Biologia_reproductiva_y_citogenetica_de

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Manual Técnico 
 
 
 
Biología reproductiva y citogenética 
de la papa 
 
 
 
 
 
 
Matilde Orrillo & Merideth Bonierbale 
 
 
 
 
Abril 2009 
 
 
 
 
Red LatinPapa Centro Internacional de la Papa (CIP) 
 
 ii
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Biología reproductiva y citogenética de la papa – Manual Técnico 
Matilde Orrillo & Merideth Bonierbale 
Centro Internacional de la Papa (CIP) 2009 
 
 iii
Tabla de Contenidos 
 
 
Prólogo iv 
Agradecimientos v 
Introducción vi 
 
1 Biología reproductiva de la papa 1 
1.1 El ciclo de vida en papa 1 
1.1.1 Ciclo de vida asexual 1 
1.1.2 Ciclo de vida sexual 1 
 
2 Mitosis (División nuclear somática) 3 
2.1 Determinación de ploidía en células somáticas 4 
2.1.1 Método de preparación de cromosomas en raíces de papa 4 
2.1.2 Conteo del número de cloroplastos en las células guarda 6 
2.1.3 Determinación de ploidía por Citometría de flujo 7 
 
3 Meiosis 9 
3.1 Meiosis I 9 
3.2 Meiosis II 11 
3.3 Observación de meiosis en células sexuales 12 
3.4 Gametos 2n 13 
 
4 Observación de polen y determinación de su fertilidad 14 
4.1 Cultivo de polen in Vitro 14 
4.2 Crecimiento del tubo polínico in vivo (en el pistilo) 17 
 
5 Cultivo in vitro de embriones inmaduros 19 
 
Literatura consultada 21 
 
 
 iv
Prólogo 
 
 
La citogenética surge de la necesidad de relacionar los hechos descritos por la genética 
con los fenómenos que ocurren dentro de la célula u órganos especializados. Ella ha 
permitido conocer la estructura y función de cada uno de los componentes de la célula, y de 
estructuras más especializadas, en relación con funciones como la reproducción sexual. 
 
La citogenética clásica y molecular ha hecho posible el análisis, interpretación y 
trascendencia de ciertas características, desde las más simples a las más complejas 
(cromosomas y genes, cromosomas condensados y linearizados), contribuyendo en gran 
medida a la resolución de problemas en aspectos taxonómicos, evolutivos y aplicativos. 
Asimismo, los estudios citogenéticos permiten realizar valiosos aportes al conocimiento de 
los mecanismos de aislamiento reproductivo y modos de especiación en las plantas. 
 
También permite la observación de los caracteres citológicos de células especializadas, su 
función y comportamiento ante cambios del entorno, o la serie de procesos que se suceden 
durante la fertilización, aportan conocimiento a la ciencia básica. 
 
En los programas de mejoramiento la citogenética ayuda dilucidar ciertos fenómenos 
genéticos, como: el apareamiento y entrecruzamiento entre los cromosomas homólogos, la 
relación entre el polen y pistilo (fertilización-fecundación) e identificación de 
incompatibilidades, irregularidades meióticas en híbridos, producción de gametos 2n y su 
relación con la formación de poliploides, etc. 
 
El presente manual servirá como guía de capacitación de investigadores, profesores, 
estudiantes y técnicos. El documento busca llevar a la práctica diversas técnicas clásicas y 
básicas, que faciliten la observación e interpretación de parámetros y resultados genéticos, 
ayudando a proyectar convenientemente un plan de mejoramiento, así como también en 
determinados estudios a nivel molecular. 
 
Los ejemplos y las ilustraciones han sido tomados de la papa, la cual, a pesar de contar con 
cromosomas pequeños, hace posible evidenciar ciertos fenómenos al nivel citológico y 
estos a su vez relacionarlos con la constitución y el comportamiento genético. 
 
Además, se da los conceptos teóricos en cada uno de los temas tratados, pudiendo estas 
técnicas ser aplicadas en otros cultivos. 
 
 
Los autores 
 v
Agradecimientos 
 
 
La publicación del presente Manual es gracias al soporte financiero de: 
 • Red Iberoamericana de Innovación en Mejoramiento y Diseminación de la Papa - 
Red LatinPapa 
• INIA España 
• FONTAGRO 
• Federal Ministry for Economic Cooperation and Development (BMZ) 
• Centro Internacional de la Papa (CIP) 
 vi
Introducción 
 
 
El número básico de cromosomas en el género Solanum es doce (× =12). En las papas 
silvestres y cultivadas existen diferentes números de ploidía, pueden ser 2n=2×=24, 
2n=3×=36, 2n=4×=48, 2n=5×=60, 2n=6×=72. El más importante y de gran significación en la 
evolución de las especies de la papa es el nivel tetraploide, que cubre un amplio rango de 
distribución desde la parte meridional de EE.UU. a la región austral y sur de Chile. El nivel 
de ploidía se determina contando el número de cromosomas en las células somáticas y/o 
células sexuales. Otro método rápido y directo es por citometría de flujo que cuantifica la 
cantidad de de ADN nuclear, sin embargo necesita de un aparato llamado citómetro de 
flujo. 
 
El análisis citogenético ha sido ampliamente usado en estudios de genética, 
comportamiento de los cromosomas, compatibilidad cromosómica, evolución, filogenia, 
origen y taxonomía, así como también para determinar la viabilidad del polen evaluando su 
fertilidad tanto in vitro como in vivo (germinación in situ); determinar la presencia de 
gametos no reducidos, el mecanismo por los cuales se producen etc., estudios que nos 
permitirán estimar el potencial de las especies o híbridos para propósitos de mejoramiento 
permitiéndonos desarrollar las estrategias a seguir en la transferencia de resistencias a 
enfermedades, plagas, etc., a través de la manipulación de ploidía. 
 
Y es a través de la biología reproductiva ya sea asexual o sexual por la cual las plantas 
producen nuevos individuos, así: 
 
Microsporogénesis, megasporogénesis, barreras de pre y post fertilización, mutantes 
meióticos, polinización, embriogénesis, desarrollo del endospermo, etc., están involucrados 
en todo el proceso de vida, y su entendimiento nos provee de una guía para la selección de 
las hibridizaciones que serían exitosas tanto artificialmente como en la naturaleza, 
proporcionando las llaves para una eficiente y efectiva manipulación del material del 
germoplasma silvestre, cultivado y avanzado de papa. Alguno de los más importantes tipos 
de información necesitada por un mejorador incluye los principios de genética y 
citogenética. 
 
Nuevas técnicas citológicas moleculares como FISH, GISH, DNA fibers, abren actualmente 
un abanico de oportunidades, sirviendo como intermediario entre mapas físicos y mapas 
genéticos, mostrando posiciones aproximadas de genes y marcadores moleculares, en sus 
distancias relativas a marcadores estructurales como centrómeros, telómeros, bandas de 
heterocromatina y constricciones secundarias. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 1
Capítulo 1. Biología reproductiva de la papa 
 
1.1 El ciclo de vida en papa 
 
Hay una generación diploide, que consiste en una serie de divisiones mitóticas, seguido por 
meiosis. Continúa con una serie de divisiones haploides, seguido de la fusión de dos 
núcleos haploides (gametos), para dar un diploide. Es convencional llamar a la fase 
haploide gametofito y la diploide esporofito. 
 
 
1.1.1 Ciclo de vida asexual 
 
Reproducción vegetativa de la papa: Asegura la conservación clonal del genotipo, una 
nueva planta se forma a partir de tubérculos, brotes o yemas dando lugar a clones 
genéticamente idénticos a la planta original, reproducción que se realiza por mitosis. La 
propagación asexual ha sido una gran ventaja para los mejoradores de papa puesto que se 
puede fácilmente obtener un genotipo seleccionado y multiplicarlo. Otro uso práctico de la 
propagación asexual es el cultivo de tejidos y el cultivo de meristemas para la erradicación 
de algunos patógenos. 
 
 
1.1.2 Ciclo de vida sexual 
 
Reproducción sexual de la papa: Permite que el material genético de dos individuos se 
combinen y se formen nuevas combinaciones alélicas, requiere de la participación de 
órganos reproductivos femeninos (pistilos) y masculinos (anteras) y por elproceso de 
polinización se formen bayas con semillas y cada una de estas constituye un nuevo 
individuo. 
 
Morfología floral: las flores se encuentran reunidas en agregados llamados inflorescencias, 
sosteniendo a la inflorescencia se encuentra el pedúnculo, y lo que sostiene a cada flor es 
el pedicelo, que está dividido en pedicelo inferior y superior. 
 
Una flor contiene 2 juegos de envolturas florales: el cáliz y la corola los que forman el 
receptáculo floral ubicado debajo de las partes fértiles de la flor y compuesto por los 
estambres y el pistilo. El estambre consiste de un corto filamento que sostiene a la antera 
con dos lóbulos que contiene el polen, los cinco estambres se encuentran separados de la 
corola. El pistilo está diferenciado en ovario, en la parte baja lleva los óvulos, el estigma es 
el que recibe el polen y el estilo es el que conecta a ambos. Cada óvulo contiene una célula 
madre llamada megaspora, la cual está rodeada de un tejido llamado nucela y de un 
integumento, cuando es fertilizado y maduro el óvulo desarrolla en una semilla. 
 
Esta fase comprende dos aspectos: Meiosis y fertilización. 
 
El más importante acontecimiento de la reproducción sexual es la creación de variación 
genética, nuevos genotipos con atributos genéticos de ambos padres pueden estar 
combinados en las semillas formadas. De dos eventos en la meiosis como es el “crossing 
over” en la Profase I y la separación al azar de bivalentes en Metafase I, podemos decir que 
cada producto es un único genotipo. El uso práctico de la reproducción sexual es lo que 
constituye una de las formas para la conservación de germoplasma, especialmente 
silvestre, otro uso es para la producción de semilla verdadera de papa. 
 
 2
• Megasporogénesis. Este proceso tiene lugar en el tejido del ovario (contiene de 
300 a 600 óvulos) y en las células madre de las megasporas, dando lugar a células 
reproductoras llamadas sacos embrionarios, que contienen al gameto femenino u 
ovocélula. Una célula materna, megaspora, mediante la I y II división meiótica forma 
4 megasporas, las 3 superiores degeneran y la inferior se convierte en megaspora 
funcional, esta dará origen al saco embrionario, que se agranda por 
megagametogenesis ocurriendo tres divisiones mitóticas, sin citocinesis que darán 
origen a 8 núcleos que al orientarse forman el saco embrionario. Uno de los 3 
núcleos del extremo micropilar del saco embrionario se trasforma en huevo 
funcional. Hay varias alternativas en la formación del saco embrionario, la descrita 
ocurre en la mayoría de las Angiospermas. 
 • Microsporogénesis. Este proceso tiene lugar en el tejido esporágeno de las 
anteras, los núcleos de células madres del polen son muy largas justo antes de la 
meiosis y en la formación de las tétradas de las microsporas la pared de callosa 
alrededor de cada célula madre del polen puede ser detectada durante la iniciación 
de la meiosis y en cada nueva microspora joven de la tétrada, la que es también 
separada por una capa de callosa después de la II división meiótica, tan pronto 
como la formación de la pared externa del polen empiece a formarse, la callosa 
empieza a desaparecer. Las capas meristemáticas que dan origen a las diferentes 
estructuras u órganos en las plantas, son denominadas L1 que dan lugar a la 
epidermis (cloroplasto), L2 que forman las hojas, tallos y flor (órganos sexuales) y la 
L3 que generan los tejidos internos del tallo. 
 
 
 
 3
Capítulo 2. Mitosis (División nuclear somática) 
 
 
Este proceso ocurre en las células conocidas como meristemas (raíces, hojas, flores) y 
meristemas axilares, estas estructuras tienen la capacidad de dividirse a lo largo de todo el 
ciclo de vida del organismo. 
 
Es un proceso continuo, en el cual se suceden en una secuencia cuidadosamente 
ordenada los complejos preparativos para la división, por la cual se hace un reparto 
equitativo del material genético ya duplicado entre las dos células resultantes, manteniendo 
así la ploidía original de la célula. Implica que cada cromátida pueda migrar a un diferente 
polo, separación que es posible mediante el huso mitótico o acromático, estas fibras están 
formadas de microtúbulos y sus proteínas asociadas por un proceso de polimerización, que 
se asocian a las cromátides permitiendo que cada una migren hacia los polos una vez que 
ambas se separan a nivel centromérico. 
 
Esta polimerización puede ser inhibida experimentalmente y muchos tratamientos con 
sustancias como la colchicina, 8-hidroxiquinoleína, Tjio y Levan (1950), para-
diclorobenceno, piretroides (Klein, 1990, Watanabe y Orrillo 1993, Chen, 2005) y 
tratamiento por frío pueden efectivamente acumular células en metafase y cromosomas 
condensados durante la mitosis. La mitosis comprende una división nuclear y somática 
(citocinesis) lo que permite que los organelos pasen más o menos al azar a una u otra de 
las dos células. 
 
El más importante carácter de la mitosis es que el número cromosómico permanece 
constante a través de sucesivas divisiones celulares, con una exacta distribución de 
cromosomas en las nuevas células formadas, genéticamente idénticas entre sí, 
manteniéndose la ploidía original de la célula. 
 
Convencionalmente la mitosis se divide en cuatro etapas: Profase, metafase, anafase y 
telofase. 
 • Interfase. Es el periodo entre las sucesivas divisiones donde los cromosomas son 
prácticamente invisibles aún con la ayuda del microscopio, durante esta fase antes 
que la célula se divida tiene lugar la replicación, que es la síntesis del ADN y 
formación de las fibras que conforman el uso mitótico o “spindle” bipolar. Este 
periodo pertenece a las etapas G1, S, G2. El genoma completo se replica una y solo 
una vez en cada ciclo. 
 • Profase. En esta etapa se aprecia la aparición nítida de los cromosomas en el 
núcleo, ya están suficientemente condensados y son visibles bajo el microscopio 
óptico. Se ve, que cada cromosoma consiste en dos copias longitudinales, llamadas 
las cromátidas hermanas, se observan claramente unidas por los centrómeros, el 
nucléolo pierde visibilidad, la membrana nuclear desaparece, el huso acromático va 
tomando cuerpo y muchas fibras cortas lo forman, las fibras polares, que llegan 
desde cada polo del huso a la región central hasta la mitad y las fibras cinetocóricas 
que se insertan en los cromosomas duplicados. Como vemos, estos dos grupos de 
fibras posibilitan la separación de las cromátidas hermanas durante la mitosis, los 
cromosomas inician un proceso de acortamiento y engrosamiento. Al final de la 
profase, los cromosomas están completamente condensados y con la desaparición 
de la envoltura nuclear, quedan en contacto con el citoplasma. 
 
 4
• Metafase. En esta etapa, los pares de cromátidas, se acortan y se alinean en un 
solo plano alrededor del centro de la célula, se observan más gruesas. 
 • Anafase. En esta etapa se duplican y separan los centrómeros y las cromátidas 
hermanas se liberan, se repelen y son engarzadas por las fibras del huso que hacen 
tracción sobre ellas, dirigiéndose a los polos, convirtiéndose cada cromátida en un 
nuevo cromosoma. A medida que continúa la anafase, los dos conjuntos idénticos 
de cromosomas se mueven hacia los polos opuestos del huso. 
 • Telofase. Al iniciarse esta etapa se nota la futura región nuclear y aparece la 
membrana nuclear, los cromosomas pierden su estado de condensación y se 
alargan. Comienza la formación del nucléolo. Se produce simultáneamente la 
citocinesis, o sea la segmentación y separación del citoplasma, se termina de formar 
la placa celular, la nueva pared celular entre las células recién formadas. 
 
 
2.1 Determinación de ploidía en células somáticas 
 
Ploidía es un término referido al número de grupos o “juegos” de cromosomas que una 
célula posee. 
 
 
2.1.1 Método de preparación de cromosomas en raíces de papa 
 
Para una correcta determinación del número de cromosomas es necesario contar con 
técnicas citológicas que den buenos resultados,con un número aceptable de metafases 
contables, con cromosomas bien separados y coloreados, por lo que las muestras deberán 
ser colectadas en estado de metafase. Para la acumulación de cromosomas metafásicos 
varios pre-tratamientos químicos son usados y el mejor protocolo usado en nuestro 
laboratorio es descrito (Watanabe y Orrillo, 1993). No hay una técnica universal, cada 
laboratorio toma una o varias técnicas de acuerdo a las exigencias de cada cultivo. 
 
El conocer la ploidía de una especie es de gran ayuda en la determinación taxonómica y de 
gran importancia en los programas de mejoramiento. 
 
La papa no es una especie ideal para estudios citogenéticos. Los cromosomas somáticos 
de S. tuberosum miden de 1.0 a 3.5 μm (Dong et al., 2000), nuevas técnicas (FISH; GISH, 
Fiber FISH), estudios de cromosomas en estadío de Paquiteno, permiten hoy la 
identificación de los cromosomas y la caracterización del genoma de la papa. Figs. 1, 2 y 3. 
 
1. Materiales 
Sembrar en macetas pequeñas, con musgo bien fino, o vermiculita tubérculos bien 
brotados (también se pueden usar “esquejes” de plantas bien enraizadas, semillas 
germinadas, plantas de in vitro). La colección de raíces se realiza en plantas bien 
pequeñas de unos 5 -10 cm de altura. Unas horas antes de colectar es conveniente 
regar bien las plantas. La colección de las raíces se hace generalmente temprano, 
en la mañana alrededor de las 11 am. 
 
2. Pre-tratamiento 
Usando una pinza de punta bien fina se colecta puntas de raíces, aproximadamente 
de 10 mm y se coloca en frasquitos o “vials” conteniendo agua destilada a 
temperatura ambiente, después de 1 h pasar a una solución de (Permetrina: 
La composicion quimica que figura en el envase es la siguiente: (3-Fenoxifenil)metil 
 a
Método de preparación de cromosomas en raíces de papa 
 
Colección de raíces en:
(H2O destilada + 15uL Permetrina, pH
5-5.8)
Hidrólisis con HCl 1 N 
previamente precalentado
8-10 min a 600C
Eliminar la solución &
Adicionar H2O destilada
Eliminar la solución 
de pre-fijación
Colocar las raíces en Placa 
Petri
24 
horas
 
Fig. 1: Toma de la muestra de raíces de papa, prefijación e hidrólisis con HCl. 
 
 
 
Tinción con Lacto-Propiónico Orceína (15min 
aprox.)
Cortar 1-2mm de la punta de las 
raíces 
Presionar para extender el
tejido
Aplastado 
(Squash)
Lámina lista
 
 
Fig. 2: Coloración con lacto propiónico orceína, aplastado (squash). 
 b
 
Observar al 
microscopio
4X
2X 4X
 
 
Fig. 3: Observación de células en metafase de raíces de papa, ploidías 2× y 4×. 
 
 5
(±) cis-trans 3-(2,2-dicloroetenil) 2,2-dimetil carboxilato de cicloropropano 
(Permetrina),15 μl en agua helada a pH 5 a pH 5.8, por 24 horas a 4° C. Caso de no 
tener disponible la Permetrina, utilizar agua helada por 48 horas a 4° C, colocando 
las botellitas conteniendo las raíces en un termo con hielo. 
 
 
 
3. Fijación 
Es optativo, se puede obviar este paso si es que se desea ver las muestras 
inmediatamente, caso de querer guardar las muestras por más tiempo se fijaran en 
alcohol 96 % 3p: ácido acético 1p; y se deja a medio ambiente por 24 horas. 
 
Si se quiere guardar en fijador hacerlo en alcohol de 70% y en refrigeración a 4° C, 
prepare suficiente cantidad de solución fijadora, de tal manera de cubrir bien las 
raíces. Los fijadores se preparan al momento de ser usados. 
 
4. Hidrólisis 
Se colocan las muestras en HCl 1N a 60° C de temperatura, por 8 -10 minutos; el 
ácido se calentara previamente, transcurrido el tiempo de hidrólisis se procederá a 
quitar el ácido y a lavar con agua destilada. 
 
5. Coloración 
Con lacto-propiónico orceína u orceína-acética, se procede a colocar las raíces en 
pequeños contenedores o Petris conteniendo el colorante. 
 
6. Aplastado o squash 
Se colocan las raíces en un porta-objeto, usamos solamente 1-2 mm de la punta, 
con una gota del mismo colorante (también podemos usar ácido acético al 45 %), se 
coloca un cubre-objeto y asegurando uno de los extremos procedemos con una 
varilla de goma, o un borrador de un lápiz o la punta de él a presionar suavemente, o 
dando golpecitos repetidos, pero firmes, permitiendo la disociación del tejido. 
Colocar el porta-objeto entre papel de filtro y presionar fuerte con el dedo pulgar 
“squash”, pero tratando de evitar cualquier movimiento lateral del porta-objeto. 
 
7. Observación 
La muestra se coloca bajo microscopio óptico, inicialmente a 10 X, 20 X con el 
objetivo de seleccionar las mejores metafases y luego pasar a objetivos de 40 X y 
100X para el conteo de cromosomas, las células deben estar intactas, no 
superpuestas ni con artefactos que puedan distorsionar el conteo exacto de 
cromosomas. 
 
 
Preparación de Lacto-propiónico orceína: Disolver 1 g de orceína en una mezcla de 23 
ml de ácido láctico y 23 ml de ácido propiónico a temperatura ambiente, completar a 100 ml 
con agua destilada, agitar bien y filtrar (Haskell y Wills, 1968) NOTA: Para obtener buenos 
resultados es necesario tener muy buenas raíces, finas, no muy gruesas; las plantas deben 
estar en perfecto estado de desarrollo. 
 
 
Pre - tratamiento 
 
Propósito: Separación de los cromosomas, acortarlos, y la clarificación de los 
centrómeros a fin de hacerlos visibles para chequear el número básico. 
 
 6
Otro pre-tratamiento que da buenos resultados es con agua helada, en lugar del uso 
de Permetrina, se utiliza agua destilada helada por 48 horas a 4° C y colocando los 
frascos (vials) que contienen las raicillas en un termo en el cual se ha colocado 
cubitos de hielo con agua, el resto del procedimiento es igual. 
 
 
Otras técnicas utilizan: 
 
8-Hidroxiquinoleía, es insoluble en agua y éter. Soluble en alcohol, acetona, 
cloroformo y benceno. 
 
Preparación: 0.002M, solución en agua destilada. Pesar 0.29 g de 8-
Hidroxiquinoleína y disolver en 25 ml del solvente escogido (generalmente alcohol) y 
se agrega el agua destilada poco a poco, haciéndola deslizar muy lentamente por 
una bagueta o vara de vidrio, evitando la precipitación de solución, hasta completar 
1 l. Usar un frasco oscuro y guardar a medio ambiente. Tratamiento por un mínimo 
de 3 horas, lo óptimo sería 5 horas a 15 ° C. 
 
Colchicina , 0.05-0.5% W/V en agua destilada por 4-6 horas a 10-15° C en 
refrigeración. Es una técnica popular desafortunadamente bastante cara y con 
posibilidad de ser este producto carcinogénico. Para obtener raíces en mitosis se 
puede usar bajas concentraciones de colchicina en semillas en estado de 
germinación. 
 
Paradiclorobenceno, alpha-bromonaftaleno, son otros de los químicos usados. 
 
 
2.1.2 Conteo del número de cl oroplastos en las células guarda 
 
Aunque no es una técnica para determinar la exacta ploidía de un genotipo, cuancdo 
manejamos una gran cantidad de material nos permite discriminar el grupo diploide de los 
otros grupos. Por ejemplo cuando queremos seleccionar haploides (2n=2×=24). 
 
1. Toma de la muestra 
Colectar hojas o los folíolos terminales de una misma planta y colocarlos en una 
placa Petri con papel toalla o filtro humedecido con agua. 
 
2. Procedimiento 
Obtener con la ayuda de una pinza fina el tejido epidérmico del envés de la hoja, de 
la zona próxima a las nervaduras, e inmediatamente colocarlo sobre un porta-
objetos donde previamente se ha colocado una a dos gotas de solución de KI - I y 
luego volver a colocar muy suavemente encima de la muestra otras dos gotas de KI 
- I y cubrir suavemente con un cubre-objeto. 
 
3. Observación 
Examinar la preparación bajo el microscopio óptico, a un aumento de 10 X, 20 X ó 
40 X. El contaje de cloroplastos se realiza solo en una de las células guarda de los 
estomas. El número promedio de cloroplastos nos dará una indicación de nivel de 
ploidía, así para una ploidía 2x en papa, el promedio es de 5 - 8 cloroplastos por 
célula guarda, contajes mayores a 9 nos indica un nivel más alto de ploidía. Es 
aconsejable por lo menos obtener el promedio en 10 células guarda. Figs. 4 y 5.c
Conteo del número de cloroplastos en las células guarda 
 
Colecta de hojas, 
foliolos 
Obtención del tejido epidérmico 
del envés usando una pinza fina
Muestra lista para su 
cbservación
 
 
Fig. 4: Procedimiento para la obtención de muestras para el contaje de cloroplastos en 
células guarda de estomas. 
 
 
Posiblemente Genotipo 
Tetraploide
Genotipo Diploide
Contar los cloroplastos en 10 células guarda, de tamaño similar y 
solo una célula por estoma
núcleo
Cloroplasto
Célula 
guarda
Promedio del N °
de cloroplastos 
por célula guarda
7 - 8
9 - 11
12 -14
15 -16
Posible 
ploidía
2X
3X
4X
5X
Huamán, 1995
 
 
Fig. 5: Criterios de evaluación para el contaje del número de cloroplastos. 
 
 
 d
 
Determinación de ploidía por Citometría de flujo 
 
 
 
 
Fig. 6: Citómetro de Flujo (Ploidy Analyser) PARTEC I. 
 
 
 
 
Fig. 7: Materiales requeridos. 
 
 
 7
Es recomendable utilizarlo en la selección de diploides y no para ploidías más altas. 
Huaman (1995) asocia niveles de ploidía al número de cloroplastos por célula 
guarda en determinaciones hechas en papas cultivadas. 
 
Preparación de KI-I 
 
1. 1 g de KI 
 
2. 1 g de I 
 
3. Ambos reactivos disolver en 100 ml de Etanol al 70%, guardar en frasco oscuro. 
 
 
2.1.3 Determinación de ploidí a por Citometría de flujo 
 
La técnica de la citometría de flujo es, básicamente un método analítico que permite la 
medida de emisión de fluorescencia y dispersión de luz de muestras marcadas (núcleos) 
con sondas fluorescentes, que a medida que desfilan, de una en una y son arrastradas por 
un flujo portador del analizador de ploidía (Partec PA-II Ploidy Analyser), que fluye del punto 
de inyección al detector y finalmente a la botella de desecho, frente a un sistema de 
detección (lámpara de mercurio que emite luz ultravioleta de 488 nm de longitud de onda). 
La corriente de núcleos en suspensión pasa por una cámara de cuarzo (conducto de 10 µm 
que no permite el paso simultáneo de dos unidades), mientras es iluminada por la luz 
ultravioleta; produciéndose dos fenómenos simultáneos: Dispersión de luz y el fluorocromo 
DAPI fijado al ADN emite una fluorescencia proporcional a la cantidad de ADN en el núcleo, 
emisión de luz fluorescente que es reconocida y captada por un fotorreceptor. 
 
De esta forma, la citometría de flujo permite medir la cantidad de ADN existente en los 
núcleos de las células, es un método rápido y directo de establecer la ploidía de una planta. 
El citómetro de flujo debe ser previamente calibrado antes de iniciar el proceso de 
evaluación de ploidía. Fig. 6 . 
 
 
Calibración del aparato 
 
El sistema se calibra previamente situando el pico correspondiente a un contenido de ADN 
igual a 2C (diploide) sobre el valor 100 de la escala de abscisas, o en su defecto sobre el 
valor 50. El patrón se determina según el área relativa en porcentaje de los picos 
correspondientes a las distintas poblaciones celulares (2C, 4C, 5C, etc.). 
 
El GAIN, se utiliza para mejorar la ampliación y el alto voltaje del foto multiplicador, entre 0 
y 1000 V, según el aumento o reducción del Gain la relación eje de abscisas (eje x) y 
ploidía puede tener con valor = 50, 2C diploide, 75 igual a 3C (triploide) y 100 igual a 4C 
(tetraploide), mientras si se aumenta dicho GAIN, este puede tener la siguiente relación: 
100= 2C (diploide), 150=3C (triploide) y 200= 4C (tetraploide). 
 
Es importante también el uso de controles de conocida ploidía en cada cultivo a evaluar. 
 
 
Procedimiento 
 
1. Materiales 
Colectar folíolos jóvenes de la parte apical y colocarlos en placas Petri, y luego 
tomar apróximadamente unos 40-50 mg. Fig. 7. 
 8
 
2. Preparación 
La muestra a analizar se coloca en una placa Petri y se adiciona 0.5 ml del buffer de 
extracción (CyStain UV Ploidy) y se cortan los folíolos con una hoja de afeitar, 
seccionando muy finamente en pequeños cuadraditos. Una vez está disgregado el 
tejido, se le adiciona nuevamente 1.5 ml del buffer de extracción y se incuba por 5 
minutos a temperatura ambiente. Este buffer de extracción de núcleos, contiene el 
fluorocromo DAPI (4, 6 –diamino-2-phenilindole), que tiñe el ADN. 
 
Una vez resuspendida la mezcla se pasa a través de un filtro de nylon de 30 µm 
(Partec 50 µm, Cell TricsTM), lo cual permite separar los núcleos, que caen a un tubo 
receptor, el cual se coloca en el analizador. Figs. 8 y 9. 
 
3. Observación 
Los resultados de la muestra son cuantificados por el sistema electrónico, que se 
encarga de la cuantificación de los destellos de la fluorescencia y de la luz 
dispersada, bajo el control del ordenador, el cual almacena los datos de miles de 
células por cada muestra, y representa los resultados gráficamente. 
 
El sistema informático que lleva incorporado el citómetro convierte cada señal 
fluorescente en un resultado que es presentado en un histograma en una escala 
logarítmica. El gráfico resultante ordena los datos según el contenido nuclear de 
ADN en el eje de abscisas, y contabiliza el número de núcleos de cada tipo en el eje 
de ordenadas. Figs. 9 y 10. 
 
Todas las células que pertenecen a un solo pico tienen la misma cantidad de ADN 
medido, y este pico representa un nivel de ploidía. 
 
El ruido consiste en una pequeña señal indeseada y aparece en los canales bajos. 
Una razón para este ruido son los fragmentos resultantes de las células al momento 
de su preparación. 
 
La cuantificación del ADN nos permite conocer también la existencia de 
aneuploidías, donde los histogramas se desplazan levemente hacia uno u otro lado 
de la ploidía esperada. 
 
 
Interpretación del histograma 
 
El histograma resultante muestra el número de células por ml, que han sido contabilizadas 
(eje y), mientras que en el eje horizontal (eje x) indica el contenido nuclear de ADN, así 
todas las células que pertenecen a un solo pico tienen la misma cantidad de ADN y un pico 
representa un nivel de ploidía. Fig. 11. 
 
 
 
 
 e
Colectar aprox. 50mg 
hojas jóvenes apicales
Cortar solo los foliolos Colocarlos en 0.5 ml el 
buffer de extracción 
(Cystain UV ploidy)
Picar muy suavemente y 
de arriba hacia abajo
Adicionar 1.5ml de CyStain
UV ploidy e incubar por 5 
minutos
 
 
Fig. 8: Procedimiento utilizado en la preparación de muestras para su análisis en el 
Analizador de ploidía (Citómetro de Flujo). 
 
 
Citómetro de Flujo
Ploidy Analyzer (PA) Partec I
Filtrar la muestra en 
filtros de 30µm
(Partec Cell Trics 30)
Colocar la muestra en el 
Clitómetro de Flujo
 
 
Fig. 9: Filtración de la muestra y su colocación en el Citómetro de flujo para su lectura. 
 
 
 
 f
Histograma de la muestra
K.Soto
Se establece los parámetros para 
la lectura de la muestra
 
 
Fig. 10: Medición, procesamiento de los datos y representación de los resultados. 
 
 
 
2x 4x
< 4X
 
 
Fig. 11: Histogramas con los resultados para plodías 2×, 4× y <4×, encontradas en GON, 
ADG y en un híbrido somático respectivamente. 
 
 9
Capítulo 3. Meiosis 
 
 
Este término se deriva del griego meioum (reducir). Cada organismo tiene un número de 
cromosomas característico de su especie. 
 
Este proceso ocurre antes de la formación de las células reproductivas o esporas, en el 
cual el número diploide normal se reduce a un juego único o haploide (n) en cada gameto, 
el número haploide se designa como n y el número diploide como 2n. La meiosis es 
también precedida por una fase S, durante la cual ocurre la síntesis de ADN (algo de 
síntesis de ADN ocurre durante la primera profase de la meiosis). Antes de iniciarse la 
meiosis el material genético en el núcleo diploide ha sido replicado sólo una vez, cada 
cromosoma consiste de dos cromátidas hermanas idénticas. 
 
Consiste en dos divisiones nucleares sucesivas, ellas son distinguidas como meiosis I y 
meiosis II. 
 
La comprensión del proceso de la meiosis es fundamental para interpretar el proceso y 
función de la recombinación genética en la evolución cromosómica. 
 
Todo este procesoes dinámico, abarca atracción, apareamiento, intercambio y ulterior 
separación de los cromosomas homólogos paternos y maternos. 
 
Durante este proceso cada gameto lleva sólo un miembro de cada par de homólogos. 
 
En toda célula diploide, cada cromosoma proviene del gameto de uno de los progenitores y 
su pareja, del gameto del otro progenitor, estos pares de cromosomas se conocen como 
pares homólogos, los que se asemejan en tamaño, forma y en el tipo de información 
hereditaria que contienen. 
 
Además de mantener un número constante de cromosomas de generación en generación, 
es una fuente de nuevas combinaciones de material genético dentro de los mismos 
cromosomas. 
 
Cada división meiótica es formalmente dividida en profase, metafase, anafase y telofase. 
De esos el más complejo y largo es la profase I la cual está subdividida en: leptoteno, 
zygoteno, paquiteno y diacinesis. 
 
 
3.1 Meiosis I 
 
3.1.1 Profase I 
 
La cromatina se condensa y los cromosomas se hacen visibles con el microscopio óptico. 
Durante este proceso cada gameto lleva sólo un miembro de cada par de homólogos. 
 • Leptoteno : Los cromosomas aparecen como largos filamentos, y repartidos a lo 
largo se pueden observar los cromómeros como las cuentas de un rosario. No se 
pueden individualizar los cromosomas y la membrana nuclear está presente. • Zygoteno : Comienza el apareamiento de los cromosomas homólogos, a este 
proceso se le llama sinapsis, aquí se hace evidente la pareja de cromosomas 
homólogos, atraídos uno con otro. El apareamiento es muy preciso, punto por punto 
 10
a manera de un cierre de cremallera. Cada homólogo consta de dos cromátidas 
hermanas y el par de homólogos consta de cuatro cromátidas (tétrada) y a los pares 
asociados se les llama bivalentes. Es el complejo sinaptonémico de naturaleza 
proteica el que mantiene los cromosomas homólogos estrechamente unidos 
formando un bivalente, se cree que su existencia es necesaria para que se produzca 
el entrecruzamiento, la formación de quiasmas (del griego, Chiasma: punto de 
cruzamiento) y el evento de recombinación. • Paquiteno : Este estado evidencia la unión longitudinal de los homólogos y 
desdoblados cada uno en dos cromátidas. Las cromátidas de cada homólogo se 
llaman cromátidas hermanas. Dos cromátidas homólogas se rompen al mismo nivel 
y de inmediato se intercambian en este punto ambos segmentos, las otras dos 
quedan intactas. Esto es lo que se conoce como entrecruzamiento, la evidencia 
citológica visible son las llamados quiasmas. Una serie de intercambios de material 
genético ocurre entre cromátidas no hermanas u homologas. • Diploteno : Los cromosomas homólogos comienzan a repelerse entre sí, excepto en 
los puntos de intercambio o quiasmas. El nucléolo y la membrana nuclear 
desaparecen y el “crossing-over” se hace visible. La consecuencia es la formación 
de nuevas combinaciones de genes, con alteración de la información genética 
localizada en los cromosomas afectados. • Diacinesis : Las bivalentes se hallan más condensadas. Paulatinamente el proceso 
de terminación continua a medida que el número de quiasmas disminuye y empieza 
a aparecer el huso acromático, los bivalentes quedan unidos por sus centrómeros al 
huso, y la membrana nuclear desaparece y comienza a formarse el “spindle”. 
 
 
3.1.2 Metafase I 
 
Los bivalentes se sitúan a cada lado del plano ecuatorial. El huso (spindle) se ha formado 
completamente y cada homólogo tiene su centrómero. Por ello el cromosoma completo se 
dirige a uno de los polos. Los cromosomas aparecen más condensados. 
 
 
3.1.3 Anafase I 
 
Los cromosomas homólogos se han separado y migran hacia los polos respectivos u 
opuestos de la célula por acción de los microtúbulos del huso acromático, sin embargo 
debido a los entrecruzamientos ocurridos, las cromátidas no son idénticas como lo fueron al 
comienzo de la meiosis. Nuevas combinaciones han surgido en cromátidas no hermanas, 
en tanto que las otras dos quedan intactas. Los centrómeros no se dividen, las cromátidas 
hermanas continúan unidas, pero los homólogos se separan. Como resultado para 
cualquiera de los pares homólogos, un polo recibe un cromosoma de origen paterno y el 
polo contrario un cromosoma de origen materno. Y no todos los cromosomas paternos se 
dirigen hacia el mismo polo. De hecho cualquier combinación de cromosomas maternos y 
paternos puede desplazarse hacia un polo determinado. 
 
 
3.1.4 Telofase I 
 
Los cromosomas propenden a alargarse, algunas veces el nucléolo y la membrana nuclear 
reaparece. Las células formadas contienen la mitad del número de cromosomas presentes 
en la célula madre. Set haploide de cromosomas. Los cromosomas se encuentran 
reagrupados en cada polo. 
 
 11
Ha concluido la fase reduccional en la cual el par de cromosomas homólogos son 
separados en dos células hijas. 
 
 
3.2 Meiosis II 
 
 
Se parece a la mitosis, excepto en que no está precedida por la duplicación del material 
cromosómico 
 
 
3.2.1 Profase II 
 
Cada célula es haploide, la membrana nuclear empieza a desintegrarse y el nucléolo 
desaparece al final de la profase II, ésta es corta y le sigue una reorganización del huso 
acromático. 
 
 
3.2.2 Metafase II 
 
En esta etapa los cromosomas que han quedado en los polos se colocan en el plano 
ecuatorial y se adhieren a las fibras del huso. 
 
 
3.2.3 Anafase II 
 
En esta fase los centrómeros se dividen y las cromátidas hermanas, que ahora son 
cromosomas, se separan y se van hacia los polos opuestos. 
 
 
3.2.4 Telofase II 
 
En esta fase se forma una tétrada de microsporas, se han formado nuevas paredes 
celulares, cada núcleo lleva un número haploide de cromosomas, cada cromosoma está 
representado una vez, Y cada núcleo de un segmento puede recibir cualquier combinación 
factible de cromátidas de origen materno y paterno. 
 
 
La división meiótica ti ene tres importantes eventos 
 
1. Transformación de los cromosomas por la ocurrencia del entrecruzamiento 
(crossing-over) en combinaciones completamente nuevas. 
2. Re-arreglo del genoma por una distribución al azar de los cromosomas homólogos. 
3. Reducción del número de cromosomas de diploide (2n) a haploide (n). 
 
De estos eventos, el más decisivo es la recombinación, siendo probablemente la más 
importante contribución a la evolución y a la diversidad genética. 
 
 
 
 
 
 
 12
3.3 Observación de meiosis en células sexuales de papa 
 
El proceso de microsporogénesis generalmente termina entre los 7 y 14 días anteriores a la 
floración, muestras apropiadas de botones florales dependen de varios factores: como el 
medio ambiente, la hora y los factores genéticos. Figs. 12, 13, 14 y 15. 
 
 
Procedimiento 
 
1. Fijación 
Usar Carnoy modificado fresco (3:1 alcohol absoluto: solución saturada de acetato 
férrico en ácido propiónico), el cual es dispensado en frascos con tapa rosca, 
sumergir la muestra de botones de diferentes estados de desarrollo, previamente 
haciendo un corte con un bisturí en la punta de los botones para permitir que el 
fijador penetre. Aquí deben permanecer de 24 a 48 horas a temperatura ambiental. 
 
Para largos periodos de almacenamiento en refrigeración, se recomienda guardar 
las muestras en etanol al 70 % a 4° C. 
 
2. Preparación 
Tomar varios tamaños de botones en una placa Petri o en un vidrio de reloj con 70 
% de etanol y chequear cada botón si está en estado óptimo para la observación de 
meiosis. 
 
Diseccionar la antera, sobre una lámina porta objeto, cortando los extremos aplastar 
presionándola con una aguja de disección para luego remover los restos de la 
antera y colocando rápidamente una gota de carmín propiónico o de lacto propiónico 
orceína, cubrir con un cubre objeto. 
 
Las agujas, pinzas de disección deben limpiarse frecuentemente para evitar su 
corrosión. 
 
3. Observación 
 Examinar la preparación bajo el microscopio óptico, a un aumento de 40 X o 100 X, 
si estuviera en un estadío óptimo, calentar levemente la muestra pasando porla 
llama de un mechero y retirar el exceso de tinte colocando la lámina entre 2 papeles 
de filtro. Se puede golpear suavemente el cubre objeto para expandir los 
cromosomas. 
 
 
Preparación de la solución saturada de acetato férrico: Se añaden 10 g de acetato 
férrico a 100 ml de ácido propiónico puro, mezclar bien, dejar sedimentar y decantar 
cuidadosamente la solución, evitando que parte del precipitado pase a la solución a usarse. 
 
Preparación de carmín propiónico: Preparar una solución al 45% de ácido propiónico, 
calentar hasta que hierva, luego añadir 1 g de carmín, dejar hervir y filtrar. 
A esta solución agregar 5 gotas de solución saturada de acetato férrico en 
45% de ácido propiónico. 
 
 
 
 
 
 g
Observación de meiosis en células sexuales 
Botones florales recolectados 
en Fijador Carnoy Modificado
Anteras en alcohol de 70% 
colocadas en placa Petri listas 
para su disección
Antera diseccionada
 
 
Fig. 12: Fijación y preparación de muestras de botones florales. 
 
 
Células 
nutritivas
Células madre del 
polen
Arquesporio
Células del Tapetum
Células madre del 
polen
Meiosis
Polen
Microsporogénesis
 
 
Fig. 13: Microsporogénesis -Tejido esporágeno - Formación del polen. 
 
 
 h
AI
Paquiteno
Metafase I Anafase I
MI
Diacinesis
Profase I
 
 
Fig. 14: Meiosis I, mostrando Paquiteno - Diacinesis (Profase I), Metafase I y Anafase I. 
 
 
Metafase II, ejes de 
los spindles (flecha) 
son paralelos
Anafase II, ps y 
telofase temprana II 
(flecha)
Telofase I, 
Anafase II 
Anafase II, husos 
normales y 
paralelos
AII
M II
Telofase I
AII
TI
 
 
Fig. 15: Meiosis I, Telofase I y Meiosis II, Metafase II, Anafase II, Telofase II, husos 
normales y paralelos. 
 
 
 
 
 13
3.4. Gametos 2n 
 
Gametos con el número somático de cromosomas (gametos 2n) son el resultado de 
mecanismos que afectan formación normal de los gametos, durante la fase premeiotica, 
meiótica y post meiótica. La incidencia de gametos 2n es frecuente en el reino vegetal, y su 
ocurrencia ha sido reportada en muchas especies de familias, incluyendo Crucíferae, 
Leguminosae, Rosaceae, Solanaceae y Vitaceae (Veilleaux, 1985). 
 
Los gametos no reducidos son de gran utilidad, ya que facilitan la poliploidización sexual y a 
la vez proporcionan un método muy efectivo para transmitir la heterocigosidad y la epistasis 
del nivel 2X al 4X. 
 
Pueden ser detectados: Por la ocurrencia de progenie tetraploide en cruzamientos 2x × 4x, 
4x × 2x; distribución bimodal del diámetro del polen: grande (2n) & normal (n). La presencia 
de tétradas, diadas y/o triadas en el estadío de formación de microsporas. Fig. 16. 
 
La poliploidía es una característica distintiva del reino vegetal y ha tenido un papel muy 
importante en la evolución de las plantas superiores especialmente la Angiospermas, 
incluyendo las especies cultivadas de mayor importancia mundial tales como el trigo, papa, 
avena, caña de azúcar y algodón que son poliploides. Camadro (1986). 
 
Los poliploides pueden originarse por duplicación espontánea del complemento 
cromosómico somático (poliploidización asexual) o por el funcionamiento de gametos 2n 
(poliploidización sexual). 
 
 
 
2n
n
Formación de 
tétradas y 
diadas
Formación de 
polen normal y 
polen 2n
Formación de triadas 
(orientación tripolar)
y tétradas 
 
 
Fig.16: Formación de díadas por husos paralelos-polen 2n y formación de triadas en 
Telofase II, los husos adoptan una configuración tripolar. 
 
 
 14
Capítulo 4. Observación de polen y determinación de su 
fertilidad 
 
 
El término viabilidad o fértil se refiere a la capacidad de los granos de polen de germinar en 
el estigma, este conocimiento es uno de los más importantes aspectos para una eficiente 
reproducción sexual. Granos de polen funcional (viables o fértiles) se observan claramente 
redondos con el citoplasma teñido uniformemente de rojo, con morfología normal, son 
considerados potencialmente funcionales, mientras los granos abortivos, no viables o 
estériles, no se tiñen, o son poco coloreados, con el citoplasma granular y permanecen 
encogidos, con citoplasma retraído (eclipse de esterilidad), deformes. Figs. 17, 18, 19, 20 y 
21. 
 
1. Colectar las flores próximas a la dehiscencia. 
2. Colocar una o dos gotas de colorante gelatina aceto-carmín glicerol, en el centro de 
un porta-objeto, y sobre ella colocar una pequeña cantidad de polen que puede ser 
obtenido de una o más anteras con la ayuda de un vibrador o dando golpecitos a las 
anteras con una aguja de disección para hacer caer directamente el polen sobre la 
lámina porta-objeto. Si el polen ha sido colectado en cápsulas de gelatina, una 
cantidad suficiente es colocada de la misma manera con la punta de una aguja o 
con mondadientes. 
3. Mover ligeramente con una aguja de disección o con el mismo mondadientes para 
asegurar una distribución uniforme y luego cubrir con un cubre-objeto, dejar por lo 
menos 24 horas para que los granos de polen se tiñan. Colocar las muestran en una 
mesa o tablero, evitando colocarlas verticalmente hasta después de unos días en 
que hayan sellado y luego colocar en cajas porta-objetos para guardarlas en 
refrigeración a 4° C. 
 
Otro test de viabilidad es el X-Gal test, donde el polen es incubado por 30 minutos en la 
oscuridad a 37° C en un medio (Singh et al., 1985) de 1 mg X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-
indoyle-β-galactoside) disuelto en 50 μl de N, N dimethyl formamide y 1 ml del buffer 
acetato (50 mmol, pH 4.8). Este test es recomendado por Trognitz, 1991 por su alta 
reproducibilidad. El grano de polen es considerado viable si se torna azul y si se muestra 
con un citoplasma teñido uniformemente. Figs. 22 y 23. 
 
 
Preparación de gelatina aceto-carmín glicerol 
 
Preparar una solución de 45% de ácido acético con agua destilada y calentar hasta llegar a 
ebullición, luego agregar 2 g de carmín hasta que el carmín esté completamente disuelto y 
quede aproximadamente 60 ml. Dejar enfriar y filtrar, finalmente agregar igual volumen de 
glicerina. Todo el proceso se realiza bajo campana extractora y constante agitación. (Marks, 
1954). 
 
 
4.1 Cultivo de polen in vitro 
 
La observación del desarrollo del tubo polínico al cultivar el polen en un medio adecuado, 
nos permite distinguir el polen no viable de las incompatibilidades que pueden ocurrir a nivel 
del estilo. Varios investigadores han reportado el uso de medios de cultivo para la 
germinación y crecimiento del tubo polínico. Mortenson y col (1964) reportaron que una 
solución de 20 % de sucrosa + 50 ppm de ácido bórico fue el medio más adecuado para la 
 i
Observación de polen y determinación de su fertilidad 
 
 
Colección de polen
Polen colectado en 
cápsula de gelatina
MaterialesLa muestra es colocada en 2 - 3 
gotas de colorante
 
 
Fig. 17: Procedimiento para la toma de muestra, coloración del polen. 
 
 
 
 
 
Fig. 18: Muestras fijadas de polen para su observación. 
 
 j
 
 
COLORANTE: Gelatina Aceto-carmín Glicerol
COLORACIÓN + polen bien formado= VIABILIDAD
Polen normal (n) + polen 
estéril no coloreado Polen estéril (n) coloreado y no coloreado 
Polen doble, 
coloreado y no 
coloreado
 
 
Fig. 19: Diferentes calidades de polen, normal (n), estéril, polen 2n, polen doble. 
 
 
Eclipse de 
esterilidad
Polen 
anómalo
Tétradas estériles
 
 
Fig. 20: Polen anómalo: Con eclipse de esterilidad, malformado y tétradas estériles. 
 
 
 
 k
Polen n y 2n estériles 
Polen n y 2n coloreados
 
 
Fig. 21: Polen (n), polen 2n coloreados (viables) y estériles. 
 
 
A B
C D
 
 
Fig. 22 : A. Polen normal (n), B. Polen n y 2n, C. Polen normal y estéril, D. Polen estéril. 
Coloración X-Gal. 
 
 l
A B
C D
 
 
Fig. 23: A. Polen con 3 poros germinativos, B. Polen doble, C. Polen con 2 poros 
germinativos, D. Polen estéril. Coloración X-Gal. 
 
 m
Cultivo de polen in vitro 
 
Materiales y medio de sucrosa al 
20% + ácido bórico 200 ppm +
Tween 20 (0.2%) 
Siembra delpolen en el 
medio de cultivo
Polen ya sembrado bajo 
cámara húmeda
 
 
Fig. 24: Procedimiento para el cultivo de polen in vitro en medio de sucrosa, ácido bórico y 
Tween 20 bajo condiciones de cámara húmeda. 
 
A B
C D
 
 
Fig. 25: A y B. Polen germinado y con buen crecimiento en el medio de cultivo. C. Polen 
con mediana germinación D. Polen con escasa germinación. 
 
 
 n
A B
C D
 
 
Fig. 26: A. Polen no germinado, B. Sólo uno de los granos del polen doble germinando, 
C. Escaso polen germinado, D. Polen soltando su contenido. 
 
 
 
 15
germinación in vitro de polen de Solanum, mientras que Bamberg y Hanneman (1991) 
encuentran que el medio de 20% de lactosa + 50 ppm de ácido bórico fue superior al medio 
con sucrosa, así Trognitz (1991) encuentra una respuesta altamente variable para este 
mismo medio. Gonzáles y col (2002) usando un medio compuesto por sacarosa 12%, 
Nitrato de Calcio (CaNO3) 300 ppm, Sulfato de Magnesio (MgSO4) 200 ppm, Nitrato de 
Potasio (KNO3) 100ppm, Acido Bórico (H3BO4) 100 ppm en solución acuosa pH=6, refieren 
que les reportó resultados confiables. 
 
 
4.1.1 Preparación del medio 
 
1. Reactivos 
Sucrosa (sacarosa), concentración en la solución al 20% 
Acido Bórico (H3BO4) 100 ppm (Solución madre 200 mg en 100 ml) 
Tween 20, 0.2 % 
 
2. Preparación del Medio de cultivo 
Se prepara con 5 ml de la solución madre de ácido bórico a 200 ppm y se agrega 20 
g de sucrosa y Tween 20, 0.2% en un cilindro graduado (Vaso de 100 cc) y se 
completa el volumen a 100 cc, agitar bien. 
 
3. Procedimiento para la Germinación 
Colocar 4 gotas (aproximadamente 15 μl de medio/gota), en una placa Petri con la 
ayuda de una aguja, o con palillo de dientes colocar pequeñísimas cantidades de 
polen sobre cada gota, la tapa de la placa Petri a la cual se ha colocado un papel 
filtro humedecido va a contribuir a formar una pequeña cámara húmeda. Las placas 
Petri se colocan a 20-24 ° C. Después de 24 horas se coloca una gota de lugol, o de 
colorantes como orceína acética, carmin propiónico, lacto propiónico orceina y se 
cubre con un cubre-objeto de 22 x 40 mm y se procede a la observación bajo el 
microscópio óptico. Se cuenta como granos germinados aquellos que por lo menos 
el tubo del polen ha crecido de igual tamaño o mayor al diámetro del grano de polen. 
Para registrar los datos se cuentan en unos 10 sitios el número de granos de polen 
que muestran el tubo de germinación. Figs. 24, 25 y 26. 
 
 
Polinización y fertilización 
 
Cuando las anteras se tornan dehiscentes, los granos de polen son transferidos al 
estigma(s) por los insectos o la mano del hombre. Una vez en contacto con el estigma, los 
granos de polen germinan formando el tubo polínico. En cada una de las microsporas 
haploides formadas durante la meiosis, el núcleo se divide por mitosis y desarrolla un grano 
de polen bicelular (gametofito masculino inmaduro). Una de las células se divide 
posteriormente otra vez habitualmente después del desarrollo del tubo polínico, dando 
como resultado tres células haploides por grano de polen: dos gametos masculinos 
masculinos (núcleo germinativo y núcleo espermático).y la célula generadora del tubo 
polínico. El tubo continúa creciendo y entra al óvulo a través del micrópilo. Los dos gametos 
son entonces liberados dentro de la sinérgida. El saco embrionario contiene 8 núcleos y 
cada uno con una dotación haploide de cromosomas. Los dos núcleos cerca al centro del 
saco embrionario son referidos como núcleos polares; la célula huevo u oosfera está 
situada cerca al micrópilo. 
 
Finalmente un núcleo espermático entra en la célula huevo y el otro se une a los dos 
núcleos polares, este acontecimiento es llamado doble fertilización, entonces se forma un 
cigoto diploide, que luego desarrolla en embrión y la unión del otro núcleo espermático con 
 16
dos núcleos polares, llamado fusión triple resulta en la formación del tejido nutritivo llamado 
endospermo (3n). Se conoce a este proceso como doble fertilización, este es un proceso 
complejo, el embrión pasa por sus primeras etapas de desarrollo mientras se encuentra 
dentro del ovario de la flor, los integumentos se desarrollan en la cubierta de la semilla y el 
ovario mismo madura y se transforma en fruto. 
 
Las polinizaciones o fertilizaciones, deben realizarse usualmente en la mañana antes de las 
10 a m, si los días son calurosos es posible hacerlos al final de la tarde. El probable éxito 
del cruzamiento es apreciado por un pedicelo sostenido y ligeramente curvado, unos 2-4 
días después de la polinización con un posterior desarrollo de frutos (bayas), los cuales 
serán cosechados cerca de 30-45 días dependiendo de las especies. Normalmente los 
frutos son protegidos durante su desarrollo con una malla de fina gasa. Después de la 
cosecha, (25-40 días), se colocarán en bolsas de papel hasta su maduración a temperatura 
ambiente, esperando hasta que se tornen suaves lo cual permite que el proceso de 
extracción sea más fácil, la extracción que se hace en un recipiente con agua donde son 
separadas las semillas de las otras partes del fruto. Las semillas viables tienden a irse 
hacia el fondo, mientras las semillas llamadas vanas flotan. Las semillas obtenidas así 
deberán ser secadas, colocadas en papel de platina especial y selladas para guardar en 
cámara de refrigeración a 4 ° C. Fig. 27. 
 
 
Polinización y fertilización 
 
Emasculación de las anteras
Polinización
Colecta de polen
Guardar el polen en 
cápsulas de gelatina
Identificación del
cruzamiento
 
 
Fig. 27: Procedimiento para efectuar las polinizaciones en un bloque de cruzamientos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 17
4.2 Crecimiento del tubo polínico in vivo (en el pistilo) 
 
Un método útil para monitorear la fertilidad del polen es teñirlo y visualizarlo para observar 
como crecen a lo largo del pistilo. Durante la polinización, el grano de polen hace contacto 
con las células receptivas del pistilo lo que favorece el crecimiento del polen de algunos 
genotipos, mientras que se opone o rechaza otros. Esta interacción polen–pistilo establece 
límites de endogamia o de exogamia. 
 
El análisis del crecimiento del tubo polínico nos permite hallar las diferencias existentes en 
cruzamientos compatibles, parcialmente o completamente incompatibles. 
 
Dos tipos de incompatibilidad pueden ser distinguidos en Solanum, auto-incompatibilidad o 
incompatibilidad interespecífica. 
 
Para monitorear el crecimiento del tubo polínico in situ: 
 
1. Fijación 
Sumergir los carpelos (pistilos) en la solución de Schreiter (Schreiter and Tiemann, 
1977), los que serán colectados 48 horas después de realizada la polinización, 2-6 
pistilos por muestra, los que serán retirados intactos de las flores, cortados desde la 
base con un escapelo. Se debe guardar las muestran en refrigeración a 4° C hasta 
una semana antes de la preparación. La solución es re-usable cerca de 10 ciclos. Si 
se torna turbia o grumosa debe nuevamente filtrarse. La solución debe manejarse 
con mucho cuidado y con guantes ya que el azul de anilina es cancerígeno. 
 
2. Preparación 
Hervir las muestras fijadas en un baño de maría, hasta que el tejido se aclare y 
suavice suficientemente, pero no más que 30 minutos. El tiempo de preparación 
dependerá de la consistencia del tejido, variando entre genotipos. El tejido en esta 
etapa se torna extremadamente frágil, hay que tener mucho cuidado en su 
manipulación. 
 
3. Montaje 
Los pistilos serán extendidos y montados en láminas porta-objetos, en una gota de 
solución acuosa de 50% de glicerol/agua, cubiertos con un cubre-objeto y aplastados 
suavemente. Los pistilos preparados de esta manera donde los tubos polínicos que 
contienen callosa pueden ser coloreados por azul de anilina y detectados con luz UV 
(Dionne y Spicer, 1958). 
 
 
Preparación de la solución 
 
Para una cantidad total de 1.2 litros de solución: 
 • 100 ml (1 parte) (w/v) de la solución acuosa de azul de anilina (2%), hervir y filtrar. • 700 ml (7partes) solución acuosa de 0.2 N K3PO4 * 3 H20 (49.53 g completar a 700 
ml con agua destilada) • 200 ml (2 partes) 1.0 N Na OH (8.0 g completar a 200 ml con agua destilada) • 200 ml (2 partes) (v/v) 10% solución acuosa de Tween 20 (180 ml de agua destilada 
+ 20 ml de Tween 20). 
 
Al azul de anilina preparada, se agrega las demás soluciones y luego se procede a guardar 
en frasco oscuro en refrigeración a 4° C, la solución toma un color amarillo claro. 
 
 18
La evaluación del crecimiento del tubo del polínico se realizará en microscopio de 
fluorescencia, en una magnificación x 100 con una lámpara HBO 200 UV- como fuente de 
luz, BG 12 filtro de excitación y UG 1 filtro de barrera y un filtro de protección Y-455. 
 
Se coloca el carpelo cocinado en una lámina porta-objeto con una gota del glicerol/ agua al 
50%. La concentración demasiado alta del glicerol afecta el material. Pero es posible 
sustituir el agua en la solución del montaje posteriormente agregando el glicerol puro. De 
esta manera, las preparaciones son durables si se mantienen en la oscuridad. El tiempo de 
la preparación depende de la consistencia del tejido y varía entre los genotipos. 
 
El crecimiento del tubo polínico será evaluado usando una escala o matriz combinada de 18 
niveles cualitativos (nivel al que llegan los tubos polínicos) y cuantitativa (cantidad de tubos 
polínicos, Trognitz, 1991). Figs. 28 y 29. 
 
 
 
 o
Crecimiento del tubo polínico in vivo (en el pistilo) 
 
 
Fig. 28: Matriz de valores combinados para evaluación cualitativa (nivel de crecimiento al 
cual llegan los tubos polínicos en el pistilo) y cuantitativa (número de tubos polínicos 
llegando a los diferentes niveles a lo largo del pistilo). 
* Niveles de longitud del tubo del polen llegan: 6 - Polen no germinado; 5 - estigma; 4 - estilo 
- estigma; 3 - estilo; 2 - final del estilo; 1 - placenta. (Trognitz,1991). 
 
 
 
 
Fig. 29: Diferentes vistas del crecimiento del tubo polínico en el pistilo y ovario después de 
ser coloreado con el colorante fluorescente azul de anilina que reacciona con la callosa. 
 
> 30 10-30 <10
16 17 18
13 14 15
10 11 12
7 8 9
4 5 6
1 2 3
Cantidad (número total de tubos polínicos en 
el estilo-ovario)
Valor combinado del nivel y cantidad 
de polen
Niveles*
No germinado
Estigma
Estilo-estigma
Estilo
Estilo (final)
Placenta
 
 19
Capítulo 5. Cultivo in vitro de embriones inmaduros 
 
 
La utilización de las técnicas de rescate de embriones ha sido muy importante para la 
obtención de híbridos ínter específicos e ínter genéricos. 
 
La reproducción de plantas se realiza mediante hibridación y selección. El cruzamiento de 
plantas permite al mejorador recombinar características deseables en nuevos genotipos y a 
través de la selección obtener mejores productos. Este proceso depende totalmente de la 
producción de descendencia; en otras palabras, de la formación de semillas viables. 
 
El cultivo in vitro de embriones permite que embriones que se pierden o no progresan 
normalmente debido a su condición de inmaduros, lleguen a progresar y desarrollar una 
plantula si son colocados en un medio adecuado superando con éxito la falta de viabilidad 
de las semillas procedentes de cruzamientos especialmente difíciles, además de reducir el 
tiempo que dura el mejoramiento en muchas plantas (Brown & Torpe, 1995; Rodrigues- 
Otubo et al, 2000). 
 
El éxito del cultivo in vitro de embriones inmaduros está influenciado por la composición 
química del medio de crecimiento, el cual debe ser capaz de inducir el desarrollo exitoso de 
embriones híbridos, también debe establecerse de acuerdo a los principales requerimientos 
nutricionales de la especie (Pellegrineschi et al., 1997). 
 
 
Procedimiento 
 
Después de realizados los cruzamientos las bayas se colectan dentro del lapso de 19-27 
D.D.P, se efectúa una desinfección previa usando una solución que contiene los acaricidas 
Azociclotin (Peropal 50 SC): Imidacloprid (Confidor 35 SC) al 1 ‰, adicionándole 6 gotas de 
Tween 20, colocando las bayas en esta solución por aproximadamente 10 minutos, seguido 
de una desinfección con alcohol 70% por 30 segundos, y finalmente se lavan 2 veces con 
agua destilada, proceso que se realiza en un área destinada para este propósito; por último 
se esteriliza superficialmente con una solución de Hipoclorito de Calcio al 2.5% por 10 
minutos y finalmente se enjuaga con agua destilada estéril, proceso que se realiza en la 
cámara de flujo laminar. En este punto las bayas están listas para ser cortadas. 
 
 
Siembra de embriones inmaduros 
 
Medio modificado de Singsit y Hanneman (1991). 
 
Todo éste proceso se realiza dentro de la cámara de flujo laminar en las mayores 
condiciones de asepsia. Se cortan las bayas para obtener las semillas inmaduras, éstas se 
abren a lo largo de su eje longitudinal, usando un escalpelo y una hoja para escalpelo No 
11, todo este proceso se realiza con la ayuda de un estereoscópico. Los embriones son 
separados cuidadosamente de la cubierta de la semilla y sembrados directamente en las 
placas Petri de 60 x 15 mm. conteniendo el medio de cultivo, que consiste de 4.6 g/L del 
medio basal Murashige y Skoog (Sigma), fortificado con 4 % de sucrosa, 100 mg/L de mio-
inositol, 0.001 mg/L de adenina, 2.0 mg/L de glicina, 1 g/L de caseína hidrolizada, 0.1mg/L 
tiamina-HCl, 1mg/L de ácido nicotínico, 0.5 mg/L de piridoxina-HCl, 100 mg/L de ácido 
málico; 0.7 % de agar, adicionado con 1g/L de carbón activado. El pH del medio se ajusta a 
pH 5.6 antes de autoclavarlo a 120 º C por 20 minutos y se agrega 0.1 mg/L IAA (ácido 3-
indol-acético) y se agrega 0.001 mg/L de kinetina al medio de cultivo por filtración antes de 
 20
dispensarlo a las placas Petri. Finalmente las placas Petri se colocaran en la cámara de 
crecimiento en un rango de temperatura de 18 a 22 º C, 16 horas de fotoperíodo y 3000 lux 
de intensidad lumínica hasta su germinación. 
 
Una vez ha desarrollada la plantita se procede al transplante a tubos con el medio de 
propagación MSA que consiste de 4.6 g/L del medio basal Murashige y Skoog (Sigma), 
fortificado con 25 g/L de sucrosa, 2.9 g/L de Phytagel y 5 mL del Stock de Vitaminas (0.025 
g de GA3 (ácido giberélico), 0.5 g de glicina y 0.125 g de ácido nicotínico) y a pH 5.6. Fig. 
30. 
 
 
Cultivo in vitro de embriones inmaduros 
 
Corazón
Torpedo
Bayas listas para ser 
cosechadas
(19-27 DDP)
Híbrido 
rescatado
Descarte de 
embriones con 
marcador
Pro-embriones 
creciendo en medio 
de 
cultivo in vitro
Apertura de bayas
in vitro
Globular
Polinización
Rescate de pro 
embriones en 
diferentes estadíos
Propagación 
in vitro
Plantas de in vitro
creciendo en invernadero
 
 
Fig. 30: Procedimiento para el cultivo in vitro de embriones inmaduros. 
 
 21
Literatura consultada 
 
 
• Bamberg J.B., and R.E. Hanneman, Jr. 1991. An effective method for culturing pollen 
tubes of potato. Amer. Pot. J. 68:373-379. 
 • Brown D.C.W and Thorpe T.A. 1995. Crop improvement through tissue culture. 
World Journal of Microbiology & Biotechnology. 11: 409-415. 
 • Camadro, E. L. 1986. Los gametos 2n en el origen y la evolución de las 
angiospermas poliploides. Mendeliana 7(2):85-96. 
 • Chen, Q. and Y. Li Hai. 2005. An improved technique for high resolution mitotic 
chromosome studies in Solanum. HortScience 40(1): 54-56. 
 • Dionne, L., and P.B. Spicer. 1958. Staining germinating pollen and pollen tubes. 
Stain Technology 33: 15-17. 
 • Dong, F., J. Song, S. K. Naess., J. P. Helgeson., C. Gebhardt., 2000 Development 
and applications of a set of chromosome-specific cytogenetic DNA markers in potato. 
Theor. Appl. Genet 101: 1001-1007. 
 • Gonzáles, M.E., A. Estévez., J. Castillo., J. Salomón., O. Moré., Ma. M. Hernández. 
2002. La calidad del polen: Requisito indispensable del mejoramiento tradicional de 
la papa en Cuba. Revista Latinoamericna de la Papa. Vol (13):75-94. 
 • Haskell, G. and A.B. Wills .1968. Primer of chromosomes practice.Oliver and Boyd. 
Londres. 150 p. 
 • Klein, M. 1990. C-Mitotic action of the insecticide Ambush 25 EC in Allium cepa L. 
Genetica Polonica 31(2): 107-113. 
 • Marks G.E., 1954. An acetic-carmine glycerol jelly for use in pollen fertility counts. 
Stain Tech 29:277. 
 • Mortenson, Lorraine R., S.J. Peloquin and R. W. Hougas. 1964. Germination of 
Solanum pollen on artificial media. Am. Pot. J 41: 322-328. 
 • Pellegrineschi, A., Fatokun. C.A., Thottappilly, G., Adepoju, A. 1997. Cowpea embryo 
rescue. 1. Influence of culture media composition on plant recovery from isolated 
immature embryos. Plant Cell Reports 17: 133–138. 
 • Rodrigues-Otubo B.M., De O. Penteado M.I., Do Valle C. B. 2000. Embryo rescue of 
interspecific hybrids of Brachiaria spp. Plant Cell Tissue and Organ Culture 61: 175 -
182. 
 • Schreiter, J.; Tiemann, H. 1977. Testing the pollen tube growth in vivo in dihaploids 
of Solanum tuberosum L. Arch. Züchtungsforschung 7:253-258. 
 • Singh, M.B., P. O’Neill., R.B. Knox, 1985. Initiation of post-meiotic β-galactosidase 
synthesis during microsporogenesis in oilseed rape. Plant Physiol 77:225-228. 
 
 22
• Singsit, C., and R.E. Hanneman Jr, 1991. Rescuing abortive inter-EBN potato 
hybrids through double pollination and embryo culture. Plant Cell Rep 9, 475 -478. 
 • Tjio, J.H. and A. Levan. 1950. The use of oxyquinoline in chromosome analysis. Ann. 
Estación Expt. Aula Dei 2:21-46. 
 • Trognitz, B. 1991. Comparison of pollen viability assays to evaluate pollen fertility of 
potato dihaploids. Euphytica 56:143-148. 
 • Veilleux, R. 1985. Diploid and polyploid gametes in crop plants: mechanisms of 
formation and utilization in plant breeding. Plant Breeding Rev 3: 253–288. 
 • Watanabe, K.N. and M. Orrillo. 1993. An alternative pretreatment method for mitotic 
chromosome observation in potatoes. Am. Potato J 70:543-548.