Biologia-celula-20

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BIOLOGÍA CELULAR6
2. Inclusión y corte. Los organismos unicelulares y las
células aisladas pueden observarse con facilidad
con el microscopio, pero los órganos y tejidos, in-
cluso pequeños fragmentos de ellos, son demasia-
do gruesos para que sean traspasados por la luz; de
ahí que sea necesario cortarlos en finas láminas.
Para ello se utiliza un aparato llamado micrótomo,
que permite la realización de cortes de tan sólo al-
gunos micrómetros de espesor. El material biológi-
co resulta de ordinario extremadamente blando pa-
ra poder efectuar los cortes; por ello, a la fijación
sigue un proceso de endurecimiento del material y
su inclusión en una sustancia plástica, generalmen-
te parafina o resina, en la que queda embebido el
tejido para que pueda cortarse con facilidad. Una al-
ternativa rápida a la inclusión, aunque con resulta-
dos de menor calidad, consiste en congelar el tejido
y hacer los cortes con un micrótomo especial para
esta finalidad (criótomo). Este procedimiento se uti-
liza en observaciones de urgencia o cuando el pro-
ceso de inclusión puede eliminar o dañar los com-
ponentes que se desea estudiar.
3. Tinción. Una dificultad en la observación microscó-
pica es el escaso contraste que presenta el material
biológico debido a su gran contenido en agua. Para
mejorar el contraste se utilizan las tinciones, que
permiten colorear artificialmente los distintos com-
ponentes tisulares. Son muchos y variados los colo-
rantes que se emplean. Aunque las primeras tincio-
nes empleadas se obtuvieron de forma empírica,
con el tiempo se han desarrollado técnicas que per-
miten demostrar determinadas reacciones enzimá-
ticas o poner de manifiesto la naturaleza de una
sustancia celular concreta mediante la utilización de
anticuerpos marcados con un colorante frente a esa
sustancia (véase página 13). 
Medios para aumentar el contraste en diversas
modalidades de microscopía óptica
Para estudiar el material vivo, en el que no pueden apli-
carse las tinciones convencionales pues las células
mueren en la fijación, se emplea el microscopio de con-
traste de fases. Con el microscopio ordinario, una parte
de los rayos que atraviesan el objeto son difractados y
se desvían cambiando su fase. En los materiales bioló-
gicos la diferencia de fase de onda entre los rayos des-
viados y los que no son desviados es de aproximada-
mente, 1/4 de esa longitud de onda. Cuando ambos
tipos de rayos atraviesan las lentes y sufren interferen-
cia, los rayos resultantes experimentan un cierto retra-
so de fase que no se detecta con el microscopio ordina-
rio. En el microscopio de contraste de fases, los rayos
difractados son adelantados o retrasados 1/4 de la lon-
gitud de onda con respecto a los no difractados por me-
dio de una placa anular. Si ambos grupos de rayos se
suman (contraste brillante o negativo), el objeto apare-
cerá más brillante que el medio, mientras que si el con-
traste es oscuro o positivo, los rayos experimentarán
una sustracción, siendo la imagen resultante más oscu-
ra que la del medio. De este modo, el microscopio de
Si se tiene en cuenta que el límite de resolución del
ojo humano sin ayuda de lentes es 0.23 mm = 230 µm
(micrómetros) = 230 000 nm, el microscopio óptico au-
menta casi 1000 veces el poder de resolución del ojo.
El límite de resolución del microscopio de luz es muy
difícil de mejorar. Para conseguir un límite de resolu-
ción más pequeño, según se desprende de la fórmula
indicada antes, habría que aumentar el denominador (la
apertura numérica) o disminuir el numerador (longitud
de onda). Aumentar el denominador no es posible en lo
que respecta al seno α, porque el seno de un ángulo
nunca puede ser mayor que uno, pero puede aumentar-
se ligeramente el índice de refracción con el empleo de
lentes de cuarzo. Con respecto a la disminución del nu-
merador, la longitud de onda de la luz blanca no es sus-
ceptible de disminución pero puede emplearse luz ul-
travioleta, cuya longitud de onda es 260 nm. De este
modo, usando lentes de cuarzo y luz ultravioleta, se
consigue el máximo límite de resolución posible, alre-
dedor de 150 nm. Sin embargo, este procedimiento tie-
ne el inconveniente de que la luz ultravioleta no es visi-
ble y hay que proceder por aproximación, tomando
fotografías para observar luego dónde se ha impresio-
nado la placa fotográfica. Este método no es útil, por
tanto, para los estudios habituales pero se ha utilizado
para el estudio de ácidos nucleicos que absorben inten-
samente la luz ultravioleta.
Los aumentos finales se obtienen multiplicando los
del objetivo por los del ocular. Hay que tener en cuenta
que la resolución de la imagen es la del objetivo, puesto
que el ocular no amplía el poder de resolución. Sin em-
bargo, el ocular es muy útil, porque con sólo el objetivo
quedaría la imagen demasiado pequeña para ser observa-
da con comodidad. En algunos microscopios se emplea,
además, una lente intermedia, cuyos aumentos constitu-
yen un factor multiplicador más a la hora de calcular los
aumentos finales. La imagen obtenida puede impresio-
nar una placa fotográfica colocada en vez del ocular. Al
positivar el negativo, la imagen puede aumentarse hasta
cuatro o cinco veces, obteniendo así una imagen amplia-
da que permite observar con comodidad los detalles
captados gracias al poder de resolución. Las ampliacio-
nes excesivas diminuirían la nitidez de la imagen.
Técnicas preparatorias utilizadas 
en microscopía óptica
La correcta observación del material biológico con el
microscopio óptico requiere una serie de procesos pre-
vios que, en esencia, son los siguientes:
1. Fijación. Las células de los órganos y tejidos mue-
ren y se descomponen cuando son extraídas de su
medio si no se las mantiene en condiciones espe-
ciales como las que se dan en los cultivos celulares.
El proceso de fijación no evita la muerte celular,
pero preserva de la descomposición manteniendo
inalterada la estructura morfológica. Entre los mu-
chos líquidos fijadores utilizados, el formaldehído o
formol es el más habitual. Otros fijadores son el al-
cohol y el ácido acético.
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