Biologia-celula-21

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CAPÍTULO 1: ESTUDIO GENERAL DE LA CÉLULA 7
contraste de fases transforma estas diferencias de fase
en diferencias de amplitud y, por tanto, de intensidad,
haciendo que el material presente un mayor contraste.
El microscopio de interferencia se basa en principios
similares pero tiene la ventaja de proporcionar resulta-
dos cuantitativos. Con este microscopio se pueden de-
terminar cambios en el índice de refracción y las varia-
ciones de fase se pueden reflejar en cambios de color
tan acentuados que una célula viviente es capaz de apa-
recer coloreada.
Una variante de este microscopio es el microscopio
de Nomarski, en el que el rayo de luz, tras atravesar el
objeto y la lente objetivo, por medio de un prisma birre-
fringente se divide en dos rayos polarizados, que si-
guen trayectorias ligeramente diferentes, y que interfie-
ren entre sí. La imagen resultante tiene un efecto en
relieve característico. Este microscopio es particular-
mente útil en el estudio in vivo de las células.
Otra variedad es el microscopio de polarización. Se
basa en la propiedad de ciertas sustancias (anisótropas)
que tienen un distinto índice de refracción según la di-
rección que se considere. Las sustancias que siempre
mantienen el índice de refracción se llaman isótropas.
Esta propiedad de las sustancias anisótropas es utiliza-
da mediante un dispositivo de polarización, que se apli-
ca al microscopio para apreciar estas diferencias como
diferencias de contraste entre las diversas sustancias.
El microscopio citofotométrico se basa en que diver-
sos componentes celulares absorben específicamente de-
terminadas bandas de luz. Así, mientras que los ácidos
nucleicos absorben la banda de 260 nm (ultravioleta), las
proteínas absorben la de 280 nm. También algunas re-
acciones histoquímicas dan bandas de absorción específi-
cas en el espectro visible y pueden analizarse cuantitati-
vamente con estos microscopios. La absorción se mide 
directamente con un fotomultiplicador o por dosimetría
sobre placas fotográficas calibradas. Así, mientras la cito-
fotometría con luz ultravioleta permite detectar los ácidos
nucleicos (DNA y RNA) sin distinguir entre ambos, si se re-
alizan tinciones específicas para el DNA (como la reacción
de Feulgen), el microscopio citofotométrico puede cuanti-
ficar el contenido en DNA sin confundirlo con el de RNA.
Para el análisis de células y tejidos con fluorescencia
propia o que han sido tratados con colorantes fluores-
centes (fluorocromos) se utiliza el microscopio de fluo-
rescencia. La característica fundamental de este micros-
copio es la incorporación de una lámpara, que actúa
excitando el fluorocromo, y de un filtro especial, que
presenta altos valores de transmisión para las ondas emi-
tidas por el colorante fluorescente. Normalmente, antes
del análisis en el microscopio hay que tratar la muestra
con reactivos que impidan la decoloración. Debido a su
gran sensibilidad y a la posibilidad de observación si-
multánea de varias longitudes de onda, el microscopio
de fluorescencia es muy utilizado para distinguir los di-
ferentes componentes celulares, utilizando marcadores
distintos para cada uno de ellos.
El microscopio óptico de barrido confocal adapta un
sistema de barrido mediante rayo láser que se concentra
en un punto de muy poco espesor. Este rayo se desplaza
mediante un sistema de espejos y rastrea punto por pun-
to un plano de la preparación. La luz que emerge del
punto por fluorescencia es dirigida a un tubo multiplicador,
donde es analizada. Los datos se registran en un ordena-
dor que integra la información elaborando una imagen de
alta definición, incluso de objetos bastantes gruesos, mu-
cho más perfecta que la imagen obtenida con los micros-
copios ordinarios, ya que esta última presenta puntos
perfectamente enfocados junto con otros fuera de foco.
El microscopio confocal, al reconstruir la imagen por or-
denador, también puede realizar una reconstrucción tri-
dimensional integrando las imágenes obtenidas de dife-
rentes planos de la preparación y rotar esa imagen para
observarla desde diferentes ángulos.
MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE TRANSMISIÓN
Características
El microscopio electrónico supone un considerable au-
mento en el poder de resolución al emplear no luz visi-
ble sino electrones acelerados, cuya longitud de onda
es unas 100 000 veces menor. Igual que la luz, los elec-
trones tienen una naturaleza vibratoria y corpuscular. Al
ser de pequeña longitud de onda, pueden contornear
muy bien los objetos, lo que les confiere un gran poder
de resolución. Su masa es muy pequeña (1/1840), por lo
que pueden ser desviados con mucha facilidad. El aire
los desvía, por lo cual se trabaja en tubos huecos en los
que reina el alto vacío, equivalente a 10–5 Torr (Torricelli
o mm de mercurio). Para desviar los electrones de un
modo controlado se utilizan lentes que no son ópticas
sino electromagnéticas. A mayor poder de la corriente,
mayor desviación. En síntesis, el funcionamiento del mi-
croscopio electrónico es como sigue:
Un filamento (cátodo) en un tubo de vidrio a gran vacío
es calentado y emite electrones que tienden a seguir una
trayectoria rectilínea aunque vibratoria. Mediante una
lente electromagnética (que hace las veces de condensa-
dor) los electrones son concentrados en el objeto. Una
segunda lente electromagnética funciona como lente ob-
jetivo, dando una imagen ampliada del objeto. La tercera
lente es el proyector, que actúa de ocular, volviendo a am-
pliar la imagen y proyectándola sobre una pantalla fluo-
rescente o sobre una placa fotográfica. Entre ambas lentes
hay una lente intermedia, también electromagnética, que
amplía una vez más la imagen (Fig. 1.1).
En el microscopio de luz de campo claro, la formación
de imágenes depende de la desigual absorción de la luz
en diferentes zonas del objeto. En el microscopio electró-
nico se debe a la dispersión de los electrones al interac-
tuar con los átomos. Al pasar por el objeto, los electro-
nes se dispersan de forma elástica y algunos caen fuera
de la apertura del objetivo. La imagen que se forma en la
pantalla resulta de la ausencia de estos electrones en de-
terminadas zonas. Esta dispersión está en función del
espesor y densidad de los átomos del objeto (masa ató-
mica). A mayor número atómico, mayor dispersión. Se
puede calcular el poder de resolución con la misma fór-
mula empleada para el microscopio óptico.
Antes de aplicar la fórmula se debe tener en cuenta
que, en el microscopio electrónico, el voltaje normal-
mente utilizado es 60 000 voltios, la longitud de onda de
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