microbiologia transformacion bacteriana

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Instituto Tecnológico de Tijuana
Ingeniería Bioquímica 
Laboratorio de Microbiología
Práctica 16: 
“Transformación Bacteriana”.
Maestro:
M.C. Martha Margarita Porras Lanzagorta
Alumnos:
Muñoz García Nely Alejandra 17210514
Paniagua Carrillo Jaime Adyair 17210517
Tijuana, B.C. a 12 de noviembre de 2019
Índice:
	Objetivo 
	3
	Introducción
	3
	Materiales y Reactivos
	
	Metodología
	
	Resultados
	
	Análisis de resultados
	
	Conclusión
	
	Cuestionario 
	
	Bibliografía 
	
“Transformación Bacteriana”
Objetivo:
· Realizar una transformación bacteriana usando un plásmido de fluorescencia. 
Introducción:
La transformación es un proceso de transferencia genética por el cual el DNA es incorporado en una célula receptora y lleva a cabo un cambio genético. Algunos procariotas son naturalmente transformables, incluyendo determinadas especies de bacterias grampositivas y gramnegativas y algunas especies de arqueas. el descubrimiento de la transformación fue uno de los eventos fundamentales para la biología, ya que permitió llevar a cabo experimentos en los que se demostró que el DNA es el material genético. (Madigan, Martinko, Dunlap y Clark, 2009)
Los genes se pueden obtener de ADN de humanos, animales o de plantas, e introducirse en las bacterias. En las condiciones adecuadas, esas bacterias pueden producir auténtica insulina humana, la cual se puede usar para tratar a los pacientes con diabetes, una enfermedad genética en la que los genes responsables de producir insulina no funcionan correctamente. (Mardigan, Biotechnology)
Normalmente, una célula individual incorpora sólo uno o unos pocos fragmentos de DNA, de modo que sólo una pequeña proporción de los genes de una célula se pueden transferir a otra mediante un acto de transformación individual. (Madigan, Martinko, Dunlap y Clark, 2009)
En la naturaleza, solo muy pocas especies bacterianas tienen capacidad de captar ADN foráneo de forma natural mediante la transformación, transducción o conjugación de genes. La transformación en el laboratorio es una técnica rutinaria de enorme utilidad, que nos permite introducir prácticamente cualquier plásmido en su forma circular o superenrollada en casi cualquier tipo de bacteria. El método que se describe a continuación es, por su simplicidad, uno de los más utilizados para transformar E. coli. Para detectar la transformación, el DNA introducido llevará un marcador seleccionable en el medio adecuado. (Gómez, Gómez y Núñez, 2018)
El sistema pGLO:
 El kit de transformación pGLO, realiza un sencillo procedimiento para transformar bacterias con un gen que codifica la síntesis de una proteína denominada GFP (Green Fluorescent Protein). La fuente natural de este gen es una medusa fosforescente llamada Aequorea victoria, en la que la GFP es la responsable de que la medusa brille o emita fluorescencia en la oscuridad. Después de la transformación, las bacterias expresan el gen de la medusa y sintetizan la proteína, lo que les permite emitir un color verde brillante cuando son expuestas a luz ultravioleta, debido a que se transmitirán genes de un organismo a otro con la ayuda de un plásmido. Además de un cromosoma, las bacterias pueden contener uno o más pequeños fragmentos circulares de ADN denominados plásmidos. Un plásmido suele contener genes que proporcionan alguna característica beneficiosa a la bacteria portadora, para facilitar su supervivencia. 
En la naturaleza, las bacterias pueden transferirse plásmidos de unas a otras, pudiendo así compartir esos genes beneficiosos. Este mecanismo les permite a las bacterias adaptarse a nuevos medios. Por ejemplo, el reciente fenómeno de la resistencia bacteriana a los antibióticos se debe a la transformación plasmídica. El plásmido pGLO de BioRad contiene el gen para la síntesis de la proteína GFP y un gen de resistencia al antibiótico ampicilina. pGLO también contiene un sistema especial de regulación de genes que se puede usar para controlar la expresión de la proteína fluorescente en las células transformadas. El gen para sintetizar GFP se puede activar en las células transformadas simplemente añadiendo arabinosa al medio de cultivo. La selección de las células que se han transformado con el plásmido pGLO se realiza observando el crecimiento en placas con antibiótico. Las células transformadas aparecerán blancas (fenotipo salvaje) en placas que no contengan arabinosa, y de color verde fluorescente cuando se añada arabinosa al agar. Y todo el proceso se puede observar con una simple lámpara de luz ultravioleta. Este kit de transformación pGLO permite la posibilidad adicional de purificar la proteína fluorescente recombinante de las bacterias transformadas mediante el kit de cromatografía GFP. (Mardigian. R. Biotechnology Explorer pGLOTM Bacterial Transformation Kit.)
Materiales y reactivos: 
· Kit Biotechnology Explorer para transformación bacteriana pGLOTM de BIORAD.Catálogo # 166-0003EDU 
· Caja Petri con Escherichia coli 
· 1 caja Petri con medio LB
· 2 cajas Petri con medio LB/amp
· 1 caja Petri con medio LB/amp/ara
· Solución de transformación
· Caldo LB
· Asa bacteriológica
· 5 pipetas
· Gradilla de foam
· Recipiente con hielo frappé
· Frasco con el plásmido hidratado
· Baño de agua con termómetro a 42 oC.
· Incubadora a 37 oC.
Metodología: 
Primera etapa
-Preparación de agar LB.
1. En un matraz de 1 L, agregar 500 mL de agua destilada y adicionarle el sobre con el medio de cultivo.
2. Mezclar y calentar a ebullición, hasta disolver el agar o utilizar el horno de microondas.
3. Mantener a 50 ◦C, hasta adicionarle el azúcar y el antibiótico.
-Preparación de arabinosa y ampicilina
Arabinosa
1. Con una pipeta estéril agregar 3 mL de solución transformante al frasco con el azúcar.
2. Tapar y mezclar (requiere de 10 min para disolverse).
Ampicilina
1. Con otra pipeta estéril, agregar 3 mL de solución transformante al frasco con el antibiótico.
2. Tapar y mezclar. 
-Etiquetado de placas
1. Marcar las cajas de la siguiente manera:
· 16 cajas con LB
· 16 cajas con LB/amp.
· 8 cajas con LB/amp/ara 
-Preparación y vaciado de cajas
1. Vaciar las 16 cajas marcadas con agar LB
2. Dejar solidificar las cajas.
3. Agregar toda la ampicilina hidratada al medio de cultivo restante y homogenizar.
4. Vaciar las 16 cajas marcadas con agar LB/amp.
5. Dejar solidificar las cajas.
6. Agregar la arabinosa al medio restante en el matraz y homogenizar.
7. Vaciar las 8 cajas marcadas con LB/amp/ara.
8. Dejar solidificar las cajas.
9. Todas las cajas ya solidificadas, sin invertir ni en bolsas de plástico, deben permanecer a temperatura ambiente durante dos días.
10. Invertir las cajas y guardarlas en bolsa de plástico en el refrigerador, hasta su uso.
Segunda Etapa
-Rehidratación de la bacteria (24 a 36 horas antes de la práctica)
1. Con una pipeta estéril, rehidratar la cepa liofilizada de Escherichia coli HB 101, adicionando 250 µL de la solución de transformación en el frasco.
2. Tapar y dejarlo a temperatura ambiente durante 5 min.
3. Mezclar.
4. Sembrar por estría cruzada, una placa de agar LB, para cada equipo de trabajo (máximo 8).
5. Incubar a 37 ◦C durante 24 a 36 horas.
Preparación del plásmido pGLO
1. Con pipeta estéril agregar 250 µL de solución transformante al frasco que contiene el plásmido.
2. Guardarlo en el refrigerador.
-Preparación de las soluciones de trabajo
1. Preparar un microtubo de color, con 1 mL de solución de transformación, para cada equipo de trabajo.
2. Marcarlos como ST y poner el número del equipo.
3. Preparar un microtubo de otro color, con 1 mL de caldo nutritivo LB, para cada equipo de trabajo.
4. Marcarlos como LB y poner el número del equipo.
5. Si se preparan un día antes de la práctica, conservar en refrigeración.
Tercera Etapa
-Transformación Bacteriana.
· Marcar 2 microtubos, uno como ADN+ y el otro como ADN-. Anotar el número del equipo.
· Colocarlos en la gradilla de foam. 
· Con pipeta estéril, adicionar a cada tubo 250 µL de solución de transformación.
· Colocar la gradilla con los tubos en el hielo.
· De la placasembrada con la bacteria, seleccionar una colonia aislada y con el asa resuspenderla mediante movimiento rotatorio de la misma, en el tubo marcado cmo ADN+, hasta quedar completamente homogéneo.
· Colocar el tubo en la gradilla.
· Esterilizar el asa.
· Repetir los pasos 5, 6 y 7 con el tubo ADN-.
· Examinar el frasco que contiene al plásmido, con una lámpara de luz ultra violeta.
· Tomar una asada y mezclarlo en el tubo marcado como ADN+.
· Tapar el tubo y regresarlo a la gradilla que está en el hielo.
· NO AGREGAR PLASMIDO AL TUBO MARCADO COMO ADN-.
· Incubar los tubos en hielo por 10 minutos. Asegurarse que estén sumergidos en el hielo.
· Choque térmico. Transferir la gradilla con los tubos de hielo a un baño a 42°C por exactamente 50 segundos.
· Asegurarse que los tubos estén sumergidos en el agua caliente.
· Rápidamente regresar la gradilla con los tubos al hielo, incubar por 2 minutos. 
· Sacar la gradilla del hielo y colocarla en su mesa de trabajo.
· Con pipetas estériles diferentes, agregar 250 µL de caldo LB a cada tubo (ADN+ y ADN-).
· Incubar a temperatura ambiente durante 10 min.
· Mezclar los tubos por inversión.
· Con pipeta estéril nueva, tomar 100 µL de la suspensión transformada (ADN+) y colocarlos en la caja marcada como LB/amp ADN+ y otros 100 µL en la caja LB/amp/ara ADN+.
· Con otra pipeta estéril, inocular con 100 µL de la suspensión control (ADN-), las cajas marcadas como LB/amp ADN- y LB ADN-. 
· Con un asa estéril, distribuir masivamente el inóculo en la superficie de las cajas.
· Incubar los medios a 37 ◦C por 24 horas.
· Observar resultados y hacer las anotaciones correspondientes.
Resultados: 
Al pasar las 24 horas de incubación se obtuvieron los siguientes resultados: 
	PLACA
	OBSERVACIÓN 
	LB/amp ADN+
	Existe crecimiento en el medio de algunas colonias, no existe presencia de fluorescencia. 
	LB/amp/ara ADN+
	Se desarrollo el crecimiento de dos colonias, ambas presentan la transformación, se puede observar la fluorescencia que emiten bajo la luz U.V. 
	LB/amp ADN-
	Las colonias de E. coli se desarrollaron masivamente, aunque no presentan fluorescencia ya que no contenían el plásmido de transformación 
	LB/amp/ara ADN-
	No se presento crecimiento alguno o en el medio, lo cual era un resultado que se esperaba obtener. 
Análisis de resultados: 
La transformación bacteriana de la cepa E. coli se llevó a cabo mediante la inserción del plásmido pGLO que contiene un gen que codifica para la producción de la enzima beta-lactamasa que le confiere resistencia a la ampicilina en las bacterias.
La mayoría de estos resultados se vieron afectados por el hecho de que no se pudo trabajar con el medio a tiempo, en algunos como la caja que contenía la LB/amp/ara ADN+ se pudo haber desarrollado mucho más él crecimiento de las colonias y observar una mayor fluorescencia. Aun así estas bacterias tomaron las características del plásmido y las expresaron eficazmente, ya que mostraron resistencia a la ampicilina gracias a la producción de la enzima betalactamasa y en el plato de cultivo que contenía arabinosa, las bacterias brillaron verde fluorescente bajo la luz ultravioleta debido a la activación de esta característica en presencia del azúcar.
Conclusión: 
	La transformación genética bacteriana se realizó a través de la transferencia de un plásmido a la bacteria E. Coli, para que está adquiriera resistencia a la ampicilina. El proceso fue confirmado satisfactoriamente. El método que se utilizó para transformar genéticamente las bacterias es relativamente sencillo, obteniéndose resultados comprobables sin necesidad de procesos sofisticados. 
Cuestionario: 
1. Mencione cuales características transfiere el plásmido pGLO a las bacterias transformadas.
El plásmido pGLO, contiene un gen que codifica para una proteína que le confiere resistencia al antibiótico ampicilina (beta-lactamasa) y un sistema especial de regulación genética que puede ser usado para el control de la expresión de la proteína verde fluorescente (GFP) en células transformadas
Los plásmidos son estructuras que contienen el ADN de una bacteria, e información genética auxiliar para desarrollar funciones no esenciales, sin embargo, son de mucha ayuda para las bacterias, ya que confieren particularidades fenotípicas que son benéficas para la bacteria, como la resistencia y la virulencia
2. Explique cuál es la importancia de realizar un choque térmico a la bacteria.
Para inducir la apertura de poros en la membrana de la bacteria haciéndola permeable.
3. Diga para que sirve la caja marcada como LB ADN-.
4. Explique qué función tiene la ampicilina en el medio de cultivo.
Los plásmidos que se usan en la clonación contienen un gen de resistencia a antibióticos. Por lo tanto, todas las bacterias van a recolectar plásmido.
5. Explique qué función tiene la arabinosa adicionada al medio de cultivo.
La arabinosa se emplea como fuente de carbono en cultivos bacterianos. Facilita la expresión de la GFP (Proteína Verde Fluorescente).
6. Mencione 2 ejemplos de microorganismos transformados y su aplicación.
Streptococcus pneumoniaen y E. coli
Bibliografía: 
A., V. (2017). Regulación de la expresión genética de las proteínas verde fluorescente y betalactamasa a través de la inserción del plásmido pGLO en la bacteria E. coli . 
Khan Academy. (s.f.). Khan Academy. Recuperado el Noviembre de 2019, de https://es.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-cloning-tutorial/a/bacterial-transformation-selection
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