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UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA FARMACOBOTÁNICA Guía de Trabajos Prácticos Marcelo Luis Wagner Rafael Alejandro Ricco Beatriz Graciela Varela Graciela Beatriz Bassols Ignacio Jorge Agudelo Leonardo Anconatani Cecilia Dobrecky Colaboradores: R. Albrecht, H. Bach, L. Benzal, K. Borri, R. Roldán, A. Vugin Edición 2023 2 3 1 FARMACOBOTÁNICA La Farmacobotánica es la rama de la Botánica que se dedica al control de calidad de muestras medicinales y alimenticias de origen vegetal desde el punto de vista anatómico. A partir de esta definición se puede ver la importancia del rol del farmacéutico en garantizar la identidad y la calidad de un determinado material vegetal. El término “Farmacobotánica” se sugirió a partir de la Sección homónima del INFYB (Instituto Nacional de Farmacología y Bromatología, actualmente ANMAT) bajo la Dirección del Prof. Dr. José Laureano Amorín. Se aceptó en la reunión plenaria realizada durante el II Simposio Argentino y V Latinoamericano de Farmacobotánica (La Plata, 1986), el término Farmacobotánica para designar a la asignatura Botánica en la carrera de Farmacia de las distintas Universidades del país. De este modo, sus objetivos se diferencian claramente de los de la Botánica para Biólogos y para Ingenieros Agrónomos. Cabe destacar que la Facultad de Farmacia y Bioquímica (UBA) fue la primera en adoptar esta denominación, acorde con el cambio del Plan de Estudios en 1987, con lo que el Profesor Titular a cargo en ese momento se constituyó en el primer profesor regular de la asignatura en el país. La entonces Cátedra de Botánica, que pertenecía al Departamento de Ciencias Biológicas, se transformó en la actual Cátedra de Farmacobotánica y se ubica en el Departamento de Farmacología. A partir de ese momento, el Curso pasa a ser exclusivo de la carrera de Farmacia. La asignatura Farmacobotánica de la Carrera de Farmacia de la UBA se ocupa de dos áreas principales, además de un área introductoria: Anatomía de Plantas Medicinales: se aplica al control de calidad de las materias primas vegetales que se emplearán en la obtención de las distintas formas farmacéuticas. Sistemática Botánica: está orientada a conocer las especies clásicas más relevantes y las de la terapéutica actual, como también a las familias más importantes en cuanto a la producción de metabolitos activos. 2 3 ÍNDICE UNIDAD 1 Generalidades de células y tejidos vegetales 5 - 27 UNIDAD 2 Técnicas para el estudio de material vegetal 28-44 UNIDAD 3 Organografía La Raíz 45-50 Trabajo Práctico Nº 1 51 El Tallo 53-62 Trabajo Práctico Nº 2 63 Trabajo Práctico Nº 3 65 La Hoja 67-73 Trabajo Práctico Nº 4 74 Trabajo Práctico Nº 5 76 La Flor 78-88 Trabajo Práctico Nº 6 89 El fruto y la semilla 90-99 Trabajo Práctico Nº 7 100 UNIDAD 4 Resolución de muestras de origen vegetal, control de calidad y determinación de materia extraña 102-108 Trabajo Práctico Nº 8 109 Trabajo Práctico Nº 9 109 UNIDAD 5 Hongos y Líquenes 110-118 Trabajo Práctico Nº 10 119 Resumen de sustancias ergásticas y tejidos 122 Autoevaluación 124 Bibliografía 127 Programa analítico 128 4 5 UNIDAD 1 GENERALIDADES DE CÉLULAS Y TEJIDOS VEGETALES LA CÉLULA VEGETAL Una célula vegetal típica está constituida por un protoplasto limitado por una membrana plasmática (plasmalema), rodeada a su vez por una pared celular, estructura rígida característica de los organismos vegetales. La célula vegetal generalmente contiene una vacuola grande, cuyo contenido principal es agua con sustancias en solución coloidal y cristales precipitados (Fig. 1). Figura 1. Estructura de una célula vegetal típica El protoplasto está formado por el núcleo y el citoplasma. El núcleo presenta una membrana nuclear que lo rodea y el jugo nuclear en el que se diferencian Objetivo: reconocer los componentes característicos de las células vegetales y los distintos tejidos vegetales en base a las características para cada uno, como así también los materiales de reserva y otros contenidos celulares. citoplasma laminilla media retículo endoplásmico núcleo nucléolo mitocondria pared celular ribosoma cloroplasto dictiosoma vacuola 6 los cromosomas y uno o más nucléolos. El citoplasma limita hacia afuera con el plasmalema y hacia el interior con el tonoplasto (membrana de la vacuola). En el citoplasma se encuentran organelas: retículo endoplásmico, ribosomas, mitocondrias, dictiosomas, microtúbulos, lisosomas, peroxisomas y plastos. Los plastos son característicos de las células vegetales, aunque no todas los poseen. Se pueden clasificar en: a. Cloroplastos: son fotosintetizantes por poseer el pigmento verde clorofila. Éste da su color al plasto, pero a veces está acompañado por otros pigmentos que enmascaran al color verde. b. Cromoplastos: no son fotosintetizantes, pero contienen pigmentos que intervienen en la producción de energía (carotenoides). Pueden ser de color rojo, amarillo o anaranjado (tomate, ají, zanahoria). c. Leucoplastos: son incoloros y acumulan materiales de reserva como almidón –amiloplastos-; lípidos –oleoplastos- y proteínas –proteoplastos-. PARED CELULAR La pared celular es la característica más importante de las células vegetales. Está formada por componentes macromoleculares: polisacáridos y lignina. 1. Polisacáridos Celulosa: componente principal formado por unidades de D-glucopiranosa. Se deposita en la matriz de la pared celular en forma de microfibrillas. Hemicelulosas: constituidas por 2 o más de los siguientes azúcares (D-xilosa, D-manosa, D-glucosa, D-galactosa, L-arabinosa) y sus 4-O-metilderivados. Pectinas: polímeros del ácido d-galacturónico esterificados con grupos metilo o salificados con calcio o con magnesio. Las hemicelulosas y las pectinas, junto con proteínas, forman la matriz de la pared celular. 2. Lignina Comprende a polímeros heterogéneos originados de tres derivados del alcohol cinámico (alcohol p-cumarílico, alcohol coniferílico y alcohol sinapílico). La lignina es un constituyente importante de las paredes celulares secundarias. 7 Laminilla media: une las células de los tejidos vegetales entre sí, y está constituida por pectatos de calcio y de magnesio. Dicha laminilla se encuentra entre las paredes celulares y presenta puntuaciones. TIPOS DE PARED CELULAR a. Pared celular primaria Es la primera que se forma. Está constituida por celulosa, hemicelulosas y pectinas. Presenta puntuaciones no visibles al microscopio óptico, con finas comunicaciones protoplasmáticas entre células vecinas (plasmodesmos). b. Pared celular secundaria Se forma después que la célula completó su crecimiento. Se deposita sobre la pared primaria, hacia el interior de la célula. Está constituida principalmente por microfibrillas de celulosa y muchas veces se lignifica. Es característica de tejidos duros (esclerénquima, xilema). La pared secundaria no se deposita en forma continua. Presenta puntuaciones visiblesal microscopio óptico, a través de las cuales se conectan las células del tejido. Se diferencian dos tipos de puntuaciones: Simples: con diámetro uniforme; su proyección es una circunferencia (Fig.2A). Areoladas: el diámetro no es uniforme, la pared se deposita en forma de tubo arqueado. Su proyección son dos circunferencias concéntricas (Fig. 2 B, C). Figura 2. Tipos de puntuaciones. A: simple; B y C: areoladas; C: vista de frente TEJIDOS VEGETALES TEJIDO: Conjunto de células de origen común, organizado como una unidad estructural y funcional. Si las células del tejido son iguales o muy similares C 8 entre sí, se denomina tejido simple. Cuando las células son muy diferentes, se denomina tejido compuesto o complejo. Cuando en un tejido aparece alguna célula aislada con el mismo origen que el resto, pero de características diferentes, recibe el nombre de idioblasto. Las diferentes células que componen el vegetal, unidas entre sí por la laminilla media, se organizan en tejidos. Desde el punto de vista del desarrollo del vegetal, se diferencian dos grandes tipos de tejidos: - Embrionarios o meristemáticos - Adultos o definitivos CLASIFICACIÓN DE LOS TEJIDOS VEGETALES Meristemas y tejidos meristemáticos Apicales Protodermis Meristema fundamental Procambium Laterales Felógeno Cambium Tejidos adultos Protectores Epidermis Rizodermis Súber Fundamentales Parénquima Mecánicos o de sostén Colénquima Esclerénquima Conductores Floema Xilema Otras funciones Endodermis Estructuras de secreción externa Pelos secretores Glándulas Nectarios Hidátodos Estructuras de secreción interna Células secretoras Cavidades y canales Tubos laticíferos 9 MERISTEMAS Y TEJIDOS MERISTEMÁTICOS Los meristemas están constituidos por células más o menos isodiamétricas, con paredes celulares delgadas, núcleo grande y numerosas vacuolas pequeñas. Se caracterizan por su capacidad de división y dan origen a los tejidos meristemáticos, con células más diferenciadas. A su vez, los tejidos meristemáticos conservan su capacidad de división y originan a tejidos adultos. 1. Tejidos meristemáticos apicales o primarios Se encuentran en el ápice de raíces y tallos. Están relacionados directamente con las células del embrión. Los tejidos meristemáticos primarios son: a. Protodermis: origina la epidermis. b. Meristema fundamental: origina tejidos fundamentales (parénquimas), colénquima, algunas células esclerenquimáticas, la endodermis. c. Procambium: origina los tejidos conductores (floema y xilema primarios) En un ápice (Fig. 3), la protodermis ocupa la región más externa, el meristema fundamental la parte media, y el procambium la región central. La caliptra (también, cofia o pilorriza), que protege al meristema apical de la raíz. Figura 3. Corte longitudinal de un ápice de raíz. P: protodermis; MF: meristema fundamental; PC: procambium; C: caliptra Los tejidos meristemáticos primarios producen el crecimiento vertical del vegetal (en longitud). El resultado de su actividad es la estructura primaria propia de plantas herbáceas y de plantas leñosas hasta el primer año de vida. Mientras se produce la división celular para el crecimiento, las células resultantes se tornan diferentes de las de los otros tejidos que las rodean. Este proceso se denomina diferenciación. Se forman tejidos adultos o definitivos con características propias. Las células que tendrán una diferenciación relacionada con su función, sufrirán además un proceso de especialización. C PC MF P 10 Una célula diferenciada, si tiene su protoplasto vivo, puede retomar su capacidad meristemática y dividirse. A partir de una sola célula se puede generar un organismo vegetal idéntico al que le dio origen. Este fenómeno se llama totipotencia y se aplica en micropropagación y en ingeniería genética. 2. Tejidos meristemáticos laterales o secundarios Provienen de células adultas que retoman la capacidad de división, o bien provienen de un tejido meristemático primario. Los tejidos meristemáticos secundarios son: a. Felógeno: tiene diferentes orígenes (epidermis, colénquima, parénquima cortical, células del floema). El felógeno, a su vez, origina hacia afuera un tejido protector llamado súber, corcho o felema, y hacia el interior la felodermis constituida por células de tipo parenquimático. El conjunto de súber, felógeno y felodermis se denomina peridermis. Se puede originar una sola peridermis o varias a diferentes niveles, según donde se origine el felógeno. Esto produce el aislamiento y muerte de los tejidos rodeados por las peridermis, formando todo el conjunto lo que se denomina ritidoma. b. Cambium: se origina a partir de un procambium inactivo o bien de células parenquimáticas que separan los haces vasculares. Se distinguen dos tipos de cambium: fascicular e interfascicular. El cambium fascicular se relaciona directamente con el haz vascular y origina floema y xilema secundarios. El cambium interfascicular también puede originar floema y xilema secundarios, o bien radios floemáticos y xilemáticos. Muchas veces se habla de zona cambial, que comprende al cambium propiamente dicho y a las células adyacentes aún no diferenciadas (Fig. 4). Por su posición lateral, los tejidos meristemáticos secundarios producen el crecimiento en grosor del vegetal. El producto de su actividad da como F Cf Ci Figura 4. Esquema de un tallo con tejidos meristemáticos laterales. F: felógeno; Cf: cambium fascicular; Ci: cambium interfascicular 11 resultado la estructura secundaria que se presenta en las plantas leñosas: Pinophyta (árboles del tipo del pino) y Magnoliophyta Dicotiledóneas arbóreas y arbustivas. En las Dicotiledóneas herbáceas, el cambium cuando aparece, es inactivo. Las Magnoliophyta Monocotiledóneas en su gran mayoría son herbáceas, con estructura primaria, pero algunas pocas pueden presentar crecimiento secundario en grosor por un mecanismo diferente del que ocurre en Pinophyta y en Dicotiledóneas. TEJIDOS ADULTOS 1. Tejidos protectores Tejido EPIDERMIS RIZODERMIS SÚBER Origen Protodermis Protodermis Felógeno Ubicación Órganos aéreos Raíz primaria Raíces y tallos con estructura 2ª Pared celular Primaria, celulósica. Puede tener una cutícula Primaria Celulósica Primaria, celulósica. Sufre suberificación Tipo de células Vivas. Algunas pueden suberificarse o silicificarse Vivas En general, muertas Función Protección y regulación de la pérdida de agua por transpiración Absorción de agua y sales minerales Protección Modificaciones (ver apartados) Estomas, Tricomas, Aguijones Pelos absorbentes Lenticelas Figura 5. Tejidos protectores: a. Epidermis (Monocot.); b. Epidermis (Dicot.); c. Súber a b c 12 Modificaciones epidérmicas Estomas: estructuras constituidas por dos células guardianas u oclusivas, que delimitan entre sí un espacio denominado ostiolo (Fig. 6). Las células oclusivas, generalmente en forma de riñón, son las únicas células epidérmicas que poseen cloroplastos. Los estomas pueden estar acompañados o no por células anexas. La función de los estomas es establecer el intercambio gaseoso y la transpiración. Internamente, el estoma comunica con una cámara subestomática, la cual se conecta a su vez con los espacios intercelulares del parénquima. Por lo general, en las hojas, la mayor proporción de estomas aparece en la epidermis inferior. La epidermis superior puede o no presentar estomas. En Magnoliophyta Dicotiledóneas, los estomas se disponen en forma desordenada debido a que las nervaduras de la hoja forman una red. En Magnoliophyta Monocotiledóneas, los estomas se disponen en forma ordenada debido a quelas hojas son paralelinervadas; sin embargo, hay excepciones: “cala”, “oreja de elefante”, “zarzaparrilla”, son Monocotiledóneas que tienen los estomas desordenados. Tricomas: en sentido estricto, comprenden a pelos. En sentido amplio, comprenden además papilas y escamas. a) Pelos: apéndices largos o cortos, uni o pluricelulares, simples o ramificados, terminados en punta o bien, en una cabezuela. Clasificación de los pelos Tectores Unicelulares Simples (a) Ramificados Estrellados Dendroides Malpigiáceos (b) Pluricelulares Simples (c) Ramificados Estrellados (d) Dendroides (e) Secretores No glandulares Urticante (f) Glandulares (g) Cabeza y pie 1-pluricelulares Figura 6. Estructura de un estoma estoma Ostíolo Células anexas Células oclusivas Células epidérmicas 13 Los pelos presentan paredes celulósicas cubiertas de una cutícula que puede ser lisa o esculturada. Los pelos tectores tienen como función principal la protección y la regulación de la transpiración. Los pelos secretores producen sustancias de diferente composición química: aceites esenciales, resinas, sustancias irritantes, etc. Por sus características, los pelos tienen valor taxonómico (Fig. 7). Una especie puede poseer un solo tipo de pelo o varios. Pueden aparecer en hojas, tallos herbáceos y partes de flores y frutos. A los órganos que los poseen se los considera pubescentes o pilosos. Cuando un órgano vegetal no tiene ningún tipo de pelo, se denomina glabro. b) Papilas: apéndices cortos, unicelulares. Pueden aparecer en hojas (p. ej.: epidermis de hoja de “coca”), en tallos herbáceos y en pétalos de flores y epidermis de algunos frutos, otorgándoles un aspecto aterciopelado (Fig. 8). c) Escamas o pelos peltados: son tricomas pluricelulares con las células en el mismo plano, formando un escudo de contorno circular. Pueden ser sésiles o con un pie central. Aparecen en hojas y en tallos herbáceos (Fig. 9). a c b f e d g g g Figura 7. Distintos tipos de pelos (referencias en pág. 12) Figura 8. Papila vista de perfil 14 Aguijones: apéndices rígidos, esclerosados, punzantes. Pueden aparecer en hojas y en tallos. A diferencia de las espinas, los aguijones carecen de tejido vascular, por ello son fáciles de arrancar. Ej.: tallo de “rosal”, tallo de “palo borracho” (Fig. 10). Figura 10. Tallos con aguijones: a. rosal; b. palo borracho Modificaciones de la rizodermis Pelos absorbentes: ocupan una región determinada de la raíz primaria (zona pilífera), y tienen como función aumentar la superficie de contacto con el suelo y optimizar la absorción del agua y de las sales minerales (Fig. 11). Figura 11. Pelos absorbentes en una raíz Modificaciones del súber Lenticelas: son estructuras circulares, lenticulares o alargadas generalmente en la superficie de los troncos, tallos y ramas de muchas plantas. A simple vista tienen el aspecto de verrugas. Las células que las constituyen se disponen a b a b Figura 9. Escamas o pelos peltados: a. Olivo; b. Clavel del aire 15 dejando espacios intercelulares entre sí. Su función es contribuir a la aireación de los tejidos subyacentes (Fig. 12). Figura 12. A: Lenticelas en un tronco; B: Corte de una lenticela 2. Tejidos fundamentales o parénquimas Origen Primario, del meristema fundamental. Si está asociado a tejidos conductores puede provenir del procambium (origen 1º) o del cambium (origen 2º). Ubicación En todos los órganos vegetales. Pared celular Primaria, celulósica. Si está relacionado con tejidos conductores puede poseer pared celular secundaria celulósica o lignificada. Tipo de células Vivas, poco diferenciadas, y con potencialidad meristemática. Tipos de parénquima Clorénquima, par. asimilador o clorofílico Parénquima de reserva Aerénquima o Par. aerífero Parénquima acuífero Función Fotosíntesis Acumulación de reservas Aireación de los tejidos Retención de agua o mucílagos a) Clorénquima, parénquima asimilador o clorofílico (Fig. 13) Sus células contienen cloroplastos, por lo tanto es asiento de la fotosíntesis. Se localiza en órganos verdes: tallos herbáceos y hojas principalmente, y partes verdes de flores y frutos. El clorénquima puede adoptar varias disposiciones: - en empalizada: en las hojas está ubicado, generalmente, en relación con la epidermis superior, pero puede aparecer también en relación con la epidermis inferior. Consta de células prismáticas casi sin espacios intercelulares entre sí. - esponjoso o lagunoso: en las hojas está ubicado, generalmente, en relación con la epidermis inferior o bien, en la parte central. Presenta células redondeadas o de forma irregular, con grandes espacios intercelulares que se comunican con los estomas presentes en la epidermis inferior. Células de relleno Felodermis Felógeno Súber A B 16 Figura 13. Parénquimas clorofílicos en un esquema de corte de hoja - radiado: se presenta en las hojas de muchas Poaceae (Gramineae) en forma de corona rodeando al haz vascular. Figura 14. Esquema de parénquima radiado en Poaceae b) Parénquima de reserva (Fig. 15) Se encuentra en cantidad en órganos acumuladores: raíces, tallos subterráneos (rizomas, tubérculos, bulbos), semillas y algunos frutos suculentos. En menor proporción aparece en tallos aéreos, en relación con tejidos conductores. Sus células acumulan principalmente almidón, pero también puede haber reservas de inulina, lípidos o aleurona (semillas). c) Aerénquima o parénquima aerífero (Fig. 16) Sus células poseen grandes espacios intercelulares que favorecen la aireación de los tejidos. Este tejido se encuentra, por lo general, en plantas de lugares húmedos o bien plantas sumergidas. En este último caso, los espacios intercelulares llenos de aire contribuyen a la flotabilidad. d) Parénquima acuífero Sus células están llenas de mucílago que retiene gran cantidad de agua. Se presenta en plantas suculentas o crasas (Aloe vera), y en xerófitas (cactus). Parénquima en empalizada Parénquima esponjoso Figura 16. Aerénquima en pecíolo de hojas de “camalote” Figura 15. Esquema de parénquima con almidón 17 3. Tejidos mecánicos o de sostén Tejido COLÉNQUIMA ESCLERÉNQUIMA Origen Primario, del meristema fundamental. Primario, m. fundamental (esclereidas) o procambium (fibras); secundario, del cambium (fibras). Ubicación Hojas y tallos herbáceos, debajo de la epidermis. En todos los órganos vegetales. Pared celular Primaria, celulósica, con áreas engrosadas. Primaria, celulósica, y secundaria celulósica o lignificada. Tipo de células Vivas. Muertas, en general. Función Sostén. Tejido plástico, permite el crecimiento. Sostén. Es un tejido más elástico que plástico; otorga mayor rigidez. Características (ver apartados) Según el engrosamiento de la pared: a) laminar, b) angular y c) lagunar Pared celular muy gruesa. Se distinguen 2 tipos celulares: a) esclereidas y b) fibras Tipos de colénquima Colénquima laminar: engrosamientos de celulosa en las paredes tangenciales de las células. No presenta espacios intercelulares (Fig. 17a). Colénquima angular: engrosamientos de celulosa en los ángulos de contacto entre las células. No presenta prácticamente espacios intercelulares (Fig. 17b). Colénquima lagunar: engrosamientos en las áreas que delimitan espacios intercelulares. Estos espacios se denominan meatos (Fig. 17c). Figura 17.Tipos de colénquima a c b 18 Tipos de células esclerenquimáticas a) Esclereidas: células de formas diversas, más o menos isodiamétricas (braquiesclereidas), alargadas o muy irregulares. Cuando tienen forma redondeada se las denomina también células pétreas. Presentan una pared celular secundaria lignificada, sumamente dura. El espacio interno de la esclereida se denomina lumen y puede estar vacío, o presentar cristales o sustancias como taninos. Las semillas de las Fabaceae o Leguminosas tienen gran cantidad de esclereidas en su tegumento, de dos tipos: columnares o macroesclereidas), y subyacentes u osteoesclereidas) (Fig. 18). Figura 18. Tipos de esclereidas b) Fibras: son células más largas que anchas y terminan en extremos agudos (fusiformes). Si presentan puntuaciones son de tipo simple. Pueden poseer pared celular secundaria celulósica o lignificada (Fig. 19). Algunas fibras pueden presentar tabiques (fibras septadas), otras pueden contener cristales (fibras cristalíferas). Existen también formas intermedias entre esclereidas y fibras a las que se denomina fibroesclereidas. Figura 19. Fibra vista de perfil (arriba) y grupo de fibras en transcorte (abajo) 4. Tejidos conductores Son tejidos compuestos o complejos porque están constituidos por varios tipos celulares pero con un mismo origen. columnares irregulares braquiesclereidas 19 Tejido XILEMA FLOEMA Origen Primario (procambium) o secundario (cambium). Primario (procambium) o secundario (cambium). Ubicación Todos los órganos. Todos los órganos. Pared celular Primaria celulósica y secundaria lignificada Primaria celulósica. Las fibras pueden tener pared secundaria celulósica. Tipo de células Muertas, salvo las del parénquima. Vivas, excepto las escleren- quimáticas. Función Conducción de agua y sales minerales (savia bruta). Conducción de sustancias orgánicas (savia elaborada). Características Cuatro tipos celulares: a) cél. parenquimáticas; b) fibras, c) traqueidas; d) unidades o miembros de vaso. Cuatro tipos celulares: a) cél. parenquimáticas; b) fibras; c) elementos cribosos; d) células anexas. - Xilema a) Células parenquimáticas: (ver parénquima de reserva). b) Fibras: (ver esclerénquima). c) Traqueidas: células largas, con extremos romos, no perforados. Presentan paredes con puntuaciones areoladas (Fig. 20). Las terminaciones de las nervaduras de las hojas están constituidas por traqueidas. Puede haber elementos de transición entre fibras y traqueidas: fibrotraqueidas. Figura 20. Traqueida con puntuaciones areoladas d) Miembros de vaso: células cilíndricas, cortas y gruesas, con paredes terminales perforadas. La perforación puede ser única o no. La pared secundaria puede depositarse de diversas maneras dando lugar a miembros de vaso anillados/anulares, espiralados, helicoidales, reticulados, escalariformes, punteados. Los miembros de vaso se unen por sus extremos formando vasos o tráqueas. Cuando el xilema presenta un gran desarrollo, como sucede en los troncos de los árboles, se denomina leño o madera. 20 En Pinophyta, los elementos conductores del xilema por excelencia son las traqueidas. En Magnoliophyta, los elementos conductores mayoritarios son los miembros de vaso, aunque pueden aparecer algunas traqueidas (Fig. 21). Figura 21. Distintos tipos de miembros de vaso - Floema o Líber a) Células parenquimáticas: (ver parénquima de reserva). b) Fibras: (ver esclerénquima). c) Elementos cribosos: células alargadas, de paredes primarias gruesas. No presentan núcleo al estado adulto. Sus paredes tienen áreas con poros (áreas cribosas). En Pinophyta, los elementos cribosos se denominan células cribosas y las paredes presentan áreas cribosas de igual magnitud. En Magnoliophyta, los elementos cribosos se denominan unidades de tubo criboso (Fig. 22), y las áreas cribosas están en las porciones terminales y se denominan placas cribosas. Las unidades de tubo criboso se unen por sus extremos y forman tubos cribosos o vasos liberianos. d) Células anexas: células con núcleo grande y abundantes ribosomas, asociadas a las unidades de tubo criboso. Asumen las funciones nucleares de los elementos cribosos y mueren cuando éstos dejan de ser funcionales. Punteado Figura 22. Unidad de tubo criboso 21 5. Otros tejidos. Endodermis Origen: primario, del meristema fundamental. Ubicación: raíces y algunos tallos subterráneos (rizomas) con estructura 1ª. Pared celular: primaria, celulósica. Puede adquirir una pared secundaria lignificada. Presenta depósitos de una sustancia llamada endodermina. Tipo de células: vivas. Cuando se lignifican, mueren. Función: regulación de la absorción de agua por la raíz. Características: células dispuestas en una sola capa y que en su estadio más joven presentan Banda de Caspary, engrosamiento de endodermina sobre las paredes radiales. Algunas células no presentan ese engrosamiento (células de paso). En Monocotiledóneas, en una etapa tardía, la endodermis presenta engrosamientos en forma de U. Las células se lignifican, dejan de cumplir su función y mueren (Fig. 23). Figura 23. Características de la endodermis ESTRUCTURAS SECRETORAS Estructuras de secreción externa a) Pelos secretores: (ver epidermis). b) Glándulas: por lo general segregan sal (plantas halófitas). c) Nectarios: generalmente presentes en flores, aunque también existen nectarios extraflorales. Segregan néctar, que contiene sacarosa, glucosa y fructosa en diferentes proporciones, y aminoácidos libres. Su función es atraer a los polinizadores (insectos, pájaros). d) Hidátodos: son estructuras encargadas de la gutación, que es la eliminación de agua al estado líquido o una solución acuosa con compuestos Célula de paso Endodermis en U 22 orgánicos o inorgánicos. Se presentan en algunas plantas (Ej.: en el pecíolo de las hojas de “pasionaria”, en plantas tropicales, en muchas Poaceae). Están constituidos por traqueidas, parénquima aclorofílico y estomas no funcionales que permiten la salida del agua (Fig. 24). Figura 24. Hidátodos Estructuras de secreción interna a) Células secretoras: son células diferenciadas del resto del tejido que las rodea y acumulan secreciones tales como aceites esenciales o resinas. Pueden aparecer en cualquier tejido (Fig. 25). b) Cavidades y canales: las cavidades son estructuras cortas, con poca profundidad, mientras que los canales pueden ser estructuras bastante largas o profundas. Según su origen pueden ser lisígenos o esquizógenos. - Cavidades lisígenas o “sucias”: se forman por ruptura o “lisis” de las células secretoras, y forman una cavidad que alojará a la secreción. En la cavidad se observan restos de las paredes celulares de las células secretoras. Aparecen en hojas, tallos, algunos frutos (Fig. 26). - Canales esquizógenos: se forman por separación y reacomodamiento de las células secretoras. La secreción se vuelca en la cavidad formada. Las células que limitan el canal o cavidad están intactas (no se observan restos celulares), por eso se las llama “limpias”. Pueden aparecer en hojas y tallos (Fig. 27). c) Tubos laticíferos: células alargadas con numerosos núcleos y paredes celulares primarias celulósicas. Según su origen pueden ser: simples o compuestos. Además, pueden presentar ramificaciones o no (Fig. 28). Pueden aparecer en todos los órganos vegetales, y en general están más relacionados con el floema. Segregan látex, líquido espeso, lechoso, de color Figura 25. Célula secretora Figura 26. Cavidad lisígena Figura 27. Canal esquizógeno23 variable (blanco, amarillo, naranja y rojo), y composición química compleja: isoprenoides, taninos, ceras, grasas, azúcares, almidón, alcaloides, cristales y prótidos. Figura 28. Tubos laticíferos articulados Tipos importantes de látex - Opio: se obtiene de los frutos verdes de la “amapola medicinal” o “adormidera” (Papaver somniferum –Papaveraceae). Contiene un 10% del alcaloide morfina, que se emplea como analgésico. Otro alcaloide presente en el opio es la papaverina, empleada como antiespasmódico. - Caucho: producido por varias especies cauchíferas, entre ellas Hevea brasiliensis –Euphorbiaceae- y Ficus elastica –Moraceae-. - Chicle: producido por Manilkara chicle –Sapotaceae-. - Gutapercha: para recubrir cables y como material de obturación en Odontología. Se extrae de Palaquium gutta -Sapotaceae. SUSTANCIAS ERGÁSTICAS Son productos del metabolismo celular acumulados en la pared, en las vacuolas o en plástidos. Su nombre proviene del griego "ergon" (trabajo). Son sustancias orgánicas o inorgánicas e incluyen: almidón, inulina, lípidos, aleurona, cristales, gomas, taninos, resinas, y otros componentes que contribuyen a la defensa del organismo, al mantenimiento de la estructura celular o constituyen sustancias de reserva. ALMIDÓN: es la reserva glucídica más importante en el reino vegetal. Se localiza en gran cantidad en órganos almacenadotes como raíces, tallos subterráneos (bulbos, rizomas, tubérculos), y semillas. En menor cantidad se encuentra en tallos herbáceos, tallos leñosos, cortezas comerciales y en frutos. Las hojas y las flores NO ACUMULAN almidón de reserva 24 El almidón se almacena dentro de las células en forma de granos o gránulos. Químicamente, está compuesto por dos polímeros de α-D-glucosa: amilosa (cadena lineal de unidades de glucosa), y amilopectina (cadena ramificada de moléculas de glucosa). Al microscopio, el almidón se observa como corpúsculos incoloros de diferentes formas y tamaños. El estudio de los granos de almidón es un carácter orientativo e incluso diagnóstico, ya que una especie determinada presenta un solo tipo de almidón. Características de los granos de almidón: son simples si presentan un solo hilo o hilio (centro de formación del grano), y compuestos si presentan más de un hilio. El hilio puede ser puntiforme, lineal o ramificado, en posición central o bien excéntrico. La superficie puede ser homogénea o estratificada, cuando la amilosa y la amilopectina se depositan formando estratos o estrías (Fig. 29). Figura 29. Distintos tipos de granos de almidón INULINA: es otro polisacárido de reserva presente en órganos subterráneos (raíces y rizomas), de algunas especies (“achicoria”, “dalia”), en las cuales no hay almidón. Estos dos polisacáridos NO COEXISTEN en el mismo órgano Químicamente es un polímero constituido por unidades de fructosa, con un bajo porcentaje de glucosa. No se encuentra como gránulos sino en forma soluble en el líquido celular. Para observarla al microscopio se debe precipitar con alcohol 96º (Fig. 30). Simple, hilio central puntiforme (trigo) Simple, hilio ramificado (maíz) Simple, hilio y estrías excéntricas (papa) Compuesto, sin hilio ni estrías visibles (arroz) Figura 30. Inulina precipitada 25 ALEURONA: constituye la reserva proteica de muchas semillas y se observa en forma de gránulos. Puede ser homogénea si el grano está compuesto sólo por proteínas, y heterogénea cuando está formada por un cristaloide proteico (A) y uno o más globoides (B) de fitina (sal de Ca y Mg del ácido hexa-inositol- fosfórico), incluidos en una masa fundamental proteica (Fig. 31). LÍPIDOS: grupo heterogéneo de sustancias insolubles en agua. Pueden ser no volátiles o “fijos”, o volátiles. Dentro de los primeros, si son sólidos a temperatura ambiente se llaman grasas y si son líquidos, aceites. Se encuentran en semillas y pericarpio de algunos frutos. Los lípidos volátiles, también llamados aceites esenciales, se encuentran en estructuras secretoras en la mayoría de los órganos vegetales. Los lípidos se observan en forma de gotas refringentes de color amarillento, o incoloras. TANINOS: son polímeros derivados de polifenoles. Pueden aparecer en todos los órganos vegetales, pero principalmente en hojas y en tallos. Su función en las plantas sería de defensa contra los microorganismos y evitar la herbivoria. Se observan en las células como un contenido de color amarillo, pardo o pardo- rojizo. CRISTALES: son productos finales de procesos metabólicos celulares. Se forman en las vacuolas de las células y muchos los consideran como productos de desecho o de excreción. La composición química de los cristales más abundantes en los vegetales es oxalato de calcio, por lo cual se los llama también cristales verdaderos y calcifitolitos. Otras sustancias ergásticas de naturaleza cristalina pueden estar formadas por carbonato de calcio o por sílice. Figura 31. Aleurona heterogénea de ricino 26 El análisis de los cristales es relevante para la caracterización de especies ya sea por la ausencia/presencia de los mismos, y por la gran variedad de formas y de tamaños que pueden adoptar (especialmente los de oxalato). Una misma especie vegetal puede poseer varios tipos de cristales distintos. - Cristales de oxalato de calcio o calcifitolitos: aparecen en todos los órganos vegetales. Se disuelven en medio ácido mineral. Según la forma se los denomina de diversas maneras (Fig. 32): Cúbicos Prismáticos: algunos cristales prismáticos se denominan estiloides. Octaédricos o Bipiramidales Aciculares: muy delgados, en forma de aguja. Pueden agruparse formando rafidios o ráfides (Fig. 33). Arenas o arenillas cristalinas: sumamente pequeños. Se observan como puntos irregulares dentro de la célula. Drusas/ Rosetas: asociaciones o agregados irregulares de cristales yuxtapuestos. . Figura 32. Distintos tipos de cristales de oxalato de calcio Figura 33. Rafidios arenillas cristalinas cúbicos prismáticos estiloides bipiramidales aciculares drusas 27 - Concreciones de carbonato de calcio o cistolitos: poseen una distribución restringida dentro de las Magnoliophyta. Están asociados al tejido epidérmico y se los encuentra principalmente en hojas y en tallos herbáceos. Se disuelven en medio ácido mineral produciendo burbujeo por el desprendimiento de dióxido de carbono. Se pueden localizar en células epidérmicas diferenciadas (litocistos) o en pelos (pelos cistolíticos) (Fig. 34). Figura 34. Distintos tipos de cistolitos - Sílice: se presenta de manera amorfa dentro de la célula. Se encuentra sólo en algunas familias (Equisetaceae, Poaceae, Verbenaceae). Aparece asociada al tejido epidérmico en hojas y en tallos herbáceos, y excepcionalmente en el leño de algunas especies de Verbenaceae (madera de teca – Tectona grandis). La “cola de caballo”, de la familia Equisetaceae, presenta gran cantidad de células silicificadas en la epidermis de sus tallos que le da un aspecto áspero a la superficie, y por esa razón se pueden utilizar como abrasivos. La sílice no se disuelve en ácidos minerales, sino sólo en ácido fluorhídrico. cistolito litocisto Pelo cistolítico 28 UNIDAD 2 TÉCNICAS PARA EL ESTUDIODE MATERIAL VEGETAL ANÁLISIS DEL MATERIAL VEGETAL De acuerdo con la Farmacopea Nacional Argentina, se deben realizar dos tipos de estudios farmacobotánicos para analizar material vegetal: 1. Análisis macroscópico o morfológico 2. Análisis microscópico o micrográfico 1. Análisis macroscópico o morfológico Se realiza a ojo desnudo y bajo lupa o microscopio estereoscópico (Fig. 35). a) Observación y descripción macroscópica: - Forma de presentación (entera, trozada o fragmentada, en polvo) - Caracteres organolépticos (color, olor, sabor) - Características de las superficies externa e interna - Dimensiones - Tipo de fractura b) Determinación de materia extraña: se deberá informar sobre lo siguiente: - Aspecto general del material a analizar (homogéneo o heterogéneo) - Aparición de insectos vivos o muertos - Aparición de huevos, larvas o partes de insectos - Presencia de excrementos de roedores o de otros animales - Presencia de pelos, plumas, arena, piedras o tierra - Presencia de material vegetal ajeno a la muestra analizada Dependiendo del tipo y de la cantidad de materia extraña hallada en la muestra, se podrá inferir que se encuentra contaminada, sustituida o adulterada. Figura 35. Modelos de Lupa o Microscopio estereoscópico 29 2. Análisis microscópico o micrográfico Para la observación se requiere del uso de microscopios y de distintos reactivos de caracterización, coloración, disociación, fijación, etc., según la técnica a usar. El microscopio más sencillo y utilizado en los análisis es el microscopio óptico (Fig. 36), y según los modelos puede venir con luz polarizada, contraste de fase y fluorescencia. Además, se puede adicionar una cámara digital o de video para obtener fotomicrografías de los preparados. Para estudios más complejos se utilizan microscopios electrónicos de barrido (MEB), de transmisión (MET), de congelación, etc. Las técnicas principales para el análisis microscópico son las siguientes: Técnicas histológicas a) Observación del material vegetal en polvo b) Raspado c) Obtención de disociados o macerados d) Obtención de cortes y coloración Técnicas o Reacciones histoquímicas Medición de elementos o Micrometría Técnicas específicas a) Observación con luz polarizada b) Técnica de Metcalfe c) Diafanización Figura 36. Distintos modelos de Microscopios ópticos 30 Técnicas histológicas: comprenden todos aquellos procedimientos para la observación en el microscopio de células, algunos contenidos celulares, tejidos y estructuras de órganos vegetales, en general. a) Observación del material vegetal en polvo Es la técnica más sencilla ya que no requiere tratamientos previos. Se toma una punta de espátula del material en polvo y se coloca entre porta y cubre- objetos con unas gotas de agua o de solución clarificante (ácido láctico 5%). Luego se coloca en el microscopio con lo cual se podrán visualizar ciertos elementos celulares provenientes de los tejidos, trozos de tejidos y contenidos celulares. Si el material vegetal se encuentra entero o en fragmentos, se puede reducir a polvo por medio de un molinillo. También, en el material en polvo se podrán practicar reacciones histoquímicas. b) Raspado Se utiliza en ciertos materiales enteros o fragmentados para la observación de pelos (en hojas secas) y sustancias ergásticas (generalmente en semillas, raíces y cortezas secas). Se toma el material, se apoya sobre un portaobjetos y con un elemente filoso (hoja de afeitar, bisturí, cuchilla descartable), se “raspa” repetidas veces hasta obtener un polvillo grueso. Se agregan unas gotas de agua, se coloca un cubreobjetos y se observa al microscopio. c) Obtención de disociados o macerados Son técnicas sencillas que brindan gran cantidad de información, por lo cual se aconseja su empleo. El fundamento de la técnica es la destrucción de la laminilla media, que une las células de los tejidos, por medio de soluciones disgregantes. Los disociados obtenidos constan de trozos de tejidos y de células sueltas. Según los reactivos que se usen hay dos tipos de técnicas: - Disociación leve o débil - Disociación fuerte Disociación leve: está indicada para el análisis de hojas, tallos herbáceos, cortezas comerciales y estructuras blandas en general. Con este método, los cristales se conservan, pero no los granos de almidón. El reactivo disgregante es una solución acuosa de Hidróxido de sodio al 5%. Técnica: Colocar en un vaso de precipitados una porción del material vegetal. 31 Agregar una solución de hidróxido de sodio al 5 % cubriendo el material. Calentar hasta llegar a ebullición y seguir el calentamiento durante 5-10’. Enfriar y filtrar o decantar con cuidado descartando el líquido. El material retenido se lava varias veces con agua destilada y el disociado se conserva en etanol 70º. Para la observación en el microscopio se coloca una pequeña porción del disociado entre porta y cubreobjetos con unas gotas de agua. Disociación fuerte: este método se indica para leños, tegumento de semillas, carozos, y en general para tejidos con células de paredes gruesas. Los reactivos disgregantes son ácidos. No se conservan granos de almidón ni cristales. Las técnicas más comúnmente usadas son: - Método de Boodle: es una técnica moderada, no demasiado drástica, en la cual los reactivos disgregantes son hidróxido de potasio y ácido crómico. Colocar el material a disociar en un vaso de precipitados. Cubrir con una solución de KOH 10 %. Calentar y dejar en ebullición durante 10 min. Enfriar y filtrar o decantar con cuidado descartando el líquido. Lavar varias veces con agua destilada el material retenido. Colocar el material retenido en un vaso de precipitados y cubrir con una solución de ácido crómico al 25 %. Dejar actuar a temperatura ambiente durante 30’-60’, según la consistencia del material. Una vez ablandado el material, lavar reiteradas veces con agua destilada hasta que el líquido quede lo más claro posible. Descartar el agua y conservar el disociado en etanol 70º. - Método de Jeffrey: es una técnica más drástica indicada para materiales realmente duros. El reactivo disgregante consiste en una mezcla de partes iguales de una solución de ácido nítrico al 10 % y una solución de ácido crómico al 10 %. Se procede con la misma metodología que el método anterior pero el calentamiento se realiza en estufa a 40º C durante 24-48 h. Nota: cuando se debe elegir entre realizar un disociado leve y uno fuerte se comienza siempre con el leve, ya que en el caso de que el material a disociar contenga cristales, se disolverían si se realiza de entrada un disociado fuerte. 32 d) Obtención de cortes y coloración Los procedimientos para la obtención de cortes coloreados van a depender de cómo se presente el material (fresco o seco), del tipo de técnica de corte y de la tinción empleada. El objetivo es obtener secciones lo más delgadas posibles donde se pueda observar la disposición de los tejidos de los órganos y el tipo de paredes celulares. Los materiales a cortar deben estar enteros o fragmentados en trozos lo suficientemente grandes como para que puedan ser cortados. Los materiales muy pequeños o muy delicados deben incluirse en alguna sustancia que actúe como soporte (parafina, ceras, resinas sintéticas). En el caso de materiales frescos y si se cortan inmediatamente, no requieren de ningún paso previo antes de ser cortados porque los tejidos todavía están hidratados. Si no se cortan inmediatamente, conviene fijarlos para provocar la muerte celular y conservar las células en el mismo estado que tenían al estado vivo. La técnica de fijación detiene los procesos de plasmólisis, deshidratación y pérdida de turgencia de las células. Uno de los fijadores más usadoses FAA, mezcla de formol, etanol, ácido acético y agua. En el caso de materiales secos, que es como se presentan la mayoría de las plantas medicinales, de herboristería y de ejemplares de herbario, se necesita un paso previa para rehidratar los tejidos antes de cortar. Por lo tanto, para este tipo de material los pasos a seguir son los siguientes: - Hidratación o ablandamiento del material vegetal; - Obtención de los cortes; - Vaciado del contenido celular; - Coloración diferencial; - Montaje del preparado. Hidratación o ablandamiento del material vegetal: hidratar implica colocar el material en contacto con agua y calentar durante un tiempo corto hasta que el material adquiera flexibilidad. Generalmente, se utiliza para hojas, flores, tallos herbáceos y estructuras blandas. Técnica: el material se coloca en un vaso de precipitados, se lo cubre con agua, se calienta hasta ebullición y se continúa calentando durante 5 min. Se deja enfriar y se procede a cortar. Las estructuras más duras (tallos leñosos, leños) requieren de un ablandamiento que consiste en un calentamiento más prolongado y el añadido de alguna sustancia. 33 Técnica: se hierve el material durante 5-10 minutos en agua con unas gotas de detergente o bien, se deja el material en contacto con etilenglicol a temperatura ambiente durante un tiempo hasta que se produzca el ablandamiento. Obtención de los cortes: la orientación de los cortes depende de la forma y del órgano que se quiera cortar. Se pueden realizar secciones en sentido transversal (transcorte), en un plano perpendicular al eje mayor del órgano, o en sentido longitudinal, en un plano paralelo al eje mayor del órgano. En este último caso hay dos posibilidades: a) longitudinal radial (cuando el plano del corte coincide con un diámetro o un radio), y b) longitudinal tangencial (cuando el plano de corte es paralelo a un diámetro) (Fig. 37). Los órganos cilíndricos (tallos y raíces) admiten los tres tipos de cortes; los órganos planos, como las hojas, generalmente se cortan en sentido transversal por la parte media de la lámina foliar. Figura 37. Distintos planos para la obtención de cortes En cuanto a los tipos de cortes, dependen del material a cortar y de cómo se presenta. En todos los casos los elementos para cortar (hojas de afeitar, navajas, cuchillas), deben tener el filo óptimo para obtener buenos resultados. 1) Cortes a mano alzada o libre: es una técnica netamente artesanal que requiere de habilidad y práctica y de las cuales depende también el espesor del corte obtenido. Generalmente, se utiliza en análisis rápidos y que no requieren de detalles muy profundos. Hay materiales que pueden cortarse directamente sin ayuda de un soporte. Otros, por ejemplo hojas, pueden colocarse entre dos mitades de un cilindro de médula de saúco, hinojo o zanahoria cortado longitudinalmente, y luego proceder al corte. A medida que se obtienen, los 34 cortes se colocan en un recipiente con agua (vidrio de reloj, caja de petri) para evitar que se deshidraten. Posteriormente, se eligen los más delgados para colorear. Si no se procesan en el momento, se deben guardar en alcohol 70º. 2) Cortes con micrótomo de mano: los micrótomos de mano constan de un cilindro metálico hueco que termina en un disco o placa de cristal por donde se desliza la cuchilla (Fig. 38). Dentro del hueco del cilindro se coloca el material a cortar que puede ir a su vez incluido en un soporte (saúco, hinojo, etc.). El espesor de los cortes obtenidos es similar al que se obtiene a mano alzada. No sirve para materiales duros. 3) Cortes con micrótomo de deslizamiento: es un micrótomo metálico que consta de un plano inclinado, la cuchilla se mueve sobre una corredera y el objeto a cortar está fijo en una platina, contenido o no dentro de un soporte. Tiene una escala graduada en micrones para establecer el espesor que se desea dar al corte. Sirve para materiales frescos, fijados, ablandados, incluidos en parafina y también para materiales duros (Fig. 39). Los que se usan para el corte de maderas se denominan xilótomos. 4) Cortes con micrótomo rotatorio (tipo Minot): este micrótomo se utiliza generalmente para cortar materiales incluidos en parafina y para cortes seriados (Fig. 40). La cuchilla está fija y el bloque de parafina con el material se desplaza en un movimiento descendente y ascendente y de avance. Vaciado del contenido celular: previo a la coloración es necesario eliminar el contenido celular. También se denomina clarificación. El reactivo clarificador por excelencia es el Hipoclorito de sodio concentrado o diluido en agua Figura 38. Micrótomo manual Figura 39. Micrótomo de deslizamiento Figura 40. Micrótomo rotatorio 35 (solución al 50 %), según el grosor del corte y la consistencia del material. El tiempo de vaciado varía para cada material pues depende del contenido celular de cada uno. Se eliminan almidones, clorofila, taninos y otros pigmentos. Los cristales de oxalato y de carbonato de calcio no se eliminan con el vaciado. Técnica: los cortes obtenidos se colocan en una solución de hipoclorito de sodio al 50 % y se dejan hasta que pierdan el color y queden lo más blancos posible. Se debe controlar el tiempo ya que si se sobrepasa, el reactivo puede actuar como disgregante y producir la disociación del corte. Una vez vaciados, se quita el hipoclorito y se hacen sucesivos lavados con agua hasta eliminar por completo la presencia del reactivo clarificador. Coloración diferencial: existen numerosas técnicas y el fundamento de la coloración es que los colorantes son capaces de ceder su color al combinarse con otras sustancias. Si el material que se tiñe queda de color semejante al del colorante usado, se produce ortocromasia (Ej.: Safranina). Si el material que se tiñe queda con dos colores diferentes usando un solo colorante, se produce metacromasia (Ej.: Violeta de Cresilo, Azul de Toluidina). Se puede usar más de un colorante con lo cual, se obtendrá una coloración diferencial combinada doble (Ej.: Safranina-Fast Green, Rojo Congo-Verde de iodo), o triple (Safranina-Cristal violeta-Naranja G). Se describe a continuación: - Coloración de Rojo congo–Verde de iodo: el fundamento consiste en la tinción de las paredes lignificadas de color verde por el Verde de iodo, y las paredes celulósicas de rojo por el Rojo Congo. Es una coloración con base acuosa y semi-definitiva para el análisis rápido de materiales. Reactivos: Solución de Verde de iodo al 0,5 % Solución de Rojo Congo al 1 % Alcohol 70º Agua destilada Técnica: los cortes vaciados se pueden colocar en recipientes adecuados para la coloración. Éstos pueden ser un cilindro de vidrio con perforaciones en la parte inferior y que se coloca a su vez dentro de otros cilindros de vidrio sin perforar que contienen los reactivos. También pueden ser pequeñas canastas 36 de acero inoxidable con malla perforada y que se sumergen en vasos de precipitado pequeños que contienen los reactivos. - Sumergir los cortes vaciados menos de un minuto en Verde de iodo; - Escurrir el exceso de colorante; - Sumergir en alcohol 70º varias veces hasta que no cedan más color; - Lavar con agua destilada; - Sumergir en Rojo Congo 15-30 min. y escurrir el exceso de colorante; - Lavar con agua destilada; - Colocar entre porta y cubreobjetos y observar al microscopio. Nota: la coloración de Safranina-Fast Green es de tipo permanente y más apropiada para preparados definitivos que se desean conservar largo tiempo. Los cortes se someten a deshidratación creciente hasta eliminar toda el agua. Montaje del preparado: para observación rápida u obtención de foto- micrografías en el momento, los cortes coloreados se colocan entre porta y cubreobjetos con unas gotas de agua o de glicerina diluida.Si se quiere conservar el preparado por un tiempo se monta en gelatina glicerinada, medio soluble en agua y que se conserva sólido en tubos de ensayo. Se funde al momento de usarlo. Para los preparados definitivos, coloreados con Safranina-Fast Green, se utiliza como medio de montaje Bálsamo de Canadá que puede ser natural o sintético y es soluble en xilol. Técnicas o Reacciones histoquímicas Se utilizan reactivos para detectar y caracterizar sustancias que forman parte de los contenidos celulares. Estas reacciones se practican generalmente sobre el material en polvo, pero algunas también pueden realizarse sobre cortes histológicos o sobre disociados. Las reacciones más usuales son las siguientes: - Caracterización de almidón: el almidón tratado con una solución yodo- iodurada (Lugol), se tiñe de color azul violáceo a casi negro por la formación de un compuesto de inclusión entre el yodo y las moléculas de amilasa (Fig. 41). La solución de Lugol se prepara con 5 g de yodo, 10 g de ioduro de potasio y agua destilada c.s.p. 100 ml, y se diluye convenientemente (1:2, 1:3). 37 Técnica: se coloca una porción del material en polvo sobre un portaobjetos, se agregan 2-3 gotas de solución de Lugol, se coloca el cubreobjetos y se observa al microscopio. Los granos de almidón tomarán una coloración azul violácea intensa. Esta reacción, además, se puede realizar sobre cortes que conservan el contenido celular, pero no se practica sobre disociados ya que con esta técnica se desnaturaliza el almidón (pierden su estructura granular). - Caracterización de inulina: la inulina tratada con cristales de timol en medio de ácido sulfúrico concentrado da una coloración roja. Técnica: sobre un portaobjetos se coloca una porción del material en polvo, se agregan unos cristales de timol y unas gotas de H2SO4 cc. Se puede realizar también sobre cortes delgados del material. - Caracterización de aleurona: las proteínas constituyentes de la aleurona se tiñen de amarillo en presencia de una solución de ácido pícrico. Técnica: sobre un portaobjetos se coloca una porción del material en polvo, se cubre con unas gotas de solución de ácido pícrico al 1%. Se coloca el cubreobjetos y se observa al microscopio. Se realiza también sobre cortes delgados del material. - Caracterización de lípidos: los compuestos lipídicos se colorean de rojo con el reactivo Sudan III, que es una solución saturada de Sudan III en alcohol 90º. Técnica: sobre un portaobjetos se coloca una porción del material en polvo, se cubre con unas gotas de solución de Sudan III. Se deja actuar durante 2-3 min. Se elimina el exceso de reactivo, se lava con alcohol 70º, se coloca el cubreobjetos y se observa. Los lípidos aparecen como gotas de color rojo. Se puede realizar también sobre cortes del material. - Caracterización de taninos: los taninos dan coloración parda a negra si se tratan con una solución de tricloruro férrico al 5% (Fig. 42). Figura 41. Reacción de Lugol positiva Figura 42. Caracterización de taninos en hoja 38 Técnica: una porción del material en polvo se coloca sobre un portaobjetos y se cubre con la solución de tricloruro férrico. Se coloca el cubreobjetos y se observa. Se realiza también sobre cortes histológicos. - Caracterización de cristales de oxalato de calcio (cristales verdaderos) y de CaCO3 (cistolitos): por tratamiento con HCl diluido, ambos tipos de compuestos cristalinos se disuelven, pero las concreciones de CaCO3 desprenden CO2 y se observa la formación inmediata de burbujas, mientras los de oxalato de calcio no producen desprendimiento gaseoso. Esta reacción, además de caracterizar a los cristales, diferencia su composición química. Técnica: una porción del material en polvo se coloca sobre un portaobjetos y se agregan unas gotas de HCl 2N. Se coloca el cubreobjetos y se observa. La aparición inmediata de burbujas indica la presencia de CaCO3; la disolución sin burbujeo indica la presencia de oxalato de calcio. Se puede realizar también sobre cortes histológicos y disociados leves (Fig. 43). Figura 43. Cristales de oxalato de calcio. A: antes de agregar HCl; B: después de HCl - Caracterización de sílice: las células con sílice adquieren refringencia cuando son tratadas con fenol y la sílice toma color rosado, mientras que el resto del tejido se vuelve transparente. Técnica: sobre un portaobjetos se coloca una porción del material en polvo, se cubre con unas gotas de fenol líquido, se coloca el cubreobjetos y se observa. Se realiza también sobre cortes histológicos. - Caracterización de lignina: la lignina se tiñe de color rojo al ser tratada con floroglucinol en presencia de HCl concentrado. Técnica: sobre un portaobjetos se coloca una porción del material en polvo y se cubre con una solución de floroglucinol al 1% en alcohol 96º. Se coloca luego una gota de HCl cc y se observa. La aparición de células teñidas de rojo indica la presencia de lignina en su pared celular. A B 39 Medición de elementos o Micrometría Esta técnica está contemplada ya que en las Farmacopeas se indica el tamaño de algunos elementos (granos de almidón, cristales, fibras, etc.). Para realizar la medición se emplean micrómetros. Hay dos tipos: Micrómetro objetivo: consiste en un portaobjetos con una escala graduada que, por lo general, mide 1 ó 2 mm y está dividida en 100 o 200 partes iguales, o sea que a cada división le corresponden 10 μm (1 mm = 1000 μm) (Fig. 44). Micrómetro ocular: es un ocular que posee una escala graduada y que se puede intercambiar con el/los oculares del microscopio (Fig. 45). Esta escala debe calibrarse con el micrómetro objetivo para cada aumento del microscopio. Calibración del micrómetro ocular y medición - Colocar sobre la platina del microscopio el micrómetro objetivo con la escala graduada calibrada. - Retirar el ocular o uno de los oculares del microscopio y reemplazarlo por el micrómetro ocular, que contiene la escala que se desea calibrar. - Hacer coincidir los ceros de ambas escalas. - Observar qué división del micrómetro ocular se corresponde exactamente con alguna división del micrómetro objetivo. Figura 44. Micrómetro objetivo Figura 45. Micrómetro ocular 40 - Retirar el micrómetro objetivo y calcular a cuántos micrones corresponde cada división de la escala del micrómetro ocular. Se obtiene un número cuyas dimensiones son μm/división. - Repetir el procedimiento para cada aumento (5x, 10x, 20x, 40x, etc.). - Para la medición, se coloca sobre la platina el preparado cuyos elementos se quieren medir. - Se hace coincidir exactamente un extremo del elemento a medir con el cero de la escala del micrómetro ocular que fue calibrada anteriormente. - Se determina cuántas divisiones de esa escala abarca el elemento. - La medida del elemento se calcula multiplicando el número de divisiones que abarca por el valor en micrones que corresponde a cada división. Ejemplo: Se determina que la división 20 del micrómetro objetivo se corresponde con la división 15 del micrómetro ocular. Con ese micrómetro ocular se mide un elemento que abarca 11 divisiones (Fig. 46). 200 divisiones del micrómetro objetivo son 2000 μm (1 mm = 1000 μm), por lo que 20 divisiones corresponden a 200 μm. Las 15 divisiones del micrómetro ocular también miden 200 μm, por lo que cada división mide 13,3 (200 / 15). Si el elemento abarca 11 divisiones, su medida será 13,3 x 11 = 146,3 μm Figura 46. Micrometría de un elemento vegetal Técnicas específicas a) Observación con luz polarizada Es la observación en un microscopio de campo claro al cual se le adicionan filtros que modifican la luz. 41 Con la luz polarizada, el almidón forma una cruz de extinción o “cruz de Malta”, debido a que es una estructuracristalina muy ordenada y la luz se refracta en dos direcciones. La inulina cristalizada, también presenta la cruz de extinción observada con luz polarizada. Los cristales de oxalato de calcio, por ser altamente refringentes, aparecen brillantes bajo la luz polarizada. Sin embargo, la sílice y las concreciones de CaCO3 no brillan con luz polarizada. b) Técnica de Metcalfe Es un procedimiento para la obtención y observación de epidermis foliar por el método de “raspado”. No se puede realizar en cualquier tipo de hoja sino en las que tengan cierta consistencia (coriáceas, carnosas, etc.). Es útil para estudiar detalles de la epidermis como la forma de las células epidérmicas, tipo de estomas y de células anexas y otras modificaciones epidérmicas. También es útil para calcular la densidad de estomas y el índice de estomas. Técnica: - Colocar sobre un portaobjetos un trozo de hoja con la epidermis que se desea estudiar hacia abajo. - Raspar suavemente la superficie con una hoja de afeitar. - Colocar sobre ella unas gotas de solución concentrada de hipoclorito de sodio y dejar actuar durante 15 minutos. - Raspar nuevamente la epidermis y el mesófilo con suavidad hasta acercarse lo más posible hasta la epidermis que se quiere ver. Eliminar con mucho cuidado el resto de mesófilo que pueda quedar. - Lavar varias veces con agua usando un gotero, agregar 2-3 gotas de amoníaco y por último agua destilada. - El preparado se puede colorear y montar con algún medio o montar sin color. Nota: el raspado se realiza siempre sobre los tejidos que no interesan estudiar. - Cálculo del Índice de estomas: se realiza sobre fragmentos de hojas y se define como: “el número de estomas por cada 100 células epidérmicas en un área fija”. IE = Estomas / (Cél. epidérmicas + estomas) x 100 42 Técnica: se requiere del empleo de un ocular de dibujo o de una cámara clara que se adosan al microscopio. Con ella se delimita un área de 2 mm de lado con la ayuda de un micrómetro objetivo. El área se dibuja en una hoja de papel colocada delante de la base del microscopio. El preparado con el fragmento de hoja tratado con la técnica de Metcalfe se coloca en la platina del microscopio y se observa con el objetivo de 40x. Se reemplaza uno de los oculares por el ocular de dibujo y se observa a través de él. En la hoja de papel se verá la imagen reflejada del preparado. Se cuentan y se marcan con un lápiz las células epidérmicas y los estomas que aparecen en esa área. Se deben efectuar 10 mediciones como mínimo cambiando las áreas de observación y luego se calcula el promedio (Fig. 47). Nota: este cálculo se puede realizar también en el material diafanizado. Figura 47. Cálculo de Índice de estomas c) Diafanización Consiste en hacer que el material en estudio se vuelva transparente para realizar ciertos estudios o determinar índices. Se emplea en hojas y en flores. Para los estudios del tipo de venación o nerviación foliar la hoja debe estar entera. Para determinar índices se pueden usar fragmentos de hojas. Se utilizan reactivos diafanizantes que dejan el material en condiciones tales que, a través de ellos, pueda pasar la luz. Los más usados son el hidrato de cloral y el hidróxido de sodio, ambos en solución acuosa. Técnica: - Colocar el material en un vaso de precipitado con alcohol 96º y llevar a ebullición en plancha calefactora durante 10 min. 43 - Pasar a una mezcla de alcohol 96º e hidróxido de sodio al 5 % en partes iguales, y llevar a ebullición durante 5-10 min. - Hacer varios lavados hasta que el agua quede limpia. - Pasar el material a agua destilada y realizar 2 cambios. - Introducir en una solución de hipoclorito de sodio al 50 % y dejar hasta que se torne transparente. El tiempo depende del material y debe controlarse. - Pasar a agua destilada y hacer 5 cambios de 3 minutos cada uno. - Colocar en hidrato de cloral (5 g en 2 ml de agua destilada) durante 5-10 min. para quitar la opacidad. El material queda listo para observar o bien, se puede colorear (generalmente con safranina) y hacer un montaje definitivo. - Cálculo del Índice de empalizada: se define como “el número de células del clorénquima en empalizada cubiertas por una sola célula epidérmica”. Técnica: con el ocular de dibujo se sigue el mismo procedimiento que para el índice de estomas: se delimita un área de 2 mm en una hoja de papel colocada en la base del microscopio; el preparado con la hoja diafanizada se coloca en la platina y se observa con el objetivo de 40x. En la hoja de papel se reflejará la imagen, entonces se dibujan 4 células epidérmicas que estén juntas, se mueve el tornillo micrométrico y se enfoca las células en empalizada que están debajo de la epidermis. Se dibujan las que quepan bajo las 4 células epidérmicas ya marcadas. Se cuentan las células en empalizada y se realiza el cálculo. Se deben efectuar 10 mediciones como mínimo y luego se obtiene el promedio (Fig. 48). Figura 48. Cálculo de Índice de empalizada I. Emp. = Nº cél. emp. / 4 44 - Cálculo del Índice de islotes venosos: se define como “el número de islotes celulares encerrados por las nervaduras de una hoja en un área fija”. Técnica: con el ocular de dibujo y el micrómetro objetivo, se delimita un área de 1 mm de lado en una hoja de papel colocada en la base del microscopio. El preparado con la hoja diafanizada se coloca en la platina y se observa con el objetivo de menor aumento (5x). Se marcan los islotes venosos que aparecen dentro del área, tanto los islotes grandes, medianos y pequeños. Se efectúan 10 mediciones como mínimo y se calcula el promedio (Fig. 49). Figura 49. Cálculo de Índice de islotes venosos - Estudios de venación o nerviación foliar: para este estudio el diafanizado debe ser de una hoja entera, para analizar toda la lámina foliar. Se observa en el menor aumento (5x) y se realiza el esquema con un ocular de dibujo (Fig. 50). Otra variante es observar en lupa y fotografiar el preparado con cámara digital (Fig. 51). I. IV= Nº islotes venosos/ mm 2 Figura 50. Esquema de hoja diafanizada Figura 51. Fotografía de hoja diafanizada 45 UNIDAD 3 ORGANOGRAFÍA OBJETIVO: Reconocer las diferentes estructuras internas de los órganos vegetales: los tejidos, su disposición y las características de cada uno. Introducción a la sistemática de las plantas superiores La mayoría de las plantas medicinales corresponden a las plantas superiores. Una planta superior es aquélla que presenta sus órganos bien diferenciados y que se propaga por semillas encerradas en frutos. Estas características corresponden a la División Magnoliófita (ex Angiospermas). Dentro de esta División se pueden distinguir dos grandes grupos: Clase Dicotiledóneas y Clase Monocotiledóneas. Las Dicotiledóneas poseen dos cotiledones en sus semillas, hojas generalmente retinervadas, y piezas florales en número de 4-5 ó múltiplos de ellos. Pueden ser hierbas, arbustos o árboles (Ej.: margarita, rosa, tilo). Las Monocotiledóneas poseen un solo cotiledón en sus semillas, hojas con nervaduras paralelas y piezas florales de a tres o múltiplo de tres. Son, en su gran mayoría, hierbas o plantas herbáceas (Ej.: cereales, pastos, orquídeas, tulipán). Existen otras plantas que se propagan por semillas pero no poseen verdaderas flores y no forman frutos. Corresponden a la División Pinófitas (ex Gimnospermas). Se trata de árboles o plantas leñosas (Ej.: pino, abeto, araucaria, ciprés, ginkgo). Conceptos de Organografía Vegetal Se considera que las plantas superiores poseen dos sistemas de órganos: - sistema vegetativo: constituido por la raíz, el tallo y las hojas - sistema reproductor:constituido por las flores (que son un conjunto de órganos), frutos y semillas. La raíz y el tallo pueden presentar una estructura primaria o herbácea, como producto de la actividad de los tejidos meristemáticos primarios, o bien una estructura secundaria o leñosa, producto de la actividad de los tejidos meristemáticos secundarios. Las hojas y las flores siempre tienen estructura 1ª. 46 SISTEMA VEGETATIVO: LA RAÍZ La raíz es un órgano generalmente subterráneo (existen raíces acuáticas y también aéreas), cuyas funciones principales son: - Fijación o anclaje de la planta al suelo - Absorción de agua y sales minerales Morfología externa (Fig. 52) - cuello o nudo vital: zona de transición entre la raíz y el tallo (nv); - zona de ramificación: pueden aparecer raíces laterales (zr); - zona de absorción o pilífera: con pelos absorbentes (za); - zona de crecimiento longitudinal: la raíz se elonga (zcl); - zona meristemática apical: con células en división (zm); - caliptra, cofia o pilorriza: protege al meristema apical (c) Figura 52. Morfología externa de la raíz Tipos de raíces según su origen: las raíces pueden originarse en la radícula del embrión, como sucede en la mayoría de las Dicotiledóneas y las Pinófitas, o bien se desarrollan a partir de células no embrionarias (raíces adventicias), como en la mayoría de las Monocotiledóneas. Tipos de raíces según su forma: en general, las Dicotiledóneas poseen una raíz central desarrollada a partir de la cual se originan raíces laterales: raíz pivotante (a) (Ej.: quina, zanahoria). Las Monocotiledóneas presentan muchas raíces, del mismo grosor y longitud: raíces fibrosas o fasciculadas (b) (Ej.: c za zcl zm zr nv 47 trigo, maíz). Cuando las raíces se engrosan y acumulan materiales de reserva se llaman tuberosas (c) (Ej.: batata, jalapa) (Fig. 53). Morfología interna de la raíz Comprende todos los tejidos que la constituyen en su estructura 1ª y 2ª. Estructura primaria (Fig. 54) En sección transversal (transcorte), una raíz presenta los siguientes tejidos: - rizodermis (r) - exodermis (ex) - parénquima cortical (pc) - endodermis (en) - periciclo (p) - floema 1º, en cordones (fl) - xilema 1º, en cordones (x) - médula (m) La exodermis, el parénquima cortical y la endodermis constituyen la corteza primaria (cp). El periciclo, el floema, el xilema y la médula forman el cilindro central (cc). Rizodermis: está constituida por una sola capa de células que cumplen la función de protección. Posee o no una cutícula delgada. Carece de estomas y de tricomas. Presenta pelos absorbentes en una zona limitada. Por lo general, la rizodermis es caduca. a b c Figura 53. Tipos de raíces: a. pivotante; b. fibrosa; c. tuberosa r pc m en p fl x ex cp cc Figura 54. Esquema de raíz primaria primaria 48 Exodermis: consta de varias capas de células suberificadas. Se transforma en el tejido protector de la raíz cuando la rizodermis no existe. Parénquima cortical: en la mayoría de las raíces, es la zona más desarrollada, con varias capas de células. Su función es acumular sustancias de reserva, principalmente almidón. En algunas plantas de la familia Asteraceae, las raíces acumulan inulina en lugar de almidón (Ej.: achicoria, diente de león). Endodermis: está formada por un solo estrato de células. Presentan engrosamientos en sus paredes radiales, conocidos como banda de Caspary. La endodermis tiene como función la regulación de la absorción de agua y de sales. Periciclo: consta de una sola capa de células muy pequeñas y de paredes muy delgadas. A partir de esta capa se originan las ramificaciones laterales de la raíz. Origina también el felógeno, tejido meristemático secundario responsable del crecimiento en grosor en la estructura secundaria. Floema y xilema: son los tejidos conductores y, en la estructura primaria, se disponen en cordones alternados. Esta disposición de los tejidos conductores es característica de la raíz primaria. Las raíces de Monocotiledóneas presentan mayor número de cordones de floema y xilema que las de Dicotiledóneas. Médula: está constituida por un parénquima de reserva y delimitada por los cordones de floema y xilema. En algunos casos, el xilema se expande y ocupa toda la porción central de la raíz, y no se encuentra médula. Estructura secundaria (Fig. 55) Las raíces de Monocotiledóneas no presentan desarrollo secundario, mientras que las de Dicotiledóneas pueden desarrollar una estructura secundaria. Esto se debe a la actividad de los tejidos meristemáticos secundarios (cambium y felógeno). El cambium aparece entre los cordones de floema y xilema y con un contorno sinuoso. Con el tiempo, y a medida que crece, se vuelve circular. Es el responsable de la formación de floema y xilema secundarios. El felógeno, como ya vimos, se origina en el nivel del periciclo y forma los tejidos de protección secundarios. Por lo tanto, en un transcorte de una estructura secundaria de raíz se distingue: 49 - peridermis (per) - floema 2º (f2) y xilema 2º (x2), en haces vasculares (hv) - cambium o zona cambial (c) - radios medulares (rm) - médula (m) Peridermis: está constituida por súber, felógeno y felodermis. El tejido más notorio es el súber, constituido por varias capas de células. El felógeno consta de una sola capa y la felodermis de varias capas de células de tipo parenquimático. Floema y xilema secundarios: su disposición ya no es en cordones, sino en haces vasculares. Cuando el floema se dispone de un lado y el xilema hacia el otro lado, constituyen un haz vascular colateral. Como además, entre floema y xilema se encuentra el cambium, el haz vascular es abierto. Si la raíz aún no es muy vieja, se pueden distinguir los cordones de xilema primario. Cambium: ubicado entre floema y xilema secundarios. Consta de células muy delgadas, en activa división y que pueden abarcar varias capas, por eso se habla de “zona cambial”. Radios medulares: son hileras de células parenquimáticas que dividen entre sí los haces vasculares. En el nivel del floema se llaman radios floemáticos, y en el xilema, radios xilemáticos. Médula: queda delimitada por los haces vasculares y consta de células de tipo parenquimático. A medida que la raíz envejece puede ser reemplazada por el xilema y volverse indistinguible. La estructura anatómica de las raíces de Dicotiledóneas y de Monocotiledóneas no muestra diferencias marcadas, salvo el número de cordones floemáticos y xilemáticos (más numerosos en Monocotiledóneas). Figura 55. Esquema de raíz secundaria 50 La mayoría de las raíces medicinales presentan una estructura secundaria. Las raíces medicinales con estructura primaria son muy pocas, por ejemplo: “zarzaparrilla blanca” (Smilax campestris – Smilacaceae-, y raicillas que acompañan rizomas: “hidrastis” (Hydrastis canadensis L. – Ranunculaceae-). CONTROL DE CALIDAD DE RAÍCES Las etapas para realizar un control de calidad en una muestra de raíces son: Descripción de la morfología externa: forma de presentación (trozos irregulares, rodajas, canutos, polvo); marcas externas o de superficie. Descripción de caracteres organolépticos: color, olor, sabor. Detalle del tipo de fractura: completa, incompleta, fibrosa, harinosa. Observación microscópica: las técnicas a emplear se deben adecuar al tipo de material y a la forma de presentación (ver capítulo de técnicas). Puede emplearse: raspado/reducción a polvo, para observar almidones, elementos de conducción y realizar reacciones histoquímicas; disociados, generalmente leves; corte y coloración, para ver la disposición de los tejidos; micrometría, para la medición de elementos. Ejemplos de raíces medicinales Nombre vulgar
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