Unidad 5 Biot

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Biotecnología I
Unidad IV 
Carrera: LICENCIATURA EN BIOTECNOLOGIA
Trayecto curricular: Ciclo de Formación Inicial
Período: 2º Cuatrimestre – 2019
Microbiología Industrial
APLICACIONES DE LOS MICROORGANISMOS Y SISTEMAS O 
PROCESOS BIOLOGICOS EN LA INDUSTRIA
DNA RECOMBINANTE 
INGENIERIA GENETICA
Manipulación de organismos 
para la obtención de productos 
biológicos deseados:
• Sustancias químicas
• Enzimas
• Vacunas
• Hormonas, anticuerpos, 
factores sanguíneos
ENZIMAS Y 
BIOCATALIZADORES
• Elaboración de alimentos
• Equipos de diagnóstico
• Biosensores
• Quimioterapia
• Sustancias químicas
TRATAMIENTO Y UTILIZACIÓN DE 
RESIDUOS
• Detoxificación
• Uso de subproductos
• Aguas residuales
INGENIERÍA DE PROCESOS
• Recolección, pretratamieto, filtración
• Reactores nuevos
• Recuperación de 
catalizadores/microorganismos
• Extracción de productos
• Reciclado de aguas
• Efluentes
INTERFERONES Y ANTICUERPOS 
MONOCLONALES
• Diagnóstico
• Tratamiento
COMBUSTIBLES
• Alcohol (azucr de caña)
• Metano (digestores de 
biomasa)
• Hidrógeno (fotolisis)
FIJACIÓN DE NITRÓGENO
• Reducción de uso de fertilizantes
• N atmosférico a amoníaco
FERMENTADORES TRADICIONALES
• Alcohol
• Antibióticos
• Sustancias químicas
CULTIVOS DE CÉLULAS VEGETALES Y 
PROTEÍNAS UNICELULARES
• Producción de Biomasa
• Sustancias químicas: esteroide, 
alcaloides
• Proteínas
Origen de las cepas industriales
1. Cultivo axénico
2. Estable
3. Fácil de inocular (esporas)
4. Crecimiento Rápido
5. Rápida producción del compuesto deseado
6. Capaz de crecer en cultivo líquido y barato
• Licor de maceración de maíz, suero
7. No tóxico ni patógeno
8. Fácil eliminación de las células del medio:
• Tamaño de célula grande o formadores de agregados celulares
9. Susceptibles de manipulación genética
Propiedades de los Microorganismos
Productos de la microbiología Industrial
Bioconversión
Producto
(bioconversión
de esteroides)
Sustrato
Productos de las Células
Enzimas
(Glucosa
Isomerasa)
Antibióticos
(Penicilina)
Aditivos
Alimenticios
(aminoácidos)
Alcohol
Productos
Químicos
(ácido cítrico)
Células
Levadura
La Levadura como producto industrial
BIOCONVERSIÓN
Producción de cortisona utilizando un microorganismo
Metabolitos Primarios y Secundarios
Sustrato de
crecimiento
Metabolito
Primario
Células
Las células y el metabolito se producen 
más o menos simultáneamente
Sustrato de
crecimiento
Metabolito
Primario
Células
Metabolito
Secundario
Después de producidas las células y el 
metabolito primario, las células 
convierten el metabolito primario en 
uno secundario
Sustrato de
crecimiento
Metabolito
Primario
Células
Metabolito
Secundario
Después de producidas las células el 
sustrato se convierte en un metabolito 
secundario durante un posterior 
crecimiento
Metabolitos primarios
-Moléculas generalmente sencillas, que participan de los caminos
metabólicos esenciales. Son casi idénticos en todos los organismos.
-Son más baratos y sencillos de producir, tienen bajo contenido de
“actividad biológica” y frecuentemente son “commodities”
1. Componentes esenciales de las células/microorganismos:
proteínas, ácidos nucléicos, polisacáridos (gelanos, xantanos) y
poliésteres, ácidos grasos (insaturados), esteroles.
2. Derivados del metabolismo intermedio: azúcares (fructosa,
ribosa, sorbosa), ácidos orgánicos (gluconato, ácido láctico,
cítrico, acético, propiónico, succínico, fumárico), alcoholes
(xilitol, etanol, glicerol, sorbitol, butanol), aminoácidos (Lys,
Thr, Glu, Trp, Phe), vitaminas (B2, B12), nucleótidos
saborizantes (ácidos inocínico y guanílico), polisacáridos y
poliésteres de reserva.
Microorganismos productores: bacterias, levaduras y hongos
Metabolitos secundarios
-Moléculas mas complejas, que participan de caminos metabólicos
no-esenciales, pero confieren capacidades de supervivencia en
situaciones de stress.
-Son muy variados y su estructura es fuertemente dependiente de la
especie y variedad utilizada para su producción. Se generan en
condiciones particulares y son más valiosos y complicados de
producir alto contenido de “actividad biológica”
-Generalmente son productos especiales (alto precio). 
Funcionan en los organismos que los producen como:
1. Armas contra otros microorganismos (antibióticos, toxinas,
inhibidores enzimáticos, pesticidas)
2. Factores de crecimiento (hormonas)
3. Ionóforos
4. Agentes de interacción microbiana
5. Efectores externos
Diferencias entre metabolismo primario 
y secundario
Azúcar
Células
Alcohol
Formación de alcohol
a partir de azucar por la levadura
Azúcar
Células
Penicilina
Trofofase Idiofase
Formación de penicilina por el
hongo Penicillium chrysogenum
Vía metabólica primaria para la síntesis de 
aminoácidos aromáticos y metabolitos secundarios 
con anillos aromáticos
Glucosa
Eritrosa Fosfoenol-piruvato
3-Desoli-7-fosfo
D-arabinoheptulosonato
Ácido shikímico
Ácido corísmico
Ácido prefénico
Ácido
antranílico
Candicidina
Nistatina
Cloranfenicol
Ansamicina
Rifamicina
Nocardicina
FenilalaninaPolimixina Tirosina Novobiocina
Triptófano
Actinomicina
Piocianina
Metabolito
primario
Metabolito
secundario
Relaciones entre metabolitos primarios 
y secundarios
Glucosa (C6)
Triosa (C3)
Piruvato (C3)
Acetato (C2)
Pentosa (C5)
Citrato (C6)
a-cetoglutarato (C5)
Oxalacetato (C4)
CO2
CO2
Tetrosa (C4)
Ácido glutámico (C5N)
Sikimato (C7)
Metabolitos secundarios
aromáticos
Aminoaácidos aromáticos
Alanina (C3N)
Malonato (C3)
CO2
CO2
Policétidos (nC2)
Ácidos grasos (nC2)
Metabolitos
secundarios
Metabolitos
secundarios
CO2
Mevalonato (C6) Pirofosfato de isopentenilo (C5)
CO2
Terpenos/Esteroides (nC5)
Valina (C5N)
Serina (C3N)
Ácido kójico
Sacáridos
Glucósidos
Glicocola (C3N)
C1-pool
Penicilina
Cefalosporina
Tetraciclina
Estreptomicina
Griseofulvina
Actinomicina
Pepstatina
ciclosporina A
Krestina
Bestatina
Gibberelina
Antibiótico
Antibiótico
Antibiótico
Antibiótico
Antibiótico (antifúngico)
Antitumoral
Tratamientos antiulcerosos
Inmunosupresor
Tratamiento del cáncer
Tratamiento del cáncer
Regulador del crecimiento vegetal
Metabolito secundario Utilidad comercial
Metabolitos microbianos secundarios comercializados
Penicilina
Actinomicina
Neomicina
Estroptomicina
Candicidina
Estreptomicina
Tetraciclina
Penicilina
Glucosa
Glucosa
Glucosa
Glucosa
Fosfato
Fosfato
Fosfato
Fuentes de nitrógeno
Componente del medio Metabolito secudario reprimido
Represión del metabolismo secundario por componentes del medio
Selección (screening)
En la selección del microorganismo/célula, se debe tener en cuenta:
1. La cepa a utilizar debe ser genéticamente estable.
2. La velocidad de crecimiento debe ser alta.
3. La cepa debe estar libre de contaminantes.
4. Sus requerimientos nutricionales deben cubrirse con medios de
cultivo de costo reducido.
5. Deben ser de fácil conservación por largos períodos de tiempo sin
pérdida de sus características.
6. Debe realizar el proceso fermentativo completo en tiempo corto.
7. Si el objetivo es un producto, este debe ser de alto rendimiento y
de fácil recuperación a partir del medio de cultivo.
Los nuevos métodos de “screening” incorporan técnicas de ingeniería
genética para crear diversidad.
Producción de proteínas 
recombinantes
Biofármacos
• Los biofármacos son producidos por Organismos Genéticamente
Modificados (OGMs)
• Aplicación: médica, veterinaria
• El primer biofármaco fue producido en 1982: la insulina
recombinante humana en bacterias
• A diferencia de las proteínas de origen natural, las proteínas
recombinantes pueden ser producidas en grandes cantidades para
cubrir la creciente demanda actual
• Las proteínas recombinantes son IDÉNTICAS (o difieren levemente)
respecto de la proteína nativa de origen humano
• Entre los sistemas utilizados para la producción de las
proteínas recombinantes se encuentran:
- Escherichia coli
- Líneas celulares de ovario de hámster chino (CHO )
- Líneas celulares de riñón de hámster bebe (BHK)
- Levaduras (Saccharomycescerevisiae, Picchia Pastoris,
Hansenula polymorpha)
• Existen también sistemas alternativos que abaratan los
costos de producción:
- Las plantas transgénicas
- Los animales transgénicos
- Las células de insecto
Mercado farmacéutico mundial 2008: US$ 750 Billion 
Biotecnológicos: Mayor del 15%, US$ 125 Billion 
Crecimiento mayor al 10%. 
Argentina: Rol importante.
Proteínas más vendidas: IFN/Anticuerpos monoclonales
/Insulina /EPO/vacunas
INDUSTRIA BIOTECNOLOGICA
46% de los productos biotenológicos son biofármacos
Upstream: 
• Elección del sistema de expresión (procariota o 
eucariota)
• Diseño del sistema de expresión 
Downstream:
• Proceso de purificación 
• Control de la calidad y validación del producto
Etapas del proceso de producción de biofármacos
PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS 
RECOMBINANTES EN BACTERIAS
Ventajas y desventajas de E. coli como 
sistema de producción 
GENERANDO UN CLON PRODUCTOR 
BACTERIANO
- Alta calidad de la proteína recombinante
- Altos rendimientos
COMPONENTES 
Factores que influyen en la expresión de 
proteinas
Modificando uno o más de 
estos factores influencia 
drásticamente los niveles de 
expresión 
Vector
Elementos básicos en un plásmido de expresión
1) ORI (origen de replicación)
2) POLILINKER (MCS: sitio múltiple de clonado)
3) MARCADORES DE SELECCIÓN (Ampi)
4) PROMOTOR
GRAN VARIEDAD DE PROMOTORES
Industria: se 
utiliza 
comúnmente el 
promotor de 
triptofano (trp
operon) que se 
induce con 
medios de cultivo 
carentes del 
aminoácido 
triptofano
En presencia de triptofano no hay 
transcripción de genes
pET Expression System
• Sistema de expresion más usado.
• Superior nivel de expresion.
• Uso de no nativa T7 RNA polymerase
• ~33 vectores para differentes aplicaciones
• Doble induccion por IPTG
lac Operon
DE QUE MANERA PUEDO MEJORAR LA 
EXPRESIÓN PROTEICA?
Mejorando la solubilidad
Purificando en un solo paso
Efficient His-tag removal. His-taged TNFα was expressed in E. coli and purified using Ni-NTA Superflow. 
The His tag was removed by initial incubation with DAPase for 30 min after which His-tagged DAPase was 
removed by subtractive IMAC. M: markers; CL: cell lysate; FT: flow-through;
W: wash; E: eluate; DAPase: DAPase reaction; pG: pGAPase reaction.
Vector de expresión típico para E. coli
Direccionamiento de la proteína 
recombinante
Cuerpos de inclusión
(insoluble) 
Citoplasma
(soluble)
Espacio periplásmico
(soluble or insoluble) 
Direccionamiento de las proteínas recombinantes en 
levaduras y E. coli y las técnicas correspondientes 
utilizadas para su liberación
IB: Inclusion bodies. ER: endoplasmic reticulum. S: secretory vesicles
E. coli:
- Amplio conocimiento de su genética y fisiología. 
- Tiempo de duplicación corto, 
- Fácil manipulación, alta acumulación de proteínas (20% del 
total celular).
HUÉSPED
Uso de Codones
Mejorando la conformación de la proteína
NO SOLAMENTE E.coli
PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS 
RECOMBINATES EN 
LEVADURAS
• Problemas que suelen aparecer cuando proteínas 
humanas se expresan en células procariotas:
– Proteínas inestables
– Sin actividad biológica
– Con contaminantes procarióticos (LPS, 
endotoxinas bacterianas, etc)
POR QUÉ USO OTROS SISTEMAS ?
Para eliminar los problemas de
expresión en procariotas, se
utilizan Sistemas de expresión
eucariotas
Sistemas de expresión eucariotas
• Cuál es la diferencia?
– Células procariotas NO pueden realizar modificaciones post-
traduccionales…
Modificaciones post-traduccionales
– Formación de uniones disulfuro correctas.
– Clivaje proteolítico del precursor inactivo.
– Agregado de residuos de azúcar
– Alteración de aminoácidos en la proteína: fosforilación, 
acetilación, agregado de grupos sulfato, agregado de 
ácidos grasos
• Sistema costo-efectivo: rápido crecimiento, bajo costo similar a E. coli
con altos rendimientos
• Bien caracterizadas genética y fisiológicamente
• Eucariota: modificaciones post-traduccionales esenciales para la
función proteica.
• No hay posibilidad de contaminación con endotoxinas bacterianas
• Secreta la proteína recombinante al medio extracelular.
• Promotores fuertes disponibles
• Es adaptable a fermentación gran
escala.
• Organismo no patógeno
(GRAS: Generally Recognized As
Safe, FDA)
Ventajas de las levaduras
Ventajas de las levaduras
Disponibilidad de promotores muy
fuertes y de regulación muy precisa
Pichia y Hansenula: levaduras 
metilotrofas
• Las levaduras metilotrofas, como Pichia o Hansenula
tienen la capacidad de crecer en presencia de metanol
(como fuente de carbono)
Se eliminan virtualmente otros microorganismos
competidores o contaminantes
• Además, P. pastoris realiza mejores modificaciones 
postraduccionales que S. cerevisiae: procesamiento 
proteolítico, glicosilación y formación de puentes
disulfuro.
Secreción de Proteínas
Rendimiento máximo (cuerpos inclusión) en E. coli: 1-3 g/L
• Bajo número de copias (integrativos: una copia integrada al 
cromosoma para expresar en bajos niveles x prot tóxica o altera 
metabolismo)
•Alto número de copias (episomales: ori 2m alto número de copias)
Tipos de Vectores
Vectores episomales
 Son ampliamente usados
 Pero….a menudo inestables en cultivos a gran escala (>10L)
 Estrategia alterar las condiciones de crecimiento para
estabilizar el vector episomal
• Usar cepas mutantes auxotróficas que requieren nutrientes
específicos. (Por ej. Uracilo)
Tipos de Vectores
Una auxotrofía es la carencia de una ruta metabólica funcional. Esta
carencia suele deberse a una mutación en la cepa de la levadura que
debido a una carencia en una enzima requerida para la síntesis de
uracilo, precisan de éste en el medio de cultivo para poder crecer.
Marcadores de selección:
Auxotrofia: URA3 (base nt), 
LEU2, TRP1 (aa)
Tipos de Vectores
Tipos de vectores para S. cerevisiae
Vector pYES Vector pYC
• Los vectores pYES están 
diseñados para la expresión de 
alto nivel de proteínas 
recombinantes en S. cerevisiae. 
Estos vectores llevan el origen 
de replicación de 2μ y se 
mantienen episómicamente en 
con alto número de copias. per 
cell). 
• Los vectores pYC llevan el 
origen CEN6/ARSH4 y 
mantienen el número de copias 
de su gen de interés similar a los 
genes de tipo salvaje. per cell
- El metanol como inductor es mucho mas económico 
- Además, la presencia de metanol induce el promotor de la alcohol 
oxidasa, dde se ha insertado el gen de la prot recombinante de interés
A nivel industrial anticuerpos pequeños (scFV, Fab)
Sistema de expresión en levaduras: 
desventajas
• Inestabilidad de plásmidos en gran escala de los vectores
episomales
• Hiper-glicosilación de glicoproteínas
>100 residuos manosa vs. 8-13 normal
puede alterar la actividad de la proteína
• Muchas proteínas secretadas quedan atrapadas en periplasma (entre 
la membrana y la pared celular)
se usan señales peptídicas
...posibles soluciones a los problemas en 
sistemas de expresión en levaduras
• Levaduras modificadas genéticamente para llevar a cabo glicosilación = 
humanos
(Science Vol 301, p1244-1246 (29 Aug 2003))
• Deleción de genes de glicosilación de levaduras
• Agregado de genes de glicosilación humanos
• Usar otros eucariotas: células de mamíferos, de plantas o de insectos
PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS 
RECOMBINANTES EN 
CÉLULAS DE MAMÍFEROS
¿ Por qué células de mamíferos y no bacterias 
o levaduras si presentan…
…Menores cinéticas de crecimiento?
…Menores productividades ?
…Mayores costos?
...Altos riesgos de contaminación (x el uso de SFB)?
•Modificaciones post-traduccionales : 
•Correcto proceso de plegado (est. 2ria, 3ria y 4ria)
•Formación de S-S (disulfuro) 
•Proteólisis de péptidos señal 
•Glicosilación correcta
acylation prenylation glycosylation, 
acetylation, myristoylation hydroxylation 
alkylation, farnesylation iodination 
methylation geranylgeranylation isoprenylation
demethylation ADP-ribosylation lipoylation, 
amidation flavin attachment phosphorylation, 
biotinylation,oxidation pyroglutamate formation 
formylation pegylation 
racemization of proline by 
prolyl isomerase 
gamma-carboxylation phosphatidylinositol sulfation, 
glutamylation, phosphopantetheinylation, Sulfation
Células de mamífero como sistemas de expresión
Glicosilación en diferentes sistemas de 
expresión
Existen en el “American Type Culture Collection” (ATCC)
3.600 líneas celulares comerciales de 80 especies
diferentes de mamíferos, insectos, plantas, etc.
cellline   meaning   Organism   origin tissue   morphology  
HEK-293 human embryonic kidney human kidney (embryonic) epithelium
HeLa Henrietta Lacks human Cervical cancer epithelium
CHO Chinese hamster ovary hamster Ovary epithelium
Sf-9 Spodoptera frugiperda
insect - Spodoptera 
frugiperda (moth)
Ovary
MTD-1A mouse epithelium
CMT canine mammary tumor dog mammary gland epithelium
COS-7
Cercopithecus aethiops, 
origin-defective SV-40
ape - Cercopithecus 
aethiops (Chlorocebus)
kidney fibroblast
HL-60 human leukemia human Myeloblast bloodcells
Jurkat human T-Cell-Leukemia bloodcells
Vero Monkey kidney epithelium
sf21 spodeoptera frugiperda Insect
 BY-2 cells Tobacco
Línea celular CHO (chinese hamster ovary)
• CHO pueden glicosilar proteínas eficientemente, pero carecen de
enzimas necesarias que permiten la glicosilación terminal de las
proteínas
• 50-60% de las proteínas humanas aprobadas para su
comercialización se producen en células CHO (factor de
coagulación, EPO, IFN, etc.)
Generación de una línea celular productora
Clonado, Transfección –Lípidos catiónicos, ClCa, electroporación.
Selección – Antibiótico, Auxotrofía (GS, glutamina sintetasa; DHFR, enz. 
Dihidrofolato reductasa)
Selección de clones alta productividad
Adaptación a SFM (medio libre de suero)- La ausencia del suero fetal bovino 
puede alterar el crecimiento y la glicosilación de la PR)
Hyclone: Invitrogen (medio de cultive libre de suero, disminuye la contaminación 
exógena)
Evaluación de calidad de producto – Glicosilación (ausencia de “glicoformas”), 
secuencia
Estrategia de producción y escalado
•Requerimientos nutricionales 
complejos.
•Cultivo en monocapa. 
•CO2
Se debe optimizar/mejorar :
•Productividad y biomasa
(diseño de cultivo y amplificación 
génica)
•Estabilidad de producción
El sistema de cultivo es más complejo…
Desventajas de las células de mamíferos
• Contaminaciones 
- si derivan de células tumorales pueden portar retrovirus
- virus, priones y micoplasmas provenientes del SFB agregado
• Inestabilidad de la línea celular (apoptosis)
PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS 
RECOMBINANTES EN 
PLANTAS
Molecular Farming: las plantas como sistemas 
de producción BIOFÁRMACOS
Ventajas frente a otros sistemas de producción de biofármacos:
• Gran producción de biomasa.
• Modificacions post-traduccionales. Los mecanismos de síntesis y secreción
de proteínas y otras modificaciones post-traduccionales son propias de las
células eucariotas.
• Gran capacidad de escalado. El escalado implica bajos costos y requiere la
misma infraestructura pre-existente que se utiliza para el cultivo, cosecha,
procesado y almacenamiento de cualquier planta a campo.
• Bioseguras. No implican riesgos de contaminación con patógenos
animales o toxinas microbianas.
• Almacenamiento estable y económico. Permiten almacenar
la proteína recombinante en semillas y tubérculos, facilitando
su conservación, transporte y distribución.
• Gozan de una mayor aceptación pública respecto de
la manipulación de animales.
Los costos de producción de proteínas recombinantes 
en plantas son potencialmente menores que en otros 
sistemas
Tomado de: Daniell et. al. Trends in Plant Sci., 2001.
%
Aseguramiento de la calidad del producto 
y consistencia
1) Caracterización de la línea celular
2) Caracterización de la proteína recombinante
3) Control del proceso
4) Control de calidad de la proteína producida
Expression Construct and Cell Clone Used to Develop the Master Cell
Bank
(MCB)
The manufacturer should describe the origin of the nucleotide sequence
coding for the protein. This should include identification and source of
the cell from which the nucleotide sequence was originally obtained.
1) Caracterización de la línea celular productora
MCB – WCB (master cell bank- working cell banks)
http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances
/ucm073459.pdf
Pureza: Esterilidad (bacterias y hongos)
Micoplasma (cultivo)
Virus, retrovirus (PCR reverse transcriptase)
Estabilidad génica: Secuenciación DNA
Southern hibridizacion
Real time PCR
1) Caracterización de la línea celular productora
MCB – WCB (master cell bank- working cell banks)
Propiedades físico-químicas:
a) Estructura Primaria. (Secuencia nucleotídica, grupos SH, PM, PI, 
perfil electroforético, perfil HPLC), etc.
b) Conformación de la proteína.
Puentes SS
Modif. post-Traducc.
2) Caracterización de la proteína recombinante obtenida
Conformacional
Oligomerización
Hidratos de Carbono
c) Heterogeneidad -> Análisis de las glicosilaciones
d) Actividad biológica:
Animales
Cultivos celulares
Ensayos bioquímicos
e) Propiedades Inmunoquímicas: 
WB/ELISA
Afinidad
f) Pureza y contaminantes: 
HPLC / WB / SDS PAGE
Proteína relacionada c/act biol
Proteína relacionada s/act biol
Impureza Huésped / Medio
Contaminación.
Estabilidad
Proteínas de interés farmacológico
producidas industrialmente
INSULINA
Diabetes e insulina
• 336 millones padecen Diabetes mellitus
• Esto representa un 30% mas de lo que se estimó
• En el 2030 la padecerán aprox. 370 millones
• Gasto sanitario alcanza los U$S 465 mil millones
• Esto significa una demanda de 4,6 Ton anuales
• Dosis: 1.4-2.1 mg/día/paciente
Requerimiento anual de 4.600 kg insulina/año
Tipos de Diabetes mellitus
En personas que no padecen diabetes, con cada comida, las células Beta 
liberan insulina con el fin de metabolizar el azúcar o la glucosa obtenida 
de los alimentos
• Tipo I: Déficit absoluto de insulina. No se observa producción de insulina
debido a una enfermedad autoinmune que destruye las células β de los
islotes de Langerhans del páncreas. Por lo tanto, necesitan disparos de
insulina para metabolizar la glucosa de los alimentos.
• Tipo II: El organismo produce insuficiente insulina o bien, los receptores
de insulina de las células están dañados. Las personas que
padecen diabetes tipo 2 necesitan medicación oral y a veces disparos
de insulina.
• Diabetes Gestacional: Resistencia temporal a la insulina
durante el embarazo
La terapia con INSULINA es esencial para la supervivencia de los 
diabéticos Tipo I (insulino-dependientes) y se utiliza para controlar la 
progresión y los síntomas de la enfermedad en diabéticos Tipo II (junto 
con otros medicamentos).
Tipos de Diabetes mellitus
Comercialización
• Existen en el mercado 180 insulinas comercialmente disponibles:
- Sanofi (487 mill Euros)
- Eli Lilly (2.500 mill U$D)
- Novonordisk (2.300 mill Euros en ventas)
La insulina es uno de los fármacos 
que mayor impacto genera en el 
mercado
- Hormona proteica .
- Regula la concentración de glucosa en sangre: sin insulina
la glucosa se acumula en la sangre hasta alcanzar niveles
elevados, con complicaciones para la salud.
- Cuando la producción es escasa o nula se puede regular el
nivel de glucosa por administración exógena de Insulina.
Estructura y función
Estructura y función
Péptido C
Cadena B, 30 aa
Cadena A, 21 aa
INSULINA
- 51 aa
- 2 puentes disulfuro 
intercatenarios
-1 puente disulfuro 
intra-catenario (A)
La síntesis de Insulina 
tiene 3 etapas: 
- Se fabrica como 
preproinsulina
-Se cortan sus extremos 
y se obtiene 
proinsulina
-La proinsulina se 
separa en el Péptido C 
(conector) y la insulina
Vías de obtención de Insulina
Hoy en día existen 4 rutas de obtención de insulina:
• 1. Extracción de páncreas (cerdos, bovinos)
• 2. Síntesis a partir de los aminoácidos individuales
• 3. Conversión de insulina porcina en humana
• 4. Fermentación de microorganismosUn paso adelante……
• Se secuencia la estructura primaria de la insulina humana (1960).
• Se establece que la Insulina humana difiere de la Insulina bovina en 3 aa y de 
la porcina en 1 aa
• El aa 30 del terminal C de la cadena B es una 
treonina en la Insulina humana mientras que la 
insulina porcina tiene una alanina en esta posición
• Explica problemas inmunológicos en algunos diabéticos.
• Del páncreas de un cerdo se obtiene insulina para un 
paciente por 3 días.
• S! qca muy costosa.
Insulina semisintética
• Insulina “humanizada”: transformación de la insulina de cerdo en una 
molécula igual a la humana, cambiando el aminoácido diferente 
mediante transpeptidación enzimática. 
Cadena B, 30 aa
Cadena A, 21 aa
Ejemplo: producen Insulina Semisintética: 
- Orgasuline y análogos (Organon, Holanda/ Merck & Co.) 
- Insuman (Hoechst)
Insulina Recombinante (ó Biosintética)
 Nueva y mejor alternativa para lograr insulina humana
 Se obtienen mediante fermentación de microorganismos
 Independencia de la provisión de páncreas (que no alcanzan para
satisfacer la demanda).
 La primera insulina recombinante se produjo en 1978 
 Hoy: las insulinas de tipo recombinante abastecen el 93% de la demanda 
mundial.
Qué alternativa de microorganismos elegir?
Insulina Recombinante (ó Biosintética)
• E. coli
• S. cerevisiae
Si bien estos son los pasos a seguir 
en la obtención de insulina 
recombinante, si se inserta en el 
plásmido de E. coli el gen entero, el 
MO produciría preproinsulina.
http://www.madehow.com/Volume-7/Insulin.html
E. coli : Estrategia de producción de insulina 1
Expresión de cadenas A y B por 
separado
La primera insulina recombinante se 
produjo de esta forma (1978).
• Expresión de cadena A
• Expresión de cadena B
• Purificación independiente de ambas 
cadenas
• Co- incubación de las dos cadenas 
purificadas en condiciones favorables 
para la unión vía SS
• Purificación para obtener la insulina
Actualmente, esta técnica no se utiliza
Vía de la proinsulina
Insulina producida por Eli Lilly (disponible comercialmente 
desde 1986) llamada “Humulin/Umuline”.
• Expresión de una única secuencia nucleotídica sintetizada 
químicamente que codifica para la proinsulina humana nativa
• Purificación del polipéptido
• Clivaje proteolítico del péptido C in vitro
• Purificación (intercambio iónico, cristalización, RP-HPLC, tamiz 
molecular).
Insulina purificada
E. coli : Estrategia de producción de insulina 2
Insulinas recombinantes (biosintéticas)
Producen Insulina Biosintética: Umuline, Lilly
Estrategias moleculares de producción de proinsulina en E. 
coli :
- EXTRACELULAR: Secreción de proinsulina
- INTRACELULAR: Cuerpos de inclusión
Insulina soluble en citoplasma
- PERIPLÁSMICO: Secreción al periplasma: no requiere refolding in vitro, xo
bajos niveles x secreción limitada
La producción de Insulina en cuerpo de inclusión ha sido la tecnología 
empleada por default
Bajos niveles de expresión por:
- Dificultad en solubilizar CI
- Corta vida media en la bacteria
- Proteólisis
- Ineficiente traducción
Utilización de péptidos de 
fusión (leader peptides) 
S. cerevisiae: estrategia de producción de 
insulina 3
• Vía proinsulina: se vio que la proinsulina humana no era secretada 
eficientemente por las levaduras (incluyendo a S. cerevisiae)
• Se diseñó el “Insulin Precursor” (IP): 
- cadena A completa 
- cadena B con 29 aa (la cadena B carece de la treonina C-terminal) 
• Ambas cadenas se producen directamente unidas o bien unidas con un 
un tripeptido sintético (ala, ala, lys- AAK)
• FUSIÓN: La secuencia nucleotídica se fusiona con una secuencia señal 
líder (-mating factor prepro-peptide signal leader seq)que guía la 
secreción extracelular y es removido enzimáticamente por la levadura 
(80 mg /l)
• RECUPERACIÓN: El polipéptido de insulina se recupera por 
cromatografía de intercambio iónico.
• TRANSPEPTIDACIÓN: La “humanización” de la insulina se hace por 
transpeptidación mediada por tripsina en presencia de exceso de ester
de treonina.
• El producto se purifica por cristalización y cromatografía.
Precursor de insulina expresado en 
levaduras
Proceso de purificación de Insulina recombinante 
expresada en levaduras y secretada al medio de cultivo
0.- Obtención del precursor de 
insulina PI en LEVADURAS
1.-Se realiza la 
transpeptidación: ester de 
insulina humana
2.- RP-HPLC 1 para eliminar
tripsina
3.- Intercambio iónico: 
elimina insulina con aa29, no 
activa
4.- Hidrólisis: para eliminar la 
función ester de la treonina, 
obtengo insulina
5.- RP-HPLC 2: elimina
residuos de la desesterificación
6.- RP-HPLC 3: elimina
subproductos de insulina
7.- Cristalización
8.- Liofilización
Estrategia de producción de insulina en Picchia pastoris
• Picchia pastoris (crece mejor a alta densidad que S. cerevisiae)
• Se produjo el IP (insulin precursor) (29 aa B y 21 aa A) conectados por el 
dipéptido Ala-Lys) 
• Utilización de -mating factor prepor-leader sequence
• Se utilizaron fermentadores (cultivos 
alta densidad) de 16 L utilizando
levaduras transformantes multi-copia
• Luego transpeptidación con tripsina
en presencia de treonina y purificación.
Insulinas recombinantes actualmente 
aprobadas para su uso médico en US y EU
Análogos de insulina: producción de Insulina de 
2da generación
• En condiciones normales:
- Tras la ingesta se da un pico de insulina 1 hs después y se alcanza el nivel 
basal nuevamente en 2 hs. 
- La insulina activa es monomérica.
- La terapia con insulina comercial no puede reproducir estos patrones de 
secreción endógenos.
• La insulina comercial es de forma cristalina y hexamérica y 
viene en dosis mas elevadas que la fisiológica (10-3 vs. 10-10 ). 
Para ser activa debe disociarse en monómeros.
• A partir de 1990: el objetivo fue mimetizar la acción normal de 
la insulina con perfiles fisiológicos similares en tiempo y acción: 
- Alterando su formulación.
- Insulina por ingeniería genética (insulina recombinante de 
2da generación).
Análogos de insulina: producción de Insulina de 
2da generación
Análogos de insulina: producción de Insulina de 
2da generación
Disminución del tiempo de acción: Insulinas Rápidas (Lispro, Aspart)
Obtención de insulina de acción basal o sostenida (Glargina, Detemir)
Insulinas de acción lenta
Insulina modificada por ingeniería genética: insulina de 
acción rápida
• Obtenidas por Bioingeniería: cambio selectivo de la secuencia de aa
La insulina modificada tiene menor tendencia que la natural a formar 
agregados moleculares (hexámeros). 
Estos agregados hexaméricos tienen que ser disociados para que la 
insulina sea absorbida desde el punto de inyección, con el resultado 
práctico de que la insulina de acción rápida tiene un comienzo más rápido 
y duración de acción más corta que la insulina soluble normal
2) Insulinas de acción prolongada obtenidas por cambio en su 
formulación: 
Formulación: Adición de Zn para promover cristales de Zn-insulina (se 
forman tres dímeros coordinados con Zn) que deben disociarse en 
monómeros para actuar luego de su inyección
Resultado: más lenta disociación en monómeros post inyección.
Insulina de acción prolongada
Insulina nativa y análogos
Insulina: situación de Argentina y el mundo
• Laboratorios Beta
• Laboratorio BioSidus S.A
• Denver Farma
Laboratorios Beta
Patentes: insulina en P. pastoris
Denver Farma: primera insulina recombinante 
formulada en Argentina
Denver Farma, que es el 
encargado de producir en el 
país insulina humana, 
denominada Densulin, 
constituyéndose en el primer 
establecimiento de América 
Latina en fabricar ese 
medicamento.
Denver Farma es una 
empresa farmacéutica 
argentina de capitales y 
técnicos argentinos, con 
sólida formación científica y 
demostrables recursos 
tecnológicos
Biosidus: tambo farmacéutico
• Vacas transgénicas capaces de dar leche para producir insulina humana,
en un hecho que se registra por primera vez en el mundo.
• La producción local de la insulinaa partir de la leche vacuna permitirá
reducir un 30% su costo en el mercado.
• La insulina producida en la leche de las vacas transgénicas necesitará luego
un proceso de aislamiento y purificación a escala industrial.
• El volumen de producción de leche de unas 25 vacas será suficiente para
cubrir la totalidad de insulina humana que demanda Argentina y que debe
importar (1,5 millón de enfermos de diabetes de los cuales 300.000 son
insulinodependientes)
• Se están realizando las pruebas de seguridad para cumplir con los
requisitos regulatorios indispensables para la aprobación del producto.
• La UE aprobó el año pasado la producción de insulina en base a la leche de
cabras transgénicas, pero ésta es la primera obtención a partir de leche
vacuna.
• En la actualidad, el mercado de insulina en la Argentina continúa 
constituyendo un oligopolio liderado principalmente por: 
- Eli Lilly (Estados Unidos) 
- Novo Nordisk (Dinamarca) 
- Laboratorios Beta SA
- Denver Farma. 
Estas empresas representan un 90% de las ventas de insulina de la 
Argentina. Participa en menor medida Aventis.
Producción de Interferón
recombinante
Interferón
Tipos de interferón
Interferones
alfa beta gama
leucocitos fibroblastos linfocitos
Células CHO / BHK bacterias
1b1a
NATURAL
BIOTEC
Generalidades
• El interferón es una proteína producida naturalmente por el sistema 
inmunitario como respuesta a agentes externos, tales como virus, ARN 
doble cadena y células cancerígenas. 
• Es una glicoproteína
•  y β son isoformas
• β : producido por fibroblastros
• Terapia IFN β : esclerosis múltiple, antiviral, antiproliferativo e 
inmunomodulador
• Acción: IFN β inicia una secuencia compleja de eventos intracelulares
como inducción de enzimas, inhibición de la proliferación celular, y 
actividades inmunomodulatorias, incluyendo la inhibición de la 
replicación de los virus en células infectadas.
IFN β 1a y 1b
• IFN β 1a es un interferón glicosilado, producido por tecnología de 
DNA recombinante por células CHO. La secuencia aminoacídica es 
idéntica a la del interferón B natural. 
• IFN β 1b es un interferón no glicosilado producido por tecnología de 
DNA recombinante por una cepa de E. coli. Posee sutiles diferencias 
estructurales con el interferón.
Interferón ß
• El interferón ß (IFN ß) es una molécula con 166 aa y su PM teórico de 
20kDa.
• El IFN ß nativo es:
-glicosilado
-Posee un SS
-Es altamente hidrofóbico.
• Estructura secundaria con 5 hélices α.
• Es un proteína que ha sido expresada en células de mamíferos, 
levaduras, insectos, plantas y bacterias
• Expresado en bacterias no se glicosila
Expresión en E.coli
Debemos considerar que: 
• El medio citoplasmático en E. coli es reductor.
• La proteína se sobre expresa y se forman cuerpos de inclusión en el 
citoplasma
Entonces el INF ß estará:
• Desnaturalizado. Las cisteínas reducidas y no se formaron las uniones 
disulfuro.
Expresión en E.coli
• Que problemas se presentan en el proceso de refolding y purificación??
Al re-oxidarse las cisteínas y formarse los puentes disulfuro nos podemos 
encontrar con:
Formación de tres posibles monómeros (puentes disulfuro intracatenario).
Formación de oligómeros (puentes disulfuro intercatenario).
O sea especies moleculares contaminantes e inactivas.
Como se solucionó el problema de la formación de puentes disulfuro
incorrectos?
• Se reemplazó la Cys17 (no involucrada en el SS) por una Ser. La 
proteína se denomina: r-INF ß (Ser 17) ó Betaferón (Bayer)
Betaferón (Bayer): tratamiento de la 
esclerosis múltiple
Expresión en E.coli
• El r-INF ß (Ser 17) es muy hidrofóbico. Como encarar este problema? 
Durante todo el proceso de purificación las soluciones tienen incorporado:
- SDS (sodio dodecil sulfato). 
- El proceso de purificación se hace en un medio reductor (ditiotreitol, 
DTT)
• En la etapa final de purificación, para renaturalizar el INF ß se diluye la 
muestra y se saca el reductor MUY LENTAMENTE 
IFN recombinantes
Interferón : INTRON A (Merck)
• INTRON®  (Interferon alfa-2b) Interferón recombinante producido
por Merck en E. coli
• “The fermentation is carried out in a defined nutrient medium
containing the antibiotic tetracycline hydrochloride at a concentration
of 5 to 10 mg/L; the presence of this antibiotic is not detectable in the
final product. The specific activity of interferon alfa-2b, recombinant is
approximately 2.6 x 108 IU/mg protein as
measured by the HPLC assay”
Biosidus
• Interferón β1a (Blastoferon®)
El Interferón beta 1a es un interferón humano recombinante producido por la 
tecnología de cultivo celular masivo. El Interferón beta 1a está indicado para el 
tratamiento de la esclerosis múltiple recurrente recidivante. El producto Interferón
beta 1a Bio Sidus se encuentra disponible como solución en jeringas prellenadas
listas para su uso para inyección subcutánea, en dos potencias, 6 M U.I. y 12 M U.I..
• Interferón  2b (Bioferon®/ Inter 2B®/ Citopheron®/ Zavinex®/ Ganapar®)
Nuestro producto Interferón alfa 2b se obtiene por fermentación bacteriana. El 
interferón alfa 2b se utiliza para tratar numerosas enfermedades, incluyendo 
hepatitis B y C, el sarcoma de Kaposi, enfermedad caracterizada por lesiones en la 
piel y mucosa oral, asociada al SIDA, y ciertos tipos de cáncer. El Interferón alfa 2b de 
Bio Sidus se encuentra disponible como polvo liofilizado en las potencias de 3 M U.I., 
5 M U.I. y 10 M U.I..
• Interferón  2a (Inter 2A®/ Inmutag®/Inferon®) El interferón alfa 2a es un 
subtipo de interferón producido por fermentación bacteriana y comparte las 
indicaciones con el subtipo alfa 2b. El Interferón alfa 2a Bio Sidus se encuentra 
disponible como polvo liofilizado en las potencias 3 M U.I., 4,5 M U.I. y 9 M U.I. 
GEMA Biotech y PC Gen
• GEMA Biotech
Compañía biotecnológica privada. Algunos de sus productos son: 
- interleuquina 2 (IL-2) proteína recombinante humana producida en E. coli, 
indicada para carcinoma renal y melanoma. 
– Eritropoyetina proteína recombinante producida en células de mamífero, 
indicada para tratar la anemia. 
– Interferon alfa 2ª producido en E. coli e indicado para tratar sarcoma de 
Kaposi, leucemia y hepatitis C crónica.
• PC Gen
El laboratorio PC gen una empresa incubada y pertenece al sector productivo 
salud humana y medicamentos. PC-Gen ha desarrollado productos como:
- Interferón alfa, 
- Interleuquina 2 
- GM-CSF y eritropoyetina.