Tesis Doctoral Garcia Mauro FINAL Actividad Inhibitoria de Sustancias Antimicrobianas

Esta es una vista previa del archivo. Inicie sesión para ver el archivo original

Doctorado en Ciencia Animal
Tesis
Actividad Inhibitoria de Sustancias Antimicrobianas Producidas por Escherichia coli y Lactobacillus spp sobre Patógenos Productores de ETA
Por: Mauro Daniel García
Facultad de Ciencias Veterinarias
U. N. C. P. B. A
2022
Doctorado en Ciencia Animal
Tesis
Actividad Inhibitoria de Sustancias Antimicrobianas Producidas por Escherichia coli y Lactobacillus spp sobre Patógenos Productores de ETA
Por: Mauro Daniel García
Facultad de Ciencias Veterinarias
U. N. C. P. B. A
Directora: Dra. Analía Inés Etcheverría
Co-Directora: Dra. Nora Lía Padola
Miembros del Jurado:
Dra. Marcela Carina Audisio
Dr. Christian Magni
Dra. Mónica Delfina Sparo
Directora: Dra. Analía Inés Etcheverría
Co-Directora: Dra. Nora Lía Padola
Índice
Doctorado en Ciencia Animal	0
Doctorado en Ciencia Animal	1
Resumen	7
Abstract	10
Abreviaturas y Palabras Clave	14
Capítulo I: Introducción	17
1.1.	Enfermedades de Transmisión Alimentaria	17
1.2.	Bacterias responsables de ETA	17
1.2.1.	Escherichia coli	18
1.2.2.	Salmonella spp.	20
1.2.3.	Staphylococcus spp.	21
1.3.	Biofilms bacterianos	22
1.4.	Estrategias de prevención de ETA	25
1.4.	Definición y aplicaciones de Probióticos	25
1.5.	Biopreservación y probióticos	27
1.6.	Probióticos y Bacteriocinas	28
1.6.1.	Clasificación y biología de bacteriocinas	29
1.6.1.4.	Propuestas alternativas de clasificación	33
1.6.2.	Modos de acción de bacteriocinas	33
1.6.3.	Potenciales aplicaciones de las bacteriocinas	37
1.6.3.1.	Aplicaciones de bacteriocinas en salud animal	37
1.6.3.2.	Aplicaciones potenciales en salud humana	39
1.6.4.	Bacteriocinas recombinantes	40
Capítulo II Hipótesis y Objetivos	43
Hipótesis de Trabajo	43
Objetivo General	43
Objetivos Particulares	43
Capítulo III Metodología	45
A.	Origen de las cepas	45
A.1. Cepas bacteriocinogénicas utilizadas	45
A.2. Cepas patógenas utilizadas	45
A.3. Cultivo en medio líquido	46
A.4. Mantenimiento de las cepas	46
B.	Extracción y concentración parcial de sustancias antimicrobianas	46
C.	Ensayo de inhibición	47
D.	Cuantificación proteica	47
E.	Extracción de ADN	48
E.1. Extracción de ADN Genómico	48
E.2. Extracción ADN Plasmídico	49
E.3. Cuantificación del ADN	51
F. Identificación de bacteriocinas por PCR	51
F.1. Primers utilizados	51
F.2. Protocolo de PCR	51
G.	Secuenciación genómica	53
G.1. Análisis de secuencias mediante bioinformática	53
H.	Naturaleza química de la Sustancia Inhibitoria	54
I.	Caracterización de la actividad inhibitoria en el tiempo	55
I.1. Estabilidad de los sobrendanates parcialmente purificados	55
I.2. Analizar el efecto de las sustancias inhibitorias sobre biofilm bacterianos.	55
I.2.1. Cuantificación de formación de biofilms	56
I.2.2. Inhibición de biofilms en estadíos previos a de formación	56
I.2.3. Inhibición de biofilms en estadíos posteriores de formación	56
I.2.4. Manejo y ajuste de datos	56
Capítulo IV: Resultados	59
1. Extraer y purificar sustancias antimicrobianas sintetizadas por cepas de Lactobacillus spp. y Escherichia coli aisladas en cortes de carne porcina y colon de bovinos	59
Concentración mediante Liofilización	59
2.	Identificar las diferentes sustancias antimicrobianas, mediante PCR y Secuenciación Genómica	60
2.1. Búsqueda de bacteriocinas por PCR	60
2.2. Búsqueda de bacteriocinas por secuenciación genómica	62
2.3. Minado de sustancias antimicrobianas mediante antiSMASH	67
2.4. Extracción de ADN plasmídico y búsqueda bioinformática	75
3.	Caracterizar las sustancias inhibitorias extraídas en su actividad y estabilidad frente a diferentes procesos físico-químicos.	75
3.1. Determinación del tipo de sustancia inhibitoria en BAL	75
3.2. Presencia de inhibición en relación a la etapa de crecimiento bacteriano.	76
3.3. Caracterización de la actividad inhibitoria	76
3.4. Estabilidad frente a procesos físico-químicos	80
4.	Analizar la actividad de las sustancias inhibitorias contra biofilms de bacterias patógenas.	81
4.1. Tratamiento previo a la formación del biofilm	82
4.2. Tratamientos posteriores a la formación del Biofilm	82
Capítulo V Discusión	88
Conclusiones	97
Bibliografía	98
ANEXO	113
Agradecimientos
En primer lugar, deseo agradecer a mis directoras, las Doctoras Analía Etcheverría y Nora Lía Padola, por la oportunidad de realizar el doctorado, por sus consejos y su apoyo durante el mismo.
También a todo el equipo del Laboratorio de Inmunoquímica y Biotecnología: Daniel, Marcelo, Guillermo, Julia, Luciana, Alejandra, Paula, Jimena, Juliana, Ana, Mariel, Emilia, Rocío, Victoria, y al resto de los miembros del SAMP y el Departamento de Biología. 
Este trabajo está dedicado a Teresa, mi madre, y a la memoria de Aldo, mi padre, que son mi sostén y modelo a seguir.
Resumen
Todas las bacterias producen en su ambiente natural una gama de sustancias inhibitorias que les permiten competir con otras filogenéticamente relacionadas o no. Las bacteriocinas se destacan dentro de estos metabolitos debido a su fuerte actividad antimicrobiana, son sustancias de naturaleza peptídica o proteica sintetizadas ribosomalmente. Las bacteriocinas provenientes de bacterias Gram positivas y negativas, constituyen una alternativa atractiva para aplicarse en la prevención de infecciones causadas por microorganismos patógenos que provocan enfermedades transmitidas por alimentos (ETA). Las bacterias generalmente implicadas en ETA corresponden a las especies Escherichia coli (E. coli), especialmente las productoras de toxina Shiga o STEC, Salmonella Typhimurium, Staphylococcus aureus (S. aureus), entre otras.
La hipótesis de este proyecto fue que, en aislamientos de E. coli y Lactobacillus spp. obtenidos de cerdos y colon de bovinos, se producen distintas sustancias antimicrobianas activas sobre bacterias patógenas causantes de ETA. El objetivo general fue caracterizar sustancias con actividad antimicrobiana obtenidas a partir de cepas de E. coli y Lactobacillus spp. aisladas de diferentes orígenes y evaluar su actividad inhibitoria sobre patógenos productores de ETA.
Se utilizaron 6 cepas productoras de colicinas (Col E. coli) aisladas de colon bovino y 4 de Lactiplantibacillus plantarum (L. p) aisladas de materia fecal porcina. Estas cepas fueron caracterizadas como comensales, no detectándose factores de virulencia que demostraron tener actividad antimicrobiana. Se probó su efecto inhibitorio contra tres cepas STEC, una cepa de Salmonella Typhimurium y una de S. aureus. En las cepas Col E. coli y L. p. se detectaron por PCR, genes para colicinas (col), microcinas (mic) y plantaricinas (pln), respectivamente. Para la concentración de las sustancias antimicrobianas se eligió la técnica de liofilización, sobre la precipitación con sulfato de amonio y TCA, debido a que se obtuvieron los mejores rendimientos; se seleccionaron cuatro cepas (Col E. coli 24.7, Col E. coli 27.4, L. p 05 y L. p 21.2) para los posteriores análisis.
Se realizó la secuenciación genómica, se confirmaron las bacteriocinas detectadas por PCR y se detectaron otras mediante la anotación de genes y minado de secuencias en plataformas bioinformáticas, BAGEL4, AntiSMASH, Virulence Finder y Plasmid Finder. Con estas plataformas se detectó en L. p 05: pln E/F, J/K, A y N, los genes involucrados en la inmunidad y modificación post-traduccional de estos péptidos, HlyD, LanT, GlyS y dos genes no identificados, pero con función putativa de inmunidad contra pln J/K; en L. p 21.2 se confirmó la presencia de genes de pln J/K, que no fueron detectadas previamente por PCR, asimismo, se detectó pln NC8 α/β, se observó la presencia de genes de inmunidad HlyD, de transporte LanT, y tres ORF asociados a inmunidad en el operón de las pln NC8 α/β. En Col E. coli 24.7. Se observaron genes correspondientes a colicina M y B, acompañadas de sus respectivos genes de inmunidad, adicionalmente, se identificó otro tipo de sustancia antimicrobiana, llamada boltromicina; Col E. coli 27.4, mostró cuatro AOI, en las que se observó la presencia de col Ib, E7, Boltromicina y col M.
Con la plataforma ANTISmash (antibiotics and secondary
metabolite analysis Shell) la cuál, permite detectar presencia de distintos Péptidos Inhibitorios de Síntesis Ribosomal con modificaciones post-traduccionales, o RIPPs, se confirmó la presencia de péptidos inhibitorios correspondientes a bacteriocinas en las cepas secuenciadas y la presencia de otras sustancias de interés con posible actividad antimicrobiana.
En la cepa L. p 05, se detectaron genes correspondientes a la síntesis de terpenos, moléculas con actividad antimicrobiana; RIPP que se corresponde a un péptido antimicrobiano con modificaciones post-raduccionales que no pudo ser identificado; T3PKS proteínas involucradas en la modificación de estos péptidos y autoinductores de lactonas cíclicas, proteínas involucradas en el quorum sensing. En la cepa L. p 21.2 se detectaron: genes codificantes de terpenos, autoinductores de lactonas cíclicas, RIPP y moléculas accesorias.
Se detectaron, en la cepa Col E. coli 24.7, genes de aril polienos, moléculas similares a los carotenos, que poseen actividad antimicrobiana. En la cepa Col E. coli 27.4 se identificó la presencia de secuencias similares a la microcina L y otra secuencia similar a un RIPP que no pudo ser identificado por el software, en las secuencias analizadas, se identificaron secuencias que codifican para proteínas asociadas al proceso de modificación post-traduccional de microcina C7; se pudieron detectar genes involucrados en la síntesis no ribosomal de péptidos y en la síntesis de tiopéptidos.
Mediante el programa plasmid finder se detectaron e identificaron los siguientes plásmidos: en L. p 05, repUS47, repUS54 y rep28; no se encontraron plásmidos en L. p 21.2; en Col E. coli 24.7 IncFIA, IncFIB(AP001918), IncFII, IncFII(pSE11), IncI1-I(Alpha), p0111 y en Col E. coli 27.4 Col156, IncB/O/K/Z, IncX1.
Con los SLC de los L. p, se comprobó que la actividad inhibitoria es debida a una sustancia proteica, ya que su actividad inhibitoria se perdió solo al ser tratada con proteinasa K y no con NaOH o Catalasa.
Se caracterizó la actividad inhibitoria de los SLC en las cepas seleccionadas. Sobre cepas STEC (una concentración de 103 UFC/ml), el SLC de Col E. coli 27.4 posee una actividad del tipo bactericida al observarse la ausencia de crecimiento y la persistencia de este efecto a lo largo del tiempo, evidenciándose por el crecimiento nulo de UFC en las placas. La cepa Col E. coli 24.7 posee una actividad bacteriostática ya que disminuye la tasa de crecimiento, pero solo por un lapso de tiempo hasta que recupera el nivel de crecimiento. El SLC de L. p 05 presentó un efecto bactericida. Este comportamiento fue proporcional a la concentración de SLC utilizado, observándose mayor efecto en las condiciones puro y diluído al medio. El mismo efecto de inhibición bacteriostático y bactericida fue observado en presencia de 103 UFC/ml de Salmonella Typhimurium y S. aureus. Estas sustancias son resistentes a distintos rangos de pH y temperatura. Aquellas producidas por cepas Col E. coli 27.4 y L. p 05 son las que toleran y mantienen su actividad a más rangos de temperatura y pH en los tratamientos aplicados. 
Se probó que los SLC, poseen un efecto inhibitorio sobre la formación de biofilm bacteriano de patógenos involucrados en ETA. Estos SLC son más efectivos al ser aplicados preventivamente antes de la maduración del biofilm. No obstante, su aplicación sobre biofilm maduros no es del todo inefectiva, ya que patógenos de importancia en ETA como Salmonella y S. aureus presentaron una menor capacidad formadora. 
En esta Tesis Doctoral, se ha logrado extracción y concentración de sustancias antimicrobianas, identificadas por técnicas moleculares y bioinformáticas como bacteriocinas, específicamente, colicinas y microcinas de E. coli y plantaricinas de L. plantarum, estas sustancias de tipo proteico han sido caracterizadas con actividad bactericida o bacteriostática, se ha observado, la persistencia de su actividad frente a diferentes condiciones de pH y temperatura, y se comprobó que son efectivas en reducir la capacidad formadora de biofilm de patógenos responsables de ETA.
No obstante, para su aplicación en alimentos, serán necesarios futuros estudios de dosis letal DL50 y de toxicidad en líneas celulares o en ratones, para evaluar su seguridad. Los organismos GRAS son organismos que poseen una larga historia de aplicación y comprobados efectos benéficos. Estos organismos, y, en particular los probióticos, deben cumplir estrictos requisitos de caracterización genotípica y fenotípica, debe estar identificado hasta el nivel de especie, y debe asegurarse que sea viable ya sea en su consumo, o durante la vida útil en góndola. Los mismos requisitos son deseables para la aplicación directa de un péptido antimicrobiano, debe asegurarse la identidad y el grado de pureza del extracto, su seguridad y su vida media. 
Abstract
All bacteria produce a range of inhibitory substances in their natural environment, which enables them to compete with other bacteria either phylogenetically related or not. Among these metabolites, bacteriocins stand out for their strong antimicrobial activity, they are defined as ribosomally synthesized peptides. Bacteriocins from Gram positive and negative bacteria are an attractive alternative for its application on the prevention of infections caused by pathogenic microorganisms responsible for foodborne diseases (FBD). The bacteria generally involved in FBD belong to the species Escherichia coli (E. coli), notably Shiga Toxin producing strains or STEC, Salmonella Typhimurium (Salmonella Typhimurium), Staphylococcus aureus (S. aureus), among others.
The hypothesis of this Thesis was that, in E. coli and Lactobacillus spp. isolates of obtained from bovine colon and pig’s intestine, different antimicrobial active substances are produced whih are pottentialy effective over pathogenic bacteria that cause FBD. The general objective is to characterize substances with antimicrobial activity obtained from strains of E. coli and Lactobacillus spp. isolated from different origins and evaluate their inhibitory activity on FBD producing pathogens.
Six colicin-producing strains (Col E. coli) isolated from bovine colon and 4 strains of Lactiplantibacillus plantarum (L. plantarum) isolated from porcine fecal matter were used. These strains were characterized as commensals, no virulence factors were detected and they showed antimicrobial activity. Its inhibitory effect was tested against three STEC strains, one strain of Salmonella Typhimurium and one of S. aureus. In the Col strains E. coli and L. p. Genes for colicins (col), microcins (mic), and plantaricins (pln) were detected by PCR, respectively. For the extraction and concentration of the antimicrobial substances, the lyophilization technique was chosen, due to the best yields obtaining a Cell Free Supernant (CFS); Four strains (Col E. coli 24.7, 27.4, L. p 05 and 21.2) were selected for further analysis.
Genomic sequencing was performed, the bacteriocins detected by PCR were confirmed and additional ones were detected by gene annotation and sequence mining on bioinformatic platforms: BAGEL4, AntiSMASH, Virulence Finder and Plasmid Finder. With these platforms, the genes involved in immunity and post-translational modification of these peptides, HlyD, LanT, GlyS and two unidentified genes, were detected in L. p 05: pln E/F, J/K, A and N. but with the putative function of immunity against pln J/K; in L. p 21.2, the presence of the pln J/K genes was confirmed, which had not been previously detected by PCR, likewise, the pln NC8 α/β were detected, the presence of the HlyD immunity genes, transport LanT, and three immunity-associated ORFs in the pln NC8 α/β operon; In E. coli 24.7, genes corresponding to colicin M and B were observed, accompanied by their respective immunity genes. In addition, another type of antimicrobial substance, called boltromycin, was identified; Col E. coli 27.4, showed four AOIs, in which the presence of col Ib, E7, Boltromycin and col M was observed.
With the ANTISmash
platform (antibiotics and secondary metabolite analysis Shell) that allows detecting the presence of different Ribosomal Synthesis Inhibitory Peptides with post-translational modifications or RIPPs was possible to confirm the presence of inhibitory peptides corresponding to bacteriocins in the sequenced strains and the presence of other substances of interest with possible antimicrobial activity.
In the L. p 05 strain, the following were detected: genes corresponding to the terpene synthesis, molecules with antimicrobial activity; RIPP that encodes to an antimicrobial peptide with post-translational modifications that could not be identified; T3PKS proteins involved in the modification of these peptides and autoinducers of cyclic lactones, proteins involved in quorum sensing. In the L. p 21.2 strain, the following genes were detected: terpene encoding genes, autoinducers of cyclic lactones, RIPP and accessory molecules.
In the Col E. coli 24.7 strain, aryl polyene genes, molecules similar to carotenes, which have antimicrobial activity, were detected. In the Col E. coli 27.4 strain, the presence of sequences similar to microcin L and another sequence similar to a RIPP that could not be identified by the software were detected. In the analyzed sequences, sequences that code for proteins associated with the process were detected. post-translational modification of microcin C7; genes could be detected involved in the non-ribosomal synthesis of peptides and in the synthesis of thiopeptides.
Using the plasmid finder program, the following plasmids were detected and identified: in L. p 21.2, no plasmids were detected; in L. p 05 repUS47, repUS54 and rep28; in Col E. coli 24.7 IncFIA, IncFIB(AP001918), IncFII, IncFII(pSE11), IncI1-I(Alpha), p0111 and in Col E. coli 27.4 Col156, IncB/O/K/Z, IncX1.
With the CFS of L. p, it was found that the inhibitory activity is due to a protein substance, since its inhibitory activity was lost only when treated with proteinase K and not with NaOH or Catalase treatments.
The inhibitory activity of the CFS of the selected strains was characterized. On STEC strains (103 CFU/ml), the SLC of Col E. coli 27.4 has a bactericidal type activity when observing the absence of growth and the persistence of this effect over time, evidenced by the null growth of CFU in the plates. The Col E. coli 24.7 strain has a bacteriostatic activity since it decreases the growth rate, but only for a period of time until it recovers the growth level. The CFS of L. plantarum 05 presented a bactericidal effect. This behavior was proportional to the concentration of CFS used, with the greatest effect being observed in the pure and diluted two-fold conditions. The same bacteriostatic and bactericidal inhibition effect was observed in the presence of 103 CFU/ml of Salmonella Typhimurium and S. aureus. These substances are resistant to different ranges of pH and temperature. But, of those studied, the substances produced by strains of Col E. coli 27.4 and L. p 05 are those that tolerate and maintain their activity at more ranges of temperature and pH of the administered treatments.
It was proven that CFS have an inhibitory effect on the formation of bacterial biofilm of pathogens involved in FBD. These CFS are more effective when applied preventively before the maturation of the biofilm. However, its application on mature biofilm is not completely ineffective, since pathogens of importance in FBD such as Salmonella and S. aureus presented a lower forming capacity.
In this Doctoral Thesis, a concentrated extract of antimicrobial substances identified by molecular and bioinformatic techniques such as bacteriocins, specifically colicins and microcins from E. coli and plantaricins from L. plantarum, has been obtained. These protein-type substances have been characterized with bactericidal or bacteriostatic activity, the persistence of their activity against different pH and temperature conditions has been observed, and it was proven that they are effective in reducing the biofilm-forming capacity of pathogens responsible for FBD.
However, for its application in food, future lethal dose LD50 and toxicity studies in cell lines or mice will be necessary to assess its safety. GRAS organisms are organisms that have a long history of application and proven beneficial effects. These organisms, and in particular probiotics, must meet strict genotypic and phenotypic characterization requirements, must be identified down to the species level, and must ensure that they are viable either for consumption or during shelf life. The same requirements are desirable for the direct application of an antimicrobial peptide, the identity and degree of purity of the extract, its safety and its half-life must be ensured.
Abreviaturas y Palabras Clave
Palabras Clave
Bactericocinas. Colicinas. Plantaricinas. Escherichia. Coli. Lactiplantibacillus plantarum. ETA.
Abreviaturas
μl: microlitro
AcNa/EtOH: Acetato de sodio etanólico
ADN: Ácido desoxirribonucleico 
BAL: Bacterias Ácido Lácticas
CIC-PBA: Comisión de Investigaciones Científicas de la Pcia de Buenos Aires.
MgCl2: Cloruro de Magnesio
CO2: Dióxido de Carbono 
CONICET: Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas
DMSO: Dimetil Sulfóxido 
dNTPs: desoxirribonucleótidos trifosfato 
DO.: Densidad Óptica
DOa: Densidad Óptiva ajustada
DOc: Densidad Óptica de corte estándar 
DFB: Débil Formadora de Biofilm
EDTA: Ácido etilendiaminotetraacético
EFSA: European Food Safety Authority
ETA: Enfermedades transmitidas por alimentos 
FAO: Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación
FCV: Facultad de Ciencias Veterinarias
FDA: Food and Drug Administration
FFB: Fuerte Formadora de Biofilm
Fw: Forward 
GRAS: Generally Recognized As Safe
h: hora 
kDa: KiloDalton
LB: Luria Bertani
LPS: Lipopolisacáridos
Mb: Megabase
MFB: Moderada Formadora de Biofilm
MRS: Man Rogosa Sharpe
ml: mililitro
NaCl: Cloruro de Sodio
OMS: Organización Mundial de la Salud 
PCR: Polymerase Chain Reaction
pH: Potencial de Hidrógeno
QPS: Qualified Presumption of Safety
RNAsa: Ribonucleasa
Rv Reverse 
seg: segundos
SLC: Sobrenadante libre de células
S-S: Salmonella-Shigella
STEC: Escherichia coli productor de toxina Shiga
SUH: Síndrome Urémico Hemolítico
TSA: Agar Tripticasa Soya
UFC: Unidades Formadoras de Colonias
Capítulo I
Introducción
Capítulo I: Introducción
La seguridad alimentaria, el acceso a alimentos de calidad en su aporte nutricional y seguros para el consumo de las personas, es un tema de gran importancia actual en la salud pública. Para evitar las enfermedades infecciosas asociadas a los alimentos, se aplican estrategias basándose en el concepto de “Una Salud”, considerando interacciones entre factores ambientales, biológicos (microorgnaismos, plantas y animales) y humanos sobre estas enfermedades. 
1.1. Enfermedades de Transmisión Alimentaria
Las enfermedades transmitidas por alimentos (ETA) son el resultado de la ingesta de alimentos o agua contaminados. En la actualidad, se reconocen más de 250 ETA causadas por patógenos, sustancias químicas y parásitos que contaminan los alimentos en distintos puntos de la cadena productiva de los mismos y afectan la salud de una persona o grupo de personas en forma aguda o crónica. Las manifestaciones clínicas más comunes de una ETA consisten en la aparición de síntomas gastrointestinales, como diarreas, pero también pueden dar lugar a síntomas neurológicos, ginecológicos, inmunológicos, pueden provocar insuficiencia multiorgánica y la muerte. Constituyen un problema sanitario y económico relevante, produciendo la muerte de 2 millones de personas por año, en su mayoría niños. Esto implica un perjuicio al desarrollo humano de los países que sufren de ETA, al ejercer presión sobre sus sistemas de salud, las economías nacionales, el comercio y el turismo (Hoffmann y Ahn, 2021). La Organización mundial de la salud ha estimado que, a causa de ETA, se producen 600 millones de casos de enfermedad debida a 31 agentes resultando
en 420.000 muertes y 33 millones de personas afectadas con secuelas de diversos grados (Havelaar et al., 2015). En Argentina, de acuerdo con las notificaciones de los años 2014 - 2016, se producen alrededor de 500.000 episodios de diarrea agudas, de los cuales entre el 40% y el 50% corresponde a menores de 5 años (Boletín Integrado de Vigilancia N° 395 – SE 03, 2018) Cabe destacar que estas cifras representan solo una pequeña porción del número real de casos de ETA dado que, para estas enfermedades existe un alto sub-reporte de casos pudiendo estimarse el número real en al menos diez veces el número de casos registrados.
1.2. Bacterias responsables de ETA
Entre los numerosos agentes infecciosos causantes de ETA se pueden mencionar a varias especies como Listeria monocytogenes, Clostridium perfringens, Clostridium botulinum, Campilobacter jejunii, Bacillus cereus, Escherichia coli (E. coli), Salmonella spp., Staphylococcus aureus (S. aureus), entre otras (Banatvala et al., 1991; Newell et al., 2010). A continuación, se describen los principales patógenos bacterianos que se utilizarán en esta Tesis.
1.2.1. Escherichia coli 
Fig. 1: Imagen de la bacteria Escherichia coli obtenida mediante microscopía de fuerza atómica en modo “tapping” (contacto intermitente) y en absencia de humedad. Se pueden observar nítidamente las estructuras flagelares y los pili (en latín “pelos”). Foto: Li, Ang. Universidad Nacional de Singapur (Singapur). SPMage: http://www.icmm.csic.es/spmage/index.php
Escherichia coli es un microorganismo Gram-negativo perteneciente a la familia Enterobacteriaceae (Fig. 1). Se caracteriza por una morfología de bacilo, con metabolismo anaerobio facultativo fermentativo, respiratorio aerobio o incluso anaerobio, pueden ser móviles o inmóviles. Esta especie forma parte de la microbiota normal del tracto intestinal del hombre, animales domésticos y silvestres. Aunque la mayoría son comensales y no producen enfermedades en organismos sanos, no obstante, otras cepas son patógenos oportunistas en individuos inmunocomprometidos (Bergey).
Se han reconocido diversas cepas patógenas de E. coli (Nataro y Kaper, 1998). Serológicamente se las puede caracterizar e identificar mediante los antígenos somáticos (O), capsular (K) y flagelar (H), hasta ahora se han detectado 174 antígenos O, 80 K y 56 H, y más de 700 serotipos producto de las distintas combinaciones antigénicas. Se clasifican en E. coli diarreigénico (DEC) y E. coli extra intestinal ExPEC. DEC agrupa serotipos productores de enfermedades severas como colitis hemorrágica (CH) y síndrome urémico hemolítico (SUH) (Griffin y Tauxe, 1991). En función de la enfermedad clínica que producen y por la identificación molecular de sus factores de virulencia. Se agrupan en seis patogrupos: E. coli enteropatogénica (EPEC), E. coli enterohemorrágica (EHEC, considerada un sub-grupo de E. coli productora de toxina Shiga (STEC)), E. coli enterotoxigénica (ETEC), E. coli enteroagregativa (EAEC), E. coli enteroinvasiva (EIEC) y E. coli de adherencia difusa (DAEC). Se consideran dos patogrupos emergentes adicionales: E. coli de adherencia invasiva (AIEC) y E. coli enteroagregativa enterohemorrágica (EAHEC) (Taylor et al., 2012). 
STEC se caracteriza por la producción de potentes citotoxinas (toxina Shiga o verotoxinas) que inhiben la síntesis de proteína en las células blanco. Sumadas a estas toxinas, se destacan otros factores de virulencia como una proteína de membrana externa, intimina, que media la adherencia de la bacteria al enterocito codificada en el gen eae presente en la Isla de Patogenicidad LEE. Puede, además, presentar un megaplásmido que contiene los genes para la síntesis de enterohemolisina (codificada en el gen ehxA), una catalasa-peroxidasa (katP), una serin proteasa extracelular (espP), una metaloprotease (stcE), una citotoxina subtilasa (subAB), fimbrias de adhesión, involucradas en la formación de biofilms sobre superficies, como por ejemplo, las fimbrias tipo I curli (Sheng et al., 2020), adhesina autoaglutinante codificada por el gen saa (Schmidt et al., 1994; Paton et al., 2001; Etcheverría y Padola, 2013) y una proteína de adherencia denominada Sab (Herold, Paton y Paton, 2009).
Debido a la importancia del serotipo O157:H7, es común clasificar los serotipos de STEC en dos categorías: O157 y no-O157 (Gyles, 2007). En los últimos años, se han reportado brotes de enfermedad asociada a serotipos no-O157, cobramdo mayor relevancia estos serotipos como O26, O103, O111, O121, O45, y O145. El nivel de riesgo de estos serotipos esta asociado a distintas combinaciones de variantes de factores de virulencia (Valilis et al., 2018). Muchas cepas STEC, poseen el locus de adherencia al enterocito (LEE) no obstante, cepas STEC LEE negativas, también se han asociado a casos de SUH, por lo que se señala que una nueva isla de patogenicidad denominada LAA, por locus de adherencia y autoagregación, sea un indicador de riesgo. Como indicador de la presencia de esta isla, se utiliza el gen hes, codificante para una hemoaglutinina (Montero et al., 2017; Vélez et al., 2020). 
La dosis de infección de este tipo de microorganismos ha sido estimada en niveles muy bajos, menor a 100 bacterias totales. Argentina tiene la mayor incidencia mundial: alrededor de 17 de cada 100.000 niños menores de 5 años, sin calcular el subregistro de la enfermedad (Rivas, Chinen y Guth, 2016). Pueden transmitirse al hombre a través del consumo de alimentos y agua contaminada, contacto con agua recreacional contaminada, transmisión persona-persona y contacto directo con animales y el ambiente (Bell et al., 1994; Crump, 2002; Holme, 2003; Fernandez et al., 2010; Etcheverría y Padola, 2013).
En la industria cárnica la contaminación se produce, en diversas etapas, en la faena, al producirse daños accidentales en tracto gastrointestinal vertiéndose el contenido sobre la carne; la contaminación debida a contactos entre las carcasas y las medias reses (Elder et al., 2000).
Las cepas ExPEC agrupa dos patotipos, las E. coli uropatogénicas (UPEC) y las E. coli de meningitis neonatal (NMEC).
1.2.2. Salmonella spp.
Fig. 2: Microfografía de stock. Salmonella Typhimurium DT 104 observada en microscopio electrónico de barrido. Mediscan / Alamy Stock Photo.
El género Salmonella (Fig. 2), integrante de la familia Enterobactericeae, se caracteriza por ser bacilos Gram-negativos, que constituyen una importante causa de enfermedades infecciosas mundialmente. Es parte de la microbiota del tracto intestinal en animales de sangre caliente. Su taxonomía ha sido modificada en varias ocasiones, según el Bergey´s manual of Determinative Bacteriology (novena edición), aceptándose dos especies: Salmonella enterica y Salmonella bongori con diferentes serovariedades, entre ellas, se destaca S. enterica Typhi causante de la fiebre tifoidea que consiste en infecciones sistémicas de tejidos hepáticos, óseos, linfáticos y nervioso. La OMS han reportado casos en 33 millones de personas estimándose 200 mil muertes por año (World Health Organization, 2015). Las serovariedades Typhimurium y Enteritidis son las causantes de la mayoría de las enterocolitis humanas. Se estima que, en Estados Unidos, un millón de casos de ETA son causadas anualmente por Salmonella spp. siendo, además, la primera causa de hospitalización y muerte (Scallan et al., 2011, 2018). La mayoría de los casos de salmonelosis en los países en desarrollo son de origen zoonótico. Se trata de una infección localizada caracterizada por diarrea y por infiltración de leucocitos polimorfonucleares (PMN) en la mucosa intestinal. En general, estos casos de enterocolitis por Salmonella Enteritidis y Typhimurium se autolimitan sin la necesidad de un tratamiento antibiótico. Sin embargo, en pacientes inmunocomprometidos o menores a 6 meses de edad, las infecciones invasivas y las diarreas sí deben ser tratadas. La resistencia ante diferentes tipos de antibióticos limita las opciones terapéuticas, comprometiendo la vida de los pacientes por la elección de drogas
menos efectivas (Karkey, Thwaites y Baker, 2018).
La ruta de entrada de Salmonella spp. es oral, por lo general, al ingerir alimentos o agua contaminados con una dosis infectiva apropiada. Una vez que la bacteria superó la barrera ácida del estómago, coloniza el intestino y atraviesa el epitelio intestinal por alguna de las siguientes vías: invasión de los enterocitos, invasión de las células M o captación por las células dendríticas (Santos y Bäumler, 2004). Una vez atravezado el epitelio, Salmonella spp. es fagocitada por los macrófagos o células dendríticas intestinales y se disemina a través del sistema retículoendotelial provocando la infección sistémica (fiebre tifoidea). Por el contrario, las serovariedades de Salmonella no tifoideas inducen una respuesta inflamatoria temprana local en la submucosa intestinal, la cual resulta en la infiltración de PMN en el lumen intestinal y en diarrea (enterocolitis) (Bernal-Bayard y Ramos-Morales, 2018; Taylor y Winter, 2020).
1.2.3. Staphylococcus spp.
Fig. 3: Micrografía electrónica de barrido de S. aureus (Gonçalves da Silva et al., 2017).
El género Staphylococcus spp. (Fig. 3) está compuesto por bacterias anaerobias facultativas, Gram positivas, distribuidas ampliamente en el mundo. Dentro de este género se destaca Staphylococcus aureus, siendo el causante más frecuente de infecciones en el ser humano debido a ser la especie más virulenta (Pahissa, 2009). S. aureus se encuentra en la piel y las mucosas, de animales de sangre caliente incluyendo al humano (Argudín, Mendoza y Rodicio, 2010; Kong et al., 2016). Mediante análisis de multi locus de secuencia (MSLT), se han podido identificar linajes relacionados en ganado bovino, caprino, ovino, así como también en humanos. Cuando penetra en los tejidos, puede ocasionar una amplia gama de infecciones debido a la producción de toxinas. Son responsables de gran variedad de enfermedades, entre ellas, osteomielitis, conjuntivitis, artritis, sinusitis, meningitis, bronquitis, neumonía, enterocolitis. Se considera que entre el 20% y el 40% de los adultos sanos son portadores asintomáticos, lo que constituye un serio problema en cuanto a la transmisión de la enfermedad. Los alimentos pueden ser también causa de intoxicación por S. aureus (Kadariya, Smith y Thapaliya, 2014).
Las enterotoxinas de Staphylococcus (SEs) son una familia de proteínas termoestables capaces de generar una respuesta pirogénica de superantígeno, desencadenando una serie de respuestas inflamatorias en el huésped (Nguyen y Tallent, 2018; Krakauer, 2019). La resistencia de estas toxinas a la temperatura, las vuelve un factor importante a tener en cuenta para la cadena productiva, y, sumado al hecho de que son poco susceptibles a la acción de proteasas como pepsina o tripsina, poseen una resistencia al pH ácido, por lo que pueden pasar fácilmente del estómago al intestino delgado, su impacto sobre la salud pública, es mayor (Schilcher y Horswill, 2020).
Dentro de la problemática debida a S. aureus, se destacan las cepas resistentes a meticilina o MRSA y las cepas susceptibles a meticlina o MSSA (Guo et al., 2020), estas cepas pueden presentar una amplia distribución poblacional, por ejemplo, se ha reportado que, en Estados Unidos, el 1,5% de la población presenta colonización con MRSA (Smith et al., 2014), esto es un factor de riesgo en internaciones en hospitales o en centros de cuidado, por lo que es deseable evitar su propagación. 
Los orígenes de la intoxicación por S. aureus difieren entre los distintos países, lo que puede deberse a diferencias en los hábitos de consumo y alimentación en cada uno (Loir et al., 2020). Los porcentajes de prevalencias varían ampliamente en alimentos listos para consumir y carnes de distintas especies como bovino, pollo, pavo y cerdo. Estas variaciones son de un 7% a 70%, en donde el porcentaje de detección de toxinas varía de un 0 a un 30%, donde la más prevalente es la toxina SEA (Moon et al., 2007; Hossein, Zargar y Doust, 2014). La prevalencia en cortes de carne de cerdo a nivel mundial varía de 45 a 70%. Estas variaciones se podrían deber a las diferencias geográficas, al ambiente, cepas naturales circulantes y a los alimentos de consumidos en cada región (Hossein, Zargar y Doust, 2014); se estima que la prevalencia de este patógeno aumenta con el procesamiento de la carne de cerdo desde la granja hasta llegar al consumidor (Colello, et al., 2018).
1.3. Biofilms bacterianos
Relacionado a la problemática que constituyen las ETA en la seguridad alimentaria en todos los niveles, desde la industria hasta las bocas de expendio; es destacable el fenómeno de los biofilms bacterianos.
Se los define como estructuras de resistencia de comunidades bacterianas formadas por múltiples o una sola especie bacteriana (Percival et al., 2011). Se encuentran adheridos a superficies de todo tipo, consistiendo en una matriz de sustancias exopoliméricas secretadas por cada célula individual que lo conforma. Su formación consiste en una serie de etapas, que se encuentran mediadas y reguladas por mecanismos de quorum sensing los cuáles inducen la transcripción diferencial de genes de aquellos de las células de vida libre o planctónicas (Costerton y Lewandowski, 1995; Davey y Toole, 2000).
En general, las etapas de la formación de un biofilm (Fig. 4) están asociadas en primer lugar a una fase de contacto y adhesión, en la que las células planctónicas se unen a la superficie, mediante sus fimbrias, flagelos, pili, asistidos por atracciones electrostáticas entre su pared celular y la superficie de adhesión, en esta fase, las células, también comienzan a adherirse entre sí y secretando los polímeros extracelulares que conforman la matriz del biofilm o EPS (Garrett, Manmohan y Zhang, 2008; Flemming y Wingender, 2010). Luego de adherirse, tiene lugar la siguiente fase, la formación de la microcolonia. En esta etapa comienzan a dividirse las células, y se produce la estratificación temprana de la estructura del biofilm. En la microcolonia se produce un activo intercambio de productos metabólicos de cada bacteria e incluso, en biofilms multiespecie, se producen asociaciones cuasi simbióticas entre las células compatibilizando distintas rutas metabólicas. Finalmente, en la maduración del biofilm, podemos observar una arquitectura en la matriz de EPS, donde, a manera de un sistema circulatorio, se forman canales internos que permiten el flujo de nutrientes y desechos de las células constituyentes (Vasudevan, 2014). Una vez que el biofilm está maduro, pueden desprenderse células de sus capas superiores que sirven para diseminarse y extender aún más la estructura (Maric y Vranes, 2007).
Los biofilms son un potencial riesgo a la salud debido a que pueden formarse en todo tipo de superficies y en particular, sobre superficies de fábricas de alimentos, desde los mismos alimentos, hasta los distintos materiales de las maquinarias, como acero inoxidable, plásticos, poliestireno, madera, goma, etc. (Abdallah et al., 2014; Colagiorgi et al., 2017). 
Los efectos perjudiciales de los biofilm no solo se limitan a su riesgo para la salud humana, sino también pueden corroer maquinarias, alterar las propiedades organolépticas de los alimentos, debido a la secreción de enzimas. Más allá de la industria alimentaria, constituyen un riesgo debido a su capacidad de formarse en insumos biomédicos, como prótesis, catéteres, implantes, marcapasos, lentes de contacto, entre otros (Donlan, 2001). 
 Si el biofilm no es removido tempranamente, se vuelve extremadamente difícil de eliminar, ya que la matriz de EPS les brinda una alta resistencia a tratamientos con luz UV, antibióticos, detergentes y desinfectantes, etc. (Oulahal-Lagsir et al., 2003; Boels, 2011; Stiefel et al., 2016; Wang et al., 2016).
Fig. 4: Etapas de la formación de Biofilm. (adaptado de Vasudevan, 2014)
1.4. Estrategias de prevención de ETA 
Debido al impacto de las ETA sobre la salud pública y la cadena productiva, surge la necesidad de encontrar nuevas herramientas que permitan la
obtención de alimentos seguros en todas sus etapas de producción. 
En la industria alimentaria, particularmente en la producción de carne, existe una serie de tratamientos para la descontaminación y la preservación del producto, los que incluyen: tratamientos con agua caliente (Smith y Graham, 1978; Sheridan, 1982), radiación infrarroja (Snijders et al., 1977), sistema de enfriado por spray (Dickson y Anderson, 1992) adicionando en paralelo sustancias químicas (Dickson, 1988; Bender, 1992; Hardin et al., 1995; Gorman, Bloomfield y Adley, 2002), agregado de ácidos orgánicos como acético (Hardin et al., 1995; Goddard et al., 1996), cítrico, propiónico (Sheridan, 1982) y láctico (Smulders, et al., 1987). Se ha optado por la combinación de tratamientos térmicos y no térmicos de preservación agrupados dentro de la tecnología de obstáculos (Leistner, 2000). También se han investigado tecnologías basadas en microondas y radiofrecuencias para la pasteurización rápida de alimentos (Koutchma, 2006; Mccleery y Rowe, 2002). Se probó la eficacia en la descontaminación de carcasas de carne bovina infectadas con distintos serotipos de STEC O157 y no-O157, con diferentes aspersiones manuales o automatizadas de ácido cítrico, acético, láctico, hipocloroso, así como también, de agua caliente y una combinación de peróxido de hidrógeno con otros desinfectantes, se ha observado que en estos casos, la aplicación de ácido láctico seguido de agua caliente en forma automatizada, fue la manera más efectiva de reducir la contaminación de STEC (Signorini et al., 2018). 
Los consumidores han expresado su interés en obtener productos de alta calidad sin conservantes químicos, y la legislación ha respondido a esta demanda restringiendo el uso de ciertos compuestos como los antibióticos (Brul y Coote, 1999; Knorr, Watzke y Knorr, 2019) u otros tratamientos; desafiando a la industria a buscar nuevas formas de preservar los alimentos manteniendo su aspecto, sabor, calidad y otras características, sin alterar.
1.4. Definición y aplicaciones de Probióticos
El efecto benéfico asociado a la alimentación con productos fermentados fue observado y reportado por primera vez en 1907 por Metchnnikoff quien relacionó la longevidad comparativamente mayor en la población de Bulgaria con el resto de Europa por el consumo de alimentos a base de yogurt y otros productos lácteos elaborados con BAL. Con el tiempo, surgió el término “probiótico” que significa “a favor de la vida”.
El mercado y la aplicación de probióticos en la industria alimentaria es un campo en creciente desarrollo. Numerosas líneas de productos comercializados y promocionados con actividades probióticas se hallan disponibles. De estos productos podemos encontrar numerosas variedades de yogures, quesos, helados, barras nutritivas, cereales y fórmulas para bebés; incluso se comercializan productos cosméticos y comprimidos con bacterias probióticas (Tang, 2015; Pavli, Tassou y Nychas, 2018; Puebla-Barragan y Reid, 2021). 
La definición precisa de probióticos ha ido evolucionando. El primero en utilizar el término fue Kollath en 1953, que los describió como suplementos orgánicos e inorgánicos que son necesarios para restaurar la salud del cuerpo en pacientes que sufrían de malnutrición. Luego de años de uso, la definición consensuada del término fue elaborada por la OMS y la FAO en 2002 siendo: “Microorganismos vivos, que, al ser administrados en cantidades adecuadas, confieren un beneficio para la salud del de huésped” (FAO, World Health Organization y Nutrition Division, 2006). En 2014, la Asociación Científica Internacional de Probióticos y Prebióticos (Swanson et al., 2020) introdujo una ligera modificación Gramatical a la definición original del 2002 para evitar el uso inapropiado del término y proteger el interés de los investigadores y consumidores (Morelli y Capurso, 2012). Este cambio tuvo como finalidad, lograr mayor claridad en la definición y excluir a ciertos tipos de productos de la definición de probióticos ya que podrían llevar a confusiones. Ejemplo de esto es el uso de alimentos fermentados de los que se desconoce la composición bacteriana o el uso de consorcios de bacterias de composición indefinida en tratamientos como el trasplante fecal (Khoruts, 2018).
Las bacterias utilizadas principalmente como probióticos corresponden a los microorganismos de los géneros Lactobacillus, y Bifidobacterium, pero existen formulaciones probióticas con microorganismos como Bacillus, E. coli o levaduras como Saccharomyces (Reid, Gadir y Dhir, 2019). 
En la actualidad, diversas líneas de investigación buscan ampliar las aplicaciones de los probióticos. Tal es el caso de los psicobióticos, probióticos administrados para tratar desórdenes psiquiátricos, en este aspecto, Dinan et al., (Dinan, Stanton y Cryan, 2013) realizaron una reseña sobre las aplicaciones de bacterias probióticas de los géneros L. rhamnosus, L. helveticus, L. casei, B. infantis y B. longum, que demostraron ser efectivos para disminuir los niveles de ansiedad, actuando como antidepresivos. Se ha observado que modulan la respuesta inmune y secretan diversos neurotransmisores conformando el eje microbiota-intestino-cerebro. 
Aunque la mayoría de los probióticos pertenecen a géneros de BAL, existen bacterias Gram negativas con propiedades probióticas, entre estas, cepas de E. coli con probados efectos beneficiosos y comercialmente disponibles en Europa. Ejemplo de estas cepas es E. coli Nissle 1917. Esta cepa es administrada en forma de comprimidos (bajo el nombre de Mutaflor) para el tratamiento de enfermedades diarreicas, mejorar la función intestinal, prevenir la constipación y en neonatos, evitar la colonización de bacterias multi resistentes a los antibióticos (Lodinová-Žádníková y Sonnenborn, 1997; Boudeau et al., 2003; Kruis et al., 2004; Grabig et al., 2006; Henker, Laass y Blokhin, 2007).
1.5. Biopreservación y probióticos
Con la finalidad de evitar la contaminación de alimentos por microorganismos patógenos, minimizar el uso de aditivos químicos como cloro, nitritos, o ácidos orgánicos y extender la vida útil de los productos en los comercios, existe una tendencia creciente en las diversas industrias alimenticias a utilizar sustancias de origen natural, derivadas de bacterias, hongos, plantas o animales y dentro de estas opciones, se destaca el uso de microorganismos generalmente considerados seguros, GRAS (generally regarded as safe) y que usualmente comprenden bacterias ácido lácticas (BAL). Estos microorganismos poseen actividad antimicrobiana debida a la acidificación del medio que generan por su metabolismo ácido y a la producción de diversas sustancias como peróxido de hidrógeno, diacetilo y bacteriocinas. Las principales cepas utilizadas en biopreservación pertenecen a los géneros Lactobacillus spp (actualmente sujeto a una reclasificación interna donde, por ejemplo, Lactobacillus plantarum, se renombró como Lactiplantibacillus plantarum subespecie plantarum), Lactococcus, Pediococcus, Leuconostoc, entre otros (Libudzisz, 2002; Coeuret, Gueguen y Vernoux, 2004; Karpiński y Szkaradkiewicz, 2013).
La mayoría de las cepas BAL son productoras de bacteriocinas, que constituyen sustancias antimicrobianas de gran interés. Actualmente, la única bacteriocina aprobada a nivel mundial para su uso como agente biopreservador es la nisina, sintetizada por Lactococcus lactis, que ha demostrado ser efectiva contra múltiples patógenos de importancia, entre ellos, se destacan, Listeria monocytogenes, Clostridium botulinum, E. coli y Salmonella spp. Es utilizada como conservante en alimentos de origen cárnico, lácteos, frutas y vegetales. Al ser digerida rápidamente por la tripsina, permanece poco tiempo en el organismo por ello es considerada como no tóxica para organismos superiores y humanos (Piard y Desmazeaud, 1991). Sin embargo, la nisina posee limitaciones, no puede ser utilizada directamente sobre la carne debido a que se une a su superficie y se distribuye desigualmente y posee baja estabilidad (Delves‐Broughton,
1990). Se ha demostrado la reducida efectividad de la nisina frente a infecciones por patógenos Gram negativos como Aeromonas, Escherichia, Salmonella, Shigella, y Yersinia spp. si estas no son expuestas a un estrés sub letal adicional (Cutter y Siragusa, 1998). 
El uso y búsqueda de nuevas sustancias antimicrobianas, continúa siendo una alternativa al uso de otros preservantes químicos y a los antibióticos, debido a la ausencia de efectos tóxicos en células eucariotas (Klement y Sands, 1990; Davies et al., 1999; Cleveland et al., 2001; De Souza, Da Silva y De Sousa, 2005; Altuntas, 2013). La búsqueda de nuevas estrategias de preservación de alimentos y la prevención de la contaminación debida a bacterias patógenas es necesaria.
1.6. Probióticos y Bacteriocinas 
La acción benéfica de los probióticos para el huésped, es debida a su antagonismo contra cepas patógenas o potencialmente patógenas del tracto gastrointestinal. Se ha reportado que las cepas probióticas son activas productoras de sustancias antimicrobianas como ácidos grasos de cadena corta, peróxido de hidrógeno, ácidos orgánicos, óxido nítrico y bacteriocinas.
Se define a las bacteriocinas como péptidos con actividad antimicrobiana de síntesis ribosomal, para diferenciarlas de aquellas sustancias producto del metabolismo secundario como los antibióticos o los glico y lipopéptidos con actividad antimicrobiana. En su ambiente natural, las diferentes especies bacterianas se encuentran sometidas a una constante competencia por nutrientes y sitios de adherencia con otras bacterias, en especial las más relacionadas genéticamente, que tendrán necesidades similares. La ocurrencia de las bacteriocinas en las bacterias es altamente frecuente, se han detectado al menos una bacteriocina en los genomas de todas las especies de bacterias Gram positivas y negativas, así como, también, en varias especies de Archeas (Kumariya et al., 2019).
Las primeras bacteriocinas fueron descubiertas en E. coli (Gratia, 1925), mientras que en bacterias Gram-positivas fueron descriptas por primera vez por Klaenhammer (Klaenhammer, 1993). Se han descripto centenares de bacteriocinas (Bactibase, 2013; Bagel, 2013). Se producen en las células en condiciones de estrés (Respuesta S.O.S) e inhiben el crecimiento de cepas relacionadas (Cintas et al., 1998; Riley y Gordon, 1999; Ennahar et al., 2000; Cascales et al., 2007; Nes, Diep y Holo, 2007; Oppegard et al., 2007; Suwanjinda, Eames y Panbangred, 2007). Son activas a nivel de membrana de la célula diana incidiendo en la fuga de iones y la pérdida de la fuerza protón motriz que en conjunto llevan a la muerte celular (Moll et al., 1999; Rodríguez, Martínez y Kok, 2002); otras inducen la lisis celular (Gonzalez et al., 1994) o inhiben la síntesis de péptidoglucano (Moll, Konings y Driessen, 1999). 
La producción de bacteriocinas es una característica deseable en toda cepa probiótica que vaya a ser utilizada como tal. 
1.6.1. Clasificación y biología de bacteriocinas
La clasificación de las bacteriocinas es un tópico en constante cambio y revisión, actualmente no existe un consenso en un esquema definitivo para agruparlas. Se han optado por criterios basados en su estructura química y secuencia de aminoácidos, en características genéticas y funcionales. En este trabajo, optaremos por presentar la clasificación que presentamos a continuación adaptada de la reseña de Simons, et al., ((Simons, Alhanout y Duval, 2020).
1.6.1.1. Clasificación de Bacteriocinas en Bacterias Gram Positivas
	
En bacterias Gram Positivas (G+) las bacteriocinas se encuentran agrupadas en cuatro clases (Fig. 5. A). 
Clase I: También llamadas Lantibióticos, representadas por péptidos pequeños (<5 Kda), estables al calor, pH y proteólisis, con modificaciones post-transcripcionales y post-traduccionales, esta última evidenciada por la presencia de aminoácidos inusuales como lantionina y 3-metil lantionina. A su vez, esta clase de bacteriocinas se divide en dos subclases, basadas en la carga neta de la molécula, la subclase Ia, caracterizada por moléculas de carga positiva, esta subclase comprende a la nisina, gallidermina y epidermina y su modo de acción es por la generación de poros en la membrana bacteriana provocando la pérdida de potencial de membrana. La subclase Ib, representada por moléculas de carga negativa, con estructura globular, poseen acción inhibitoria de enzimas esenciales de la célula blanco; por ejemplo, lacticina 481, salivaricina y citolisina (Bierbaum y Sahl, 2009; Nishie, Nagao y Sonomoto, 2012; Zacharof y Lovitt, 2012; Ahmad et al., 2017). 
Las de clase II, son péptidos pequeños (<10 KDa) termoestables, pero, a diferencia de la Clase I, no poseen modificaciones post-traduccionales, excepto, la formación de puentes disulfuro. Su actividad es mediante la formación de poros en la membrana o la permeabilización y desestabilización de ésta. Se agrupan en cuatro subcategorías, subclase IIa son bacteriocinas con actividad anti-Listeria y poseen una estructura lineal con puentes bisulfuro, pediocina PA1, leucocina A y acidocina A son ejemplos de esta clase. La subclase IIb se caracteriza por necesitar la combinación de dos cadenas peptídicas (α y β) para ser activas, ejemplos de esta son la plantaricina NC8, lactococina Q. La subclase IIc están asociadas a un péptido líder con uno o dos residuos de cisteína en su secuencia y con una estructura cíclica, ejemplos son la lactococina A y acidocina B. Finalmente, la subclase IId comprende a bacteriocinas <10 KDa, pero diferentes a la pediocina, ejemplo de esta es garvicina A o Q (Maldonado-Barragán et al., 2013; Tymoszewska et al., 2017). Esta última subclase se halla en revisión (Green et al., 1997; Héchard y Sahl, 2002; Fimland, Johnsen y Nissen-meyer, 2005; Kjos et al., 2010; Nissen-Meyer et al., 2010; Devi y Halami, 2011).
Las bacteriocinas de Clase III son péptidos grandes (>30 KDa) termosensibles y con actividad enzimática (endopeptidasa, por ejemplo), capaces de degradar la pared celular bacteriana; ejemplos son la zoocina A y la helveticina J (Joerger y Klaenhammer, 1986; Vaughan, Daly y Fitzgerald, 1992).
Las bacteriocinas de Clase IV. Comprenden péptidos con modificaciones post-traduccionales que incluyen lípidos e hidratos de carbono en sus estructuras, en consecuencia, son moléculas sensibles a enzimas glicolíticas y lipolíticas. La plantaricina S y la Leuconocina S son ejemplos de esta clase (Kawai et al., 2004).
1.6.1.2. Clasificación de bacteriocinas en bacterias Gram negativas
Las bacteriocinas en las bacterias Gram negativas (G-) (Fig. 5. B) poseen un espectro de acción más reducido en comparación a las bacteriocinas de bacterias G+, no obstante, son efectivas contra muchos patógenos de importancia. La mayoría de estas bacteriocinas han sido identificadas en cepas de E. coli, pero, también han sido identificadas en Shigella, Yersinia, Klebisella y Pseudomonas spp. (Riley y Chavan, 2007; Severinov et al., 2007; Yang et al., 2014).
Se clasifican en: Colicinas, moléculas mayores a 10 KDa, poseen dos modelos de acción, la formación de poros en la pared celular ejemplificadas por las colicinas A, B, E1, Ia, Ib y la degradación de ácidos nucleicos (ADNsa, ARNsa o tARNsa) en colicinas de la serie E2 a E9 (James et al., 2002; Papadakos, Wojdyla y Kleanthous, 2012). Las colicinas se encuentran, a menudo, codificadas en plásmidos colicinogénicos (pCol) que varían en plásmidos multicopia tamaño 5-10 Kb o plásmidos de bajo número de copia de más de 40 Kb. Su expresión está a menudo asociada a la expresión de genes de lisis que provocan la muerte de la célula productora y la liberación de las moléculas al exterior, y de proteínas inmunitarias que evitan la acción sobre clones de la célula productora (Gillor, Kirkup y Riley, 2004; Bakkal et al., 2010). Una segunda categoría comprende a las bacteriocinas producidas por otras cepas G- distintas a E. coli, pero con actividad similar a las colicinas descriptas anteriormente, como las piocinas de Pseudomonas aeruginosa (Michel-briand y Baysse,
2002).
La segunda clase de bacteriocinas G- agrupa a péptidos de pequeño tamaño (<10 KDa) y son llamadas por ello, microcinas. Su modo de acción es diverso, actúan interfiriendo en la permeabilidad de la membrana celular, inhibiendo diversas funciones enzimáticas como la ATPsintasa, ARNpol y ADNgirasa. Se hallan subdivididas en dos subclases, la subclase I comprende a moléculas menores a 5 KDa y sufren modificaciones post-transcripcionales y post-traduccionales, ejemplo son microcinas B17, J25 y C7. La sublase II agrupa a moléculas de tamaño entre los 5 y 10 KDa, sin modificaciones y ejemplificadas por microcinas H47 y E492. Su secreción es mediante un transportador ABC (Pons et al., 2004; Duquesne et al., 2007). 
El espectro de acción de las microcinas es, en comparación con las colicinas, superior, afectando a bacterias de las especies Salmonella, Pseudomonas, Proteus, Enterobacter, Citrobacter, Klebsiella y Yersinia.
Las bacteriocinas tipo fago o tailocinas, se denominan así por a la similitud estructural a los bacteriofágos; se caracterizan por alto peso molecular y por una estructura cilíndrica capaz de unirse a la pared celular bacteriana y producir un poro en ésta. Se cree que provienen de la “domesticación” de genomas de fagos, y se las ha identificado principalmente en P. aeruginosa. (Nakayama et al., 2000; Scholl, 2017).
A
B
Fig. 5: A: Clasificación de Bacteriocinas en bacterias Gram+. B: Clasificación de Bacteriocinas en bacterias Gram-. (Adaptado de Simons et al., 2020)
1.6.1.3. Bacteriocinas en Arqueas
Las bacteriocinas que se han identificado hasta la fecha en Arqueas corresponden a Halobacteria y Sulfolobus llamándose en concordancia, halocinas y sulfolobicinas (Karthikeyan, Bhat y Chandrasekaran, 2013; Charlesworth y Burns, 2015). Halocinas presentan una alta diversidad de acuerdo a su peso molecular y actúan a nivel de la permeabilidad de la membrana celular afectando diversos sistemas de transporte de iones. Son secretadas entre la fase exponencial tardía y la fase estacionaria temprana. En cuanto a las sulfolobicinas, aún no se ha descripto su modo de acción, pero si su espectro reducido a Sulfolobus y se las ha caracterizado como moléculas resistentes a pH 2-4 y temperaturas de 65-85°C (Ellen et al., 2011).
1.6.1.4. Propuestas alternativas de clasificación
Como se explicó anteriormente, los criterios de clasificación de bacteriocinas están en constante revisión; nuevos criterios son propuestos para abarcar la mayor cantidad de moléculas identificadas y lograr una mayor consistencia. Se ha propuesto un nuevo esquema de clasificación basado en la presencia de motivos conservados de aminoácidos, que englobaría al 70% de las bacteriocinas descriptas en la actualidad (Zouhir et al., 2010). Este criterio sólo ha sido aplicado a bacteriocinas G+. por lo que quedarían fuera un número importante de bacteriocinas. Una razón de esto, es que la filogenia de las bacteriocinas G+ está bien descripta, mientras que, en el caso de las bacteriocinas G-, aún no hay bases de datos suficientemente robustas para comparar los motivos (Zimina et al., 2020).
1.6.2. Modos de acción de bacteriocinas
Dobson y colaboradores (Dobson et al., 2012) realizaron una reseña bibliográfica en la que se describen los posibles roles de las bacteriocinas en la dinámica de las cepas probióticas del tracto gastrointestinal (Fig. 6). En primer lugar (Fig. 6. A), las bacteriocinas tienen la función de mediar en la colonización de la cepa probiótica en el epitelio, debido a que es un ambiente densamente poblado por diversas bacterias. La producción de una proteína inhibitoria actúa sobre individuos sensibles y le brinda una ventaja competitiva a la cepa productora sobre el resto. En este aspecto, Gillor et al., (2008), demostraron que, en ratones tratados con estreptomicina, las poblaciones de E. coli productoras de bacteriocina se encontraban varios órdenes de magnitud por encima de las no productoras y presentaban una mayor colonización intestinal. 
En otro estudio, una mezcla de cinco cepas probióticas de Lactobacillus y Pediococcus, de las que, sólo una de ellas era productora de bacteriocinas, fue administrada a cerdos infectados con Salmonella, luego de la ingesta, mejoraron los parámetros microbiológicos y la cepa predominante fue la de Lactobacillus productora de bacteriocina(Walsh et al., 2008).
Un estudio realizado con ratones tratados con dos cepas de Enterococcus faecium productor de bacteriocinas y no, los animales tratados con la cepa productora, presentaron poblaciones significativamente mayores de Lactobacillus en relación a los tratados con la no productora, esto demuestra, según los autores, que la cepa productora es capaz de modular la población de cepas insensibles a bacteriocinas (Bhardwaj et al., 2010).
Otra de las actividades de las bacteriocinas relacionadas a la función probiótica de las cepas productoras, es su actividad como “péptidos asesinos” de bacterias sensibles (Fig. 6. B). Estudios realizados para evaluar la actividad inhibitoria de bacterias productoras de bacteriocinas sobre patógenos han demostrado, por ejemplo, que L. salivarius o Paenibacillus polymyxa productores de bacteriocinas son capaces de inhibir a Campylobacter jejuni in vitro o, al administrar directamente 250 mg de las bacteriocinas encapsuladas suministradas in vivo a pollos de plantas de producción avícola (Stern, 2008). El uso de cepas potencialmente probióticas de bacterias Gram negativas también ha sido explorado, una cepa de E. coli H22 productora de bacteriocinas como microcina C7, colicinas Ib y E1 demostraron ser activas in vitro contra Klebsiella pneumoniae y Salmonella spp; en estudios de ratones libres de gérmenes, se observó una reducción en la población de Shigella flexneri en la materia fecal, estos resultados, y el hecho de que esta cepa sea ineficiente en inhibir cepas humanas probióticas de los phyla Bacteroidetes y Bifidobacterium, la posicionan como un candidato a utilizarse como probiótico (Cursino et al., 2006). En otro caso, una mezcla de cepas de E. coli productoras de colicina E7 fue administrada a terneros con el objetivo de inhibir a E. coli O157:H7 observándose una marcada reducción de este patógeno en la materia fecal de los individuos tratados en relación al grupo control (Schamberger y Diez-Gonzalez, 2004).
Otro rol de las bacteriocinas en la actividad probiótica, es su potencial como péptidos señalizadores (Fig. 6. C) . En poblaciones bacterianas, existen mecanismos de comunicación entre los individuos de una misma cepa mediadas por moléculas difusibles que participan en el proceso llamado quorum sensing que les sirve para sincronizar respuestas grupales a estímulos ambientales; una de estas moléculas, es la homoserin lactona en bacterias Gram negativas. Se ha propuesto a las bacteriocinas con un rol dual en este proceso, a altas concentraciones, actúan de manera inhibitoria, mientras que, a bajas concentraciones, son moléculas señalizadoras. El mecanismo de este proceso suele estar mediado por un sistema de dos componentes con un receptor de membrana, a menudo una Proteína Histidina Kinasa, y un regulador de respuesta intracelular; un ejemplo es la nisina que actúa como autoinductor de su propia síntesis, actuando, así como molécula inhibitoria y señalizadora (Kleerebezem, 2004). La actividad señalizadora no está restringida intraespecificamente, se ha reportado que cepas de L. plantarum cocultivadas con distintas cepas BAL varían en sus niveles de expresión de bacteriocinas (Cagno et al., 2011). Se registró que, la síntesis de Plantaricina A en L. plantarum, es inducida por la presencia de una cepa sensible, como L. sanfranciscensis DPPMA174; en este caso, la bacteriocina también activa la expresión de genes de rutas metabólicas relacionados al sistema S.O.S. (Calasso et al., 2013). A nivel del tracto gastrointestinal, se ha propuesto que las bacteriocinas son capaces de modular y reclutar a células del sistema inmune, por ejemplo, en el caso de L. plantarum WCFSI puede modular perfiles
de citoquinas, de células dendríticas y de células mononucleares de sangre periférica; la deleción de genes de bacteriocinas en L. plantarum, demostró afectar a estas células (Meijerink et al., 2010; Van Hemert et al., 2010).
En la Fig. 7 se observa un resumen de los modos de acción de diferentes bacteriocinas de bacterias Gram + o – contra las respectivas células blanco, adaptado a partir de la revisión de Cotter y colaboradores (Cotter, Ross y Hill, 2013).
Estos antecedentes ponen en evidencia que las bacteriocinas y sus cepas productoras son necesarias para la funcionalidad probiótica.
Fig. 6: Actividades propuestas de las bacteriocinas en la función probiótica. A: Actividad de las bacteriocinas como péptidos colonizadores. B: Actividad de las bacteriocinas como péptidos asesinos de patógenos presentes en el lumen intestinal. C: Actividad señalizadora de las bacteriocinas para reclutar células del sistema inmune. Adaptado de Dobson, et al 2012). 
Fig. 7: Modos de acción de bacteriocinas representativas. Izquierda; actividad de bacteriocinas de bacterias G+ contra células G+ alterando la envoltura celular. Derecha; actividad de bacteriocinas que inhiben bacterias G- necesitan ser translocadas por receptores específicos y poseen diversas actividades enzimáticas. Adaptado de Cotter, et al., 2012
.
1.6.3. Potenciales aplicaciones de las bacteriocinas 
El potencial de las bacteriocinas como agentes de biopreservación de alimentos contra diferentes patógenos ha sido discutido ampliamente (Montalban-Lopez et al., 2011; Silva, Silva y Ribeiro, 2018; Kumariya et al., 2019; Negash y Tsehai, 2020). Otras aplicaciones de importancia en la salud pública también han sido exploradas (Chikindas et al., 2018). 
El uso de bacterias productoras de bacteriocinas como probióticos es de amplia aplicación. Las cepas de BAL, por su estatus GRAS, son reconocidas cómo potenciales probióticos. El uso de bacterias Gram negativas como probióticos, es un tópico en debate. En Europa, está aprobado el uso probiótico de preparados compuestos por cepas de E. coli Nissle 1917, denominadas Mutaflor, E. coli colinfant, E. coli symbioflor (Jacobi y Malfertheiner, 2011; Beimfohr, 2016). 
Además de su uso como biopreservadores antagónicos a patógenos de ETA, las bacteriocinas poseen potenciales aplicaciones novedosas en la salud animal y humana.
1.6.3.1. Aplicaciones de bacteriocinas en salud animal
El uso de la nisina no se restringe solo a la aplicación en alimentos, sino que es comercializada en preparaciones desinfectantes de aplicación tópica e intramamaria, Teat seal®, Wipe Out®, MastOut®, Inmuncell Corp y Cross Vetpharm, respectivamente, aplicado al ganado lechero con mastitis, debido a Staphylococcus aureus, Streptococcus uberis y Streptococcus agalactiae. Alternativamente, se han probado bacteriocinas expresadas por estos géneros para su tratamiento con resultados prometedores (Coelho Varella et al., 2007). También se han utilizado bacteriocinas de Lactococcus lactis contra bacterias involucradas en mastitis (Crispie et al., 2005).
El uso de antibióticos como promotores del crecimiento en la cría intensiva de animales, por ejemplo, aves, ha recibido críticas debido a la posible asociación entre su uso y la aparición de cepas patógenas multiresistentes (Diez-Gonzalez, 2007). En relación a esta aplicación, Grilli y colaboradores (Grilli et al., 2009) utilizaron una preparación parcialmente purificada de pediocina PA-1 para inhibir Clostridium perfringens en granjas de pollos, obteniéndose, adicionalmente una ganancia de peso en los individuos.
En criaderos de ganado porcino, Hu et al., 2018, utilizaron la bacteriocina circular gasericina A, purificada a partir de Lactobacillus gasseri LA39, como estrategia para minimizar el efecto de diarreas en lechones. La cepa productora de esta bacteriocina es parte de la microbiota normal de estos animales. 
El uso de bacteriocinas no se restringe solo a aquellas producidas por bacterias G+, colicina E1 y microcina J25, producidas por E. coli se han aplicado tanto en producción avícola como porcina, mejorándose la ganancia de peso en cerdos e inhibiendo el crecimiento de Salmonella y de cepas ETEC en aves (Cutler et al., 2007; Yu et al., 2018). 
1.6.3.2. Aplicaciones potenciales en salud humana
La actividad antimicrobiana de las bacteriocinas producidas por cepas GRAS está intrínsecamente asociada a la condición de probiótico de estas cepas, por lo que, pueden suministrarse a individuos sin riesgo alguno en tratamientos orientados a la recuperación de la microbiota intestinal, por ejemplo, luego de un ciclo de quimioterapia (Lazzarini et al., 2005).
Una de las principales aplicaciones de las bacteriocinas en la salud humana es el tratamiento de bacterias multiresistentes a antibióticos responsables de infecciones intrahospitalarias. Se ha probado la efectividad de Lactacin 3147 y Nisina A (Piper et al., 2009) contra MRSA y VRE (Enterococcus resistente a vancomicina). Aunque la aparición de resistencia o tolerancia a bacteriocinas es un factor a tener en cuenta en las aplicaciones terapéuticas, una alternativa sería el empleo de combinaciones de bacteriocinas de distintos orígenes o de bacteriocinas modificadas en su secuencia peptídica para evadir la resistencia adquirida por las células blanco.
Otra potencial de las bacteriocinas es el tratamiento anticancerígeno, se ha probado la citotoxicidad de las bacteriocinas producidas por bacterias G- tales como colicina E492. A, D, E1-E3 (Lancaster, Wintermeyer y Rodnina, 2007) o de bacteriocinas de G+ como nisina (Joo et al., 2012). La actividad potencialmente anticancerígena ha sido analizada in vitro, por lo que aún es necesario realizar ensayos in vivo para afirmar su efectividad, no obstante, Kaur (Kaur y Kaur, 2015) evaluó el potencial citotóxico de las bacteriocinas de diversos orígenes y concluyó que la principal actividad anticancerígena es debida a la inducción de la apoptosis, resultante de la despolarización de la membrana celular mediada por las bacteriocinas. 
En conclusión, las bacteriocinas son moléculas con potenciales aplicaciones de importancia a nivel de la industria alimenticia, la salud animal y la salud humana. Por ende, la búsqueda de cepas productoras y la caracterización funcional de estas moléculas es de suma importancia. 
1.6.4. Bacteriocinas recombinantes 
Las diferentes tecnologías de biología molecular han sido exploradas para mejorar los rendimientos en la producción masiva de bacteriocinas, ampliar su espectro de acción y reducir la aparición de resistencia en las células blanco.
Para ampliar el espectro de acción de las bacteriocinas se han explorado fusiones entre bacteriocinas de bacterias Gram positivas y negativas. Un ejemplo es la fusión entre enterocina CRL35 y microcina V, denominada Ent35-MccV. Esta quimera demostró ser efectiva contra diferentes cepas patógenas de E. coli, Salmonella, P. aeruginosa, L. monocytogenes, Enterococcus faecalis y Actinobacter baumanii (Acuña et al., 2012). Un estudio similar, exploró la fusión de entrerocina A y colicina E1, obteniendo un péptido estable a diferentes condiciones de temperatura, pH y concentraciones de sal; activo contra patógenos Gram positivos y negativos (Fathizadeh et al., 2020). Se puede destacar el péptido construido en base a colicina Ia y a una feromona agrD de S. aureus, este constructo demostró ser efectivo contra MRSA y MSSA, presentando en estos casos, un efecto bactericida (Qiu et al., 2003). La modificación de la secuencia de aminoácidos de bacteriocinas con probada actividad es una opción prometedora, el uso de derivados de nisina, obtenidos por mutagénesis dirigida, demostraron una mayor actividad contra patógenos Gram negativos de origen clínico, veterinario y alimenticio y también contra bacterias cómo E. coli, Salmonella Typhimurium y Cronobacter sakazakii (Field et al., 2012).
El uso de vectores de expresión heterólogos ha sido explorado para mejorar los parámetros de rendimiento en la producción de bacteriocinas. El vector
de expresión por excelencia es E. coli, en este aspecto Mesa Pereyra (Mesa-Pereira et al., 2018) realizaron una reseña bibliográfica donde exploraban las distintas bacteriocinas, de diversos orígenes, clonadas en vectores de expresión de E. coli, describiendo las ventajas y desventajas obtenidas. La sobreexpresión de Plantaricina NC8 alfa y beta en E. coli y su posterior purificación, presentando actividad inhibitoria contra Salmonella spp. (Jiang, Li y Gu, 2016). 
En ocasiones, E. coli, no es un vector apropiado, por lo que se ha optado por otros. En el caso de la expresión de la Plantaricina JK se optó por clonar en un vector de Lactococcus lactis inducible bajo el control de nisina obteniendo altos rendimientos de esta bacteriocina y manteniéndose su actividad probada sobre S. aureus. (Xu et al., 2019). Otros vectores, como levaduras, también se han utilizado, con el objetivo de producir por ejemplo leucocina C, se logró clonar el gen de esta bacteriocina en la levadura probiótica Saccharomyces boulardii con el objetivo de ampliar la aplicación probiótica de la levadura (Li et al., 2021).
La expresión en vectores eucariotas es otra opción debido a la mayor biomasa obtenida. El clonado y expresión de bacteriocinas con diversos orígenes y modos de acción fue probado en Arabidopsis thaliana, una planta modelo, y subsecuentemente, en tomate (Solanum licopersicum), la transformación fue estable, y las bacteriocinas producidas mantuvieron su actividad, esto hace que el uso de plantas transgénicas para la producción de bacteriocinas sea una opción con gran potencial (Mirzaee et al., 2021).
En conclusión, las bacteriocinas son moléculas con potenciales aplicaciones de importancia a nivel de la industria alimenticia, la salud animal y la salud humana. Por ende, la búsqueda de cepas productoras y la caracterización funcional de estas moléculas es de suma importancia.
Capítulo II
Hipótesis y Objetivos
Capítulo II Hipótesis y Objetivos
Hipótesis de Trabajo
Escherichia coli y Lactobacillus spp aislados de distintos orígenes, inhiben patógenos productores de ETA al producir sustancias antimicrobianas.
Objetivo General
Obtener y caracterizar sustancias con actividad antimicrobiana a partir de cepas de Escherichia coli y Lactobacillus spp. aisladas de diferentes orígenes y evaluar su actividad inhibitoria sobre patógenos productores de ETA.
Objetivos Particulares
Para cumplir el objetivo general expuesto, proponemos:
1. Extraer y purificar sustancias antimicrobianas sintetizadas por cepas de Lactobacillus spp. y Escherichia coli aisladas en cortes de carne porcina y colon de bovinos.
2. Identificar las diferentes sustancias antimicrobianas, mediante PCR y Secuenciación Genómica. 
3. Caracterizar las sustancias inhibitorias extraídas en su actividad y estabilidad frente a diferentes procesos físico-químicos.
4. Analizar el efecto de las sustancias inhibitorias sobre biofilms bacterianos.
Capítulo III
Metodología
Capítulo III Metodología
A. Origen de las cepas
A.1. Cepas bacteriocinogénicas utilizadas
Se utilizaron cepas de Escherichia coli productoras de colicinas (Col E. coli) aisladas de colon bovino y de Lactiplantibacillus plantarum (L. plantarum) aislada de materia fecal porcina. Estas cepas fueron caracterizadas como comensales, no detectándose de factores de virulencia y demostraron tener actividad antimicrobiana.
Se trabajó con un número inicial entre 6 cepas de Col E. coli y 4 de L. plantarum. 
Estas cepas fueron registradas como:
· Col E. coli 4.8
· Col E. coli 8.2
· Col E. coli 13.7
· Col E. coli 24.7
· Col E. coli 27.4
· Col E. coli 27.12
· L. p 05
· L. p 21.2
· L. p 31.1
· L. p 31.2
A.2. Cepas patógenas utilizadas
Se utilizaron como cepas patógenas para probar el efecto inhibitorio, 3 cepas STEC O157:H7 aisladas de casos clínicos de SUH, colitis hemorrágica y ganado bovino (código interno DS8; SUH 73 STEC 166); una cepa de Salmonella Typhimurium aislada de criaderos porcinos y una de Staphylococcus aislada de la boca de expendio de carne porcina (Colello, et al., 2016 y 2017).
A.3. Cultivo en medio líquido
Col E. coli, STEC, Salmonella Typhimurium y S. aureus fueron cultivadas en 250 ml de medio LB (Luria Bertani) a 37ºC en agitación durante 18 h.
L. plantarum fueron cultivados en 250 ml de caldo MRS (de Man, Rogosa, Sharpe). Durante 18 h a 37°C en microaerofilia.
A.4. Mantenimiento de las cepas
Cultivos líquidos de las bacterias en estudio fueron conservados en criotubos con 20% de glicerol y congelados a -70°C.
B. Extracción y concentración parcial de sustancias antimicrobianas
Los cultivos de E. coli y L. plantarum. se centrifugaron a 12.000 rpm durante 30 min. a 4°C. Los sobrenadantes se filtraron a través de una membrana de 0,22 µm obteniéndose sobrenadantes libres de células (SLC). Estos luego fueron concentrados mediante diferentes técnicas descriptas a continuación:
B.1. Precipitación son sulfato de amonio: Los SLC fueron precipitado con sulfato de amonio (40% de saturación). Las mezclas se mantuvieron en agitación por 2 h a 4°C y luego se centrifugaron a 12.000 rpm durante 20 min. (Klaenhammer, 1998). Los precipitados obtenidos se resuspendieron en 1, 5 o 10 ml de PBS 0,05M (pH 7).
 
B.2. Precipitación con ácido tricloroacético/acetona: Los SLC fueron precipitados con ácido tricloroacético (TCA) glacial al 20% durante 1h en hielo, luego se centrifugó a 12.000 rpm durante 30 min. los precipitados obtenidos fueron lavados con acetona fría y mantenidos a -20°C durante 20 min., posteriormente se centrifugaron a 12.000 rpm en 4°C por 15 min. Se descartó la acetona mediante una pipeta y por evaporación en la estufa. Se resuspendió el precipitado en 1, 5 o 10 ml de PBS 0.05 M (pH 7). 	
B.3. Concentración por liofilización: Los SLC fueron congelados a -70°C y llevados al liofilizador Thermovac® durante 24-48 h hasta obtener un polvo fino. Los precipitados obtenidos se resuspendieron en 1, 5 o 10 ml de PBS 0,05M (pH 7).
C. Ensayo de inhibición
Posterior a la concentración, se probó la actividad inhibitoria de la fracción obtenida mediante ensayos de inhibición. Se utilizaron placas de LB agar, en las que se vertieron 10 o 5 ml LB agar 0,4-0,7% inoculado con 105 UFC/ml de cada patógeno en estudio. Una vez gelificado, se realizaron pocillos con ayuda de un sacabocado estéril y en estos, se colocó un volumen de cada uno de los SLC parcialmente purificado (30-95 µl) y se incubó a 37°C durante 18 h.
La presencia de inhibición se constató mediante la observación, alrededor del pocillo, de una zona translúcida indicativa de la ausencia de crecimiento bacteriano producto del efecto inhibitorio. Si la zona posee un diámetro mayor a 1 mm, se consideró como positiva.
D. Cuantificación proteica
Se utilizó el protocolo de Bradford (Bradford, 1976) para cuantificar los extractos en los diferentes esquemas. Se preparó el reactivo de reacción disolviendo Coomasie Blue G-250 en etanol 95% y ácido fosfórico. Se confeccionó la curva estándar utilizando Sero Albumina Bovina (BSA Sigma Aldrich®). Cada muestra en estudio fue alicoutada utilizada pura y diluida en diferentes proporciones (1:10, 1:100, 1:1000). Se analizó la concentración mediante lectura de ABS595 en cubetas de cuarzo.
E. Extracción de ADN
E.1. Extracción de ADN Genómico 
Se utilizó el kit de extracción InBio Highway Puriprep B Kit®. Las cepas de Col E. coli y L. plantarum. se incubaron en caldo LB y MRS. Se siguieron los siguientes pasos:
1) Se centrifugaron 2 ml de cada cultivo a 10.000 g descartando el sobrenadante. 
2) Se resuspendió el precipitado en 1 ml de buffer TE, centrifugando a 10.000 g y descartando el sobrenadante.
3) Se resuspendió el precipitado en180 µl de buffer BRB. Se incubó 30 min. a 37°C.
4) Se agregaron 200 µl de buffet BT y 20 µl de solución de proteinasa K (20 µg/ml).
5) Se agregaron 4 µl de solución de RNAsa A (10 mg/ml) e incubando por 30 min a 37°C.
6) Se agregaron 10 µl de buffer BL mezclando por inversión varias veces.
7) Se incubó durante 15 min a 56°C, al finalizar se dio