Unidad 3 Biot

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Biotecnología I
Unidad III 
Carrera: LICENCIATURA EN BIOTECNOLOGIA
Trayecto curricular: Ciclo de Formación Inicial
Período: 2º Cuatrimestre – 2018
Herramientas genéticas y edición génica
Edición génica
• Enfoques de recombinación (ratones, levadura).
• Elementos transponibles (Drosophila), inserción 
bacteriana de ADN (Arabidopsis).
• Transfección de construcciones génicas en células 
(integración al azar).
• Hasta hace poco, no era posible realizar cambios genéticos 
dirigidos en las células humanas -> edición del genoma.
¿Qué es la edición del genoma?
• Un enfoque de ingeniería genética en el que el ADN se inserta, elimina 
o reemplaza en una ubicación precisa dentro del genoma.
• Nucleasas diseñadas.
• Enfoques basados en recombinación
Edición génica basada en nucleasas:
Zinc-finger nucleasas
TALENs
CRISPRs
Edición con genoma viral:
rAAV
• La creación de líneas celulares isogénicas -> solo difieren en el 
cambio que hemos introducido.
• ¡Permiten realizar (casi) cualquier modificación que deseemos!
Edición del genoma con rAAV
Se utiliza un vector viral para transportar ADN dentro de la célula
La recombinación homóloga permite la incorporación de ADN modificado en el 
genoma.
La incorporación de un gen de resistencia a antibióticos permite la selección de 
células editadas con éxito.
Edición del genoma con rAAV
ITR ITRLoxP LoxPG418 Resistance Gene Exon
Single nucleotide alteration
LoxP LoxPG418 Resistance Gene Exon
Single nucleotide alteration
Insertion into genome by homologous recombination
LoxP Exon
Single nucleotide alteration
Removal of G418 resistance gene
Edición del genoma basado en nucleasas
Nucleases modificadas por ingeniería genética que cortarán el genoma 
en una posición deseada 
Las nucleasas inducen roturas doble cadena específicas generando:
• Non-homologous end joining (NHEJ) mutagénicos
• Mutaciones puntuales por recombinación homóloga (HR)
• Reemplazo de genes por recombinación homóloga (HR)
Mecanismos 
de reparación 
de mutaciones
Nucleasas
Zinc-Finger Nucleasas 
(Año 2000)
Zinc Fingers Reconocen Tripletes
Es posible vincular los Zinc Fingers a un sitio target conocido y así producir una 
proteína con la especificidad deseada
Los ZNF se han diseñado para que reconozcan las 64 posibles combinaciones 
de trinucleótidos, y al unir diferentes porciones de dedos de zinc, se pueden 
crear ZNF que reconocen específicamente cualquier secuencia específica de 
tripletes de ADN.
En la mayoría de las nucleasas, las 
funciones de unión a ADN y nucleasa 
están estructuralmente integradas, lo 
que las hace difíciles de diseñar. FokI
ZFN
Cada brazo homólogo contiene de 5 a 6 proteínas Zinc Finger
La especificidad genética es 30 o 36 bases
FokI nuclease
domain (Fn)
FokI nuclease
domain (Fn)
Esta tecnología se ha utilizado para:
- Crear reporteros genéticos endógenos
TAL effector nucleases (TALENs)
(Año 2010)
TALENs
• TALEs – (Transcription Activator-Like Effector) proteínas producidas por una bacteria 
(Xanthomonas sp.) patógena de plantas. Actúan como efectoras durante la patogénesis.
• Contienen una señal de translocación nuclear (NLS) y un dominio activador 
transcripcional (AD). Regulan la expresión génica del húesped activando genes que ayudan 
a la patogénesis
Contiene 30 repeticiones en tándem de un motivo de 33-35 aa que puede 
reconocer una única base a través de dos residuos di-variantes (RVD) que ha sido 
descifrado.
Se pueden generar secuencias 
personalizadas de TALEs para 
reconocer secuencias genómicas 
únicas 
N: Asparragina
I: Isoleucina
G: Glicina
H: Histidina
D: Ac. aspártico
A la secuencia de TALEs personalizada se puede fusionar la nucleasa FokI
para generar el dímero funcional de corte 
TGAGGAGGCGGCAACGGCGGGCGCCGGGGCGGCGGGCCCCGGGGCGAGCA
ACTCCTCCGCCGTTGCCGCCCGCGGCCCCGCCGCCCGGGGCCCCGCTCGT
Fok1
Fok1
Clivage
Resumiendo - Ingeniería TALE
•Los genes TALE pueden mutarse para generar proteínas de unión a ADN específicas 
de secuencia.
• Los TALE modificados pueden fusionarse con nucleasas para DSB dirigidos en 
plantas y animales.
• Los TALE modificados se pueden fusionar con activadores transcripcionales para 
activar la expresión de genes ectópicos en mamíferos.
Software para el diseño de TALENs
• Utilizado para el diseño de 
efectores TALEN y TAL para la 
edición del genoma
• Las pautas reflejan efectores 
TAL de origen natural
- Sitios de enlace
- Longitud del espaciador
Aplicaciones de 
TALENs para editar 
genomas de forma 
dirigida en varios 
organismos.
Zinc-finges vs. TALENs
CRISPR/Cas9
(Año 2013)
CRISPR/Cas9
Sistema CRISPR/Cas – una forma de inmunidad adquirida que se 
encuentra en las bacterias.
El ARN guía dirige a la proteína Cas9 a un sitio diana o target.
Crear una ARN guía es muy simple.
Nomenclatura CRISPR loci y Cas nucleasa 
CRISPR: Clustered Regularly Interspaced Palindromic Repeats Loci - en el 
40% de las bacterias y el 90% de las arqueas .
Cas9: CRISPR associated protein 9 
una nucleasa, una enzima especializada para cortar ADN. Existen Cas1..Cas10 
CRISPR/Cas: tipo I, tipo II y tipo III .
gRNA: RNA guía - una construcción/quimera de ARN CRISPR (crRNA) 
y ARN CRISPR trans-activador (ARNtracr).
PAM: protospacer adjacent motif con secuencia NGG (cualquiera, guanina, 
guanina) específica para Streptococcus pyogenes y 5'-NAG (cualquier, 
adenina, guanina) PAM tolerada en células humanas.
CRISPR/Cas: el sistema inmune de las bacterias
Existen 3 tipos de sistemas CRISPR/Cas (I, II y III)
Pueden coexistir en el 
mismo organimo
Solo tracrRNA y Cas9
Necesitan un complejo 
multi-Cas
Tijeras de ADN programables
CRISPR/Cas9 incluye una ruptura de doble cadena específica
Corte de la Cas9 nativa
Pueden cortar 
únicamente una de las 
dos cadenas
Pueden guiarse con un par de gRNA espaciados y orientados apropiadamente para 
cortar simultáneamente en ambas cadenas
Reducción de off-targets!!!!
Se puede modificar el 
sistema CRISPR/Cas9 
para activar o reprimir la 
transcripción
Constitutivo Inducible
Edición de ARN con CRISPR/Cas9 usando RCas9
Cas9 guiado por ARN escinde ARN monocatenario (ARNss)
targets en presencia de un PAM corto que posee un oligonucleótido de 
ADN (PAMmer)
Requiere únicamente la síntesis de un gRNA correspondiente y 
PAMmer complementarios 
Edición génica
Creciente utilización de la técnica CRISPR/Cas9
CRISPR Timeline
2015: Se desarrollan los tomates con resistencia editando con CRISPR y se edita por primera 
vez genoma de embrión humano.
2016: USDA determina que cultivos editados no serán tratados como OGMs y el NHI aprueba 
el primer trial para hacer edición génica en humanos.
2017: le dan la patente al Broad Institute.
El triunvirato de la edición génica
Por qué CRISPR/Cas9 es mejor? - Ventajas
VENTAJAS
-Simple
- Eficiente
- Especificidad
-Potencial como terapia génica dirigida
-Medicina personalizada
La increíble eficiencia de CRISPR
Algunos expertos consideran que CRISPR/Cas9 es aproximadamente 100 
veces más eficiente que los métodos anteriores
Problemas - Desventajas
APLICACIONES
Software y bases de datos 
Western blot
qPCR
CRISPR – Flujo de trabajo
20-30%
3-4 bps from the PAM seq
PAM seq
PAM seq
P. Bompada et al., Int J Biochem Cell biology, 2016 Oct
3-4 bps from the PAM seq
Ejemplo de aplicación de CRISPR/Cas9
Target deletion of Ep300 exon1 by CRISPR in INS1 832/13
Target deletion of Ep300 exon1 by CRISPR in INS1 832/13
Western blot
qPCR
0.2%
CRISPR – Flujo de trabajo
Aplicaciones de CRISPR/Cas9
Terapia génica con 
CRISPR/Cas9
CRISPR/Cas9 reduce tiempos de generación de ratones transgénicos
Aplicaciones clínicas
28 de octubre de 2016, 
Un equipo liderado por el oncólogo 
Lu You de la Universidad de Sichuan 
en Chengdu, China, suministró a 
células modificadas en un paciente 
que sufre de un agresivo cáncer de 
púlmon. 
Aplicaciones clínicas
21 de junio de 2016, 
EE.UU. aprobó una propuesta parautilizar CRISPR-Cas9 en la mejora de 
terapias contra el cáncer; basadas en 
reclutar células T.
Cerdos resistentes a síndromes respiratorios
En 2017, Investigadores de la 
Universidad de Edinburgh, demostraron 
que con CRISPR desactivaron el gen 
CD163. Los cerdos no produce la 
proteína CD163, encargada de propagar 
el virus por el cuerpo del animal. 
Cuando los animales libres de CD163 han 
sido expuestos a los principales subtipos 
de los SRRP, no se han enfermado.
Hasta la fecha, ninguna vacuna ha 
mostrado efectividad para esta 
enfermedad que cuesta cada año más de 
660 millones de dólares
Cerdos resistentes a síndromes respiratorios
En 2015, científicos de 
Corea del Sur y de China 
modificaron el gen de la 
miostatina (MSTN) en 
cerdos.
La MSTN inhibe el 
crecimiento de las células 
musculares, controlando 
el tamaño del músculo, sí 
la MSTN es interrumpida 
las células musculares 
proliferaran, creando un 
volumen anormal de 
fibras musculares.
Ganado vacuno con resistencia a la tuberculosis
En 2017, Estudio en la Universidad Northwest en China utilizaron 
una versión modificada de CRISPR/Cas9 para insertar un gen de 
resistencia a la tuberculosis (NRAMP1) en el genoma de la vaca. 
Hasta ahora sin efectos no deseados.
Naranjos de Florida inmunes al enverdecimiento
Enfermedad de Huanglongbing (HLB), 
destruye la producción, apariencia y valor de 
los árboles cítricos; produce frutos amargos 
no comestibles y muerte progresiva del 
árbol.
La enfermedad apareció en Florida en 2005 
y desde entonces la producción ha caído 
hasta los 104,4 millones de cajas de naranjas 
en 2014, su nivel más bajo en los últimos 30 
años.
En las Universidades de Texas y Florida se 
están desarrollando árboles modificados que 
puedan hacer frente al enverdecimiento.
En busca del tomate perfecto…
Un equipo del Cold Spring 
Harbor Laboratory
Buscan diseñar plantas más 
productivas, utilizando CRISPR 
para desarrollar con ramas y 
flores optimizados para el 
tamaño del fruto, mejorando 
los rendimientos.
Este enfoque se puede aplicar a 
la mejora de cultivos en general 
y no sólo en el tomate.
Champiñones resistentes al pardeamiento
En 2013, Yinong Yang, utilizó
CRISPR/Cas9 
Deleciones (1 a 14 bp) en los 6 genes 
que codifican para la enzima 
polifenol oxidasa en Agaricus
bisporus
El servicio de Inspección de Salud 
Animal y Vegetal (APHIS) declaró a 
los champiñones blancos 
modificados por CRISPR/Cas9 como 
cultivos exentos de regulación 
aplicable a la importación, el 
movimiento o la liberación de 
organismos modificados 
genéticamente en USA.
Modificación genética vs. Edición genética
- La edición precisa permite modificar atributos sin introducir genes 
exógenos.
- El desafortunado término OMG es, de alguna manera, sinónimo de 
transgénico.
- Muchas formas de edición genética precisa serían no-transgénicos (Ej. 
Eliminación de genes, sustitución de alelos, modificación de genes sobre 
diseños teóricos, etc.)
Clasificación de los productos por edición genética
Regulaciones
Actualmente se debate sobre la manera como se deben de regular el uso de 
este tipo de tecnologías
Preocupaciones
Debate internacional por la Edición Génica 
Diciembre 1-3 de 2015; Washington D.C., USA.
Expertos mundiales, convocados para discutir cuestiones científicas, legales y 
bioéticas.
Se elaboró un reporte al respecto durante el 2016.
1.Investigación básica y preclínica sujeta a una adecuada supervisión legal y 
ética.
2.Uso clínico (somático); usar en células somáticas para tratar enfermedades 
como el cáncer y la anemia de células falciformes autorizada dentro de los 
marcos legales existentes.
3.Uso clínico (línea germinal); se deben de resolver de seguridad y deberá de 
existir un amplio consenso social sobre las aplicaciones propuestas.
4.Necesidad de un foro continuo; a fin de establecer normas .
Pronunciamiento al final de la cumbre
Informe de la Academia Nacional de Ciencias y la Academia 
Nacional de Medicina de Estados Unidos
14 de febrero de 2017
Se debe de actuar con: Responsabilidad, seguridad 
y transparencia.
El empleo en terapia génica somática es muy 
promisorio y debe regularse conforme a las mismas 
normas ya bien establecidas.
Las personas deben tener voz en la discusión sobre 
la utilización de las técnicas de edición genómica en 
humanos.
Únicamente en el caso de enfermedades graves y 
bajo estricta vigilancia podrían permitirse los 
ensayos clínicos en los que se incluya edición del 
genoma en la línea germinal.
Instituto Broad del MIT vs. Universidad de California-Berkeley
CRISPR War - PATENTE
2012
2014
Empresas biotecnológicas basadas en CRISPR/Cas9
Empresas que ofrecen servicios de CRISPR/Cas9