Tesis doctoral Maria Laura Chiapparrone pdf

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Doctorado en Ciencia Animal 
Tesis 
 
Caracterización fenotípica y genotípica de cepas de 
Campylobacter fetus aisladas de rodeos bovinos 
 
 
Por: María Laura Chiapparrone 
 
 
 
Facultad de Ciencias Veterinarias 
U.N.C.P.B.A. 
 
 
 
 
 
2018 
Doctorado en Ciencia Animal 
Tesis 
 
Caracterización fenotípica y genotípica de cepas de 
Campylobacter fetus aisladas de rodeos bovinos 
 
 
Por: María Laura Chiapparrone 
 
 
Director: Dra. María del Carmen Catena 
Co directores: Dr. Pedro Soto, M. Sc. Fernando Paolicchi 
 
 
Facultad de Ciencias Veterinarias 
U.N.C.P.B.A. 
 
 
Miembros del Jurado 
Dr. Heriberto Fernández Jaramillo 
Dra. Marta Mollerach
Dedicatoria 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
A mis padres 
Agradecimientos 
 
“... Y siempre supe que apenas una carilla jamás me alcanzaría para agradecer todo lo vivido a tantas personas 
que estuvieron y que están a mi lado. Más allá de que me olvidaría de tantas personas y de tantas cosas... De las 
ayudas, de los consejos, de los hechos, de las palabras, de las presencias, de las compañías, de las ausencias, de las 
esperas, de los apuros, de los entendimientos, de las conversaciones, de las experiencias transmitidas, vividas, 
compartidas, aprendidas, ganadas y perdidas... Y de tantos momentos, de tantos segundos, minutos, horas, días, 
meses y años que me hicieron crecer no sólo como profesional sino también como persona. En los distintos lugares 
con su gente: en Tandil, en Balcarce, en Buenos Aires, en Mar del Plata... Cada lugar al que fui, con toda persona 
que compartí. Ojalá todos y cada uno de ustedes pudieran ver reflejado el andar de su camino en una parte de la 
vida como yo lo hago en este momento... ¿Y qué me queda de todos los momentos, los lugares y las personas? Lo 
mejor... Ojalá todos y cada uno de ustedes puedan vivir de los que les gusta, de su pasión, de aquello que los hace 
feliz... Ojalá todos y cada uno de ustedes tengan al lado personas como las que yo tengo... De esas que te saludan 
con un beso, un abrazo y una sonrisa cuando llegas cada mañana a tu trabajo, cuando salís al pasillo... De esas 
que se alegran de verte... De esas que te abren la puerta con una sonrisa y la mejor predisposición cuando te 
acercas con una inquietud, con un pedido, con un problema... De esas que te transmiten su experiencia sin pedir 
nada a cambio... De esas que confían en vos... De esas que te hacen dudar... De esas que te hacen pensar... De esas 
que te hacen sentir... De esas que te muestran otra parte de la vida... De esas que por fortuna tengo en mi vida y que 
son tantas que no quiero nombrarlas porque no me perdonaría olvidarme de una de ellas. Pero siempre 
comenzamos a vivir estas experiencias por grandes personas que nos empujan, nos sostienen y de ellas sé que no 
me olvidaría... Mi agradecimiento a María por su recibimiento, oportunidad, paciencia, entendimiento, tolerancia y 
por seguir a pesar de todos y todo... A Pedro por su gran sabiduría, experiencia, contención, presencia y ejemplo... 
A Fer por su oportunidad, presencia, flexibilidad, entendimiento y por su “modo tan divertido y particular de ver 
las cosas”... A Gina por su eterna, inolvidable y entrañable presencia, compañía, contención, sabiduría y 
conocimiento... A Juli, Clau y Caro por entender tantas ausencias, por enseñarme a compartir de manera tan feliz 
cada uno de nuestros días... A Clau, Ale y todos los que formaron y forman parte del laboratorio por compartir 
tantos días... A Peter por su humor, humildad, compañía y gran amistad... A Edgardo por su gran dedicación, 
paciencia y compromiso... A Mario, Mati y todos los que colaboraron a campo... A Agus por su ayuda con “mirada 
molecular”... A Clau Morsella por su capacidad de trabajo, responsabilidad y predisposición... A Ale Velilla por 
tanto esfuerzo conjunto... A Fabi por su ayuda, paciencia y persistencia... A Ine por su atención siempre tan 
dedicada, responsable y su gran amistad... A los evaluadores por sus devoluciones tan dedicadas y detalladas. A 
Belén por acompañarme y ayudarme con su enorme amistad de tantos años... A todos gracias por cada momento 
compartido... A mi gran familia de sangre y de corazón a la cual está dedicado cada uno de los logros de mi vida 
porque siempre están incondicionalmente, me sostienen, me acompañan... A mis amigos, los de ayer y los de hoy. A 
todas y cada una de las personas que estuvieron, están y estarán... Y a mí... Siempre me voy a agradecer a mí 
misma permitirme vivir esta experiencia y crecer junto con ella, comienzo de tantas experiencias más...” 
 
GRACIAS 
RESUMEN 
 
Campylobacter fetus subsp. venerealis y Campylobacter fetus subsp. fetus son agentes causales 
de la campylobacteriosis genital bovina (CGB), una de las enfermedades reproductivas más 
importantes en los rodeos bovinos de Argentina. 
Hasta la actualidad, se han realizado escasos estudios sobre el comportamiento de ambas 
subespecies de C. fetus en los rodeos bovinos. 
Lo antedicho, probablemente se deba a que el diagnóstico de rutina de la CGB se realiza por 
inmunofluorescencia directa (IFD) a partir de muestras de esmegma prepucial por su rapidez, 
bajo costo, sensibilidad y especificidad, pero sin la identificación microbiológica de las cepas. 
Además, los conjugados que se emplean en esta técnica, no diferencian entre C. fetus subsp. 
fetus y C. fetus subsp. venerealis. Por lo tanto, se carece de información sobre la presencia de 
ambas subespecies a nivel regional. 
El cultivo microbiológico sigue siendo la técnica de referencia, sin embargo la alta 
contaminación de algunas muestras clínicas, sumado al costo de un equipamiento adecuado y el 
tiempo que requiere el cultivo y la posterior caracterización por pruebas bioquímicas, determinan 
que el diagnóstico microbiológico no se realice en forma rutinaria. 
En las últimas décadas se han desarrollado y puesto a punto técnicas de biología molecular para 
optimizar la identificación y la caracterización de C. fetus. La aplicación de nuevas técnicas 
permitirá complementar los resultados obtenidos por las pruebas tradicionales, caracterizar los 
perfiles fenotípicos y genotípicos de las cepas, determinar su influencia en la patogenia de la 
enfermedad, el grado de homología entre ellas y finalmente, contribuir con estudios 
epidemiológicos que analicen el comportamiento de las cepas en los rodeos a través de los años. 
 
El objetivo de la presente tesis doctoral fue caracterizar parámetros fenotípicos y genotípicos de 
cepas de C. fetus aisladas del tracto reproductor y de abortos bovinos de la provincia de Buenos 
Aires. El documento se divide en cuatro capítulos, correspondiendo cada uno de los objetivos 
particulares propuestos. 
 
En el Capítulo I se realiza la identificación de las cepas de C. fetus del cepario constituido a 
partir de los ceparios de C. fetus pertenecientes a los laboratorios de Bacteriología (EEA-INTA 
Balcarce) y Microbiología Clínica y Experimental de la Facultad de Ciencias Veterinarias 
(UNCPBA) conformados por primoaislamientos de muestras de esmegma prepucial, mucus 
cérvico vaginal y abortos, conservados a -80 °C. La identificación de C. fetus se realizó 
mediante IFD y pruebas bioquímicas convencionales. De un total de 159 aislamientos 
registrados en ambas instituciones entre los años 1999 y 2014, se seleccionaron 95 cepas 
indígenas de C. fetus de los ceparios citados. Los criterios de selección considerados fueron: 
año de aislamiento, muestras clínicas de origen y localización geográfica, los cuales permitieron 
los estudios de distribución temporal y espacial que se desarrollaron en los capítulos siguientes. 
Para la identificación bioquímica de género, especie y subespecie bacteriana, las cepas fueron 
descongeladas y cultivadas. Posteriormente, se realizó la descripción de la morfología de 
colonias y bacteriana mediante tinciones y observaciónen fresco por microscopía de campo 
oscuro. La inmunomarcación de las cepas se realizó por IFD. La identificación de especie y 
subespecie bacteriana se realizó mediante pruebas bioquímicas de rutina de nuestro laboratorio. 
Conjuntamente, se utilizó un sistema comercial miniaturizado de identificación para bacterias del 
género Campylobacter, Arcobacter y Helicobacter de origen humano. 
La morfología de las colonias y bacteriana de todas las cepas, fueron compatibles con las 
descriptas para las especies de Campylobacter. La IFD y las pruebas bioquímicas de rutina 
permitieron clasificar todas las cepas dentro de la especie C. fetus. Por pruebas bioquímicas, se 
diferenciaron ambas subespecies. La totalidad de las cepas analizadas presentaron fluorescencia 
positiva. Las pruebas de producción de SH2 en sustratos sensibilizados y de tolerancia a la 
glicina, fueron definitorias en la determinación de la subespecie bacteriana y para el biotipo 
intermedius de C. fetus subsp. venerealis. Por pruebas bioquímicas convencionales, 50 cepas 
(52,6%) fueron clasificadas como C. fetus subsp. fetus, 40 (42,1%) como C. fetus subsp. 
venerealis y 5 (5,3%) como C. fetus subsp. venerealis biotipo intermedius. 
El sistema miniaturizado comercial no permitió la diferenciación de algunas cepas de ambas 
subespecies: seis cepas (6,3%) no pudieron ser caracterizadas. Sesenta y ocho (76,4%) fueron 
identificadas como C. fetus subsp. venerealis y 21 (23,6%) clasificadas como C. fetus subsp. 
venerealis/C. fetus subsp. fetus. 
Los resultados de la identificación de especie y subespecie bacteriana por pruebas bioquímicas y 
el sistema comercial, fueron comparables para 89 cepas. Se registraron coincidencias para 32 
cepas identificadas como C. fetus subsp. venerealis por ambas metodologías. De las 21 cepas 
clasificadas como C. fetus subsp. venerealis/C. fetus subsp. fetus por el sistema comercial, 15 se 
correspondieron con C. fetus subsp. fetus y seis con C. fetus subsp. venerealis por pruebas 
bioquímicas. La limitante del sistema comercial para identificar cepas de C. fetus subsp. fetus, no 
permitió comparar los resultados para esta subespecie. 
 
En el Capítulo II, se caracterizan los parámetros de patogenicidad de C. fetus mediante la 
capacidad de adherencia y citopatogenicidad. Como modelos de estudio se utilizaron cultivos 
celulares primarios de útero y vagina bovina y la línea celular MDBK. Las monocapas con 
semiconfluencia celular, fueron desafiadas con las cepas. Para los cultivos primarios se 
seleccionaron 35 cepas (13 cepas de C. fetus subsp. venerealis, dos de C. fetus subsp. venerealis 
biotipo intermedius y 20 de C. fetus subsp. fetus) en base a: el año de aislamiento, la muestra 
clínica de origen, la localidad geográfica y la subespecie bacteriana. Los cultivos de células 
MDBK fueron desafiados con la totalidad de las cepas. El inóculo fue establecido en una DO610 
de 0,8. La incubación se realizó de acuerdo al objetivo del ensayo: evaluación de la capacidad de 
adherencia (3 h) y efecto citopatogénico (48-72 h). 
La adherencia bacteriana se observó por tinción de Giemsa y fueron puestas a punto las técnicas 
de inmunocitoquímica y microscopía electrónica de barrido para confirmar y caracterizar la 
adherencia de C. fetus. Se calcularon los indicadores: porcentaje de adherencia a células y 
número de bacterias adheridas por célula. 
Para la comparación de los cultivos primarios y células MDBK, las cepas fueron utilizadas como 
bloques para las variables observadas. El efecto de los cultivos se evaluó mediante un análisis de 
variancia (ANOVA) con un diseño en bloques. 
Los resultados permitieron confirmar la capacidad de adherencia de C. fetus a las células 
uterinas, vaginales y MDBK como así también la aplicabilidad de las técnicas empleadas. El 
100% de las cepas fueron adherentes. Los porcentajes de adherencia fueron significativamente 
mayores para los cultivos primarios en relación a la línea MDBK. Contrariamente, el número de 
C. fetus por célula fue significativamente mayor para las células MDBK. 
La aplicación de las técnicas de inmunocitoquímica y microscopía electrónica de barrido 
permitieron confirmar y caracterizar la adherencia de C. fetus. 
Para la evaluación del efecto citopatogénico de C. fetus en células uterinas, vaginales bovinas y 
MDBK, se registraron alteraciones citoplasmáticas, nucleares y muerte celular. Las alteraciones 
citoplasmáticas fueron evaluadas mediante la observación en fresco y tinción de Giemsa. El 
coeficiente de distensión celular (F<1,3) en células desafiadas y controles, se determinó con la 
aplicación del programa Image Pro. La actividad mitótica y las alteraciones nucleares mediante 
tinción DAPI. 
La observación de los cultivos celulares en fresco y por tinción de Giemsa, permitió establecer 
una secuencia de hallazgos: granulación del citoplasma, vacuolización citoplasmática, 
redondeamiento y distensión celular, condensación nuclear y muerte celular con desprendimiento 
de la monocapa. Las alteraciones se observaron en el 100% de las cepas analizadas para ambos 
cultivos. 
La distensión celular fue significativamente mayor en cultivos primarios y la citopatogenicidad 
en células uterinas. 
La evaluación de la actividad mitótica en los cultivos de células MDBK, permitió identificar los 
distintos estadios del ciclo celular, con detenimiento en interfase y profase en los cultivos 
desafiados respecto a los controles. 
En los núcleos de células MDBK desafiadas con 17 cepas, se registraron modificaciones 
compatibles con efectos apoptóticos. 
El desarrollo y la implementación de los modelos de estudio in vitro permitieron profundizar los 
conocimientos referentes a la adherencia y el efecto citopatogénico de C. fetus, considerando la 
importancia de los aspectos éticos, económicos, de bienestar animal y de practicidad. 
Para evaluar la asociación lineal entre los parámetros de patogenicidad de C. fetus en los cultivos 
celulares, se calculó el coeficiente de correlación de Pearson y de Spearman, utilizando el 
procedimiento PROC CORR del SAS V9.3 (SAS Institute, Cary, NC, USA). Se consideraron 
como relevantes aquellas correlaciones ≥ 0,5. 
El análisis de las correlaciones de los parámetros de patogenicidad evaluados en cultivos 
primarios y células MDBK, permitió obtener resultados similares por ambos métodos. Las 
correlaciones entre los parámetros de patogenicidad fueron positivas, significativas y de distinta 
magnitud. La mayor correlación en los tres cultivos se registró entre el porcentaje de adherencia 
y de citopatogenicidad. 
 
En el Capítulo III se caracterizaron los perfiles moleculares de C. fetus. La caracterización de los 
perfiles proteicos de las cepas se realizó mediante electroforesis en geles de poliacrilamida con 
dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE). 
Los extractos bacterianos de las 95 cepas fueron obtenidos según la metodología de Laemmli 
(1970). Las corridas se realizaron en un sistema homogéneo en gel de poliacrilamida al 10% 
(Brooks et al., 1996). Los perfiles moleculares proteicos fueron visualizados por coloración con 
Coomassie Blue. El análisis proteico se basó en la detección del polipéptido mayor que se 
correspondería con la microcápsula. 
Ochenta y siete (91,6%) cepas de C. fetus presentaron bandas del polipéptido mayor con 
variabilidad de pesos moleculares que se ubicaron en un rango de 100 a 117 kDa. La variabilidad 
para las cepas de casos intrarodeo fue menor. 
La tipificación genotípica de las cepas de C. fetus, mediante una reacción en cadena de la 
polimerasa (PCR). La puesta a punto, se realizó teniendo en cuenta el protocolo descripto por 
Schulze et al. (2006) basado en el trabajo de Hum et al. (1997) modificando las condiciones de 
reacción y termociclado (Henegariu et al., 1997). Se emplearon los primers MG3F - MG4R para 
la detección de la especie C. fetus y los primers VenSF - VenSR para ladiferenciación de la 
subespecie de C. fetus subsp. venerealis (Hum et al., 1997). 
A partir de los cultivos puros de las cepas en estudio, se realizaron suspensiones bacterianas con 
una DO610 0,1. La extracción de ADN se realizó por ebullición. Como controles negativos se 
utilizaron cepas de C. jejuni, C. coli, C. hyointestinalis, C. bubulus y E. coli. 
La PCR permitió tipificar la totalidad de las cepas en estudio, dentro de la especie C. fetus y 
diferenciar ambas subespecies: C. fetus subsp. venerealis 49 (51,6%) y C. fetus subsp. fetus 46 
(48,4%). Las cepas de casos intrarodeo fueron tipificadas dentro de la misma subespecie. No se 
observaron amplificaciones inespecíficas ni resultados positivos para microorganismos 
estrechamente relacionados. 
La caracterización y subtipificación de las cepas de C. fetus, se realizó por análisis de 
polimorfismos genéticos a partir de la aplicación de electroforesis en gel de campo pulsado 
(PFGE - SmaI). 
Para la implementación de la técnica, se seleccionaron 28 cepas en base a los parámetros 
descriptos anteriormente. Se aplicó el protocolo para la subtipificación molecular de C. jejuni 
elaborado por el Centro para el Control y la Prevención de las Enfermedades (CDC) en el marco 
de la Red PulseNet América Latina y el Caribe para la subtipificación de Campylobacter spp. La 
interpretación de los resultados se realizó de acuerdo a lo descripto por Tenover et al. (1995). La 
observación y el registro fotográfico de los geles se realizaron en el fotodocumentador BioRad 
Gel DOC EQ System y software Quantity One. La comparación de los perfiles de PFGE (PFPs) 
se realizó visualmente. Para la interpretación de los datos y la elaboración de los dendogramas, 
se utilizó el programa informático Bionumerics v.5.1 (Applied Maths). 
Con el objetivo de determinar la relación genética entre las cepas de C. fetus seleccionadas en 
esta tesis y cepas de C. fetus, C. coli y C. jejuni, se seleccionaron aislamientos pertenecientes a la 
Red PulseNet. 
Los perfiles de PFGE obtenidos para C. fetus presentaron fragmentos incluidos en un amplio 
rango de tamaño y con una distribución homogénea. La homología interespecie entre C. fetus, C. 
coli y C. jejuni fue 40 - 50% e intraespecie para C. fetus > 70%. La PFGE – SmaI permitió 
identificar 19 PFPs para las 28 cepas de C. fetus. 
 
En el Capítulo IV se relacionaron los parámetros fenotípicos y genotípicos analizados en los 
capítulos anteriores, con los datos de origen de las cepas de C. fetus y entre sí. 
La distribución temporal y por muestra clínica de origen de las subespecies de C. fetus fueron 
analizadas mediante las herramientas de gráfico en el programa Excel. La distribución espacial 
se evaluó mediante el programa SatScan V9.3 tomando como unidad de localización geográfica 
al centroide del partido de origen de las cepas. La visualización espacial de las cepas se realizó 
mediante mapas gráficos utilizando el software QGis 2.10.1. 
Para la visualización de la distribución espacial de los parámetros de patogenicidad se 
consideraron los mayores y menores porcentajes de adherencia y de citopatogenicidad para cada 
subespecie bacteriana. 
El efecto del origen y de la subespecie de C. fetus sobre los parámetros de patogenicidad, se 
analizó mediante un ANOVA. 
Para evaluar la asociación lineal entre los parámetros observados en los distintos cultivos 
celulares en relación a la muestra clínica de origen y las subespecies, se calculó el coeficiente de 
correlación de Pearson y de Spearman. 
En el período de tiempo analizado se registró la presencia de ambas subespecies de C. fetus con 
un predominio de C. fetus subsp. fetus en siete años. El mayor número de cepas de C. fetus 
subsp. fetus fueron aisladas de fetos y de C. fetus subsp. venerealis de hembras y toros. 
Se observa una distribución temporal homogénea para el porcentaje de adherencia de las cepas 
en los diferentes cultivos. En células MDBK, los porcentajes fueron menores en relación a los 
cultivos primarios. 
La distribución del número de C. fetus por célula fue homogénea, si bien en la mayoría de los 
años los mayores valores se registraron en los cultivos de células MDBK. 
Los porcentajes de citopatogenicidad de las cepas fueron superiores al 50% y el F > 1,3 en todos 
los años de estudio. La subespecie bacteriana no tuvo efecto significativo sobre los parámetros 
de patogenicidad evaluados. La mayor patogenicidad se observó en las cepas de origen fetal y la 
menor en las aisladas de toros. Las correlaciones entre los parámetros de patogenicidad fueron 
positivas y significativas. La adherencia y el efecto citopatogénico se correlacionaron 
independientemente del número de bacterias adheridas por célula, principalmente para las cepas 
aisladas de fetos y hembras. 
La presencia del polipéptido mayor fue independiente de los datos de origen de las cepas. La 
distribución temporal de las cepas con el polipéptido mayor fue homogénea en todos los años. Al 
evaluar la distribución espacial, no se observó ninguna tendencia de distribución definida. El 
polipéptido se observó en 46 cepas aisladas de fetos, 30 de hembras y 11 de toros. En cambio, las 
cepas que no presentaron el polipéptido fueron aisladas de muestras de fetos (3) y hembras (5). 
La subespecie bacteriana no tuvo asociación significativa sobre los parámetros de patogenicidad. 
La mayor patogenicidad se observó en las cepas de origen fetal y la menor en las aisladas de 
toros. 
Las subespecies bacterianas, los parámetros de patogenicidad y la presencia del polipéptido 
mayor de las cepas no registraron tendencias de distribución temporal ni geográfica. 
 
Los resultados de la distribución temporal, espacial y por muestra clínica de origen para las 
cepas caracterizadas por PCR, fueron similares a los obtenidos por pruebas bioquímicas. 
Los PFPs de C. fetus no se relacionaron con el año de aislamiento, la localización geográfica y la 
muestra clínica de origen de las cepas en estudio. 
El porcentaje de similitud para la especie C. fetus fue > 70%. El porcentaje intrasubespecie para 
C. fetus subsp. venerealis (13 cepas) fue > 80% y sólo tres fueron 100% homólogas y para C. 
fetus subsp. fetus (15 cepas) > 70%, ocho fueron indistinguibles bajo esta metodología. Los 
resultados confirman la utilidad de la PFGE – SmaI como una herramienta molecular de alto 
poder discriminatorio a nivel de subespecie para C. fetus. 
Para C. fetus subsp. venerealis, sólo dos cepas aisladas de mucus cérvico vaginal fueron 
indiferenciables bajo esta metodología. En las cepas aisladas de toros las homologías registradas 
fueron < 75% y para los fetos < 70%. Para C. fetus subsp. fetus, tres cepas aisladas de feto fueron 
indistinguibles. En las cepas aisladas de hembras las homologías fueron < 70% y en toros <75%. 
Los PFPs registrados para ambas subespecies en los casos intrarodeo se correspondieron tanto 
con cepas homólogas como heterólogas. 
 
Para evaluar el grado de concordancia entre los resultados obtenidos por pruebas bioquímicas y 
la PCR para caracterizar las subespecies, se realizó el test de Mc Nemar y se estimó el 
coeficiente Kappa mediante el procedimiento PROC FREQ del SAS V.9.12 (SAS, Institute Inc., 
Cary, NC, USA). 
Para la subespecie C. fetus subsp. venerealis, fueron identificadas por pruebas bioquímicas 45 
cepas (47,4%) y por PCR 49 (51,6%). Para C. fetus subsp. fetus por pruebas bioquímicas 50 
cepas (52,6%) y por PCR 46 (48,4%). El test de Mc Nemar no detectó diferencias significativas 
(p=0,1573) y el coeficiente Kappa fue de 0,8319 indicando una alta concordancia entre ambas 
técnicas. 
El bajo número de cepas procesadas por PFGE limitó la asociación de los PFPs con la presencia 
del polipéptido mayor. 
Los parámetros fenotípicos y genotípicos considerados en la presente tesis, no se relacionaron 
entre sí. 
Finalmente, se concluye que las cepas de C. fetus actuantesen los rodeos bovinos poseen 
diferencias fenotípicas y genotípicas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Palabras clave: Campylobacter fetus, caracterización fenotípica, caracterización genotípica, 
bovinos, adherencia, citopatogenicidad, perfil proteico, reacción en cadena de la polimerasa 
(PCR), electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE), distribución temporal, distribución 
espacial. 
SUMMARY 
 
Campylobacter fetus subsp. venerealis and Campylobacter fetus subsp. fetus are the etiological 
agents of bovine genital campylobacteriosis (BGC), one of the most important reproductive 
diseases in Argentinean herds. 
Presently, there are scarce studies on the behavior of both subspecies of C. fetus in bovine herds. 
This is probably due to the fact that routine diagnosis of BGC is performed by direct 
immunofluorescene (DIF) of preputial smegma samples since it is rapid, inexpensive, sensitive 
and specific. However, this test does not provide information on the microbiological 
identification of the strains. Furthermore, the antibody conjugates used in this technique do not 
differentiate between C. fetus subsp. fetus and C. fetus subsp. venerealis. Therefore, there is no 
information about the presence of both subspecies at the regional level. 
Microbiologic culture is still the reference technique. Nevertheless, the high contamination of 
some clinical samples, the cost of proper equipment, the time required for the culture and the 
further characterization by biochemical tests determine that microbiological diagnosis is not 
routinely performed. 
In the last decades, molecular biology techniques have been developed and set to optimize the 
identification and characterization of C. fetus. The adoption of new techniques will allow the 
complementation of the results obtained by traditional tests, the characterization of the 
phenotypic and genotypic profiles of the strains, the determination of their influence on the 
pathogeny of the disease, the degree of homology between strains and, finally it will contribute 
to epidemiological studies for the analysis of the behavior of the strains in the herds throughout 
the years. 
 
The objective of this doctoral thesis was to characterize the phenotypic and genotypic parameters 
of C. fetus strains isolated from the bovine reproductive tract and from bovine abortions in 
Buenos Aires province. The document is divided into four chapters, each one corresponding to 
the proposed particular objectives. 
 
In Chapter I it is described the identification of C. fetus strains from the strain collection 
integrated by collections of C. fetus belonging to the laboratories of Bacteriology (EEA-INTA 
Balcarce) and Clinical and Experimental Microbiology of the Faculty of Veterinary Sciences 
(UNCPBA), which is comprised by prime-isolations from preputial smegma, cervico-vaginal 
mucus and abortion samples stored at -80 °C. The identification of C. fetus was done by DIF and 
conventional biochemical tests. Ninety-five indigenous C. fetus strains of the mentioned 
collections, out of 159 isolates recorded by both institutions between 1999 and 2014, were 
selected. Criteria considered for selection were: year of isolation, clinical samples of origin and 
geographic location, which allowed the studies on temporal and spatial distribution developed in 
the following chapters. 
For the biochemical identification of bacterial genus, species and subspecies, the strains were 
thawed and cultured. Then, the description of colony and bacterial morphology was done by 
staining and fresh observation by dark field microscopy. 
The immunemarcation of the strains was done by DIF. The identification of bacterial species and 
subspecies was performed by biochemical tests routinely performed in our laboratory. At the 
same time, a miniaturized commercial system for the identification of bacteria of the genus 
Campylobacter, Arcobacter and Helicobacter of human origin was used. 
Colony and bacterial morphology of all strains was compatible with that of the species of 
Campylobacter. DIF and routine biochemical tests allowed the classification of all the strains 
within the species C. fetus. By biochemical tests both subspecies were differentiated. All strains 
analyzed presented positive fluorescence. Tests of SH2 production in sensitized substrates and 
glycine tolerance were defining for the determination of bacterial subspecies and for the biotype 
intermedius of C. fetus subsp. venerealis. By conventional biochemical tests, 50 strains (52.6%) 
were classified as C. fetus subsp. fetus, 40 (42.1%) as C. fetus subsp. venerealis and 5 (5.3%) as 
C. fetus subsp. venerealis biotype intermedius. 
The miniaturized commercial system did not allow the differentiation of some strains of both 
subspecies: six strains (6.3%) could not be characterized. Sixty-eight (76.4%) were identified as 
C. fetus subsp. venerealis and 21 (23.6%) were classified as C. fetus subsp. venerealis/C. fetus 
subsp. fetus. 
The results of the identification of bacterial species and subspecies by biochemical tests and the 
commercial system were comparable for 89 strains. Coincidences were recorded for 32 strains 
identified as C. fetus subsp. venerealis by both methodologies. Of the 21 strains classified as C. 
fetus subsp. venerealis/C. fetus subsp. fetus by the commercial system, 15 coincided with C. fetus 
subsp. fetus and six with C. fetus subsp. venerealis by biochemical tests. The limitation of the 
commercial system to identify strains of C. fetus subsp. fetus, did not allow the comparison of 
the results for this subspecies. 
 
In chapter II, the parameters of pathogenicity of C. fetus by its capacity of adherence and 
cytopathogenicity are characterized. As model of study, primary cell cultures of bovine uterus 
and vagina and the cell line MDBK were used. The semi-confluent cell monolayers were 
challenged with the strains. For primary cultures, 35 strains were selected (13 C. fetus subsp. 
venereal strains, two C. fetus subsp. venerealis biotype intermedius and 20 C. fetus subsp. fetus) 
based on: year of isolation, clinical sample of origin, geographic location and bacterial 
subspecies. MDBK cultures were challenged with all the strains. The inoculum was established 
at an OD610 of 0.8. The incubation was performed according to the objective of the experiment: 
evaluation of the capacity of adherence (3h) and cytopathogenic effect (48-72 h). 
Bacterial adherence was observed by Giemsa staining and the immunocytochemical and 
scanning electron microscopy techniques were optimized to confirm and characterize the 
adherence of C. fetus. The following indicators were calculated: percentage of adherence to the 
cells and number of bacteria adhered per cell. 
For the comparison of the primary cultures and MDBK cells, the strains were used as blocks for 
the observed variables. The effect of the cultures was evaluated by variance analysis (ANOVA) 
with a block design. 
The results allowed the confirmation of the capacity of adherence of C. fetus to uterine, vaginal 
and MDBK cells as well as the applicability of the employed techniques. The 100% of the strains 
were adherent. In relation to MDBK cells, the percentages of adherence for the primary cultures 
were significantly higher. On the contrary, the number of C. fetus per cell was significantly 
higher for MDBK cells. 
The application of immunocytochemistry and scanning electron microscopy allowed the 
confirmation and characterization of the adherence of C. fetus. 
The evaluation of the cytopathogenic effect of C. fetus in bovine uterine and vaginal cells and 
MDBK cells revealed cytoplasmic and nuclear alterations and cell death. Cytoplasmic alterations 
were evaluated by fresh observation and by Giemsa staining. The coefficient of cell distension 
(F<1.3) in challenged and control cells was determined by the applicationof the ImagePro 
software. Mitotic activity and nuclear alterations were evaluated by DAPI staining. 
The observation of cell cultures in fresh and by Giemsa staining allowed the establishment of a 
sequence of findings: cytoplasm granulation and vacuolization, cell rounding and distension, 
nuclear condensation and cell death with detachment of the monolayer. Alterations were 
observed in 100% of the analyzed strains for both cultures. 
Cell distension was significantly higher in primary cultures and cytopathogenicity was higher in 
uterine cells. 
The evaluation of the mitotic activity in MDBK cell cultures allowed the identification of the 
different stages of the cell cycle, halting in interphase and prophase in the challenged cultures 
with respect to controls. 
In the nuclei of MDBK cells challenged with 17 strains modifications compatibles with apoptotic 
effects were recorded. 
The development and the implementation of in vitro models of study deepened the understanding 
about adherence and cytopathogenic effect of C. fetus, considering the importance of ethic, 
economic, animal welfare and practical aspects. 
To evaluate the lineal association between the parameters of pathogenicity of C. fetus in the cell 
cultures, Pearson and Spearman correlation coefficients were calculated using the PROC CORR 
procedure of SAS V9.3 (SAS Institute, Cary, NC, USA). Correlations ≥ 0.5 were considered 
relevant. 
The analysis of the correlations of the pathogenicity parameters evaluated in primary cultures 
and MDBK cells allowed the gathering of similar results by both methods. Correlations between 
the parameters of pathogenicity were positive, significant and of different magnitude. The 
highest correlation in the three cultures was recorded between the percentage of adherence and 
cytopathogenicity. 
 
In Chapter III, the molecular profiles of C. fetus were characterized. The characterization of the 
protein profiles of the strains was performed by dodecyl-sodium sulfate polyacrylamide gel 
electrophoresis (SDS-PAGE). 
Bacterial extracts of the 95 strains were obtained according to the methodology of Laemmli 
(1970). Runnings were performed in a homogeneous system in 10% polyacrylamide gels 
(Brooks et al., 1996). The molecular protein profiles were visualized by Coomassie Blue 
staining. Protein analysis was based on the detection of the major polypeptide which would 
correspond to the microcapsule. 
Eighty-seven (91.6 %) strains of C. fetus presented bands of the major polypeptide with 
variations in the molecular weights in a range of 100 to 117 kDa. The variability for the strains 
of intra-herd cases was lower. 
Genotyping of the strains of C. fetus was done by polymerase chain reaction (PCR). The 
optimization was performed according to the protocol described by 
Schulze et al. (2006), based on the work of Hum et al. (1997) and modifying the reaction and 
thermocycling conditions (Henegariu et al., 1997). Primers MG3F - MG4R were used for the 
detection of species of C. fetus and primers VenSF – VenSR for the differentiation of the 
subspecies of C. fetus subsp. venerealis (Hum et al., 1997). 
Suspensions with an OD610 0.1were obtained from the pure cultures of the strains under study. 
DNA extraction was done by boiling. As negative controls C. jejuni, C. coli, C. hyointestinalis, 
C. bubulus and E. coli strains were used. 
PCR allowed the typing of all the strains under study within the species C. fetus and the 
differentiation of both subspecies: 49 (51.6%) C. fetus subsp. venerealis and 46 (48.4%) C. 
fetus subsp. fetus. Strains of intra-herd cases were typified within the same subspecies. 
Unspecific amplifications or positive results for closely related microorganisms were not 
observed. 
The characterization and subtyping of the strains of C. fetus was done by the analysis of genetic 
polymorphisms by the application of pulsed-field gel electrophoresis (PFGE - SmaI). 
For the implementation of the technique, 28 strains were selected according to the previously 
described parameters. The protocol for the molecular subtyping of C. jejuni developed by the 
Centers for Disease Control and Prevention (CDC) in the frame of the Latin American and 
Caribbean Net PulseNet for the subtyping of Campylobacter spp. was used. The interpretation of 
the results was done according to the description by Tenover et al. (1995). The observation and 
photographic record of the gels were performed by photo documentation using the BioRad Gel 
DOC EQ System and Quantity One software. The comparison of the PFGE profiles (PFPs) was 
visually done. 
For data interpretation and dendograms elaboration, the computer software Bionumerics v.5.1 
(Applied Maths) was used. 
With the aim of determining the genetic relation among C. fetus strains selected in this thesis and 
C. fetus, C. coli and C. jejuni strains, isolates belonging to the Net PulseNet were selected. 
The PFGE profiles obtained for C. fetus presented fragments included in a wide range of size and 
with homogeneous distribution. Interspecies homology among C. fetus, C. coli and C. jejuni was 
40 – 50% and intraspecies homology for C. fetus was > 70%. PFGE – SmaI allowed the 
identification of 19 PFPs for the 28 C. fetus strains. 
 
In Chapter IV, the phenotypic and genotypic parameters analyzed in the previous chapters were 
related with the data of origin of the strains of C. fetus and were also related between them. 
Temporal and by clinical sample of origin distribution of the subspecies of C. fetus were 
analyzed by the graphic tools in Excel software. Spatial distribution was evaluated by the 
SatScan V9.3 software, using the centroid of the district of origin of the strains as geographic 
location unit. The spatial visualization of the strains was done by graphic maps using the QGis 
2.10.1 software. 
For the visualization of the spatial distribution of the parameters of pathogenicity, the highest 
and lowest percentages of adherence and cytopathogenicity for each bacterial subspecies were 
considered. 
The effect of the origin and of C. fetus subspecies on the parameters of pathogenicity was 
analyzed by ANOVA. 
To evaluate the lineal association between the parameters observed in the different cell cultures 
in relation to the clinical sample of origin and the subspecies, the Pearson and of Spearman 
coefficients of correlation were calculated. 
In the period of time analyzed, the presence of both subspecies of C. fetus with predominance of 
C. fetus subsp. fetus in seven years was recorded. The highest number of C. fetus subsp. fetus 
strains was isolated from fetuses and in the case of C. fetus subsp. venerealis from females and 
bulls. 
A homogeneous temporal distribution is observed for the percentage of adherence of the strains 
to the different cultures. In MDBK cells, the percentages were lower in relation to primary 
cultures. 
The distribution of the number of C. fetus per cell was homogeneous even when, in most of the 
years, the highest values were recorded in MDBK cell cultures. 
The percentages of cytopathogenicity of the strains were higher to 50% and F was > 1.3 during 
all years of study. The bacterial subspecies had no significant effect on the evaluated parameters 
of pathogenicity. The highest pathogenicity was observed for the strains of fetal origin and the 
lowest for those strains isolated from bulls. Correlations between parameters of pathogenicity 
were positive and significant. There was correlation for adherence and cytopathogenic effect, 
independently of the number of bacteria adhered per cell, particularly for the strains isolated 
from fetuses and females. 
The presence of the major polypeptide was not dependent on the data of origin of the strains. The 
temporal distribution of the strains with the major polypeptide was homogeneous during all the 
years. When evaluating the spatial distribution, a definedtendency on the distribution was not 
observed. The polypeptide was observed in 46 strains isolated from fetuses, 30 from females and 
11 from bulls. In contrast, strains that did not have the polypeptide were isolated from fetuses (3) 
and females (5) samples. 
The bacterial subspecies had no significant effect on the parameters of pathogenicity. The 
highest pathogenicity was observed for the strains of fetal origin and the lowest for those isolated 
from bulls. 
Bacterial subspecies, parameters of pathogenicity and the presence of the major polypeptide of 
the strains did not show tendencies on the temporal or geographic distribution. 
 
For the strains characterized by PCR, the results of temporal, spatial distribution and clinical 
sample of origin were similar to those obtained by biochemical tests. 
The PFPs of C. fetus were not related with the year of isolation, geographic location and clinical 
sample of origin of the strains under study. 
The percentage of similarity for the species C. fetus was > 70%. The percentage of intra 
subspecies for C. fetus subsp. venerealis (13 strains) was > 80% and only 3 were 100% 
homologous. For C. fetus subsp. fetus (15 strains) it was > 70% and eight strains were 
indistinguishable by this methodology. The results confirm the usefulness of PFGE– SmaI as a 
molecular tool of high discriminatory power at the level of subspecies for C. fetus. 
For C. fetus subsp. venerealis, only two strains isolated from cervico-vaginal mucus were non-
differentiable under this methodology. In the strains isolated from bulls the homologies recorded 
were < 75% and for fetuses < 70%. For C. fetus subsp. fetus, three strains isolated from fetuses 
were undistinguishable. In the strains isolated from females the homologies were < 70% and in 
bulls < 75%. 
The recorded PFPs for both subspecies in intra-herd cases were coincident for the homologous as 
well as the heterologous strains. 
 
To evaluate the degree of concordance between the results obtained by biochemical tests and 
PCR for the characterization of subspecies, the Mc Nemar test was performed and the Kappa 
coefficient was estimated by PROC FREQ procedure of SAS V.9.12 (SAS, Institute Inc., Cary, 
NC, USA). 
For the subspecies C. fetus subsp. venerealis, 45 strains (47.4%) were identified by biochemical 
tests and 49 (51.6%) by PCR. For C. fetus subsp. fetus 50 strains (52.6%) were identified by 
biochemical tests and 46 (48.4 %) by PCR. By Mc Nemar test significant differences were not 
detected (p=0.1573) and the Kappa coefficient was 0.8319, indicating a high concordance 
between both techniques. 
The low number of strains analyzed by PFGE limited the association of PFPs with the presence 
of the major polypeptide. 
The phenotypic and genotypic parameters considered in this thesis are not related between them. 
Finally, it is concluded that the strains of C. fetus circulating in bovine herds have phenotypic 
and genotypic differences. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Key words: Campylobacter fetus, phenotypic characterization, genotypic characterization, 
bovines, adherence, cytopathogenicity, protein profile, polymerase chain reaction (PCR), pulse-
field gel electrophoresis (PFGE), temporal distribution, spatial distribution. 
ÍNDICE GENERAL 
 
Introducción general ........................................................................................................................ 1 
Hipótesis .......................................................................................................................................... 3 
Objetivos generales y particulares ................................................................................................... 4 
Capítulo I. Identificación de cepas de Campylobacter fetus aisladas del tracto reproductor y de 
abortos en rodeos bovinos ............................................................................................................... 5 
Sección 1. Colección de cepas de Campylobacter fetus .............................................................. 6 
1.1.1 Introducción .................................................................................................................... 6 
1.1.2 Materiales y métodos .................................................................................................... 18 
1.1.3 Resultados ..................................................................................................................... 19 
1.1.4 Discusión ...................................................................................................................... 26 
1.1.5 Conclusiones ................................................................................................................. 27 
Sección 2. Identificación bioquímica de género, especie y subespecie bacteriana .................... 28 
1.2.1 Introducción .................................................................................................................. 28 
1.2.2 Materiales y métodos .................................................................................................... 35 
1.2.3 Resultados ..................................................................................................................... 41 
1.2.4 Discusión ...................................................................................................................... 59 
1.2.5 Conclusiones ................................................................................................................. 61 
Capítulo II. Caracterización de parámetros de patogenicidad de Campylobacter fetus ................ 62 
2.1 Introducción ......................................................................................................................... 63 
2.2 Materiales y métodos ........................................................................................................... 82 
Sección 1. Evaluación de la capacidad de adherencia de Campylobacter fetus en células 
uterinas bovinas, vaginales bovinas y MDBK ........................................................................... 91 
2.1.1 Materiales y métodos .................................................................................................... 91 
2.1.2 Resultados ..................................................................................................................... 94 
2.1.3 Discusión .................................................................................................................... 107 
2.1.4 Conclusiones ............................................................................................................... 108 
Sección 2. Evaluación del efecto citopatogénico de Campylobacter fetus en células uterinas 
bovinas, vaginales bovinas y MDBK ...................................................................................... 109 
2.2.1 Materiales y métodos .................................................................................................. 109 
2.2.2 Resultados ................................................................................................................... 112 
2.2.3 Discusión .................................................................................................................... 134 
2.2.4 Conclusiones ............................................................................................................... 135 
Sección 3. Comparación de los parámetros de patogenicidad de Campylobacter fetus en 
cultivos primarios y células MDBK ........................................................................................ 136 
2.3.1 Materiales y métodos .................................................................................................. 136 
2.3.2 Resultados ...................................................................................................................136 
2.3.3 Discusión .................................................................................................................... 138 
2.3.4 Conclusiones ............................................................................................................... 138 
Capítulo III. Caracterización de los perfiles moleculares de Campylobacter fetus 
 ..................................................................................................................................................... 139 
Sección 1. Caracterización de los perfiles proteicos de cepas de Campylobacter fetus: 
electroforesis en geles de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) ............. 140 
3.1.1 Introducción ................................................................................................................ 140 
3.1.2 Materiales y métodos .................................................................................................. 145 
3.1.3 Resultados ................................................................................................................... 146 
3.1.4 Discusión .................................................................................................................... 152 
3.1.5 Conclusiones ............................................................................................................... 152 
Sección 2. Tipificación genotípica. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) .................. 153 
3.2.1 Introducción ................................................................................................................ 153 
3.2.2 Materiales y métodos .................................................................................................. 165 
3.2.4 Discusión .................................................................................................................... 172 
3.2.5 Conclusiones ............................................................................................................... 173 
Sección 3. Caracterización y subtipificación de las cepas de Campylobacter fetus por análisis 
de polimorfismos genéticos: electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) ........................ 174 
3.3.1 Introducción ................................................................................................................ 174 
3.3.2 Materiales y métodos .................................................................................................. 182 
3.3.3 Resultados ................................................................................................................... 187 
3.3.4 Discusión .................................................................................................................... 196 
3.3.5 Conclusiones ............................................................................................................... 197 
Capítulo IV. Relación entre los parámetros fenotípicos, genotípicos y los datos de origen de las 
cepas de Campylobacter fetus ..................................................................................................... 198 
4.1 Introducción ....................................................................................................................... 199 
Sección 1. Distribución témporo-espacial y por muestra clínica de origen de los parámetros 
fenotípicos de Campylobacter fetus ......................................................................................... 214 
4.1.1. Distribución de las subespecies de Campylobacter fetus identificadas por pruebas 
bioquímicas .......................................................................................................................... 215 
4.1.2. Distribución de los parámetros de patogenicidad de Campylobacter fetus ............... 219 
4.1.3. Distribución del polipéptido mayor de Campylobacter fetus .................................... 242 
Discusión ............................................................................................................................. 244 
Conclusiones ........................................................................................................................ 246 
Sección 2. Distribución témporo-espacial y por muestra clínica de origen de los parámetros 
genotípicos de Campylobacter fetus ........................................................................................ 247 
4.2.1. Distribución de las cepas de Campylobacter fetus caracterizadas genotípicamente por 
PCR ...................................................................................................................................... 248 
4.2.2. Distribución de los PFPs de las cepas de Campylobacter fetus subtipificadas por 
PFGE ................................................................................................................................... 248 
Discusión ............................................................................................................................. 258 
Conclusiones ........................................................................................................................ 259 
Sección 3. Relación entre los parámetros fenotípicos y genotípicos de Campylobacter fetus 
 ................................................................................................................................................. 260 
4.3.1. Relación entre la caracterización bioquímica y genotípica de Campylobacter fetus 261 
4.3.2. Relación entre los parámetros de patogenicidad y la caracterización genotípica de 
Campylobacter fetus ............................................................................................................ 265 
4.3.3. Relación entre la presencia del polipéptido mayor y la caracterización genotípica de 
Campylobacter fetus ............................................................................................................ 266 
4.3.4. Relación entre los PFPs y la caracterización genotípica de Campylobacter fetus .... 266 
4.3.5. Relación entre PFPs y la presencia del polipéptido mayor de Campylobacter fetus 266 
4.3.6. Análisis de los parámetros fenotípicos y genotípicos para las cepas de Campylobacter 
fetus caracterizadas por PFGE ............................................................................................. 266 
Discusión ............................................................................................................................. 269 
Conclusiones ........................................................................................................................ 270 
Conclusión general ...................................................................................................................... 271 
Anexo .......................................................................................................................................... 273 
Referencias bibliográficas ........................................................................................................... 283 
 
 
 
 
1 
 
INTRODUCCIÓN GENERAL 
 
La identificación de nuevas especies de Campylobacter como patógenos humanos, ha reforzado 
la importancia del género en medicina veterinaria en los últimos 15 años. 
La importancia zoonótica de especies como C. coli, C. jejuni y C. fetus subsp. fetus y los avances 
en el área de la biología molecular, han incrementado los conocimientos referentes a la 
taxonomía, la epidemiología y la patogénesis de dichas bacterias. En particular, estudios 
relacionados con la virulencia y los modelos experimentales que ayuden a dilucidar los 
mecanismos patogénicos hasta el momento desconocidos. 
La especie C. fetus ha sido estudiada desde principios del siglo pasado. En el caso de los C. fetus 
de origen reproductivo, se han realizado escasos estudios referentes al comportamiento de la 
especie en los rodeos bovinos. 
Campylobacterfetus subsp. venerealis y Campylobacter fetus subsp. fetus son causales de la 
campylobacteriosis genital bovina (CGB), una de las enfermedades infecciosas reproductivas 
presentes en los rodeos bovinos de Argentina. La alta incidencia de las enfermedades de la 
reproducción limita la eficiencia reproductiva con disminución de los porcentajes de preñez 
hasta el 25%. 
La CGB es una enfermedad de transmisión venérea, en la hembra bovina se caracteriza por 
producir infertilidad por muerte embrionaria con incremento en el número de servicios 
necesarios para obtener un ternero, alargamiento del ciclo estral y ocasionalmente, abortos 
esporádicos desde el quinto mes de gestación, mientras que el toro es portador y diseminador de 
la enfermedad. 
En la actualidad, el diagnóstico de rutina de la CGB se realiza a partir de muestras de esmegma 
prepucial por inmunofluorescencia directa (IFD) por su rapidez, sensibilidad, especificidad y 
bajo costo, sin la identificación microbiológica de las cepas. Los conjugados que se emplean no 
diferencian entre C. fetus subsp. venerealis y C. fetus subsp. fetus, ya que ambas subespecies son 
antigénicamente similares. Por lo tanto, se carece de información sobre la presencia y 
distribución de las subespecies a nivel regional. 
El cultivo microbiológico continúa siendo la técnica de referencia. Sin embargo, variables como 
la contaminación de las muestras clínicas, el equipamiento necesario para el cultivo e 
identificación, el tiempo que requiere el desarrollo de un cultivo hasta su identificación, entre 
otros, determina que esta técnica no se realice en forma rutinaria. 
2 
 
La caracterización fenotípica de C. fetus, ha llevado a la discusión por parte de diferentes 
autores. La diferenciación bioquímica de ambas subespecies se basa en una única prueba de 
tolerancia al 1% de glicina. Chang and Ogg (1971) han demostrado que esta prueba puede no ser 
fiable para la separación de las subespecies, porque dicha tolerancia puede ser por transducción o 
mutación adquirida. Además, se han descripto variantes de C. fetus subsp. venerealis glicina-
tolerantes (denominadas biovar "intermedius") aunque algunas evidencias sugieren que estos 
resultados podrían deberse a una inadecuada normalización de las pruebas bioquímicas. De la 
misma manera, se han registrado cepas de C. fetus subsp. fetus sensibles a la glicina. Por otro 
lado, existen escasos estudios referentes a otras técnicas de caracterización fenotípicas que 
permitan contribuir a la diferenciación de las subespecies. 
La ausencia de la identificación genoespecífica no permite conocer las características de las 
cepas indígenas presentes en nuestros rodeos bovinos. En las últimas décadas se han desarrollado 
y puesto a punto técnicas de biología molecular para optimizar la identificación y caracterización 
de cepas de C. fetus. El desarrollo y la aplicación de nuevas técnicas moleculares no sólo 
permitirá complementar los resultados obtenidos por las pruebas tradicionales sino también 
profundizar el estudio de las cepas presentes en nuestros rodeos y así determinar la influencia de 
los perfiles fenotípicos y genotípicos de las cepas regionales en la patogenia de la enfermedad y 
finalmente, contribuir con estudios epidemiológicos que analicen el comportamiento de las cepas 
en los rodeos a través de los años y determinar el grado de homología entre las cepas. 
Al considerar la tendencia de los estudios registrada en la bibliografía consultada y por nuestro 
grupo de investigación, en la presente tesis doctoral se caracterizaron fenotípica y 
genotípicamente cepas de C. fetus aisladas de rodeos bovinos con antecedentes de fallas 
reproductivas de nuestro país. A futuro, la evaluación de los aspectos citados anteriormente 
permitiría mejorar los métodos diagnósticos, los inmunógenos presentes en el mercado actual y 
conocer más acerca de la epidemiología de esta enfermedad para rediseñar planes de control 
tendientes a la erradicación de la enfermedad. 
 
3 
 
Hipótesis 
 
Las cepas de Campylobacter fetus actuantes en los rodeos bovinos 
poseen diferencias fenotípicas y genotípicas. 
 
4 
 
Objetivos generales y particulares 
 
Objetivo general 
Caracterizar parámetros fenotípicos y genotípicos de cepas de Campylobacter fetus de diferentes 
orígenes. 
 
Objetivos particulares 
I. Identificar cepas de Campylobacter fetus aisladas del tracto reproductor y de abortos de 
rodeos bovinos. 
II. Caracterizar parámetros de patogenicidad de las cepas de Campylobacter fetus en estudio: 
capacidad de adherencia y citopatogenicidad. 
III. Determinar los perfiles moleculares de las cepas de Campylobacter fetus. 
IV. Determinar si los parámetros fenotípicos y genotípicos evaluados se relacionan con el 
origen de las cepas. 
 
 
 
 
5 
 
 
 
 
 
 
CAPÍTULO I 
 
Identificación de cepas de Campylobacter fetus aisladas del 
tracto reproductor y de abortos en rodeos bovinos 
 
 
6 
 
CAPÍTULO I 
 
Sección 1 
Colección de cepas de Campylobacter fetus 
 
1.1.1 INTRODUCCIÓN 
 
Breve reseña histórica de la taxonomía de Campylobacter fetus 
 
El género Campylobacter por muchos años presentó una gran confusión taxonómica basada en la 
amplia diversidad de los hábitats de los microorganismos que lo componen, sus características de 
crecimiento y la inercia en los sistemas de identificación, actuando estos factores como 
obstáculos para la apropiada identificación y nomenclatura Penner (1988). 
McFadyean and Stockman (1913) describen un “vibrio” responsable de abortos en ovejas 
preñadas en el año 1906: “...comma shaped, but long spirilla forms, apparently consisting of several 
commas joined end to end, were also present. In hanging drops these organisms were actively 
motile...”. A partir de la inoculación experimental de este microorganismo en vacas preñadas, se 
logró reproducir el aborto. Luego, Smith (Smith, 1918) recuperó un “espirilo” microaerófilo de 
terneros abortados, sosteniendo que el mismo era idéntico al descripto por McFadyean y 
Stockman. El mismo fue designado por Smith y Taylor como Vibrio fetus, debido al predominio 
de las bacterias en forma de “coma” sobre la de espirilo, principalmente en cultivo jóvenes 
(Smith, 1919; Smith and Taylor, 1919). 
La asignación del microorganismo en estudio al género Vibrio no fue satisfactoria, ya que Vibrio 
fetus se diferenciaba en algunos aspectos fenotípicos y genotípicos de otras especies del mismo 
género como V. cholerae (Véron, 1966). El género Vibrio comprende bacterias que fermentan la 
glucosa (Hugh and Leifson, 1953) y en su ADN contienen entre un 40 y 53% de guanina y 
citosina (G + C), mientras que las del género Campylobacter son asacarolíticas y el porcentaje de 
G + C varía entre 29 y 36% (Sebald and Veron, 1963; Véron, 1966; Vandamme et al., 2005; 
Terzolo and Catena, 2007). Por esta razón, Sebald y Véron en el año 1963 propusieron un nuevo 
género denominado Campylobacter que incluye la especie Campylobacter fetus (Sebald and 
Veron, 1963). 
La diferenciación taxonómica de las especies de Campylobacter se redefinió en 1973 al 
discriminar las bacterias incluidas dentro del género en función de su reacción a la enzima 
7 
 
catalasa y la producción de ácido sulfhídrico (SH2) (Veron and Chatelain, 1973). Como resultado, se definieron tres grupos: cepas catalasa positivas 
y SH2 negativas que incluía a C. fetus, cepas catalasa y SH2 positivas como C. coli y C. jejuni, cepas catalasa y SH2 negativa como C. sputorum. 
 
Clasificación anterior Clasificación actual 
Smibert Florent Smith and Taylor Veron and Chatelain Smibert 
C. fetus var. intestinalis V. fetus var. intestinalis V. fetus C. fetus subsp. fetus C. fetus subsp. fetus 
C. fetus subsp. fetus V. fetus var. venerealis V. fetus C. fetus subsp. venerealis C. fetus subsp. venerealis 
 
Tabla N° 1.1.1. Esquema de la evolución histórica de la nomenclaturade Campylobacter fetus. Adaptado de Penner (1988). 
 
En 1991, Vandamme et al. introdujeron el género Campylobacter en la superfamilia VI ARNr en base a los estudios de hibridación, una de las 
técnicas que más aportes realizó dentro de la familia Campylobacteraceae (Vandamme and De Ley, 1991), la cual incluye tres géneros: 
Campylobacter, Arcobacter y Sulfurospirillum. Los dos primeros, asociados a enfermedades en humanos y animales, mientras que Sulfurospirillum 
con bacterias ambientales. Si bien inicialmente el género Arcobacter fue denominado para incluir cepas aerotolerantes de Campylobacter, luego se 
demostró que poseen diferentes perfiles de ADN-ARNr (Vandamme et al., 1991). 
 
En los últimos años, para contribuir a clarificar algunos aspectos de importancia, se ha avanzado en el estudio de la constitución genética del género. 
El desarrollo de nuevas metodologías de estudio para los caracteres fenotípicos y genotípicos, determinó que el género Campylobacter sufra 
continuas modificaciones debido a la incorporación de nuevas especies, como así también, a la reasignación de algunos microorganismos a otros 
géneros con características compartidas. Actualmente el género Campylobacter se incluye en la Clase V Epsilonproteobacteria, Orden I 
Campylobacterales, Familia I Campylobacteraceae (Vandamme et al., 2005). 
8 
 
 
Imagen N° 1.1.1. Árbol filogenético de la familia Campylobacteraceae basado en el 
porcentaje de similitud de la secuencia 16S rARN. 
Wassenaar and Newell (2006) adaptado de Vandamme (2000) 
 
Características generales del género Campylobacter 
 
El nombre Campylobacter deriva de una palabra griega que significa “bacilo curvo”. Las 
campylobacterias son bacterias con morfología curva, espiralada o en forma de “S”, Gram 
negativas, no formadoras de esporas y miden entre 0,5 a 8 µm de largo y 0,2 a 0,5 µm de ancho. 
Generalmente tienen un solo flagelo polar o uno en cada extremo cuyo largo puede superar en 
9 
 
hasta tres veces el tamaño de la célula. La motilidad de la bacteria es rápida y característica en 
forma de “tirabuzón”. Son de crecimiento relativamente lento de hasta 6 días, asacarolíticos y 
generalmente, bioquímicamente no reactivos (Sebald and Veron, 1963; Penner, 1988; 
Vandamme et al., 2005; Terzolo and Catena, 2007). 
Con respecto a los requisitos atmosféricos y si bien la mayoría de las bacterias incluidas en el 
género son microaerófilas, existe un espectro de crecimiento óptimo que se extiende desde 
condiciones anaeróbicas hasta necesidades y tolerancia al oxígeno (O2) en otros casos. Del 
mismo modo, hay un amplio rango de temperaturas que se extiende desde los 15 °C para C. 
cryoaerophila hasta los 41 a 42 °C para C. jejuni, C. coli y C. laridis (C. lari). Por otra parte, las 
especies y subespecies incluidas, varían su crecimiento en relación a la temperatura óptima 
(Penner, 1988; Carter, 2004; Vandamme et al., 2005; Terzolo and Catena, 2007). 
El género incluye actualmente 34 especies y 14 subespecies confirmadas 
(http://www.bacterio.net/campylobacter.html), 10 se consideran de interés en microbiología 
veterinaria, de las cuales C. fetus, y C. jejuni son comúnmente aisladas en el diagnóstico de 
enfermedades reproductivas. Si bien ambas han demostrado ser causantes de abortos bovinos 
esporádicos, la especie de mayor relevancia es C. fetus. Las especies C. hyointestinalis y C. 
sputorum se consideran comensales del tracto digestivo y reproductor (Penner, 1988; Terzolo 
and Cipolla, 1992; Quinn et al., 2002; Carter, 2004; Vandamme et al., 2005; Terzolo and Catena, 
2007). 
 
Especie Campylobacter fetus 
 
La especie C. fetus se divide en dos subespecies: C. fetus subespecie fetus y C. fetus subespecie 
venerealis (Florent, 1959; Veron and Chatelain, 1973; Penner, 1988; Carter, 2004; Vandamme et 
al., 2005; Terzolo and Catena, 2007). Por pruebas de hibridación se ha confirmado que entre 
ambas subespecies hay una estrecha relación ya que tienen similar contenido de guanina y 
citosina (G+C) en su ADN (Veron and Chatelain, 1973; Harvey and Greenwood, 1983; Roop II 
et al., 1984; Penner, 1988; On, 1996; Carter, 2004; Vandamme et al., 2005; Terzolo and Catena, 
2007). Harvey and Greenwood (1983) señalaron que no habría base genética para la división de 
la especie en subespecies. Además, ambas subespecies son aglutinables en un antisuero contra el 
mismo serotipo (Veron and Chatelain, 1973; On, 1996; Terzolo and Catena, 2007). 
Las primeras secuencias completas del genoma de C. fetus subsp. fetus (82-40) y C. fetus subsp. 
venerealis (84-112) se conocieron en el 2006 (número de acceso al GenBank NC_008599) y 
2011, respectivamente (Chaudhuri and Pallen, 2006). 
http://www.bacterio.net/campylobacter.html
10 
 
van Bergen et al. (2005a) analizaron 140 aislamientos de C. fetus por Multilocus Sequence 
Typing (MLST). La especie fue genéticamente homogénea y estable, comparada con otras 
especies del género. En total, se identificaron 14 tipos de secuencias (STs), con una baja 
diversidad genética basada en 22 sitios con 3.312 nucleótidos. Existe una mayor variabilidad en 
los STs de C. fetus subsp. fetus con respecto a C. fetus subsp. venerealis. El ST 4 sólo se asoció a 
C. fetus subsp. venerealis. La elevada similitud observada entre ambas subespecies condujo a 
considerar a C. fetus subsp. venerealis como un clon bovino de C. fetus subsp. fetus. 
 
Las dos subespecies de C. fetus están adaptadas al tracto genital bovino. El toro es portador y 
diseminador de la enfermedad por transmisión venérea, el principal hábitat de C. fetus son las 
criptas prepuciales. Las secreciones genitales de las vacas que abortaron y aquellas hembras 
portadoras de la bacteria en el área cérvico vaginal, los fetos abortados, la placenta y el intestino, 
también son fuentes de infección (Clark, 1971; Smibert, 1978; Ware, 1980; Hoffer, 1981; Coid 
and Fox, 1983; Garcia et al., 1983; Hum, 1987; Penner, 1988; Eaglesome and Garcia, 1992; 
Carter, 2004; BonDurant, 2005; Joens et al., 2010; Terzolo and Catena, 2007). 
C. fetus subsp. fetus también puede ingresar a través de la ingestión de alimentos y/o agua 
contaminada con heces y ser aislado a partir de muestras de intestino y todo material 
contaminado con heces (Easterbrooks and Plastridge, 1952; Clark, 1971; Smibert, 1978; Ware, 
1980; Hoffer, 1981; Coid and Fox, 1983; Garcia et al., 1983; Hum, 1987; Penner, 1988; 
Eaglesome and Garcia, 1992; Joens et al., 2010; BonDurant, 2005; Vandamme et al., 2005; 
Terzolo and Catena, 2007). 
Si bien por muchos años la única subespecie reconocida como causa infrecuente de infecciones 
en seres humanos fue C. fetus subsp. fetus, se han reportado casos por C. fetus subsp. venerealis 
y C. fetus subsp. testudinum. La bibliografía cita infecciones sistémicas asociadas con 
meningitis, pericarditis, peritonitis, salpingitis, artritis, celulitis y abscesos en seres humanos con 
condiciones predisponentes como inmunosupresión, entre otras (Righter et al., 1983; Francioli et 
al., 1985; Penner, 1988; Kubota et al., 1993; Sauerwein et al., 1993; Wilhelm et al., 1996; 
Chuman et al., 2003; Patrick et al., 2013; Iraola et al., 2015; Wagenaar et al., 2014; Escher et al., 
2016; van Samkar et al., 2016; Yen-Hung et al., 2017). 
 
Si bien C. fetus es aislado comúnmente de rumiantes, principalmente bovinos y ovinos, también 
se han identificado cepas de diversas especies de reptiles (Wang et al., 2013) genéticamente 
divergentes de cepas de origen humano, representando incluso un grupo taxonómico distinto (Tu 
et al., 2005; Dingle et al., 2010). 
11 
 
Fitzgerald et al. (2014) al analizar 58 cepas aisladas de humanos y 55 de reptiles, describieron 
una nueva subespecie para 13 cepas a la que denominaron C. fetus subsp. testudinum. Los 
resultados obtenidos a partir de técnicas de ribotipificación (16S rARN), desorción/ionización 
mediante láser asistida por matriz - acoplada a un analizadortiempo de vuelo (MALDI-TOF 
MS), electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE), polimorfismos en la longitud de 
fragmentos amplificados (AFLP), hibridación ADN-ADN y la secuenciación completa del 
genoma, han demostrado que estas cepas están relacionadas con la especie C. fetus pero se 
diferencian claramente de las subespecies descriptas hasta el momento (Imagen N° 1.1.2). Si 
bien la diferenciación fenotípica por pruebas convencionales aún no es clara, por MALDI-TOF 
MS se identificaron múltiples biomarcadores fenotípicos que distinguirían a C. fetus subsp. 
testudinum de las subespecies reconocidas de C. fetus. En la actualidad no se han reportado 
aislamientos de esta nueva subespecie para las cepas de bovinos. 
Li et al. (2016) reportaron un caso de peritonitis bacteriana espontánea causada por 
Campylobacter fetus subsp. testudinum en una persona con cirrosis hepática. 
 
12 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Imagen N° 1.1.2. Dendograma de correlación entre especies del género Campylobacter (coeficiente de Pearson - UPGMA). 
(Fitzgerald et al., 2014) 
 
 
 
 
 
13 
 
Las muestras clínicas enviadas de rutina a los laboratorios de diagnóstico para el aislamiento de 
C. fetus incluyen: esmegma prepucial, semen criopreservado, mucus cérvico vaginal, placenta, 
líquido abomasal y órganos parenquimatosos de fetos abortados, siendo de elección el pulmón. 
Las técnicas para la toma de muestra de esmegma prepucial incluyen el raspaje, el lavado y la 
aspiración, las muestras de mucus se toman por aspirado con jeringa de Cassou y vainas de 
inseminación artificial generalmente en el momento de realizar la palpación transrectal o cuando 
se detectan fallas reproductivas tempranas (Terzolo et al., 1992; Terzolo and Catena, 2007). 
La técnica utilizada para la recolección de muestras impacta en los resultados del aislamiento. 
Tedesco et al. (1977) demostraron que el éxito en la detección de C. fetus y el grado de 
contaminación, se correlacionarían con el método de muestreo mediante la técnica de raspado, 
aspiración y lavado. Para el primer parámetro evaluado los valores obtenidos fueron de 71,4%, 
36% y 25,8%, mientras que para el segundo 33,9%, 63% y 83,9%, respectivamente. Del análisis 
de los resultados y en concordancia con otros trabajos (Shepler et al., 1963; Clark et al., 1974; 
Hum et al., 1994; Hum et al., 2009; Chaban et al., 2013), se concluye que el raspaje constituye 
una de las técnicas de muestreo que otorgarían mayores probabilidades de obtener un resultado 
positivo a la detección de C. fetus y asimismo, un menor nivel de contaminación. Actualmente, 
la OIE (2012) incluye todas las opciones como parte del procedimiento recomendado. 
 
La naturaleza de crecimiento lento de C. fetus y el potencial desarrollo de los contaminantes 
presentes en las muestras, determinan que el uso de medios de transporte y enriquecimiento 
(TEM) sea esencial si las muestras no serán procesadas en el laboratorio el mismo día de su 
recogida, caso contrario podrán ser transportadas en PBSs. Dentro de los TEMs descriptos se 
destacan el Caldo Brucella semisólido, Cary-Blair (Garcia et al., 1984; Terzolo et al., 1992; Hum 
et al., 1994; Monke et al., 2002), Clark (Clark et al., 1974), de Lander (Lander, 1990b) y 
Thomann Transporte y Enriquecimiento (TTE) (Harwood et al., 2009). El medio de Lander ha 
sido modificado por Hum et al. (2009) con el objetivo de reducir la concentración de polimixina 
B debido a las sensibilidades demostradas por algunas cepas de C. fetus subsp. venerealis. El 
protocolo actual de la OIE recomienda el uso de TEM de Lander para el transporte de los 
aislamientos de campo para el cultivo de C. fetus subsp. venerealis (OIE, 2012). 
Para su envío al laboratorio, las muestras deben conservarse a temperatura de refrigeración entre 
4 y 10 °C, protegerse de la luz (OIE, 2012) y con atmósfera circundante para ayudar al 
crecimiento de las bacterias microaerofílicas (Monke et al., 2002). 
La técnica de IFD para C. fetus es la herramienta utilizada para el diagnóstico de rutina de la 
campylobacteriosis genital bovina, a partir de muestras de esmegma prepucial. También se 
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puede utilizar en muestras de mucus cérvico vaginal y líquido abomasal pre enriquecidas. La 
técnica fue evaluada por varios autores considerando el límite de detección, efecto del 
observador y sensibilidad (Mellick et al., 1965; Soto and di Rocco, 1982; Figueiredo et al., 
2002), mientras que la especificidad fue probada para Campylobacter spp., Arcobacter spp., 
Helicobacter spp., E. coli y otras bacterias de la microbiota prepucial. El límite de detección de 
la IFD fue 10
4 
UFC/mL para PBS y lavados prepuciales sin centrifugación y 10
2
 UFC/mL para 
lavados prepuciales centrifugados; no hubo efecto del observador y la sensibilidad y la 
especificidad fueron 92,59% y 88,89%, respectivamente (Figueiredo et al., 2002). Su principal 
limitante es la incapacidad de diferenciar las subespecies de C. fetus ya que ambas tienen 
antígenos comunes y el conjugado utilizado en esta técnica es a célula entera (Mellick et al., 
1965; Soto and di Rocco, 1982; Figueiredo et al., 2002), por lo que no se dispone de información 
sobre diferenciación de estas dos subespecies a nivel regional (Baldone et al., 2014). 
 
El aislamiento y la identificación de las cepas de C. fetus contribuye al estudio epidemiológico, 
al monitoreo temporal y geográfico en las distintas regiones. Sin embargo, esta metodología no 
se realiza de forma rutinaria en todos los laboratorios diagnósticos ya que es un microorganismo 
de crecimiento lento con requerimientos especiales. 
 
El aislamiento de C. fetus a partir de las muestras clínicas de interés, se efectúa utilizando 
medios de cultivo selectivos, atmósferas microaerófilas y una temperatura de incubación 
adecuada. 
En las muestras de mucus cérvico vaginal, debido a la presencia de bacterias de la microbiota 
vaginal y al bajo número de campylobacterias presentes, es recomendable efectuar un pre-
enriquecimiento antes de su cultivo en placas de agar selectivo, siendo de elección el medio 
Brucella semisólido con el agregado de antibióticos (Terzolo et al., 1992; Quinn et al., 2002; 
Carter, 2004; Vandamme et al., 2005; Terzolo and Catena, 2007; OIE, 2012). 
Por otra parte, se debe considerar que el esmegma prepucial contiene microorganismos que 
conforman la microbiota del prepucio y por lo tanto, “competirán” con C. fetus por los nutrientes 
al momento del cultivo, dificultando de esta manera el aislamiento del microorganismo de 
interés. La concentración de C. fetus subsp. venerealis presente en muestras prepuciales varía 
entre 10
2
 a 10
5
 UFC/mL (Clark, 1971), los cuales cohabitan con microorganismos contaminantes 
de rápido crecimiento como Pseudomonas spp., Proteus spp., Escherichia coli, Corynebacterium 
spp., Micrococcus spp. y otra especies patógenas intestinales pertenecientes al género como C. 
coli y C. jejuni (Ruebke, 1951) y no patógenas como C. bubulus, comensal que se limita a la 
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porción anterior del prepucio, mientras que C. fetus subsp. venerealis se encuentra comúnmente 
en el fondo de saco prepucial (Samuelson and Winter, 1966). Por tal motivo, para el 
procesamiento de este tipo de muestras se recomienda la filtración de la muestra con membranas 
millipore de 0,45 a 0,8µm y el uso de medios de cultivo suplementados con antibióticos como: 
agar Skirrow con trimetoprim, vancomicina, anfotericina B y polimixina B y agar Preston con 
trimetoprim, rifampicina, ciclohexamida y polimixina B (Terzolo et al., 1991; Quinn et al., 2002; 
Carter, 2004; Vandamme et al., 2005; Terzolo and Catena, 2007; OIE, 2012). 
La filtración como un método de exclusión por tamaño se ha utilizado en numerosos estudios 
para el aislamiento de diferentes especies de Campylobacter en laboratorios de diagnóstico 
humano y veterinario para muestras de sangre, contenido intestinal