a la acción de una 
serie de factores de elongación. 
Factor de Elongación Función 
TFIIF, CSB, ELL, elongina Suprimen la pausa de la RNApol II que puede suceder cuando la 
enzima transcribe una región donde se puede formar una horquilla. 
TFIIS Impide la detención (suspensión completa de la elongación) 
FACT Desensambla los dímeros H2A y H2B de los nucleosomas 
Poliadenilación y Terminación de la síntesis de mRNA 
La mayoría de los mRNA eucariontes tienen una serie de hasta 200 Adenosinas en sus 
extremos 3’, que no están especificadas en el ADN. Son agregadas luego de que el transcrito 
es liberado. 
La RNApol II transcribe más allá del sitio 
correspondiente al extremo 3’ del mRNA. 
Un complejo de proteínas reconocen una 
secuencia del mRNA, se produce un corte 
endonucleolítico y el mRNA se escinde de 
la Polimerasa. 
Otras unidades del mismo complejo 
agregan la poli(A) en el nuevo extremo 3’ 
Una exonucleasa degrada el RNA que la 
Polimerasa sigue transcribiendo, hasta que 
alcanza a la RNApol, interactúa con el 
dominio CTD y se libera la RNApol del ADN 
molde: Termina la Transcripción. 
En los eucariontes superiores, la secuencia de poliadenilación es 5’-AAUAAA-3’ 
Para que se genera un extremo 3’ 
correcto se necesita: 
Endonucleasa: formada por los 
componentesCFI y CFII 
CPSF: componente de especificidad, 
reconoce la secuencia AAUAAA. 
Polimerasa poli(A) (PAP): RNA polimerasa 
independiente del molde. 
Sintetiza la cola de poli(A). 
PABP (o PBP): proteína de unión al poliA. 
CstF: factor de estimulación, se une a GU. 
Procesamiento de los mRNA eucariotas 
El transcrito primario (con CAP y poliA) que es liberado de la burbuja de 
transcripción, contiene intrones que deben ser eliminados antes de que el mRNA 
pase al citoplasma y sea traducido. 
El proceso por el cual se eliminan los 
intrones se denomina splicing (corte 
y empalme) 
Intrón GU-AG: En la mayoría (98%) de los intrones de los pre-mRNA, los primeros 
nucleótidos son GU y los dos últimos con AG. 
Tipo de Intrón Localización 
GU-AG Pre-mRNA nuclear eucarionte 
AU-AC Pre-mRNA nuclear eucarionte 
Grupo I Pre-tRNA nuclear eucarionte, RNA organelas, pocos RNA 
bacterianos 
Grupo II RNA organelas, algunos RNA procariontes 
Grupo III RNA organelas 
Intrones de pre-tRNA Pre-tRNA eucarionte 
Intrones arqueobacterianos Diversos RNA 
¿Cómo se realiza el splicing? 
Si bien las reacciones de transesterificación son sencillas para las células, existe un 
problema topológico: la longitud de los intrones. 
Se requiere de una maquinaria que reconozca y acerque los sitios de corte y empalme. 
Los componente centrales del aparato de corte y empalme para los intrones GU-AG son 
los snRNA denominados U1, U2, U4, U5 y U6. 
(son moléculas cortas de RNA, entre 102 y 185nt). 
Los snRNA se asocian con proteínas y forman las snRNP ribonucleoproteínas nucleares 
pequeñas. 
Las snRNP junto con otras proteínas accesorias, 
se unen al transcrito y forman una serie de 
complejos, el último de los cuales es el 
“empalmosoma” o spliceosoma, donde se 
producen los cortes y empalmes reales. 
Estructura modelo de un snRNA: U1 
Empalmosoma o Spliceosoma: 
El reordenamiento de los snRNP en el complejo de spliceosoma requiere el gasto de ATP 
En los intrones AU-AC se utiliza otro empalmosoma: 
Empalmosoma U12: está formado por los snRNA: 
U11 y U12: cumplen la función de U1 y U2 
Una variante de U5 
U4atac y U6atac 
Ambos tipos de intrones coexisten en una variedad de genomas, incluso coexisten 
en un mismo gen. 
Splicing alternativo 
Cae el dogma “un gen – una proteína” 
Un gen  una proteína 
Con un mismo gen se obtienen proteínas con distinta afinidad o funcionalidad 
dependiente de tejido o temporalidad. 
Splicing en trans: Es casi imposible pensar que se pueden ensamblar exones de 
diferentes genes, sin embargo, es lo que sucede en algunos genes 
de C. elegans, tripanosomas y cloroplastos de algunos vegetales 
En C. elegans los tres mRNA de actina se forman de esta manera: 
El splicing es necesario para que los mRNA sean llevados al citoplasma para ser traducidos: 
Eliminación de intrones de los tRNA eucariontes: 
Los intrones de los tRNA son comunes en eucariontes inferiores, son secuencias cortas 14-60nt. 
A diferencia de otros tipos de intrones, el corte y empalme de los intrones de tRNA no 
implica transesterificaciones, sino la acción de una endonucleasa. 
Otros tipos de intrones: 
Grupo I: los encontramos en pre-rRNA nuclear eucarionte (5.8S, 18S y 28S), 
 en RNA de organelas y en pocos RNAs bacterianos. 
Grupo II: los encontramos en los RNA de organelas de hongos y plantas 
 y se conocen algunos pocos en procariontes. 
Grupo III: los encontramos en los RNA de organelas. 
Estos intrones son autocatalíticos, es el mismo RNA quien realiza las reacciones de 
transesterificación. 
Los intrones de tipo II que son eliminados 
también forman una estructura de lazo, al 
igual que los intrones GU-AG 
¿Existe una relación evolutiva? 
Los intrones de tipo I que son 
escindidos, se eliminan en forma 
lineal. 
Modificaciones químicas de los tRNA y rRNA eucariontes 
Los tRNA y rRNA eucariontes sufren las mismas modificaciones químicas que sus 
contrapartes bacterianas. 
Varía la forma en que los rRNA de eucariontes son modificados. 
Los RNA nucleolares pequeños 
(snoRNA) actúan como guías en 
la modificación química de los 
rRNA. 
Degradación de los RNA eucariontes 
Degradación del mRNA por desencapuchamiento dependiente de desadenilación 
Un mRNA sin CAP no 
puede ser traducido. 
Dcp1p 
Acción de los RNA interferentes (siRNA) y de los miRNA 
Dicer 
siRNA 
siRNA 
Degradación del mRNA viral 
Los siRNA se descubrieron como un mecanismo de las plantas para defenderse de las 
infecciones virales. 
Luego se comprobó que las plantas y animales sintetizan siRNA y miRNA para regular la 
presencia y actividad de sus propios mRNAs. 
miRNA endógenos: 
Aproximadamente el 50% de los miRNA están en clusters codificados como un 
transcrito policistrónico, que posteriormente se fragmenta en múltiples miRNAs. 
Algunos miRNAs son transcriptos a partir de promotores específicos que responden a 
factores de transcripción específicos. 
Algunos miRNAs se encuentran en los intrones de los genes que deben regular. En el 
momento del splicing, el intrón liberado es procesado para generar el miRNA. 
Los miRNAs están implicados en la regulación de genes durante el desarrollo 
embrionario y durante la diferenciación tisular. 
Los miRNAs se convirtieron en una valiosa herramienta para la manipulación de la 
expresión genética, estudios del desarrollo embrionario, técnicas contra la replicación 
viral, terapia contra cáncer, etc.