Unidad 8 Biot

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Biotecnología I
Unidad VIII 
Carrera: LICENCIATURA EN BIOTECNOLOGIA
Trayecto curricular: Ciclo de Formación Inicial
Período: 2º Cuatrimestre – 2019
Troncales, Estaminales o Stem Cells
Células capaces de: 
• Generar como descendencia células hijas especializadas 
en cualquier tipo tisular.
• Autorrenovarse en el tiempo.
CÉLULAS MADRE
Qué es una célula madre?
Células madre
idénticas
Célula
madre
Autorenovación
Célula
madre
Células especializadas
Diferenciación
División simétrica y asimétrica de células medre
célula madre 4 células especializadas
Diferenciación - reemplaza células 
muertas o dañadas a lo largo de tu vida
División asimétrica – Por qué?
célula madre
Auto renovación -
mantiene la reserva de 
células madre
Dónde se encuentran las
células madre?
Células madre
embrionarias
Blastocisto – un embrión
muy temprano
Células madre de 
tejido/adultas
Feto, bebe y durante toda la 
vida
Células madre
 Capacidad de autorenovación
 Potencialidad
Totipotente
Pluripotente
Multipotente Unipotente
Cigoto
Célula madre embrionaria
Célula madre
neonatal
Célula madre
adulta
Célula madre pluripotente inducida
Células madre adultas: Dónde
podemos encontrarlas?
Músculos
Piel
Superficie del ojo Cerebro
Mama
Intestinos
Médula ósea
Testículos
Células madre adultas: Qué pueden hacer?
MULTIPOTENTE
células madre
sanguíneas
encontradas en
médula ósea
Diferenciación
Sólo tipos especializados de células 
sanguíneas:
glóbulos rojos, glóbulos blancos, 
plaquetas
Células madre adultas:
Principios de renovación de tejidos
Célula madre
Progenitores
comprometidos:
“Células amplificadoras
transitorias”
multipotente
división rápida
no auto-renovación
Célula madre:
auto renovación
se dividen raramente
alta potencialidad
raras
células 
especializadas:
trabajo
sin división
CÉLULAS MADRE ADULTAS
 Cordón Umbilical
 Hematopoyéticas (HSC)
 Estroma de la Médula ósea (MSC)
 Sistema Nervioso Central
Células madre adultas:
Células madre hematopoyéticas (HSCs)
HSC
Progenitores comprometidos
neutrophil
NK cell
erythrocytes
dendritic cell
plateletsmegakaryocyte
macrophage
eosinophil
basophil
B cell
T cell
Células especializadas
Médula ósea
Células madre adultas:
Células madre neurales (NSC)
NSC
cerebro
Progenitores comprometidos Células especializadas
Neuronas
Interneuronas
Oligodendrocitos
Type 2 Astrocitos
Type 1 Astrocitos
Células madre en el cerebro adulto: ¿siguen 
funcionando para nosotros ahora?
Células madre adultas:
Células madre intestinales (GSC)
GSC
Intestino delgado
Progenitores comprometidos
Células de Paneth
Células columnares
Cubiletes
Células endócrinas
Células especializadas
Células madre adultas:
Células madre mesenquimales (MSC)
MSC
Médula ósea
Progenitores comprometidos
Hueso (osteoblastos)
Cartílago (condrocitos)
Grasa (adipocitos)
Células especializadas
Células madre en el músculo esquelético 
maduro: ¿Hay poder todavía en nuestras células 
madre?
APLICACIÓN DE LAS CÉLULAS MADRE ADULTAS 
PARA TERAPIAS
 Terapias Celulares
 Reparación de Tejidos dañados
 Tratamiento de enfermedades genéticas o 
producidas por terapias oncológicas 
 Leucemias
 Depleciones del Sistema 
Inmunitario
 Anemias
 Linfomas HSCs
Controversia
Mejoras observadas: no por 
regeneración sino por liberación de 
factores de sobrevida, anti-
inflamatorios
TRATAMIENTOS 
ACTUALES CON 
VECTORES Y 
CELULAS MADRES
(Gran mayoría aún 
experimentales!!!)
Células madre embrionarias
Zigoto 
(óvulo 
fecundado)
Única Célula 
Totipotente
Masa Celular 
Totipotente
Mórula 
(varios 
Blastómeros)
Blastocisto 
(masa celular 
interna)
Masa Celular 
Pluripotente
Día 0 
Fecundación
Día 3 
Trompas 
Día 7 
Previo a Implantación
m.c.i.
Trofoblasto
Placenta
Embrión
Células Madre 
Embrionarias
in vitro
Células madre embrionarias (CME)
Las CME fueron derivadas por primera vez en 1981 a partir de un 
embrión de RATON.
– Nature 292:54-156 (1981); Proc Natl Acad Sci USA 78:7634–7638 (1981)
Aislamiento de CME humanas por por James Thomson, et al. en 1998.
– Science 282:1145–1147 (1998)
Los protocolos para el cultivo de CME humanas se optimizaron a partir de 
CME de ratón.
Las CME humanas se aislaron transfiriendo la masa celular interna de un 
embrión de 3-5 días a una capa alimentadora de fibroblastos de ratón.
Células madre embrionarias – Un poco de historia…
Células madre embrionarias (CME)
• Derivadas a partir de embriones
de descarte de clínicas de 
fertilización.
• Pueden mantenerse
indiferenciadas in vitro de 
manera indefinida.
• Mantienen la pluripotencia, es
decir la capacidad de 
diferenciarse a cualquier tipo
celular especializado.
Colonia de CME
Blastocisto
Macizo celular 
interno
Neuronas
Fuentes proveedoras de células madre 
embrionarias
• Sobrantes de Fecundación in vitro
• Abortos
• Embriones Clonados
Las células de la masa celular interna (m.c.i.) del blastocisto tanto 
como las células germinales de la cresta germinal del embrión 
temprano se obtienen a partir de:
Inyección intracitoplasmática de espermatozoides
Inyección intracitoplasmática de espermatozoides
Ovocito fertilizado
Embrión de 2 células
Embrión de 4 células
Embrión de 8 células
Mórula
Embryonic
Stem
Cells
Blastocisto – Día 5 post fertilización
¿En qué punto es esto un feto?
• Días 7-14: Implantación uterina.
• Día 14: Tres capas distintas comienzan a formarse (no más 
células madre pluripotentes)
• Días 14-21: Inicio del futuro sistema nervioso.
• Días 21-24: Inicio del futuro rostro, cuello, boca y nariz.
• Semanas 3-8: Inicio de la formación de órganos.
• Semana 5-8 +: ahora se llama feto
CME
PLURIPOTENTES
Todos los tipos posibles de células 
especializadas.
Diferenciación
Células madre embrionarias: Qué pueden hacer?
neuronas
CME
piel
sangre
hígado
Células madre embrionarias: Desafíos
En muchos países se han restringido la investigación y uso 
de CME:
Por cuestiones éticas relacionadas con las fuentes celulares
Por posible rechazo inmunológico en terapia celular
Células madre pluripotentes inducidas (iPS)
No hay problemas éticos
No presentan problemas de histocompatibilidad
Shinya Yamanaka, 2006 – Reprogramación de células murinas
Probaron combinación de 24 genes!!!
Oct3/4, Klf4, Sox2, and c-Myc 
Perfiles de expresión génica de células iPS
Pluripotencia de células iPS derivadas de MEFs
Shinya Yamanaka, 2007 – Reprogramación de células humanas!!!
La generación de células iPS a partir de fibroblastos dérmicos humanos 
adultos con los mismos cuatro factores: Oct3/4, Sox2, Klf4 y c-Myc.
Las células iPS humanas fueron similares a las células madre embrionarias 
(CME) humanas en morfología, proliferación, antígenos de superficie, 
expresión génica, estado epigenético de genes específicos de células 
pluripotentes y actividad de telomerasa. Además, estas células podrían 
diferenciarse en tipos celulares de las tres capas germinales in vitro y en 
teratomas.
Estos hallazgos demuestran que las células iPS pueden generarse a partir de 
fibroblastos humanos adultos.
Células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPS)
Oct3/4:
-Implicado en el 
mantenimiento de la auto 
renovación.
-Su represión en CME conduce 
a la formación del 
trofoectodermo.
Sox2:
- Esencial para el desarrollo 
embrionario.
- La regulación por 
disminución mediante 
silenciamiento génico induce la 
diferenciación de CME 
murinas.
- Klf4 reprime p53 directamente, 
la proteína p53 suprime Nanog 
durante la diferenciación de CME. 
Klf4 contribuye a la activación de 
Nanog y otros genes específicos 
de CME.
Klf4:
- El rol de c-Myc ha sido 
destacado como un posible 
regulador maestro de la 
pluripotencia.
c-Myc:
4 factores de reprogramación fundamentales
Células madre pluripotentes inducidas (iPS)
Célula somática
adulta
‘reprogramación’
= incorporación de ciertos genes a la célula
Célula madre pluripotente inducida
(iPS)
Similara célula madre embrionaria
Ventaja: no se usan embriones! Cualquier tipo de célulaespecializada
Cultivo in vitro de iPs
Diferenciación
(Oct4, Klf-4, Sox2, cMyc)
Fibroblasto
Reprogramación
(iPS)
Diferenciación
Células madre pluripotentes inducidas (iPS)
Fuente de células somáticas para reprogramación
Invasiva, requiere 
pequeña intervención
Más sencilla
No invasiva
Más difícil de 
reprogramar
Métodos de reprogramación
Métodos virales
 Virus Integrativos : Lentivirus & 
Retrovirus 
 Virus No-integrativos : Adenovirus, 
Sendai Virus
Métodos No Virales
 Transfección de proteínas
 Transfección de mRNAs 
 Transfección de microRNAs
 Compuestos químicos pequeños
miR-302, miR-17
 Vectores no-integrativos o excisables
Métodos para el delivery de factores de reprogramación
Ejemplo de un vector 
lentiviral policistrónico muy 
utilizado en reprogramación
Desarrollado por el grupo 
del argentino Gustavo 
Motoslavsky en Boston, USA
Cultivo in vitro de células madre pluripotentes (CMP = CME y iPs)
Las células CMP se cultivan típicamente en co-cultivo de fibroblastos 
embrionarios de ratón (MEF) (Capa nutricia).
Componentes básicos de los medios de cultivo de CMP
+ Capa nutricia de MEFs inactivadas (soporte físico y liberación de factores 
indispensables para la troncalidad, supervivencia y proliferación).
NO SE PUEDE USAR SUERO, contiene morfógenos que diferencian las células.
bFGF: el factor de crecimiento fibroblástico básico, fundamental para el mantenimiento 
del estado indiferenciado y la auto-renovación de las CMP humanas. Es caro, pero su 
agregado en indispensable. En células murinas hay que usar LIF.
• Problemas de las MEFs
- Trabajo intensivo para mantener dos tipos de células.
-Variación de diferentes lotes del MEFs.
• Contaminación
- Posible contaminación de patógenos animales provenientes de la capa 
nutricia de MEFs. Es una preocupación importante al tratar de pasar a 
aplicaciones terapéuticas.
• Manipulación posterior
-Las colonias que se forman en las capas nutricias son compactas y 
difíciles de transfectar y manipular genéticamente.
- Difícil aislamiento de ADN/ARN debido a posible contaminación 
cruzadas de células murinas.
Limitaciones del co-cultivo de CMP con fibroblastos 
embrionarios de ratón (MEFs)
• Documentado por primera vez en 2001 (Xu, et al. Nature Biotech.
24: 185)
• BD Matrigel ™ o superficie recubierta con Geltrex utilizada con 
medios condicionados por la capa nutricia de MEFs inactivados 
(MEF-CM).
• Posteriormente se han desarrollado múltiples medios de cultivo 
totalmente definidos que han sido utilizados con éxito para cultivar 
in vitro CMPh en combinación con las matrices extracelulares 
comerciales Matrigel (BD), Geltrex (Thermo) o Vitronectina 
(Thermo).
Cultivo de CMPh sin capa nutricia de MEFs (feeder free)
BD Matrigel ™ Matrix: una reconstituida 
membrana basal
lámina basal = membrana basal
BD Matrigel ™ Matrix = membrana basal reconstituida
Laminina ~ 60%
Colágeno IV ~ 30%
Entactina ~ 8%
Heparan sulfate proteoglycan (perlecan)
Factores de crecimiento (por ejemplo, PDGF, EGF, 
TGF-β)
Metaloproteinasas de la matriz
No es un sustrato definido.
BD Matrigel ™ Matrix: una reconstituida 
membrana basal
Preparación purificada de tumores de ratón EHS
Composición:
Hay también una versión reducida en factores de crecimiento
Interacción de las células con la Lamina Basal de la matrix 
extracelular (ECM)
• La ECM interactúa con las células a 
través de receptores de la superficie 
celular tales como integrinas.
• Reserva de factores de crecimiento.
• Sustrato y orientación para fijación 
y migración celular. Funciona 
también como andamiaje para el 
ensamblaje de tejidos.
• Influye en la morfología de las 
células.
• Puede estar asociada con
patrones particulares diferenciación 
y proliferación celular. 
BD Biosciences, StemCell Technologies y el Instituto de Investigación WiCell ™ 
han establecido una colaboración estratégica para desarrollar entornos de 
cultivo celular optimizados e independientes de capa nutricia para la 
investigación de CMPh.
– mTeSR™1 o TeSR-E8 Maintenance Medium de StemCell Technologies
– BD Matrigel™ hESC-qualified Matrix de BD Biosciences
Un entorno de cultivo completo para CMPh
Media + Surfaces = Entornos celulares completos
Medios de cultivo 100% definidos
Otras empresas han desarrollado luego 
entornos similares.
Nichos de células madre
Contacto directo Factores solubles Células intermediarias
Célula madre
nicho
Nicho
Microambiente alrededor de las células 
madre que proporciona soporte y señales 
que regulan la auto renovación y la 
diferenciación.
• Colonias H9 compactas y densas crecidas sobre MEFs
• Colonias dispersas y de tipo monocapa en las placas Matrigel de BD
Morfología de las CMPh cultivadas en distintas condiciones
Formación del cuerpos embrionarios (EB) a partir de CMPh
Imagen de contraste de fase de cuerpos embrioides formados
por células H9 que crecidas en diferentes superficies.
Si se pone a los EB en un medio con suero fetal 
bovino (contiene factores por diferenciación).
Se induce la 
diferenciación. Se usa 
como validación de 
pluripotencia.
Validación de pluripotencia – Células crecidas sobre MEFs
Validación de pluripotencia – Células crecidas sin MEFs
Medio E8 y como matriz extracelular Vitronectina
Protocolos de diferenciación específicos de CMP
Ejemplo 1 – Diferenciación dirigida a linaje cardíaco
CHIR99021
IWP-2
Campo claro DAPI (tinción núcleos) cTnT (proteína cardíaca)
200x
hiPs FN2.1
12uM CHIR99021
CMP NSC
N°
terapéuticamente 
adecuado
Diferenciación a 
linaje neural
Terapia de 
reemplazoNSC
Protocolos de diferenciación específicos de CMP
Ejemplo 2 – Diferenciación dirigida a linaje neuronal
Células madre neurales primitivas (NSC)
● Validación de NSC a partir de CMPIh (FN2.1)
Aplicación de las células madre 
pluripotentes (CME y iPs)
Mecanismos de funcionamiento de los 
sistemas orgánicos y de sus patologías
Alzheimer, Parkinson y Enfermedades 
Neurodegenerativas
 Investigación Biomédica
 Diseño de nuevos medicamentos
 Terapias Celulares
 Ingeniería de Tejidos
Modelado de enfermedades
Usos potenciales de las células madre pluripotentes
Usos potenciales de las células madre pluripotentes
Potencial para estudiar enfermedades humanas. No sólo su 
biología básica sino para detección de nuevas drogas.
Se han generado iPs a partir de pacientes con una gran 
variedad de enfermedades genéticas (Park, et al. Cell 143: 1
[2008]; Dimos, et al. Science 231: 1218 [2008]):
- Esclerosis lateral amiotrófica (ELA)
- Enfermedad de Parkinson (EP)
- Enfermedad de Huntington (HD)
- Diabetes mellitus tipo 1 (JDM) de inicio juvenil
Células iPs como modelo de enfermedades humanas
Células iPs como modelo de enfermedades humanas
iPs + CRISPR/Cas9 Terapia celularCorrección de 
mutaciones
iPs + CRISPR/Cas9
Corrección de 
mutaciones
Terapia celular
Diferenciación de CMPh en 3D: Organoides
Los organoides son tejidos derivados de células y estructuras similares a 
órganos compuestas por uno o más tipos de células que pueden formarse 
mediante el cultivo de células en 3D y la diferenciación de células madre 
embrionarias o pluripotentes inducidas (CME y iPs). 
Son capaces de recapitular estructuras de tejidos y órganos e imitan sus 
funciones in vitro. 
El potencial investigativo y terapéutico de los organoides incluye:
Morfogénesis de tejidos y modelos de organogénesis.
Tumor, enfermedad y modelos de infección.
Prueba de drogas.
Detección de toxicidad.
Medicina personalizada.
Medicina regenerativa/reemplazo de órganos.
Diferenciación de CMPh en 3D: Organoides
Modelos basados en organoides
Ejemplo: organoides cerebrales o minibrains
Día 7 Día 10 Día 17
Día 24 Día 30 Día 45
Células H9
Diferenciación neural 3D
Ejemplo: organoides cerebrales o minibrains
Células madre
Ingeniería de Tejidos y Órganos
Pretende lograr estructuras 
tridimensionales organizadas:
• Reconstrucción de vejigas.
• Arterias funcionales artificiales.
• Prótesis óseas biológicas. 
C. Vacanti de la Universidad de Massachusetts usó un
andamio biodegradable con forma de oreja sobre el
cual creció células de cartílago y de piel y los implantó
en un ratón que proveía las condiciones in vivo.
EEUU:Apligraf y Carticel
• Células encapsuladas que 
liberan sustancias terapéuticas. 
Utilización de impresoras 3D en biomedicina –
Utilización de células madre
Xenotransplantes
Transferencia de órganos de una especie a un receptor de otra especie
A tener en cuenta:
- Evitar el rechazo del sistema inmune:
- Eliminación de genes (Knockout)
- Inserción de genes de la especie receptora
- Buen funcionamiento del órgano trasplantado
- Controlar la posibilidad de trasmitir enfermedades
para el receptor
TRASPLANTE DE TEJIDOS: CELULAS MADRE!