Unidad 1 Biot I

Vista previa del material en texto

Biotecnología I
Unidad I 
Carrera: LICENCIATURA EN BIOTECNOLOGIA
Trayecto curricular: Ciclo de Formación Inicial
Período: 2º Cuatrimestre – 2019
Dr. Leonardo Romorini
Investigador Adjunto – CONICET
LIAN, FLENI
leonardoromorini@gmail.com
BIBLIOGRAFÍA (obligatoria):
1) Alberts et al. Biología Molecular de la Célula, traducción al español de la 5a edición. 
Editorial Omega, Barcelona (2010). En Bs. As. distribuye Cúspide. 
2) Alberts, B., Bray., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K. y Walter, P. Introducción a 
la Biología Celular. Traducción al español de la 3ra. edición. Editorial Omega, Barcelona.
3) Díaz, A. Maffia, P. Biotecnología. Editorial Univ. Nac. de Quilmes, Edición 2011
Edición 2013.
4) Lodish, H., Berk, A., Lawrence Zipurski, S., Matsudaira, P., Baltimore, D. y Darnell, J. E. 
Biología Celular y Molecular. Editorial Médica Panamericana, Buenos Aires, 2005 
(traducción de la 5a edición en inglés).
5) Muñoz de Majalovich, M. A. Biotecnología. Editorial Univ. Nac. de Quilmes.
6) Rennenberg, R. Biotecnología. Traducción al español 3ª edición Editorial Reverté, 
Edición 2008.
7) Stryer, L. Bioquímica. Traducción al español de la 7a edición. Editorial Reverte, 
Barcelona (2013). 
BIBLIOGRAFÍA (complementaria):
1) Alberts et al. Molecular Biology of the Cell (6th edition). Garland Science Publishing, New 
York & London (2014).
2) Alberts, B., Bray, D., Hopkin, K., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K. y Walter, P. 
Essential Cell Biology (4a edición). Garland Publishing, New York & London (2013).
3) Barron, N. MicroRNAs as Tools in Biopharmaceutical Production, Springer, 2012.
4) Bernard R. Glick, Jack J. Pasternak. Molecular Biotechnology: Principles and Applications 
of Recombinant DNA. ASM Press, 2010.
5) Díaz, A. Biotecnología en todos lados. Editorial SigloXXI, Edición 2014.
6) Flint, S.J., Enquist, L.W., Racaniello, V.R., Skalka, A.M., Principles of Virology. 3rd Ed. 2009 
ASM Press.
7) Gary Walsh. Pharmaceutical Biotechnology: Concepts and Applications John Wiley & 
Sons, 2007.
8) Goldstein, D. Biotecnología Universidad y Política Editorial Siglo XXI, Edición 1996.
9) John E. Smith, Biotechnology fifth edition. Cambridge UniversityPress 2009.
10) Krishnarao, A. MicroRNAs, From basic science to disease biology. Cambridge University 
Press, 2008.
11) Levy Montalcini, R. Elogio a la imperfección Editorial Tusquets, Edición 2013.
Lundgren, M. CRISPR Methods and Protocols, Springer Protocols, 2015.
12) Michael Wink, An introduction to molecular biotechnology, fundamentals methods and 
applications. Second updated edition, WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA 2011.
BIBLIOGRAFÍA (complementaria):
13) O. Kayser, R.H. Müller. Pharmaceutical Biotechnology, Drug Discovery and Clinical
Applications. Wiley-VCH Verlag GmbH &Co.KgaA, 2004.
14) R. Guilford-Blake, D. Strickland. Guide to Biotechnology. Biotechnology Industry
Organization (BIO), 2008.
15) Slack, J. The Science of Stem Cells, Wiley Blackwell, 2018.
16) Tsang, S.H. Precision Medicine, CRISPR, and Genome Engineering, Springer, 2017.
17) Turksen, K. Stem Cells and Good Manufacturing Practices, Springer Protocols, 2015.
18) Watson J., Baker T., Bell S., Gann A., Levine M., Losick R. Molecular Biology of the Gene. 
(7a edición). Benjamin Cummings (2013).
Y las TEORICAS!!!
Es el uso integrado de la biología, bioquímica,
microbiología, informática y ciencias de la ingeniería
para lograr la aplicación tecnológica (industrial) de las
capacidades de los microorganismos, células animales y
vegetales y/o fracciones subcelulares derivadas de ellos.
(Federación Europea de Biotecnología)
BIOTECNOLOGÍA 
Áreas de la Biotecnología
Biotecnología Industrial (Blanco)
Biotecnología Farmacéutica (Roja)
Biotecnología Vegetal y de Alimentos (Verde)
Biotecnología Ambiental (Azul)
Impacto de la Tecnología Blanca
• Caso producción vitamina B12: 
– Proceso tradicional: 8 pasos de síntesis química
– Proceso Biotecnológico: Fermentación 40% menos impacto 
ambiental y 40% menos costos.
• Caso producción Cephalexin (AB amplio espectro): 
– Proceso tradicional: 10 pasos de síntesis (bio)química
– Proceso Biotecnológico: Fermentación y catálisis enzimática
• 65% menos Material usado
• 65% menos energía consumida.
• 50% reducción de costos.
Impacto global de la biotecnología blanca en la economía
La Biotecnología puede ser aplicada en la producción del 10 al 20% de
todos los productos químicos vendidos en un año. El impacto dependerá
del desarrollo de nuevas tecnologías de proceso, el aumento de la
demanda, las regulaciones internacionales.
www.europabio.org (2010)
 BIENES:
Todos los productos (alimentos, productos farmacéuticos,
recuperación de metales, biomateriales, obtención de
transgénicos, clonación de animales, etc.)
 SERVICIOS:
Lo relacionado específicamente con las prestaciones tales
como purificación de agua o tratamiento de efluentes,
remediación (extracción de derrames de petróleo),
herramientas analíticas, etc.
“La Biotecnología es la aplicación de los principios científicos y de la
ingeniería del procesamiento de materiales por agentes biológicos
para proveer bienes y servicios”
(Organización de Cooperación y Desarrollo Económico)
CONOCIMIENTO CIENTÍFICO
Bioquímica
Ingenierías 
Microbiología
Biología Molecular
Biología Celular
Computación
Inmunología
Fisiología
HERRAMIENTAS BIOTECNOLÓGICAS
Antisentido – CRISPR/Cas9
Bioprocesos
Ingeniería de proteínas
Cultivo de células y tejidos
Ingeniería genética
MEDICINA
AMBIENTAL
AGROPECUARIO
Rendimiento de cosechas
Salud animal Calidad de 
alimentos
Diagnóstico Vacunas
Terapéutica
Biorremediación Monitoreo ambiental
Control de la polución
La compañía Eli Lilly consiguió la aprobación de la (F.D.A) Food
and Drug Administration de los EE UU para la utilización de
“insulina humana” clonada y producida en Escherichia coli. A
esto siguieron los interferones, hormonas de crecimiento
humana y bovina, el antígeno de superficie del virus de la
hepatitis B, etc.
Bover y Swanson fundan Genentech Inc., la primera compañía biotecnológica,
dedicada al desarrollo y comercialización de productos basados en el ADN
recombinante, y al año siguiente Genentech reporta la producción de la
primera proteína humana fabricada en una bacteria: la somatostatina (Era
de la biotecnología).
Historia de la biotecnología…
Nueva “Revolución Industrial” llamada Biotecnología…
basada en microorganismos que, en manos de
científicos, se convierten en minúsculas fábricas para
producir fármacos, compuestos químicos industriales,
combustibles o alimentos.
Date Yield 
(units/mL)
Development
1929 2-20 Wild-type (P. 
notatum)
1941 40-80 Better WT
1943 80-100 New WT (P. 
chrysogenum)
1944 100-200 Colony selection
1944 300-500 X-irradiation
1945 800-1000 UV-irradiation
1949 1500-2000 Chemical 
mutagenesis
1951 2400 Chemical 
mutagenesis
1953 2700 Strain selection
1960 5000 Strain selection
1970 10000 Strain selection
Evolución de la 
producción de penicilina
Es cualquier proceso biológico que utilice células vivas
completas o alguno de sus componentes (por ej. Enzimas,
cloroplastos, etc) para desarrollar bioproductos de importancia
médica o industrial.
La utilización de la levadura para hacer pan, por ejemplo, es un
bioproceso.
Bioproceso
Son compuestos producidos por procesos biológicos, que
pueden ser tan simples en su estructura (como el metano,
CH4) hasta proteínas terapéuticas muy complejas (como la
insulina).
Metano InsulinaEtanol 
Bioproductos
Objetivos de los bioprocesos
• Utilizar y optimizar sistemas biológicos naturales o
artificiales por medio de la manipulación de células y su
ambiente para producir un producto deseado, de la calidad
requerida.
• La transición entre el laboratorio y la producción industrial
son las bases de la ingeniería en bioprocesos.
Criterios de diseño de un bioproceso
Calidad de la molécula: pureza, secuencia, 
glicosilaciones, actividad (in vivo, in vitro)
Concentración de la moléculaProductividad (volumétrica, específica)
Rendimiento
(se busca aumentar la velocidad de formación de producto (qP) y el rendimiento de 
biomasa (YX/S), que son los principales parámetros de productividad.
En los productos farmacéuticos (alto valor agregado) la calidad siempre 
es el primero de los criterios para diseñar un bioproceso.
Q
C
P
Y
O
rd
en
de
 im
po
rt
an
ci
a
o Ácidos orgánicos
Ác. cítrico (alimentos, bebidas, saborizante, acidulante, etc.)
Ác. itacónico (propiedades adhesivas: dientes, textiles, alfombras)
Ác. glucónico (lavado de botellas de vidrio, tratamiento def. Ca, anemia)
Ác. láctico
Ác. acético (vinagre)
Ác. Propiónico, butírico, fumárico
o Alcoholes y Cetonas
Etanol (bio-etanol)
Acetona
Butanol
o Aminoácidos
Ác. Aspártico (aspartamo- edulcorantes)
Ác. Glutámico
Lisina
Bioproductos
o Antibióticos
Penicilina, streptomicina, gentamicina, neomicina, ciclosporinas…)
o Vitaminas
o Enzimas
Proteasas, -amilasa, pectinasas, lipasas (jabón en polvo: lipasas, proteasas y amilasas)
o Proteínas terapéuticas
Productos de la sangre (fres. De coagulación, IFN, seroalbúmina humana, etc), 
Vacunas, Anticuerpos monoclonales, Insulina, Eritropoyetina, citokinas, etc.
o Polisacáridos
o Esteroides
o Bioinsecticidas
Bioproductos
STR: Stirrer Tank Reactor
M. Gavrilescu, Y. Chisti . Biotechnology—a sustainable alternative for chemical
industry . Biotechnology Advances 23 (2005) 471–499.
Etapas de un bioproceso
 Operaciones del Upstream Processing (USP)
Operaciones del Downstream Processing (DSP)
Las industrias que utilizan esta terminología incluyen las industrias
de metales, aceite, gas, biofármacos y otras industrias
biotecnológicas
Los procesos biotecnológicos industriales basados en la acción de
microorganismos como agentes transformadores constan de tres etapas
generales
Upstream o Pre-
tratamiento 
Comprende la preparación y 
esterilización del medio de 
cultivo y el inóculo. 
Los componentes de los 
medios y su naturaleza 
química debe cumplir con los 
requerimientos del 
crecimiento y de formación de 
productos y suministrar 
energía para el mantenimiento 
celular.
Biotransformación
Se da por acción de un 
catalizador biológico que 
generalmente es un 
microorganismo o una 
enzima, industrialmente 
este proceso ocurre en un 
Bioreactor.
Downstream o Post-
tratamiento
Comprende concentración y 
purificación, operaciones 
que se denominan 
Bioseparación.
Upstream 
Processing
Pre-tratamiento
Bio-reacción
Downstream 
Processing
Materia
prima
Producto
Etapas del proceso
Clasificación, tamizado, 
hidrólisis, formulación del medio, 
esterilización
Producción de Biomasa, 
biotransformación, síntesis del 
metabolito
Filtración, centrifugación, 
sedimentación, floculación, ruptura
celular, extracción, ultrafiltración, 
precipitación cristalización, 
cromatografía
Operaciones unitarias
más frecuentes
Etapas de un bioproceso
Producto
Esquema operaciones Upstream y Downstream
Gronemeyer P et al. Bioengineering (2014)
Etapas de un bioproceso
Operaciones del Upstream Processing
Elección del agente biológico
Optimización del medio de cultivo
Elección de la materia prima
Molienda
Tamización
Hidrólisis
Esterilización
Filtración
Etc.
Optimización del proceso de fermentación a escala de laboratorio
Son todas las operaciones comprendidas entre el aislamiento inicial de la célula 
productora y el establecimiento del banco celular hasta la cosecha de estas células 
(finalización del cultivo y colecta de celular) luego de la fermentación
Optimización del scale-up (escalado)
Ejemplo 1
Ejemplo 2
Fermentación industrial
Upstream
Material Crudo
Pretratamiento
Operaciones
Molienda
Tamización
Hidrólisis
Diseño de Medio
Esterilización
Filtración
Cultivo Stock
(criopreservado)
Cultivo 
Erlenmeyers
Biorreactor inóculo
Upstream Processing
Biorreactor inóculo
Preparación 
medio de cultivo
Esterilización 
medio de cultivo
Esterilización 
fermentador
Operaciones
Biotransformación
Operaciones del USP
1. Elección del agente biológico.
2. Optimización del medio de cultivo.
3. Optimización del proceso de fermentación.
Los agentes biológicos que llevan a cabo el bioproceso pueden ser 
desde plantas o animales hasta microorganismos, células de tejidos 
animales o vegetales o enzimas. 
En Biotecnología se utilizan agentes biológicos de distinta 
naturaleza para obtener productos de utilidad en muy diversos 
campos: farmacéutico, diagnóstico, médico, agrícola, alimenticio, 
ambiental. 
1. Agentes biológicos
Agentes biológicos usados en Biotecnología
• Células enteras
 Células microbianas
 Células vegetales
 Células animales
• Partes de células
 Animales
 Vegetales
• Enzimas
• Organismos enteros 
 Animales 
 Plantas 
• Tejidos y Órganos
 Vegetales
1. Agentes biológicos
Microorganismos
• Procariotas
>>bacterias
• Eucariotas
» levaduras
»hongos
»algas
»células animales
»células vegetales
Bacterias
Ventajas
Fácil manipulación genética
Alta productividad, 
Alto µ 
Resistentes al shear, la presión
osmótica
Levaduras
Ventajas
Alta productividad, 
Alto µ 
Altas concentraciones
celulares
Resistentes al shear, la presión
osmótica
Desventajas
Pobres secretores
No glicosilan
No realizan modificaciones post-
traduccionales
Desventajas
Glicosilaciones típicas de 
levaduras
Realizan modificaciones post-
traduccionales
Ej: Saccharomyces cereviceae Pichia Pastoris, Hansenula polymorpha
Ej: Zymomonas sp. Escherichia coli, Lactobacillus sp
Microbiología Industrial,
Ertola, Yantorno y Mignone (1994)
Células de mamíferos
Ventajas
Producen proteínas “human like”
Secretan proteínas
Plegadas correctamente y biológicamente activas
Desventajas
Tasa de crecimiento lenta (µ)
Densidad celular baja
Baja productividad
Sensibles al shear, la presión osmótica, a sustrato/productos tóxicos, edad celular
Ej. líneas celulares de mamíferos: CHO (Chinese Hamster Ovary), BHK 
(Baby Hamster Kidney), HEK, COS
Agentes Biológicos
• Tipo salvaje (wild type). 
Ej: Rubia tinctorum, antraquinonas
• Recombinantes.
Algunos microorganismos productores wild type
Obtención de recombinantes
OGMs: (organismos genéticamente modificados)
1. Microorganismos recombinantes
- resistencia a plagas
2. Vegetales - resistencia a herbicidas
- molecular farming
3. Animales - biomoléculas de interés 
farmacéutico
Requisitos de un buen microorganismo:
Un microorganismo de uso industrial debe:
- Producir la sustancia de interés.
- Tiene que estar disponible en cultivo puro.
- Debe ser genéticamente estable.
- Tiene que crecer en cultivos a gran escala.
- Tiene que crecer rápidamente y producir el producto deseado en un 
corto período de tiempo.
- Debe crecer en un medio de cultivo relativamente barato y disponible 
en grandes cantidades. 
- No debe ser patógeno para el hombre, ni para animales ni plantas.
- Debe ser fácil separar las células microbianas del medio de cultivo (la 
centrifugación es dificultosa o cara a gran escala). Los 
microorganismos industriales más favorables para esto son aquellos de 
mayor tamaño celular (hongos filamentosos, levaduras y bacterias 
filamentosas) ya que estas células sedimentas más fácilmente que las 
bacterias e incluso son más fáciles de filtrar. 
- Tiene que ser susceptible a la manipulación genética (si aplica).
Capacidad Productora
• “Per-se”
• Vinculadas al medio: selección del sustrato y 
optimización del medio de cultivo
• Optimización de las condiciones de operación
Algunas características del agente biológico
 Información genética:
-Información en el genoma.
-Información en plásmidos.
-Mutación
-Mutantes regulatorias.
 Empleo de secuencias regulatorias especiales
•Promotores específicos
•Enhancers de traducción
•Secuencias 5’ y 3’ UTR
•Secuencias señal: secreción espacio periplásmico (bacterias,
levaduras).
Secreción al medio de cultivo (bacterias, levaduras, células animales y
vegetales). Expresión en compartimentos celulares (plantas y células
animales)Operaciones del USP
1. Elección del agente biológico.
2. Optimización del medio de cultivo.
3. Optimización del proceso de fermentación.
2. Optimización del medio de cultivo
Del 
laboratorio a 
escala 
industrial…
Medio de Cultivo
• Satisfacer requerimientos nutricionales
• Nuevos componentes (ej. anti-foam)
• Optimización
• Relación costo/beneficio
Tipos de medios
-Sintéticos: químicamente definidos
-Complejos: químicamente indefinidos, con peptonas, extracto de levadura,
macerado de maíz, extracto de soja
Componentes
-Macronutrientes (fuentes de C, N, S, P, K y Mg en g/L)
-Micronutrientes (elementos traza como sales de Fe, mn, Ca, Zn, Co en mg/L)
-Factores de crecimiento: vitaminas, aminoácidos, étc.
Diseño de medios
Constituyentes de medios de cultivo
-Agar (sólido o líquido)
-Azúcares como fuente de C (glucosa, lactosa, sacarosa)
-Extractos (extracto de carne, de levadura, de tejidos de animales y vegetales,
etc)
-Peptonas (proteínas vegetales ó animales hidrolizadas, obtenidas por
digestión química o enzimática)
-Plasma, suero (SFB)
-Sales amortiguadoras (buffer)
-Soluciones indicadoras de pH
Tipos de medio de cultivo
Por su composición:
-Medios generales (se desarrollan gran variedad de MO)
-Medios de enriquecimiento (favorecen el desarrollo de determinado grupo de
MO)
-Medios selectivos (favorece el crecimiento de un tipo de MO e inhibe el
desarrollo de los demás)
-Medios diferenciales (énfasis en alguna propiedad que un determinado MO
posee)
Operaciones del USP
1. Elección del agente biológico.
2. Optimización del medio de cultivo.
3. Optimización del proceso de fermentación.
3. Fermentación 
Proceso realizado en un fermentador o biorreactor mediante el cual
determinados sustratos del medio de cultivo (ó de la materia prima) son
transformados por acción microbiana en metabolitos y biomasa.
El microorganismo aumenta su concentración, la composición del medio
de cultivo se va modificando y como resultado, se forman nuevos
productos como consecuencia del metabolismo.
El conjunto bioreactor-sistema de cultivo debe cumplir con los 
siguientes objetivos:
•Mantener las células uniformemente distribuidas en todo el 
volumen de cultivo.
•Mantener constante y homogénea la temperatura.
•Minimizar los gradientes de concentración de nutrientes.
•Prevenir la sedimentación y la floculación. 
•Permitir la difusión de gases a la velocidad requerida por el 
cultivo.
•Mantener el cultivo puro.
•Mantener un ambiente aséptico.
•Maximizar el rendimiento y la producción.
•Minimizar el gasto y los costos de producción.
•Reducir al máximo el tiempo.
3. Fermentación 
El proceso involucra una reacción o conjunto de
reacciones en las que un precursor pre-formado es
convertido en un determinado producto por el uso
de enzimas o células, ya sean libres o
inmovilizadas.
El producto se obtiene de novo utilizando C y una
fuente de energía, como por ejemplo glucosa vía
metabolismo primario
Síntesis de novo
Biocatálisis/Biotransformaciones
Síntesis de novo
Medio de cultivo
Agente biológico
Biorreactor
Producto Producto 
purificado
DSP
Tratamiento de 
efluentes
• Biotransformación:
En general, un proceso industrial puede realizarse por síntesis química 
o por bioconversión. Los microorganismos tienen la capacidad de 
modificar químicamente una amplia variedad de compuestos orgánicos 
de una forma muy específica. 
• Un compuesto orgánico es modificado en una o varias reacciones 
sencillas que forman parte de procesos biológicos. Estos cambios son 
denominados transformaciones microbianas o biotransformaciones.
Estos procesos catalizados por enzimas en la industria son cada día 
más numerosos, ya que presentan ventajas frente a los catalizadores no 
biológicos
Proceso 
• Aeróbico
• Anaeróbico
• En medio líquido
• En medio sólido (sustrato sólido- compostaje)
• Microorganismos inmovilizados
• Enzimas inmovilizadas
• El UPS generalmente comienza con la preparación
del inóculo, el cual se realiza en diferentes pasos de
scale-up, hasta obtener una cantidad determinada
de inóculo.
• Luego se inocula asépticamente el biorrector
esterilizado.
• La fermentación se puede realizar con diferentes
tipos de cultivo: batch, fed-batch, cultivo continuo
(dependiendo del tipo de alimentación del cultivo)
Scale-up
Inóculo
Biorreactor
Fermentación
Operación en batch (Discontinuo)
En la industria, el sistema más utilizado es el de operación en batch (o por lotes), que
consiste en un biorreactor que es alimentado al principio del proceso con el medio de
cultivo y con el agente biológico de interés, permitiendo su crecimiento hasta obtener
el producto deseado, sin agregar o extraer material del biorreactor.
La composición de la mezcla y la velocidad de reacción cambian con respecto al
tiempo.
El reactor generalmente es de tanque agitado, de manera que las composiciones de la
mezcla sean las mismas en cualquier parte del reactor.
La operación por lotes tiene tiempos muertos (limpieza y esterilización) y sufre
retrasos prolongados antes de que los organismos entren en fase de productividad
elevada.
Existen diferentes tipos de operaciones para 
bioprocesos
Se adiciona medio de cultivo desde el comienzo de la
fermentación y se alimenta el sistema a intervalos hasta un vol.
máx. Hoy se lo usa industrialmente para la producción de
penicilina, vitaminas, aminoácidos y enzimas.
Operación con fed-batch (Semicontinuo o batch alimentado)
La operación continua consiste en alimentar un 
biorreactor con sustancias nutritivas 
continuamente tratando de controlar el período de 
muerte celular. Los productos deben ser 
removidos de forma simultánea y continua. La 
composición de la mezcla varía con cada seteo del 
equipo y a cada posición le corresponde una 
composición que es constante siempre que el 
equipo se opere bajo esas condiciones de: 
alimentación constante, extracción de productos y 
remoción de calor. 
La operación continua presenta muchas ventajas, 
siendo la principal desventaja lograr mantener las 
condiciones de pureza del cultivo cuando se 
manejan volúmenes tan grandes. También es 
posible que en las operaciones continuas los 
microorganismos se deterioren al pasar las 
generaciones de los mismos y los rendimientos 
pueden caer.
Aún así, cerveza, levadura panificadora y vinagre 
se producen en cultivos continuos a gran escala.
Operación continua 
Monitoreo de la Fermentación
Durante el período de cultivo se toman muestras asépticamente para el
monitoreo de distintos parámetros inherentes al proceso de fermentación:
Controles de Proceso
 Estimación de biomasa (DO).
 Evolución de pH.
 Estimación y evolución del potencial de óxido/reducción (anaerobios).
 Estimación del oxígeno disuelto (presión parcial de oxígeno).
 Producción de CO2.
 Estimación del sustrato consumido (fuente de carbono, fuente de nitrógeno).
 Evaluación de los productos formados.
 Metabolómica.
 Proteómica.
 Transcriptómica.
Se toman muestras del ambiente durantes toda la etapa de USP para asegurar
que la calidad del aire y del agua que se está utilizando cumpla con los
criterios específicos requeridos por los protocolos de validación (GMP, GLP,
SOPs, etc. )
El producto deseado que se obtiene de la fermentación puede ser:
- Biomasa (levadura del pan)
- Productos metabólicos (metabolismo anaerobio: etanol)
- Productos de metabolismo primario (aminoácidos, vitaminas, etc.)
- Productos de oxidación incompleta (ácido acético, ácido glucónico, etc.)
- Productos de metabolismo secundario (antibióticos, inmunosupresores, 
etc.)
- Polisacáridos
- Proteínas recombinantes
Características del producto
• Concentración (efecto inhibitorio sobre estructuras vitales y/o sistemas
enzimáticos).
• Degradación del producto.
• Formación de subproductos.
• Localización:
 Productos intracelulares (acumulación en la biomasa, cuerpos de 
inclusión)
 Productos extracelulares (liberación al medio de cultivo). 
Biorreactores
50-100 Litros
1000 Litros
Las Plantas como biorreactoresProducción de proteínas recombinantes en plantas de interés
industrial o farmacéutico (antígenos para vacunas, anticuerpos
monoclonales, sustitutos de la sangre, hormonas, etc.)
(A recent article on the production of therapeutic monoclonal antibodies
using soybeans and corn stated that "transgenic soybeans and corn will prove
competitive with bacteria, fungi and mammalian cell fermentation as
production vessels for pharmaceuticals based on mammalian proteins.
Purified products produced with existing technology (bacteria, fungi and
mammalian cell fermentation) can cost $100 to $10.000 per kg, compared to
around $1 per kg for compounds produced in transgenic plants".)
Los Animales también pueden ser utilizados como
Biorreactores
Producción de proteínas en la leche de vaca, ovejas, cabras, etc.
Pampa- BioSidus (hormona de crecimiento humana en la leche-
Tambo farmacéutico). Este acontecimiento ubica a la Argentina en
el primer país que logra producir la hormona de crecimiento
humano (hGH) en animales.
Etapas de un bioproceso
 Operaciones del Upstream Processing (USP)
Operaciones del Downstream Processing (DSP)
Etapas de un bioproceso industrial
(Ejemplo: producción de una proteína recombinante humana)
• Formulación: luego de la purificación de la proteína de interés, se le agregan al
producto final los excipientes, se filtra asépticamente, liofilizados, se realizan
inspecciones y se etiqueta.
Todas las etapas del proceso y el ambiente general de la planta en que se llevan
a cabo estas operaciones son monitoreadas por la división de CONTROL DE
CALIDAD de la misma.
Upstream
processing
• Ingeniería genética, biología molecular
• Investigación en el laboratorio, desarrollo de cepas recombinantes, etc. (I+D). Se obtienen 
células genéticamente modificadas que contienen el gen de la proteína humana de interés.
Bioproceso
• Cultivo (proceso fermentativo).
Downstream
processing
• Aislamiento y purificación de la proteína en cuestión. 
Los pasos iniciales del DSP incluyen la purificación y/o filtración
necesaria para separar las células del medio de cultivo (COSECHA ó
harvesting).
Dependiendo de la localización del producto de interés, se descartará el
medio de cultivo o las células.
Ejemplo 1: en algunas bacterias, como por ej. E. coli, las proteínas recombinantes
quedan retenidas en el interior celular en cuerpos de inclusión por lo que se descarta el
medio de cultivo.
Ejemplo 2: en células animales, como las CHO (Chinese Hamster Ovary), y en algunas
levaduras (como Pichia pastoris) las proteínas pueden ser secretadas al medio
extracelular, por lo que se guarda el medio de cultivo para la purificación de la proteína
de interés.
Ejemplo 3: en las células vegetales la proteína recombinante o el compuesto de interés
puede quedar retenido en el interior celular, en el apoplasto o ser secretado al medio
extracelular.
Downstream Processing (DSP)
Las Operaciones del DSP dependerán de la localización del producto de interés
DSP: el gran desafío
Impurezas que
provienen del 
proceso
Menor tiempo
Menor costo
Mejor Calidad
Pureza
Volumen
DSP: el gran desafío
Downstream processing
(Unidades operacionales)
• Ruptura celular
• Centrifugación
• Precipitación/cristalización
• Filtración
• Extracción líquido-líquido
• Cromatografía (exclusión molecular, IEC, 
interacción hidrofóbica, afinidad, proteínas de 
fusión/tagging)
• Secado/liofilizado
(operaciones unitarias utilizadas para la separación y purificación de 
productos biológicos)
‘‘Under the most rigorously defined conditions of temperature, pH,
aeration, and nutrient concentrations, the organism will do
whatever it damn well pleases.’’
S. J. Hochauser, 1983
Master Production Batch Record (MPBR)
Es el que gobierna el comportamiento tanto del personal involucrado en el
proceso como de todas las operaciones (USP, fermentación, DSP, Control de
Calidad) de acuerdo a los protocolos validados y estandarizados denominados SOP
(Standard Operating Procedures).
Esto asegura la uniformidad batch-to-batch para cada producto en particular.
GMP (Good Manufacturing Practices) compliance
Controles de Proceso
Monitoreo del Proceso
- Durante todo el proceso se toman muestra para su monitoreo, en el cual se
miden distintos atributos inherentes al proceso:
RT: Release Test
IPC: In Process Control
IPT: In Process Testing
Controles de Proceso
- Se toman muestras del ambiente (Salas Clasificadas) y del agua durante todo el
proceso para asegurar que la calidad del aire y del agua que se está utilizando
cumpla con los criterios específicos requeridos por los protocolos de validación
(GMP, GLP, SOPs, etc. )
La calidad desde el diseño (QbD)
La calidad farmacéutica por Diseño (QbD) pretende ser un enfoque sistemático para el 
desarrollo de un producto comenzando con objetivos definidos haciendo hincapié en 
comprensión y control de los procesos, basándose en conocimientos científicos sólidos y la 
gestión y control de riesgos.
Calidad por Diseño (QbD), se ha pensado para mejorar la garantía de suministro de 
medicamentos seguros y eficaces para el consumidor para mejorar significativamente la 
calidad de fabricación.
Proceso de desarrollo de un producto con QbD
• Definir el producto en sí y el perfil de calidad: describiendo su uso, así como los aspectos de seguridad 
y la eficacia del producto.
• Reunir los conocimientos pertinentes anteriores a la obtención del medicamento tales como, excipientes 
potenciales y tareas incluidas en los procesos en lo que se denomina un espacio de conocimiento. En este 
punto, se utiliza la evaluación de riesgos para ponderar la importancia de las posibles lagunas de 
conocimiento y así potenciar la investigación
• Diseñar una formulación e identificar las propiedades de los materiales críticos que determinan el 
producto final y que deben ser controlados para cumplir con el perfil del producto objetivo. 
Deberemos considerar los excipientes, materias primas, reactivos, disolventes, procesos de intermedios, 
materiales de etiquetado y envasado, así como sus propiedades físicas, químicas, microbiológicas etc.
• Diseñar un proceso de fabricación para producir un producto final contando con materiales críticos y 
sus propiedades.
• Identificar los parámetros críticos del proceso y las propiedades de los materiales críticos que deben 
ser controlados para conseguir las propiedades del producto final. Utilizaremos la evaluación del riesgo 
para priorizar los parámetros que influyen en el proceso y las propiedades de los de materiales para 
realizar la verificación experimental. Combinaremos de esta forma el conocimiento previo con 
experimentos para establecer un espacio de diseño o lo que se conoce como una representación de la 
comprensión del proceso.
• Establecer una estrategia de control para todo el proceso que puede incluir desde controles de 
entrada de materiales, controles de procesos y sistemas de monitoreo que delimiten nuestro espacio de 
diseño considerando operaciones unitarias individuales o múltiples, y / o pruebas de productos finales. La 
estrategia de control debe abarcar los cambios esperados de forma proporcionada, por lo que será 
conveniente que se utilice para esto un sistema de evaluación de riesgos.
• La consistencia de la calidad se debe asegurar con la supervisión y actualización continua del proceso.
Esquema general de un proceso de fermentación
Elección del agente 
biológico
Optimización del 
medio de cultivo
Optimización del 
proceso de 
fermentación
Pre-tratamiento
OPERACIONES
Molienda
Tamización
Hidrólisis
Esterilización
Filtración
Inóculo para el 
Biorreactor
USP DSPProceso
Ejemplo de bioproceso
Esquema de la producción de levadura prensada
- Saccharomyces cerevisiae
-125 toneladas de lev. 
prensada en 65 hs.
-Materia prima: melaza de 
remolacha o de caña de azúcar 
(sacarosa)
- Proceso de 5 etapas 
(batch/fed-batch:
E1, E2, E3, E4: batch
E5 y E6: fed-batch
Melaza: residuos remanentes de la
industria azucarera. Son un
subproductode la industria azucarera.
Es un jarabe denso y oscuro derivado
de caña de azúcar y de remolacha
azucarera.
Mosto: sustrato “azucarado” q se
obtiene de la materia prima.
(centrifugación)
Sacarosa + O2 + NH3-----------Biomasa + CO2 + H2O + calor
Sacarosa + O2 + NH3-----------Biomasa + CO2 + H2O + calor
La producción comercial de levadura de panificación es llevada a cabo en un proceso a múltiple 
etapa, de las cuales las primeras se realizan en batch, y las úl-timas en batch alimentado. Son
5 etapas con una producción comercial de 125 ton. en 65 h. 
Medio de producción
Como ya se mencionó la materia prima elemental de elección es la melaza de remolacha o de caña o 
ambas en conjunto, cuando se las dispone.
La sacarosa es el azúcar predominante en ambas melazas. 
La materia orgánica no azúcares en la melaza de caña está compuesta fundamentalmente por go-
mas solubles y ácidos orgánicos sobre todo aconítico y compuestos nitrogenados.
En el caso de la melaza de remolacha los no azúcares están constituidos por un mayor porcentaje de 
compuestos nitrogenados como betaína y ácido glutámico y algunos ácidos orgánicos como láctico, 
málico, acético y oxálico. En las cenizas predomina en ambas melazas el K, teniendo mayor 
porcentaje de fósforo la melaza de caña que la de remolacha.
Las melazas se utilizan generalmente diluídas al 50%. Como los compuestos coloidales de la melaza 
de caña pueden causar problemas en las varias etapas del proceso de fermentación, el mosto es casi 
siempre clarificado. La clarificación puede hacerse antes o después de la esterilización, que se 
realiza en la última etapa por inyección de vapor directa, a la presión atmosférica en la mayor parte 
de los casos.
La clarificación se realiza fundamentalmente con la ayuda de centrífugas intermitentes (para 
sedimentar y decantar sólidos). Se han mencionado como ventajas de utilizar mostos clarificados 
que la levadura es más fácil para prensar y secar y que además, la clarificación probablemente 
facilita la transferencia de O2 y reduce la formación de espuma.
Bioprocesos Integrados
• Acoplar adecuadamente las operaciones del 
USP con las del biorreactor y las del DSP.
Ventajas de la Integración de Bioprocesos
• Reduce el número de operaciones.
• Reduce el tiempo del proceso.
• Facilita la separación.
• Mejora el rendimiento del producto y calidad.
• Mejora la productividad y economía de los 
procesos y reduce el impacto ambiental.
Evolución de los niveles de producción y costo de la penicilina 
La integración de las etapas del bioproceso permiten aumentar los 
niveles de producción y abaratar los costos
Ejemplo de Bioproceso Integrado
El bagazo de caña de azúcar es un
residuo fibroso que constituye un
desecho importante de la industria
azucarera.
Una parte de la producción de este
desecho es reciclada como fuente de
materia prima para la fabricación del
papel, pero los tratamientos
industriales de deslignificación y de
blanqueo de la pasta de papel
pueden resultar nefastos para el
medio ambiente.
Investigadores franceses, desarrollaron
un nuevo método biológico que:
- Transforma el bagazo en pasta de
papel,
- y produce, a la vez, una enzima de
interés industrial.
Bagazo: residuo de materia después de extraído su jugo (de uva, de caña)
Caña de azúcar
bagazo
Azúcar
Papel 
Papel  + enzima 
El principio de este proceso no contaminante está basado en el metabolismo de un
hongo filamentoso Pycnoporus cinnabarinus que cultivado sobre el bagazo en
presencia de etanol, produce naturalmente la enzima deslignificante llamada
“laccasa” (que destruye la lignina del substrato transformándolo en pasta de papel).
Esto ayuda a reciclar el bagazo de caña de azúcar.
A medida en que la lignina desaparece, la pasta obtenida se blanquea. Esta pasta
puede ser utilizada tal cual para la fabricación de cartón.
Las primeras pruebas realizadas en laboratorio revelan que este bioproceso
integrado puede ser adaptado al tratamiento de otras fuentes de fibras, lo que abre
una perspectiva interesante para la industria papelera.
Contribuciones al costo total de producción en bioprocesado
Alto Costo de Investigación y Desarrollo
• Proteínas terapéuticas (insulina, hormona del 
crecimiento, eritropoyetina, interferón, factor 
activador del plasminógeno, etc.).
• Anticuerpos monoclonales.
• Vacunas recombinantes (hepatitis B, etc.). 
Alto Costo de Recuperación
• Antibióticos.
• Vitaminas.
• Enzimas de aplicación industrial.
• Proteínas recombinantes.
Tradicionalmente, las técnicas de recuperación primaria más utilizadas son:
- Centrifugación
- Filtración
- Adsorción
- Precipitación.
El número de etapas utilizadas en todo proceso de bioseparación o
recuperación de productos tiene un impacto significativo sobre el porcentaje
final de recuperación y, por consecuencia, dicho número debe ser reducido.
Un enfoque práctico para mejorar esta situación es mover las etapas de
purificación lo más cercano a la etapa de producción (fermentación), o
bien, seleccionar métodos de recuperación que permitan combinar
varias operaciones unitarias en una sola.
Recuperación del producto
Reactor de diálisis de membrana para células
suspendidas, cultivo y cámara de diálisis
equipada con agitadores.
Adaptaciones para la extracción in situ del producto 
(diálisis)
Diagrama de un tanque de agitación
mecánica modificado para operar con
remoción in situ del producto
1: tanque; 2: malla de acero inoxidable para
inmovilizar raíces; 3: sensor de oxígeno; 4: malla
acero inoxidable; 5: medidor DO; 6: agitador; 7:
lana de vidrio; 8: resina XAD-2; 9: filtro de
vidrio; 10: generador de aire; 11: condensador;
12: marco de la malla
Tomado de: Hairy Roots, Culture and Application, 1997.
Adaptaciones para la extracción in situ del producto
Amberlite® XAD®-2 (Sigma) polymeric adsorbent is a hydrophobic crosslinked polystyrene
copolymer resin, supplied as 20-60 mesh size white insoluble beads. The resin is widely used to
adsorb soluble organic compounds from aqueous streams and organic solvents, generally in cyclic
columnar operations.
(antibiotics, organic nitrogen, grease, and various aromatic compounds from aqueous streams).
Cultivo de células animales
Introducción
• Estudio de células, tejidos u órganos in vitro
• Más de 24 horas
Ventajas
• Estudio del comportamiento celular sin las variaciones que 
ocurren en el animal.
• El control del entorno de crecimiento conduce a la uniformidad de 
la muestra.
• Las características de las células se pueden mantener durante 
varias generaciones, lo que permite una buena reproducibilidad 
entre los experimentos.
• Los cultivos pueden exponerse a reactivos, p. radioquímicos o 
drogas en concentraciones definidas.
• Finalmente, evita los problemas legales, morales y éticos de la 
experimentación con animales.
Desventajas
• Deben desarrollarse técnicas estandarizadas para mantener 
células viables para que los experimentos sean reproducibles.
• Toma tiempo aprender a trabajar en esterilidad.
• Cantidad de material es limitada.
• Puede ocurrir desdiferenciación y selección de los cultivos, por lo 
que muchos de los mecanismos celulares originales se pueden 
perder.
Terminología
Cultivo de órganos
Un cultivo tridimensional de tejido no desglosado que conserva algunas o 
todas las características del tejido in vivo.
Cultivo de células
Las células individuales, ya no se organizan como tejidos. Derivado de células 
dispersas tomadas del tejido original.
Las líneas celulares tienen una vida útil limitada, pasan varias veces antes de 
que se vuelvan senescentes.
Cultivo celular primario
Derivado de un explante, directamente del animal.
Usualmente solo sobrevive por un periodo finito de tiempo.
Implica disgregación enzimática y/o mecánica del tejido y algunos pasos de 
selección para aislar las células de interés de una población heterogénea.
El cultivo primario contiene una población de células muy heterogénea.
El subcultivo de células primarias conduce a la generación de líneascelulares.
Las células como los macrófagos y las neuronas no se dividen in vitro, por lo 
que se pueden utilizar como cultivos primarios.
Líneas celulares continuas
- La mayoría de las líneas celulares crecen durante un número limitado de 
generaciones después de lo cual entran en senescencia.
- Líneas celulares pueden ser espontáneamente o mediante inducción viral o 
química transformadas en líneas celulares continuas.
- Características de las líneas celulares continuas:
- Más pequeñas, más redondeadas, menos adherentes y con una relación 
mayor núcleo/citoplasma.
- Crecimiento rápido y número de cromosomas aneuploides.
- Reducción de requerimiento de suero y anclaje reducido. Más proclives a 
crecer en suspensión.
- Capacidad de crecer hasta una densidad celular más alta.
- Diferentes fenotípicamente al tejido original.
- Dejan de expresar genes específicos del tejido original.
¿Por qué se usa el cultivo celular?
Áreas donde la tecnología de cultivo celular desempeña actualmente un papel 
importante:
Sistemas modelo para…
Estudiar la biología celular básica, las interacciones entre los agentes 
causantes de enfermedades y las células, los efectos de los medicamentos 
en las células, el proceso y la activación del envejecimiento y estudios 
nutricionales.
Prueba de toxicidad
Estudiar los efectos de las nuevas drogas.
Investigación sobre el cáncer
Estudiar la función de diversos productos químicos, virus y 
radiación para convertir las células cultivadas normales en células 
cancerosas.
Virología
Cultivo de virus para la producción de vacunas, también se utiliza 
para estudiar allí el ciclo infeccioso.
Ingeniería genética
Producción de proteínas comerciales, producción de virus a gran 
escala para su uso en la producción de vacunas, ej. polio, rabia, varicela, 
hepatitis B y sarampión.
Terapia génica
Las células que tienen un gen funcional pueden reemplazarse por 
células que tienen un gen no funcional.
Terapia celular
Células madre pueden diferenciarse a múltiples células 
terminalmente diferenciadas plausibles de ser usadas en medicina 
regenerativa.
Consisten en proteínas de alto peso molecular con o sin grupos
glicosídicos.
Incluyen a enzimas, hormonas, vacunas, inmunobiológicos
(anticuerpos monoclonales, citoquinas), drogan anticancerígenos.
Productos obtenidos de cultivos celulares animales
Productos
Anticuerpos
monoclonal
es
Regulador
es
inmunoló
gicos
Vacunas
virales
Hormonas
Producido por una célula de 
hibridoma
Utilizado para sistemas de ensayo de 
diagnóstico (determinar
medicamentos, toxinas y vitaminas); 
fines terapéuticos y separaciones
biológicas - separaciones
cromatográficas para purificar
proteínas
Interferón – glucoproteína
anti-cancerígena (célula 
animal secretada o 
bacteria recombinante)
Linfoquinas
Interleucinas (agente anti-
cancerígeno)
Profilácticos.
El virus es recolectado, 
inactivado y utilizado como 
vacuna.
Una forma debilitada inducirá 
una respuesta protectora pero 
ninguna enfermedad.
Grandes moléculas: 50-200 
aminoácidos.
Producidas por órganos 
sintetizadores de hormonas.
También se puede producir por 
síntesis química.
Ejemplo: eritropoyetina
Productos
Enzimas
InsecticidasCélulas 
enteras y 
cultivo de 
tejidos
Producción de algunos 
virus de insectos que son 
altamente específicos y 
seguros para el medio 
ambienteÓrganos artificiales y 
estructura ósea y 
semisintética
Tipos celulares
En función de la morfología (forma y apariencia) o de sus características 
funcionales:
Del tipo Epitelial, unidas a sustrato y con apariencia
aplanada y forma poligonal.
Células similares a linfoblastos, permanecen en suspensión con forma esférica.
Células similares a fibroblastos unidas a un sustrato parecen alargadas y 
bipolares 
Crecimiento cinético del cultivo celular de mamíferos
No. Cells Growth condition
1. Mammalian cells 37°C, pH ~7.3
Doubling time: 12 – 20 h
Need to be gently aerated and agitated
Buffer used: Carbonate buffer/CO2-enriched 
air/HEPES
2. Insect cells 28°C, pH 6.2
3. Fish cells 25°C-35°C, pH 7 – 7.5
Tipo de medio Ejemplos
Medios naturales
Fluídos biológicos
Plasma, suero, linfa, suero de 
cordón placentario humano, 
líquido amniótico
Extractos de tejidos
Extracto de hígado, bazo, 
tumores, leucocitos y médula 
ósea, extracto de embrión bovino 
y embrión de pollo
Coágulos
coagulantes o coágulos de 
plasma
Medios artificiales
Soluciones salinas
equilibradas
PBS, DPBS, HBSS, EBSS 
Medios basales MEM DMEM 
Medios complejos RPMI-1640, IMDM 
Tipos de medios de cultivo
Medios de cultivo celular
• Muy útil
• Falta de conocimiento de la composición exacta de estos medios 
naturales
• Suero que contiene medios
• Medios sin suero (medios de cultivo definidos)
• Medios químicamente definidos
• Medios sin proteínas
Medios naturales
Medios artificiales
Los medios de cultivo (como polvo o como líquido) contienen:
• Aminoácidos
• Glucosa
• Sales
• Vitaminas
• Otros nutrientes
Los requisitos para estos componentes 
varían entre las líneas celulares, y estas 
diferencias son en parte responsables de 
la gran cantidad de formulaciones de 
medios existentes.
Componentes básicos de los medios de cultivo
• Sistema de almacenamiento en búfer (bicarbonato de ácido carbónico, HEPES)
• Rojo fenol como indicador de pH (amarillo o morado)
• Sales inorgánicas
• Aminoácidos (L-glutamina) – Aminoácidos no esenciales
• Hidratos de carbono
• Proteínas y péptidos (importantes en medios sin suero. Ej. Albúmina, transferrina)
• Ácidos grasos y lípidos
• Vitaminas
• Elementos de seguimiento
• Antibióticos
Un medio de crecimiento típico para células de mamífero contiene 
suero (5-20%), sales inorgánicas, fuentes de carbono y energía, 
vitaminas, oligoelementos, factor de crecimiento y buffer en agua.
El suero es un líquido libre de células recuperado de la sangre (suero 
fetal bovino FBS, suero de ternera CS, suero de caballo HS)
Se sabe que el suero contiene aminoácidos, factores de crecimiento, 
vitaminas, ciertas proteínas, hormonas, lípidos y minerales.
Suero
Funciones del suero:
1) Estimular el crecimiento celular y otras actividades celulares 
por hormonas y factores de crecimiento.
2) Mejorar la unión de ciertas proteínas como el colágeno y la 
fibronectina.
3) Proporcionar proteínas de transporte que transportan 
hormonas, minerales y lípidos.
Medios de cultivo celular más comunes
• Eagle’s Minimum Essential Medium (EMEM)
• Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)
– Baja glucosa
– Alta glucose
• RPMI-1640
• Ham’s Nutrient Mixtures
• DMEM/F12
• Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM)
Línea celular Morfología Especie Medio de cultivo Aplicaciones
HeLa B Epitelial Humano
MEM+ 2mM Glutamine+ 10% FBS + 1% 
Non Essential Amino Acids (NEAA) 
Tumorigenicidad y 
estudios de virus
HL60 Linfoblastos Humano
RPMI 1640 + 2mM Glutamine + 10-20% 
FBS 
Estudios de 
diferenciación
3T3 clone 
A31 
Fibroblasto Ratón
DMEM + 2mM Glutamine +5% New 
Born Calf Serum (NBCS) + 5% FBS 
Tumorigenicidad y 
estudios de virus
COS-7 Fibroblasto Mono DMEM+ 2mM Glutamine + 10% FBS 
Expresión génica y 
estudios de 
replicación de 
virus
CHO Epitelial Hamster 
Ham′s F12 + 2mM Glutamine + 10% 
FBS 
Estudios 
nutricionales y de 
expresión génica
HEK 293 Epitelial Humano
EMEM (EBSS) + 2mM Glutamine + 1% 
Non Essential Amino Acids (NEAA) + 
10% FBS 
Estudios de 
transformación
HUVEC Endotelial Humano F-12 K + 10% FBS + 100 µg/ml Heparin 
Estudios de 
angiogénesis
Jurkat Linfoblastos Humano RPMI-1640 + 10% FBS Señalización
Cultivo de células
• Las células se cultivan en adherencia o en suspensión, por lo 
general dependiendo del tipo de tejido de origen.
• Las líneas celulares transformadas crecen como monocapa o en 
suspensión.
¿Por qué subcultivar? ¿ Cuándo?
• Una vez que la superficie del sustrato disponible está cubierta por 
células (cultivo 100% confluente) el crecimiento se ralentiza y cesa 
(inhibición por contacto).
• Las células que deben mantenerse en un estado saludabley en 
crecimiento tienen que ser subcultivadas o pasadas.
• Optimamente habría que pasarlas cuando alcanzan el 80-90% de 
confluencia en los platos o placas.
• Enzimas como tripsina, dipasa, colagenasa en combinación con 
EDTA rompen el “pegamento celular” que une las células a la 
superficie.
Células adherentes
- Células que dependen de anclaje a sustrato
- Las células se lavan con solución de PBS (sin Ca2+ y Mg2+)
- Agregue suficiente tripsina / EDTA para cubrir la monocapa
- Incubar la placa a 37 C por 1-5 minutos
- Agregue un medio completo para disociar y desalojar las células que 
permanecen adheridas con la ayuda de una pipeta
- Agregar medio completo dependiendo del subcultivo a realizar
Células en suspensión
• Más fáciles de pasar ya que no hay necesidad de separarlas
• A medida que las células en suspensión alcanzan la confluencia 
eliminar de manera estéril 1/3 del medio
• Reemplazar con la misma cantidad de medio precalentado
Los microscopios invertidos se utilizan para visualizar las células y 
determinar su crecimiento y actividad celular
Visualización de las células en cultivo
Células muertas
Células vivas
Recuento y viabilidad celular
• Usando un hemocitómetro, las células se cuentan para 
determinar si están listas para cosechar
• Se pueden teñir las células con azul Tripán para 
determinar si aún están vivas. Todas las células que 
excluyen el tinte son viables. Todas las células teñidas 
están muertas. Se puede calcular el % de células viables.
Cámara de 
Neubauer
Métodos de transfección
• Precipitación de fosfato de calcio
• DEAE-dextrano (dimetilaminoetil-dextrano)
• Lipofección mediada por lípidos catiónicos
• Electroporación
• Infección retroviral (transducción)
• Microinyección
Manipulación génica in vitro
(ADN plasmídicos, RNA, proteínas)
Indispensable en biotecnología 
para técnicas de CRISPR/Cas9, 
generación de líneas que 
sobreexpresen o silencien 
genes de interés, etc….
Contaminantes del cultivo celular
Dos tipos de contaminantes de cultivos celulares:
Químicos: difíciles de detectar, causados por endotoxinas, plastificantes, 
iones metálicos o rastros de desinfectantes que son invisibles.
Biológicos: contaminación de los cultivos con micoplasmas, levaduras, 
bacterias u hongos o también contaminación cruzada de células de 
otras líneas celulares.
Efectos de la contaminación biológica
• Compiten por los nutrientes con las células anfitrionas.
• Los subproductos ácidos o alcalinos secretados inhiben el 
crecimiento de las células huésped.
• La arginina y la purina degradadas inhiben la síntesis de histonas y 
ácidos nucleicos.
• También producen H2O2 que es directamente tóxico para las 
células.
Detección de contaminantes
• En general, los indicadores de contaminación son medios de cultivo 
turbios, cambios en las tasas de crecimiento, pH anormalmente alto, falta 
de unión, células multinucleadas, apariencia celular granulosa, 
vacuolización, cuerpos de inclusión y lisis celular.
• Las levaduras, las bacterias y los hongos generalmente muestran un 
efecto visible en el cultivo (cambios en la turbidez media o pH).
• El micoplasma se detectó por tinción directa de ADN con sustancias 
fluorescentes intercalares, p. Hoechst 33258.
• El micoplasma también se detecta mediante inmunoensayo enzimático 
por antisueros específicos o abs monoclonales o por amplificación por 
PCR de ADN micoplasmático.
• La mejor y más antigua forma de eliminar la contaminación es descartar 
las líneas celulares infectadas directamente.
Equipamiento básico utilizado en cultivo celular
• Es preferible un cabina de seguridad/flujo laminar Vertical.
• Instalaciones de incubación: temperatura de 25-30C para insectos 
y 37C para células de mamíferos, CO2 2-5% y 95% de aire a 99% 
de humedad relativa. 
• Refrigeración: medios líquidos a 4ºC, enzimas (por ejemplo, 
tripsina). Material de plástico poliestireno.
TODO ESTERIL!!!!
Autoclave
Hornos
Filtración
Oxido de etileno
Cultivo de células vegetales
• Requisitos más simples que las células animales.
• Más fácil de producir una planta entera de una sola célula:
- Totipotencia nuclear: capaz de producir todos los tipos de 
células diferenciadas porque el genoma contiene todos los 
genes (todas las células son totipotentes nucleares, en teoría).
• Explantos (células o pedazos de tejido) crecen en medios 
apropiados (requieren luz - fotoautótrofo).
• Los reguladores de crecimiento (hormonas vegetales) inducen la 
diferenciación para producir plantas enteras.
• Los protoplastos también se pueden cultivar en plantas enteras 
para producir híbridos o células genéticamente modificadas.
• La falta de pared celular significa que los genes se introducen 
fácilmente
Métodos