Descarga la aplicación para disfrutar aún más
Vista previa del material en texto
Teórico 20: Replicación del ADN Prof.: Dr. Hugo Adamo Año 2017 METABOLISMO DEL DNA: -Replicación: copias fieles de DNA. -Reparación y Recombinación. El ADN es una doble hélice, donde los nucleótidos están apareados. Sabemos que la Replicación es Semiconservativa (cada molécula hija de DNA está formada por un templado que es parental que no se modificó, y una nueva hebra que se copió, que se acaba de sintetizar). Semiconservativa porque una de las hebras se conserva del DNA original y la otra se sintetizó nueva. Contrariamente a lo que se podría pensar de que una célula hija recibe dos hebras nuevas de DNA. ¿Cómo podemos demostrar que la replicación del DNA es Semiconservativa? Ahora se podría marcar fluorescentemente una de las hebras y mediante microscopía moderna, muy potente, se podría discriminar la fluorescencia de las dos hebras. Pero en el momento histórico en el que se propuso que la replicación del DNA era Semiconservativa no existía una resolución tan avanzada en los Microscopios. Existía una técnica, sin embargo, que era muy exquisita en la detección de las diferencias de masa: la Ultracentrifugación Analítica. Hoy en día hay pocas ultracentrífugas tan potentes como para separar moléculas por diferencia de peso. Uno lo que puede llegar a hacer cotidianamente es separar organelas, fracciones subcelulares. Pero también se pueden separar moléculas. La velocidad con la que migra una molécula en un campo centrífugo depende del peso que tiene y su relación con el solvente. Una molécula podemos pensarla como un cuerpo que se encuentra en un medio líquido. Está sometido a una fuerza de peso hacia el centro de la centrífuga y a una fuerza de empuje que se opone a la del peso (como cuando nosotros nos metemos en el agua). La fuerza de empuje depende del volumen y de la densidad. Eso hace que la fuerza resultante entre el peso y el empuje, dependa de la diferencia de densidad que existe entre la molécula y el solvente. En un campo centrífugo, la molécula va a desplazarse desde la parte de arriba del tubo hacia el fondo. Si la densidad a lo largo del tubo varía, la molécula va a migrar hasta que encuentra una densidad equivalente. Cuando la densidad del solvente y la molécula es la misma, no hay fuerza, y, por lo tanto, la molécula no se mueve. Éste fue el principio que utilizaron Meselson y Stahl para hacer el experimento que demostró finalmente que la replicación del DNA era Semiconservativa como había sido propuesta por Watson y Crick en 1953. ¿Qué es lo que hicieron? Crecieron E. coli en un medio que contenía un isótopo pesado del Nitrógeno (15N). Notar que se usa 15N no por sus propiedades radioactivas, sino simplemente porque al ser un isótopo, tiene un neutrón más entonces es más pesado (los isótopos difieren en su número másico –neutrones + protones- pero poseen el mismo número atómico –protones-). Y como dijimos, la ultracentrifugación Analítica es tan sensible que puede detectar esas diferencias de peso. Entonces, a partir de esas E. coli se aisló el ADN cromosómico y se colocaron en un campo centrífugo: centrifugación de equilibrio en un gradiente de densidad de Cloruro de Cesio (CsCl). Así, el DNA va a migrar hasta que llegue a su densidad. Así se va a obtener una banda donde las moléculas de DNA se van a estabilizar. Esa banda corresponder a la densidad de la molécula parental Luego tomaron ese mismo cultivo y lo hicieron crecer en un medio que ahora tiene el isotopo liviano (14N). Volvieron a aislar el DNA (con mucho cuidado que no se fragmente) y centrifugaron nuevamente. Se obtiene una banda que cuando se la compara con el caso en que se incuba por mucho tiempo con 14N, se ubica en una posición intermedia entre la banda pesada (todo 15N) y la banda liviana (todo 14N). Entonces, este resultado muestra que inicialmente durante la primera generación de las células hijas, se produce un híbrido que tiene una densidad intermedia entre la parental (todo 15N) y la hija que se obtiene cuando se deja crecer durante mucho tiempo (todo 14N). Entonces, este resultado sólo es compatible con el modelo de replicación semiconservativa. Otro hallazgo importante acerca del mecanismo de replicación, fue que: existe una región del cromosoma que se denomina Origen de Replicación. ¿Dónde se inicia la replicación, la copia de la molécula hija? En el Origen de Replicación, hay una región específica en el DNA, con características particulares que permite que sea ese el lugar elegido para el inicio de la replicación. El cromosoma de las bacterias es único y circular. En E. coli existe un único Origen de Replicación y recibe el nombre de OriC. Cuando se separan las dos hebras, se obtiene esa estructura de letra griega (θ, Theta) que muestra que la replicación se expande en una forma bidireccional. Todo esto se determinó a partir del uso de isótopos radioactivos. Se usa algún otro nucleótido marcado y si se aísla con mucho cuidado el ADN cromosomal y se extiende en una placa radiográfica se puede observar esa estructura donde las flechitas muestran los lugares donde se esta incorporando activamente la radiactividad y se observa dos lugares, eso significa que la replicación se extiende a partir de la burbuja inicial que se formo en ambas direcciones. ENTONCES LA REPLICACION ES SEMICONSERVATIVA Y BIDIRECCIONAL. Los Fragmentos de Okazaki se originan debido a que una de las hebras no puede ser copiada en forma continua. ¿A qué se debe esto? Esto se debe a una propiedad de las DNA Polimerasas: solamente extienden la nueva hebra de DNA a partir del extremo 3´ libre (allí está el hidroxilo libre, RECORDAR QUE EN EL EXTREMO 5’ ESTA EL FOSFATO LIBRE Y EN EL EXTREMO 3’ EL OXHIDRILO LIBRE). Decimos que “la DNA Polimerasa solamente puede extender la cadena cuando ve el hidroxilo (OH) de 3´ libre. Entonces, eso significa que la DNA Polimerasa sólo extiende en una única dirección. Con la hebra que se va a utilizar como molde que se extiende de 3´-5 ´, la azul, la DNA Polimerasa no tiene ningún problema en utilizarla como molde, en copiarla y extender la hebra hija a partir del extremo 3´ de la roja. Se va abriendo, se van separando las hebras de DNA y va copiando. Esta hebra que se está copiando se llama “Hebra conductora”. En el caso de la hebra que se va a usar como molde que se extiende de 5´3´ (no se puede copiar antes de que se abra, entonces como puede copiar si no tiene el inicio de replicación accesible?), como la hebra hija tiene que crecer a partir del extremo 3´, va a ir copiando en pequeños fragmentos porque necesita que las dos hebras se vayan abriendo, se separen, para poder seguir creciendo a partir del extremo 3´ (se abre un poco, se copia, se libera este fragmento de Okazaki y asi sucesivamente). Entonces, esta segunda hebra está creciendo en forma discontinua. Por eso esta hebra que se está copiando se la llama “Hebra Rezagada” o “Hebra Retardada”. Esta ultima tarda mas en copiarse y lo hace de manera discontinua. Las DNA Polimerasas siempre requieren un templado, un molde para copiar. Van acoplando los nucleótidos entrantes, requiere del oxhidrilo 3’ libre. El hidroxilo (OH) 3´ de la ribosa de la hebra naciente ataca al fosfato α de un nuevo desoxirribonucleótido trifosfato (dNTP). Esto produce la liberación de un Pirofosfato y la incorporación de un nuevo nucleótido a la hebra hija, o hebra naciente. Esta reacción ocurre con una Constante de Equilibrio cercana a 1. Eso quiere decir que el ΔGo´ es cercano a cero. Eso significa que no tiene una tendencia a ocurrir en forma espontánea. Sólo ocurre en la dirección que describimos por la energía libre muy negativa de hidrólisis del Pirofosfato liberado. Entonces, si no tuviéramos Pirofosfatasas, no ocurriría la replicación del DNA. Entonces, pregunta de examen: ¿Qué ocurriría si se inhiben las Pirofosfatasas durante el proceso de replicación del DNA? Se inhibe la replicación. Otra pregunta de examen: ¿Qué fosfato es el que quedaincorporado en la hebra de DNA? Recordar que el los dNTP poseen 3 fosfatos α, β, γ. El Fosfato α que es el que está directamente unido a la desoxirribosa, es el fosfato que es incorporado a la hebra de DNA. Los fosfatos βγ se liberan como Pirofosfato. Pensemos en una PCR, que se utiliza para amplificar un fragmento de DNA. En una PCR, nosotros agregábamos Magnesio (Mg2+). ¿Por qué? Las DNA Polimerasas tienen 2 Aminoácidos (Aspartato) que poseen carga negativa y coordinan dos iones Mg2+. Esos iones Mg2+ son importantes para estabilizar los fosfatos del dNTP. De esa manera, la hebra de DNA naciente, va a atacar con su hidroxilo (OH) en posición 3´ al fosfato α del desoxirribonucleótido trifosfato entrante. Si esas cargas negativas de los 2 Aspartato de la DNA Polimerasa no fueran neutralizadas por los 2 Mg2+, ni tampoco fueran neutralizadas las cargas negativas de los fosfatos del dNTP, esas cargas negativas tenderían a repelerse y, por lo tanto, la reacción no se produciría. En la clase que viene hablaremos de la importancia de los mecanismos de reparación del DNA. La constancia de la secuencia genómica, obviamente es fundamental para que no ocurran mutaciones, que no se generen cambios indeseados, para que se conserve la información, etc. Existen múltiples mecanismos que operan luego de la síntesis para repararlo. Si algo salió mal, se intenta repararlo. Sin embargo, esto que veremos, que tiene que ver con la fidelidad de la replicación del DNA, está dado durante la síntesis de DNA. Las DNA Polimerasas tienen un sitio activo diseñado para recibir al sustrato que son los nucleótidos. Ese nucleótido tiene que aparear en una forma precisa con la base de la cadena molde que se está copiando. Se puede observar que la distancia entre dos puntos de los dos nucleótidos apareados es siempre la misma. Esto tiene que ver con que la DNA Polimerasa logra mantener apareados en su sitio activo a los nucleótidos que corresponden. Sino la distancia de la que hablamos sería distinta. Otro elemento que contribuye a la fidelidad de la replicación, es la actividad de corrección de la DNA Polimerasa. En particular existe una actividad que es denominada de EXONUCLEASA. Tenemos una corrección de errores por la actividad Exonucleasa de 3´5´ de la DNA Polimerasa I. Nosotros dijimos que la polimerización ocurre en el sentido 5 ´3´. La actividad Exonucleasa se da en el sentido opuesto a la síntesis de la hebra naciente. Esquemáticamente se puede representar a la DNA Polimerasa con dos cajitas de colores donde tenemos dos sitios activos: un sitio de Polimerización en azul y un sitio de Exonucleasa 3´5´ en naranja (en inglés se dice que este sitio tiene actividad de “proofreading”=corrección de pruebas) . Las bases nitrogenadas tienen formas tautomerías que dependen mucho del pH. Uno de los casos más claros es el caso de la Citosina. Normalmente cuando en la hebra que se va a copiar tenemos una A esperamos que se incorpore en la hebra naciente una T y que apareen. Sin embargo, existe una forma tautomérica de la Citosina (C*) que puede aparear con A y entonces ser incorporada en forma incorrecta durante el crecimiento de la hebra hija. Si bien ese nucleótido erróneo (C*) se incorporó, antes que la polimerasa se desplace, la Citosina se tautomeriza de C* a C. El nuevo nucleótido está ahora apareado incorrectamente. Notar que en el sitio de polimerización (azul) no tenemos apareamiento de las bases (C y A no aparean). Esta distancia entre los nucleótidos, no es la que corresponde. El extremo 3´ apareado incorrectamente de la cadena en crecimiento, bloquea la elongación. La DNA polimerasa se desliza hacia atrás para colocar la base incorrectamente apareada en el sitio activo de la Exonucleasa 3´-5´ (naranja). El nucleótido apareado incorrectamente es eliminado. La DNA polimerasa se desliza hacia adelante (sitio activo de polimerización en azul) y reemprende su actividad polimerizante. Si tenemos un desbalance entre los niveles de los dNTP vamos a tener también una posibilidad aumentada de incorporar un nucleótido incorrecto, y por lo tanto aumentamos la posibilidad de que existan mutaciones. Entonces, esta actividad Exonucleasa 3´-5´ es muy importante para la fidelidad de la copia de DNA y es un mecanismo que ocurre durante la síntesis (a diferencia de los que vamos a ver después). Hablamos de DNA Polimerasa I porque estamos hablando de las DNA Polimerasas de E. coli, DNA Polimerasas procariotas. La DNA Polimerasa I es la primera que se descubrió. La persona que la describió dijo que era la “replicasa” (la encargada de replicar el cromosoma). Por este descubrimiento recibió el Premio Nobel. Pero después se dieron cuenta que no era la replicasa. Es una enzima que cumple un rol muy importante durante la replicación y durante la reparación. Pero la replicasa es la DNA Polimerasa III. Si se trata a la DNA Polimerasa I con proteasas, se puede obtener un fragmento que se conoce históricamente como Fragmento de Klenow, que retiene la capacidad de polimerización, y la actividad de proofreading (Exonucleasa 3´5´). ¿Qué perdió entonces? Perdió la actividad de Exonucleasa de 5´3´. Es decir que la DNA Polimerasa I tiene una actividad de Exonucleasa 5´3´. Notar que es la única de las DNA Polimerasas de E. coli que tiene esta actividad. Eso tiene que ver con la función específica de la DNA Polimerasa I, por eso las otras no tienen esa actividad (lo desarrollaremos en un rato). La DNA Polimerasa I es un único polipéptido (1 subunidad). Notar que las tres DNA Polimerasas tienen actividad de proofreading (Exonucleasa 3´🡪5´). Lo particular de la DNA Polimerasa I es que tiene actividad de Exonucleasa 5´🡪3´. Es decir, en la misma dirección en la cual polimeriza también puede remover los nucleótidos. Es relativamente lenta (baja velocidad de polimerización) la DNA Polimerasa I si la comparamos con la II y III. Notar que la replicasa es la III, que posee la mayor velocidad de polimerización. La velocidad de la DNA Polimerasa I no alcanza para replicar el cromosoma. Es tan lenta que en el tiempo en el que una célula se divide no llegaría a copiar todo el cromosoma. El otro factor importante es la “procesividad”. Uno podría pensar que la DNA Polimerasa se pega al OriC, empieza a copiar y no para hasta que se replica todo el cromosoma. Sin embargo, eso no es lo que sucede en la realidad. La DNA Polimerasa es una enzima y como todo complejo enzima-sustrato tiene una constante de asociación: es decir que se pega al DNA, pero también se disocia. La Procesividad justamente es un parámetro que mide cuántos nucleótidos se agregan a la hebra hija antes que la DNA Polimerasa se disocie. Cuanto mayor sea la procesividad, la enzima va a ser más eficiente, voy a poder copiar más y el proceso va a ser más rápido. La DNA Polimerasa I tiene una procesividad que es mucho menor que la II y III. La procesividad de la DNA Pol III es muchísimo mayor. La DNA Polimerasa II también está implicada en procesos de reparación, pero no vamos a hablar demasiado de ella. La DNA Polimerasa III requiere de una mayor complejidad que no tiene la DNA Pol I. La III posee más de 10 subunidades. Dijimos que la actividad Exonucleasa 5´🡪3´característica de la DNA Polimerasa I es esencial para su función. Además, esta actividad de Exonucleasa 5´🡪3´de la DNA Pol I sirve como una herramienta en el laboratorio. Antes, para obtener la secuencia de una proteína, muchas veces se buscaba la secuencia de ADN que codificaba para esa proteína de interés (por poner un ejemplo). Por lo tanto, era necesario crear sondas de ADN que pudieran hibridar con determinados sectores del genoma. Una herramienta fundamental era el Nick translation o el traslado de una mella, una interrupción, un Nick. ¿Qué quiere decir eso? Que se interrumpió una se las cadenas del DNA. Esto ocurre con mucha frecuencia cuando por ejemplo se aísla el DNA. El DNA es una molécula rígida,por el simple hecho de agitar el tubo se producen Nicks. O también estos Nick se pueden hacer mediante una enzima de restricción. Entonces, en verde se muestra un DNA o RNA. La DNA Pol I tiene la capacidad Exonucleasa 5´🡪3´ que va a eliminar los nucleótidos de la cadena que aparece en verde. Y con su actividad Polimerasa puede copiar la hebra que se va a utilizar como molde. ¿Qué hizo? No cambió la secuencia, solamente desplazó la interrupción (Nick) que estaba en un sitio determinado y ahora está más adelante. ¿Qué es lo interesante de eso? Si en el medio nosotros pusimos nucleótidos marcados con un isótopo radioactivo, eso que se incorporó ahora va a ser radiactivo (la hebra nueva que es roja). Eso puede ser utilizado para screening, para una búsqueda de cualquier secuencia del genoma (acá habló de una sonda, pero no se entiende bien la explicación, buscar la figura del libro y leer bien lo del Nick y su utilidad como herramienta en lo que él menciona porque acá no queda claro). Para cerrar el Nick se requiere una enzima llamada “Ligasa” que utiliza ATP para establecer el nuevo enlace covalente. Entonces, la DNA Pol I puede hacer lo que describimos. La función in vivo de la DNA Polimerasa I va a ser la de remover primers de RNA. La DNA Polimerasa III tiene varias subunidades (13), hablaremos de algunas de ellas que son las más importantes. La parte catalítica está representada por la subunidad α, que es la que tiene la actividad de polimerización. Junto con la subunidad ɛ que tiene la actividad de proofreading (Exonucleasa 3´🡪5´). Tanto la subunidad α, ɛ y θ (esta última no hace falta saberla) conforman el Core de la Polimerasa. Además del Core de la Polimerasa, después tenemos un Complejo de Carga de la subunidad β. La Subunidad β es la que le confiere alta procesividad a la DNA Pol III. En el mecanismo de replicación del DNA, es muy importante que esta subunidad β englobe al DNA. Notar que hay dos subunidades β por Core (ahora veremos que la DNA Pol III posee 2 Core de Polimerización. Cada Core tiene dos subunidades β). En las diapos de la página anterior a la derecha se observa cómo esas dos subunidades β que forman un dímero, engloban a una de las hebras de DNA. Las Subunidades β son cargadas por todo un complejo que sirve para que esta subunidad β reconozca al primer de RNA y de lugar a la formación del Fragmento de Okazaki. En una de las diapos de la página anterior de la izquierda, se muestra como parte integral de la estructura tenemos a la Helicasa, enzima requerida para separar las dos hebras. La Helicasa es una ATPasa, utiliza ATP para ejercer su acción porque la tendencia de las dos hebras va a ser a unirse. Por eso en el mecanismo de replicación es requerido que se catalice la separación de las hebras a través de la acción de las Helicasas. La Helicasa corre por delante de todo el sistema de replicación. Lo primero que se carga en el OriC es la Helicasa. La Helicasa está conectada por las subunidades τ (Tau) de la DNA Pol III, con los dos Core de Polimerización (formados por subunidades α, ɛ, θ). En una de las diapos menciona que el Core está formado por una subunidad omega en vez de theta, pero me fije y en el libro figura omega. En cada Core de Polimerización, tenemos un dímero de subunidades β (se lo llama “Abrazadera β”). Entre medio de los dos Core tenemos el Complejo de carga de la abrazadera, que también es una ATPasa. Este Complejo va a moverse hacia un lado o hacia el otro para cargar las abrazaderas β sobre cada una de las hebras del DNA. De este modo tenemos una misma enzima que polimeriza al mismo tiempo las dos hebras, por eso tenemos los dos Core. Una de las hebras va a pasar a través de un Core y la otra va a pasar por el otro Core. ¿Cómo es el inicio del proceso de replicación? Lo que tenemos que estudiar es el OriC. Como dijimos, en una bacteria tenemos un único Origen de Replicación. Sin embargo, en un cromosoma eucariota hay varios orígenes de replicación (no alcanzaría el tiempo para copiarse todo el cromosoma si tuviera un único Ori, por eso requiere que varias DNA Pol comiencen la replicación en varios lugares). Características del OriC: está caracterizado por una secuencia DUE (del inglés DNA Unfolding Element), que es un elemento de desenrollamiento del DNA. Es una secuencia consenso que es rica en AT. Como sabemos, el apareamiento A-T interaccionan en forma débil (sólo 2 enlaces de hidrógeno) y por lo tanto son fáciles de disociar. Entonces, en el DUE es donde se disocia inicialmente y donde se forma la burbuja de replicación, sobre la cual luego actúa la Helicasa. Luego existen elementos repetitivos, secuencias consenso que forman el sitio de unión de la proteína de iniciación DnaA. En bacterias las tres proteínas implicadas en el inicio de la replicación son DnaA, DnaB, DnaC. En los exámenes nos pueden pedir que describamos un modelo del inicio de la replicación en E. coli. ¿Qué es esto?... En la diapo se muestra la secuencia DUE, los sitios consenso de unión de la proteína DnaA que es una ATPasa. Es miembro de la familia proteica de las AAA+ ATPasa. Muchas AAA+ ATPasas, incluida la DnaA, forman oligómeros e hidrolizan ATP de forma relativamente lenta. Son 8 los sitios donde se van a unir la DnaA: los sitios R1, R5, R2, R3, R4 y los sitios I1, I2, I3. Entonces, Páginas 985 y 986 del Lehninger: “8 moléculas de la proteína DnaA, todas en el estado de ATP unido, se ensamblan para formar un complejo helicoidal que abarca a los sitios R e I en OriC. La DnaA tiene mayor afinidad por los sitios R que por los sitios I, y se une con la misma afinidad por los sitios R tanto con ATP como con ADP unido. Los sitios I, que unen solamente la forma de DnaA con ATP unido, garantizan la discriminación entre las formas activa e inactiva del DnaA. El enrollamiento apretado hacia la derecha alrededor de este complejo introduce un superenrollamiento positivo efectivo. La tensión producida en el DNA cercano provoca la desnaturalización de la región DUE rica en A=T. El complejo formado en el origen de replicación contiene otras proteínas de unión al DNA: HU, IHF y FIS, que facilitan la curvatura del DNA”. La DnaA interacciona con las secuencias consenso particulares del OriC, pero también interacciona consigo misma formando Oligómeros. Eso origina un aumento en el enrollamiento en la cadena de DNA. El mecanismo por el cual las dos cadenas se separan, por el cual se abren las dos cadenas en la región DUE, está generada por la nueva torsión dada por la carga de las DnaA. La carga de las DnaA, generó una nueva torsión, un aumento en el superenrollamiento, que se disipa perdiendo el enrollamiento en la región DUE. Lehninger página 986: “A continuación la proteína DnaC, otra AAA+ ATPasa, facilita la unión de la proteína DnaB a las hebras separadas de la región desnaturalizada. Un hexámero de DnaC, con ATP unido a cada una de sus subunidades, forma un fuerte complejo con la Helicasa hexamérica en forma de anillo DnaB Helicasa. La interacción DnaC-DnaB abre el anillo de la DnaB, proceso facilitado por la interacción entre DnaB y DnaA. Dos de los hexámeros en forma de anillo de DnaB se asocian a DUE, uno a cada cadena de DNA. El ATP unido a DnaC se hidroliza, liberando DnaC y dejando DnaB unida al DNA”. Entonces, una vez que se abrió la región DUE, aparece la DnaB (en forma de anillo hexamérico) que es la Helicasa. La DnaB tiene que ser cargada con la ayuda de otra proteína que es la DnaC que es una ATPasa. Entonces, se carga la DnaB como Complejo DnaB-DnaC, se hidroliza el ATP, se libera el DnaC y queda la Helicasa (DnaB) cargada sobre la burbuja de replicación que ahora va a extenderse hacia un lado y hacia el otro (recordar la bidireccionalidad). En la tabla se muestran las proteínas requeridas para la iniciación de la replicación en E. coli. Además de las DnaA, DnaB y DnaC (y las otras proteínas HU, FIS, IHF) que vimos en la Iniciaciónde la replicación del DNA, aparecen otras proteínas que veremos que después aparecen e intervienen en el proceso de replicación. Entonces, tenemos a la Primasa: sintetiza el primer de RNA (es una RNA Polimerasa). El RNA puede aparear con el DNA formando híbridos. Como sabemos, el RNA es mucho más inestable y se hidroliza fácilmente. Por eso no es un buen material para sintetizar un genoma estable, en cambio, el DNA sí. Es decir que el inicio de la replicación del DNA, comienza con RNA. Esta es una evidencia bastante interesante de aquellos que sostienen que en los inicios de la vida estaba involucrado el RNA. Luego tenemos a las proteínas SSB (Single-stranded DNA-Binding protein). ¿Por qué son importantes las SSB? Una vez que abrimos las hebras a nivel de la región DUE, las hebras van a tender a pegarse de nuevo. Si queremos que el proceso de replicación continúe debemos mantener las hebras de DNA separadas y tenemos que evitar que se vuelvan a aparear. Esto se logra gracias a que las proteínas SSB se unen al DNA de cadena simple, evitando así que se vuelvan a aparear las cadenas de DNA. Otro factor muy importante es la presencia de las Topoisomerasas. Nosotros habíamos dicho que lo primero eran las Helicasas, bueno, eso no es así: primero son las Topoisomerasas que van todavía más adelante que las Helicasas, no siempre formando parte del Complejo de Replicación. ¿Por qué son importantes las Topoisomerasas? Si separamos las dos hebras para que pueda ocurrir el proceso de replicación, perdemos energía de torsión porque estamos separando las hebras, estamos desenrollando, lo que sucede es que más adelante en el ADN vamos a tener enrollamiento. Para evitar eso y que pueda continuar el proceso de replicación, las Topoisomerasas cortan, se desenrolla el DNA y vuelven a unir. Las Topoisomerasas catalizan ambos procesos, el corte y la unión. Sin la acción de las Topoisomerasas, la replicación se detiene. Por eso inhibidores de Topoisomerasas son medicamentos que se utilizan por ejemplo para el tratamiento de enfermedades virales, cáncer, porque podemos inhibir la replicación a través de la inhibición de las Topoisomerasas. Después tenemos las Dam Metilasas que veremos la clase que viene, muchas veces se las asocia a este proceso de inicio de la replicación. Las Dam Metilasas son enzimas encargadas en la reparación del DNA. Lehninger página 986: “El inicio de la replicación está afectado por la metilación del DNA y por interacciones con la membrana plasmática bacteriana. El DNA de OriC es metilado por una metilasa Dam, que metila la Adenina (A) en N6 dentro del palíndromo (5´) GATC. Hablaremos de la síntesis de los fragmentos de Okazaki: Notar que en la diapo ya se produjo la separación de las dos hebras. Tenemos delante de todo a la Topoisomerasa II (DNA Girasa). Y tenemos el complejo para la replicación del DNA. Se esquematiza a la hebra conductora que se sintetiza en forma continua (en ese sentido, 5´🡪3´ avanza la replicación). En la Hebra Conductora, sucede una única vez que se une la Primasa, sintetiza el cebador o primer de RNA, y luego pasa por el Core de la DNA Polimerasa III que va a sintetizar la cadena en forma continua. En el caso de la Hebra Rezagada, la Helicasa (hexámero de DnaB) se cargó en el OriC. A la Helicasa se une la Primasa, que es una RNA Polimerasa muy primitiva que tiene una procesividad bajísima. Sintetiza un primer de unos 20 nucleótidos y se disocia. Ese primer de RNA de 20 nucleótidos es el que inicia el fragmento de Okazaki. En el esquema también se muestran las proteínas SSB estabilizan la cadena simple. Las reacciones en la horquilla de replicación están coordinadas por un único dímero de DNA Polimerasa III integrada en un complejo con la Helicasa DnaB. El inicio con la Primasa que coloca el primer de RNA, ocurre una sola vez en la hebra conductora. Para se lleve adelante la síntesis de DNA a partir del primer de RNA, necesitamos que el Core de la DNA Pol III sea cargado a la hebra. En la hebra rezagada, tenemos la formación de los Fragmentos de Okazaki. Notar algo muy interesante: la hebra rezagada tiene que formar una especie de rulo o de Loop para que todo el Complejo Macromolecular pueda avanzar en la misma dirección. Notar que la síntesis se lleva adelante en ambas hebras en la misma dirección, que está marcada con una flecha roja. La flecha roja marca el avance de la polimerización. El fragmento de Okazaki es un híbrido de RNA y de DNA. La DNA Polimerasa III usa un juego de subunidades núcleo (la polimerasa núcleo o Core) para la síntesis continua de la hebra conductora, mientras que el otro juego de subunidades núcleo circula entre un fragmento de Okazaki y el siguiente sobre el bucle formando por la hebra rezagada. En a) vemos que la Helicasa DnaB, unida por delante de la DNA Polimerasa III, desenrolla el DNA en la horquilla de replicación, a medida que viaja a lo largo del molde de la hebra rezagada en dirección 5´🡪3´. En b) vemos que la Primasa DnaG se asocia ocasionalmente con la Helicasa DnaB y sintetiza un corto cebador de RNA. En c) se ve que una nueva abrazadera deslizante β (dímero violeta y azul) es entonces posicionada en el cebador o primer por el complejo de carga de la abrazadera de la DNA Polimerasa III (verde). En d) y e) podemos ver que cuando se ha completado la síntesis de un fragmento de Okazaki, la replicación se detiene y las subunidades núcleo de la DNA Polimerasa III se disocian de su abrazadera deslizante β (y del fragmento de Okazaki completado) y se asocian con la siguiente abrazadera. Ello inicia la síntesis de un nuevo fragmento de Okazaki. El conjunto del Complejo responsable de la síntesis coordinada en la Horquilla de Replicación se denomina “Replicosoma”. El Cargador de la abrazadera de la DNA Polimerasa III es una AAA+ ATPasa. Lehninger página 988: “Este Complejo se une al ATP y a la abrazadera β deslizante. La unión genera tensión en la abrazadera dimérica (dímero β), lo que provoca la apertura del anillo en la interfase de una de las subunidades. La recién cebada hebra rezagada (donde la Primasa sintetizó el cebador o primer de RNA) se desliza al interior del anillo a través de la discontinuidad que se acaba de establecer. A continuación, el cargador de la abrazadera hidroliza el ATP, liberando la abrazadera β deslizante que se cierra alrededor del DNA”. De esta manera es que el Cargador de abrazadera es el encargado de llevar a la abrazadera β sobre el cebador o primer de RNA. En una etapa final, tenemos que remover los primers de RNA de los fragmentos de Okazaki y reemplazarlos por DNA. Aquí entra en juego la famosa DNA Polimerasa I con su actividad de Exonucleasa de 5´🡪 3´, que elimina el primer de RNA y utilizando la hebra molde copia la secuencia para sintetizar DNA (así se reemplaza el RNA por DNA). ¿Qué sucedería si tuviéramos una enzima sin actividad de Exonucleasa 5 ´🡪3´? Encontraríamos RNA en el genoma. Entonces, ahora tenemos fragmentos de Okazaki todos de DNA, pero alguien tiene que unir esos Fragmentos… La DNA Ligasa une los fragmentos de Okazaki, catalizando la formación de los enlaces covalentes, los enlaces fosfodiéster. El mecanismo de acción de la DNA Ligasa es un mecanismo muy similar al de las DNA Polimerasas. La DNA Ligasa requieren de la utilización de ATP para catalizar la unión covalente de los fragmentos. Libera un Pirofosfato. Tienen Mg2+ como Cofactor. En algunos casos, es necesario que se indique la terminación de la replicación. Tenemos que saber que existen secuencias que se llaman “Secuencias Terminadoras”. Estas Secuencias Terminadoras tienen una orientación: solamente funciona en un sentido y no en el otro. Estas secuencias nos sirven para hacer más eficiente la replicación. Las secuencias Ter son lugares de unión para una proteína denominada Tus. El complejo Ter-Tus puede detener sólo la replicación desde una dirección. Lehninger página 989: “Dadoque las horquillas de replicación que se mueven en direcciones opuestas se detienen al encontrarse, las secuencias Ter no parecen esenciales, pero es posible que sirvan para evitar la sobrerreplicación por una de las horquillas de replicación, en el caso de que la otra se haya retrasado o detenido a causa de daños en el DNA o por algún otro obstáculo”. Uno puede tener E. coli que no poseen Topoisomerasas. En esos casos lo que se observa es que los Cromosomas se sintetizan, pero quedan enlazados entre sí formando una estructura que se conoce como Cromosomas encadenados o “Catenados”. Finalmente, la replicación se detiene, pero inicialmente se pueden realizar algunos ciclos de replicación. Y obtenemos estas estructuras de Cromosomas encadenados típicas de la inhibición de las Topoisomerasas. Lehninger página 990: “La replicación del DNA entre las horquillas de replicación opuestas deja los cromosomas recién completado encadenados, es decir, ligados topológicamente. Los círculos no están unidos covalentemente, pero no pueden separarse porque están entrelazados y cerrados covalentemente. La separación de los círculos encadenados requiere la acción de las Topoisomerasas. En E. coli, una Topoisomerasa de tipo II, llamada DNA Topoisomerasa IV, tiene el papel principal en la separación de los cromosomas encadenados; corta transitoriamente las dos hebras de DNA de uno de los cromosomas, permitiendo que el otro cromosoma pase a través de la brecha”. Nosotros en esta materia no vemos replicación en mamíferos porque se desarrolla extensamente en BCM. Además de ser más compleja la replicación en mamíferos, aparecen elementos que tiene que ver con la regulación del Ciclo Celular (CDT y CDC). Las Ciclinas y Kinasas dependientes de Ciclinas son las que coordinan el ciclo celular con la replicación del DNA. El Aciclovir es un análogo de nucleótidos, termina la extensión, la elongación de la cadena. Es un Antiviral muy común utilizado, por ejemplo, para Herpes. El Aciclovir funciona de dos maneras: el Aciclovir es una Aciclo-guanina. El hidroxilo (OH) es fosforilado por una kinasa viral (Timidina Kinasa, TK) y convertido en Acilo-GTP. La TK viral es mucho más activa que la TK de las células eucariotas. Entonces cuando uno utiliza Aciclovir, aquella célula infectada que tiene la TK viral, transforma mucho más el Aciclovir a Aciclo-GTP. El Aciclo-GTP al no poseer ese hidroxilo (OH) es un terminador de la cadena cuando se incorpora en la hebra naciente. Así, las células infectadas son las que detienen con mayor frecuencia la replicación.
Compartir