Lab Bioquimica i nforme 2Protocolo optimo

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Universidad Industrial de Santander Laboratorio de Bioquímica, código 24726 
 
Copyright 2020 © Universidad Industrial de Santander, Escuela de Química Junio [2020] |1 
Práctica No 2. Protocolo optimizado para la extracción de 
proteínas de la válvula mitral humana. 
 
Julio Cesar Grande Verdugo, 2142687. 
Silvia Juliana Merchán Gómez, 2152507. 
 
Fecha de la elaboración de la práctica: 2020-06-09. 
Fecha de presentación del informe: 2020-06-12 
Resumen 
El conjunto total de proteínas expresadas y modificadas por una célula, tejido u órgano a una condición dada se le considera proteoma. 
Muchos de los estudios diagnósticos, pronósticos clínicos y la relación de enfermedades se hacen mediante la identificación, caracterización 
y cuantificación de los tejidos afectados por los patógenos presentes donde la enfermedad puede ejercer su mecanismo de 
acción/reproducción. Un claro ejemplo de esto se encuentra en el protocolo dispuesto para la válvula mitral, donde mediante técnicas de 
extracción concretas y técnicas analíticas de gran relevancia como la cromatografía acoplada a masas se pudo identificar cerca de 422 
proteínas, así como su localización subcelular siendo estas sujetas a estudios posteriores para el manejo clínico de enfermedades 
cardiovasculares. Sin embargo, en dicho protocolo se encontraron 4 proteínas que no había sido vistas anteriormente lo cual abro un 
apartado para nuevos posibles patógenos no identificados aún. 
 
1. INTRODUCCIÓN 
La válvula mitral es una de las cuatro válvulas del corazón, esta 
separa la aurícula izquierda del ventrículo izquierdo, Su principal 
función es abrirse de tal manera que la sangre dispuesta en la 
aurícula izquierda fluya al ventrículo izquierdo. Luego la válvula 
mitral se cierra para evitar que esta se devuelva y pueda continuar 
su recorrido hacia la aorta1. Actualmente, se ha estudiado que el 
análisis del proteoma celular de dicha válvula proporciona 
información que ayuda a explicar los mecanismos asociados a las 
enfermedades y objetivos terapéuticos, sin embargo, la 
composición proteica sigue siendo parcialmente desconocida dado 
que esta zona posee baja celularidad, provocando biosíntesis baja 
en proteínas. Esta práctica describe un protocolo optimizado para 
la extracción de proteínas de la válvula y aunque representa un 
desafío tecnológico, actualmente se ofrecen herramientas 
proteómicas que permiten realizar el análisis a gran escala y alto 
rendimiento para la identificación, cuantificación y validación de 
niveles alterados de proteína; uno de los métodos más usados en 
este campo es la cromatografía de afinidad y de exclusión, sumado 
a estos métodos la espectrometría de masas hace un gran aporte 
dado que es usada para lograr una eficiente identificación y 
caracterización de las proteínas aisladas. 
Este estudio a grandes rasgos puede ayudar dilucidar los procesos 
patológicos subyacentes, lo que puede posteriormente ayudar a 
mejorar el manejo de las enfermedades vasculares2. 
2. METODOLOGÍA 
Para realizar este protocolo primeramente se tomó una muestra de 
corazón humano otorgado por el centro cardiológico de Monzino 
(Milán, Italia), seguido de dos pasos: preparación de la muestra y 
extracción de proteínas. 
 
a. Preparación de la muestra de la válvula 
mitral humana. 
 Primeramente, se inició con el debido protocolo para la extracción 
y conservación del corazón humano, seguidamente en una cabina 
previamente esterilizada se cortó el corazón completamente para 
buscar la ubicación exacta de la válvula para luego separarla, 
lavarla con solución salina y posteriormente envolverla en papel 
aluminio llevándola a congelación con nitrógeno líquido. 
 
b. Extracción de proteínas. 
Una vez recogida la muestra se llevó inmediatamente a hielo seco, 
aun envuelta en papel aluminio, verificando cuidadosamente que 
esta no se descongele durante las transferencias, para esto se dejó 
enfriar tanto el mortero como las espátulas; seguidamente se 
procedió a moler la muestra para luego transferirla a un tubo de 
centrifuga. Al terminar la centrifugación se adiciono 200.0 µL 
buffer de urea sobre 100 mg de muestra. Después, se procedió a 
homogenizar la muestra con un agitador magnético y un mortero 
de vidrio, recuperando el sobrenadante de la solución y tratando la 
muestra restante nuevamente con urea. Finalmente se centrifugo el 
sobrenadante para luego medir la concentración de proteínas 
usando el ensayo de Bradford2. 
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
Inicialmente se debe discutir la eficacia de este protocolo, 
contextualizando un poco acerca del tema que abarca la mayor 
parte de esta investigación, la proteómica. 
 
En proteómica se puede caracterizar la expresión de las proteínas 
codificadas con un genoma y establecer sus propiedades 
funcionales y estructurales, también, es la encargada de fijar la 
secuencia de muchos genomas, estos definen la información de los 
organismos y por tanto la tipología de estos, uno de los tópicos más 
importantes de la proteómica es su funcionalidad para determinar 
 
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la localización celular, interacciones proteína-proteína, 
determinación de la estructura terciaria, en alto grado alcanzado 
por cristalografía, la relación entre estructura y función y 
modificaciones postraduccionales3. En esta investigación se 
realizaron todos los procedimientos pertinentes para la eficaz 
obtención de proteínas de la válvula mitral, contando con un 
sistema efectivo de molienda para la muestra, debido que estas 
muestras son difíciles de recuperar si muelen en un mortero 
convencional; también hay que evidenciar la importancia del uso 
del nitrógeno líquido para congelar dicha muestra debido a que este 
evita la degradación biología y permite a su vez una muestra 
pulverizada eficientemente. Un paso determinante para la eficacia 
es la preparación del tampón de extracción, este se debe disponer 
con las concentraciones exactas de urea y tiourea para obtener el 
resultado adecuado realizando así eficazmente su función de 
solubilizar las proteínas escasamente solubles, también, es 
totalmente compatible con el ensayo de Bradford para determinar 
la concentración de la proteína2. 
Los resultados obtenidos en esta investigación resultan ser 
favorables gracias al proceso basado en métodos de espectrometría 
de masas libres de gel, es decir cromatografía liquida acoplada al 
análisis de espectrometría de masas. La aplicación de este 
protocolo para la extracción de proteínas de las válvulas mitrales 
humanas permitió la identificación de 422 proteínas. 
Específicamente 169 proteínas fueron identificadas por 2-DE, 330 
proteínas por fase líquida IEF, 96 proteínas por LC / MS E, y 148 
proteínas Por 2D-LC / MS E. 
 
La clasificación de estas proteínas se llevó a cabo por medio de un 
software para el análisis de ontología genética (GO), este mostro 
que adicional a las proteínas esperadas en la región extracelular, la 
mayoría de las proteínas que se encontraban pertenecían a la región 
intracelular. Estos resultados fueron confirmados en tres muestras 
independientes de válvula mitral. Ahora, podemos realizar un 
análisis de las proteínas identificadas en términos de distribución 
celular (figura 1), donde podemos observar que el tamaño del 
circulo es proporcional al número de componentes de proteínas 
asociadas con los términos de GO seleccionados, y se informa de 
la escala de color para el valor de p de sobrerrepresentación. 
 
Figura 1. Análisis de las proteínas de la válvula mitral 
identificadas en términos de distribución celular 
 
FUENTE: Banfi, C., Guarino, A., Brioschi, M., Ghilardi, S., 
Mastrullo, V., Tremoli, E., Polvani, G. Optimized Protocol for 
the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve. J. Vis. 
Exp. (124), e55762, doi:10.3791/55762(2017). 
Seguidamente, el análisis de inmunotransferencia se realizó 
usando anticuerpo monoclonal de ratón contra anticuerpo 
policlonales CryAB y conejo contra los anticuerpos septin-11, 
FHL-1 y dermatopontina arrojando como resultado 3 muestras 
independientes al tejido de la válvula mitral las cuales no fueron 
identificados4, (figura 2). 
 
Figura 2. Análisis de inmunotransferencia de septin11, FHL-1, 
dermatopontin y CryAB en extracto completo de tres mitrales 
normales de válvula humanos. 
FUENTE: Banfi, C., Guarino, A., Brioschi, M., Ghilardi, S., 
Mastrullo, V., Tremoli, E., Polvani, G. Optimized Protocol for 
the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve. J. Vis. 
Exp. (124), e55762, doi:10.3791/55762 (2017). 
 
A pesar de que el protocolo haya arrojado un resultado satisfactorio 
cabe resaltar que el tampón usado no es el ideal para la 
solubilización de la muestra ya que ciertas proteínas no pueden 
completar el proceso. En diferentes tampones de extracción se 
podrían revelar proteínas indectables ya sea por su carácter acido 
o por interferencia de sales en su fase liquida. 
 
Observaciones 
Previamente para ejecutar el protocolo el órgano en cuestión debe 
pasar por un proceso previo en el cual se analiza de manera 
detallada las razones tanto técnicas como funcionales por las cuales 
son excluidos de un posible trasplante, una vez aceptado se debe 
tener el consentimiento y autorización de los familiares del 
paciente de manera escritas en la cual se expone propósito del uso 
que en este caso será clínico con fines investigativos dada las 
razones previas. 
 
4. CONCLUSIONES 
Mediante el protocolo de extracción se pudo obtener de manera 
completa la caracterización e identificación de los componentes 
proteicos del tejido en cuestión, la cantidad de muestra de estas 
proteínas fueron suficientes para el propósito siendo 50 µg /1 mg 
de tejido. No obstante, se debe mencionar que, aunque apto es una 
gran limitación dado su porcentaje extracción relativamente bajo, 
esto se puede incrementar mediante el uso de instrumentos más 
modernos, así como protocolos más eficientes. A su vez se aprecia 
el uso de la cromatografía acoplada a la espectrometría de masas y 
 
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otras herramientas analíticas como herramienta clave para el 
proceso de reconocimiento, ayudando a dilucidar los mecanismos 
de los procesos fisiológicos y patológicos en las enfermedades 
relacionadas a la válvula mitral. 
 
5. BIBLIOGRAFÍA 
Escriba la bibliografía siguiendo el siguiente formato: 
 
1. P. (2018, 26 junio). Válvula mitral: ¿cuál es su función 
y sus principales fallas? Recuperado de 
https://cirugiacardiovascular.co/valvula-mitral/ 
2. Banfi, C., Guarino, A., Brioschi, M., Ghilardi, S., 
Mastrullo, V., Tremoli, E., Polvani, G. Optimized 
Protocol for the Extraction of Proteins from the Human 
Mitral Valve. J. Vis. Exp. (124) (2017). 
3. Mojica Ph.D, T., Sánchez, O., & Bobadilla, L. (2015). 
La Proteómica, otra cara de la genómica. Nova, 1(1), 13-
16. 
4. Banfi, C., Guarino, A., Brioschi, M., Ghilardi, S., 
Mastrullo, V., Tremoli, E., & Polvani, G. (2017). 
Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from 
the Human Mitral Valve. Journal of Visualized 
Experiments, (124), 1-15. https://doi.org/10.3791/55762 
https://cirugiacardiovascular.co/valvula-mitral/