Métodos de diagnóstico de laboratorio

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Métodos de diagnóstico de laboratorio
En los últimos años, ha surgido una 
bat-ería de modalidades diagnósticas de 
van-guardia, que hacen que la 
identificación de muchas enfermedades 
infecciosas sea sencilla, sin requerir más 
habilidad que el poder leer las 
instrucciones y ejecutarlas. El 
entrenamiento de microscopía no es 
necesario en estos casos. Cada uno de los 
capítulos anteriores atestigua este hecho, 
con un sólido muestreo de las modernas 
estrategias de diagnóstico serológico y 
molecular.
La gran mayoría de los laboratorios de 
parasitología en hospitales y clínicas ambu-
latorias de todo el mundo continúan depen-
diendo de enfoques más tradicionales para 
el diagnóstico de parásitos eucarióticos. En 
estos casos, la microscopía sigue siendo el 
referente para la identificación de patóge-
nos. Este capítulo sirve como una referen-
cia estándar para estos procedimientos de 
laboratorio tradicionales.
La Parte I trata de especímenes no con-
servados y la Parte II con especímenes 
preservados. No existe un único método 
que permita que todas las etapas de todos 
los parásitos estén disponibles para la iden-
tificación microscópica; a menudo se deben 
realizar varias pruebas para obtener resulta-
dos óptimos.
Muestras de heces no conservadas
Idealmente, las muestras de heces 
deben tener menos de una hora de anti-
güedad cuando se examinan por primera 
vez, aunque esto no siempre es posible. 
Las heces de hasta 24 horas pueden ser 
útiles para la recuperación de quistes proto-
zoarios, larvas y huevos de helmintos, pero 
los trofozoítos rara vez sobreviven tanto 
tiempo. Un factor de confusión cuando 
se examinan especímenes dejados a tem-
peratura ambiente durante más de 24 horas 
es que algunos parásitos pueden crecer y 
desarrollarse. La refrigeración ayuda a pre-
venir este problema. Las heces no deben 
congelarse, ya que esto alteraría la mor-
fología de los organismos examinados.
Debido a la variabilidad diaria en la can-
tidad de las varias etapas del parásito en un 
individuo infectado, los parásitos podrían 
no estar presentes en una muestra en par-
ticular, especialmente cuando la infección 
es ligera. Se sugiere un total de tres espe-
címenes recogidos en días consecutivos 
cuando se intenta detectar la mayoría de 
las infecciones entéricas por microscopía 
visual. Algunos parásitos (por ejemplo, 
los esquistosomas y Giardia lamblia) a 
menudo requieren más muestras para la 
detección o el uso de modalidades diag-
nósticas más sensibles.
El bario o el aceite mineral interfieren 
con la identificación de los parásitos. Los 
pacientes no deben someterse a estudios 
radiográficos que incluyan bario ni a laxa-
ntes que contengan aceite mineral hasta que 
se hayan obtenido las muestras de heces.
Examen directo
Examen general:
1. Observe y registre la apariencia de toda
la muestra, observando el color, la con-
sistencia y el olor.
2. Examinar la muestra para detectar la
presencia de parásitos vivos.
3. Realizar un examen microscópico.
4. Examine un frotis directo del material.
El examen directo es eficaz para diag-
nosticar parásitos vivos (por ejemplo, 
Entamoeba histolytica, Giardia lamblia, 
Strongyloides stercoralis) y debe realizarse 
en heces sueltas, diarreicas o purgadas. 
Cuando las amebas móviles se encuentran 
en un frotis directo, también se debe exami-
nar un preparado teñido para el diagnóstico 
definitivo. Si la ameba contiene eritrocitos 
Para eliminar el exceso de teñido, sum-
erja brevemente el cubreobjetos en la 
solución de decoloración una o dos veces. 
Enjuague con etanol al 90% para detener 
el proceso. Los frotis finos se descompo-
nen rápidamente; los más gruesos pueden 
requerir tres o cuatro inmersiones para 
obtener una diferenciación óptima. El pro-
ceso es el siguiente:
Solución Tiempo
Etanol 95% o 100% Dos enjuagues
Etanol 100% 1 minuto
Xylol 1 minuto
Monte el cubreobjetos en un medio de 
montaje apropiado y examine bajo un 
microscopio.
Métodos de Concentración
Sedimentación por Centrifugación: 
Método de Formaldehído-Acetato de 
Etilo.
La sedimentación por concentración y 
exposición a formaldehído-acetato de etilo 
concentra los quistes y los huevos de los 
parásitos, pero los restos y los materiales 
solubles en éter se localizan en la interfase 
formaldehído-éter o en la capa de éter en 
la parte superior del tubo. Este proceso 
destruye los trofozoítos, ya que se desinte-
gran en acetato de etilo.
1. Mezcle las heces 1:10 con H2O.
2. Coloque una sola capa de gasa en un
tubo de centrífuga de 15 ml.
3. Centrifugar las heces fecales (1 minuto
a 2.000 rpm) y desechar el material flo-
tante.
4. Lavar el sedimento una vez con H2O.
5. Repita los pasos 3 y 4.
6. Deseche el material flotante y guarde el
sedimento.
7. Añadir 10 ml de formaldehído al 7,5%
al sedimento.
8. Dejar reposar 10-30 minutos.
9. Añadir aproximadamente 3 ml de aceta-
dentro del citoplasma, es indicativo de una 
infección causada por E. histolytica.
Si la muestra parece negativa, como 
puede ocurrir con infecciones ligeras, la 
muestra debe ser concentrada.
1. Sumerja un palo de aplicador de madera
en el espécimen para cubrir la punta del
mismo con las heces.
2. Mezcle las heces en un portaobjetos de
vidrio transparente en el que se ha colo-
cado una gota de solución salina normal
y cubra con un cubreobjetos. Los frotis
deben ser lo suficientemente delgados
para facilitar el examen microscópico.
Manchado del frotis directo
El tricrómico de Wheatly-Gomori 
(WGT) tiñe los núcleos protozoarios de 
color rojo a azul oscuro, el citoplasma de 
un azul más claro, y el material de fondo 
verde. Los trofozoítos y quistes tienden a 
encogerse lejos del material de fondo y por 
lo tanto son relativamente fáciles de locali-
zar.
El reactivo WGT consiste en 6,0 g 
de cromotropo 2R, 0,5 g de anilina azul 
CI42755 y 0,25 g de ácido dodecatungsto-
fosfórico AR en 3 ml de ácido acético gla-
cial. La mancha de WGT se aplica a una 
fina capa de heces en un cubreobjetos y el 
cubreobjetos se sumerge secuencialmente 
en las soluciones enumeradas a continu-
ación durante los tiempos prescritos.
Solución Tiempo 
El fijador de Schaudinn 5 minutos en 
50+˚C, o 1 hora a temperatura ambiente
Etanol-yodo 70% 1 minuto
Etanol 70% 1 minuto
Etanol 70% 1 minuto
Tinción de tricromo 2-8 minutos
Etanol 90% 10-20 segundos
(Acidificado) 
to de etilo, tapar los tubos con tapones 
y agitar vigorosamente la mezcla.
10. Retire los tapones y centrifugue los tu-
bos a 1.500 rpm durante 1 minuto.
11. Suavemente afloje los restos de la
pared del tubo con una varilla de apli-
cación, teniendo cuidado de no pertur-
bar el gránulo.
12. Desechar el material flotante
13. Examinar microscópicamente el sedi-
mento.
14. Añadir una gota de solución de etanol-
yodo al 70% (solución de Lugol) y
examinar de nuevo si las estructuras
internas de los quistes no se reconocen
en el primer examen.
Sedimentación por gravedad:
La prueba de sedimentación de agua se 
utiliza principalmente para la concentración 
y recuperación de los huevos de Schisto-
soma mansoni y Schistosoma japonicum, y 
es eficaz para determinar su viabilidad. Un 
día entero de las heces deben examinarse 
en una sola prueba porque los huevos de 
esquistosoma se desprenden esporádica-
mente.
1. Emulsionar toda la muestra de heces en
H2O.
2. Colar el espécimen a través de una sola
capa de gasa en matraces cónicos de
sedimentación.
3. Dejar reposar el sedimento (aproxima-
damente 20 minutos) y desechar el ma-
terial flotante.
4. Vuelva a suspender el sedimento en
agua.
5. Repita los pasos 3 y 4 hasta que el mate-
rial flotante esté despejado.
6. Deseche el material flotante final y
guarde el sedimento.
7. Examinar microscópicamente todo el
sedimento.
Todo el procedimiento de sediment-
ación de agua debe realizarse dentro de 
las dos horas siguientes al inicio, ya que 
la exposición prolongada de los huevos de 
esquistosoma al agua estimula su eclosión. 
Si se produce la eclosión,las cáscaras 
vacías permanecen en el sedimento y las 
miracidias ciliadas se pueden ver movién-
dose rápidamente.
Método de sedimentación Baerman.
Este método es extremadamente útil 
para concentrar y recuperar larvas de Stron-
gyloides stercoralis. La prueba requiere 
un embudo con un trozo de tubo de goma 
unido a él. Se aplica una abrazadera ajust-
able a través de la tubería y todo el aparato 
se suspende de un soporte de anillo en una 
incubadora de 37ºC. Las larvas se concen-
tran en el sedimento que se acumula en 
la base del tubo de caucho conectado al 
embudo y el fluido que las contiene se con-
duce en un tubo de ensayo para la identifi-
cación microscópica.
1. Emulsionar toda la muestra de heces en
H2O.
2. Colar el espécimen a través de una sola
capa de gasa en matraces cónicos de
sedimentación.
3. Dejar reposar el sedimento (aproxima-
damente 20 minutos) y desechar el ma-
terial flotante.
4. Vuelva a suspender el sedimento en
agua.
5. Repita los pasos 3 y 4 hasta que el mate-
rial flotante esté despejado.
6. Deseche el material flotante final y
guarde el sedimento.
7. Examinar microscópicamente todo el
sedimento.
Flotación por Centrifugación:
Los métodos de flotación concentran 
varias etapas de los parásitos aprovechando 
su gravedad específica. Los sedimentos 
no deseados de residuos en el fondo del 
tubo durante la centrifugación, pero las 
formas de diagnóstico flotan a la superfi-
cie. Los quistes y la mayoría de los huevos 
se pueden recuperar en grandes cantidades 
por este método, pero los trofozoítos, los 
huevos operculados y los huevos de esquis-
tosoma se destruyen o se sedimentan en el 
fondo del tubo.
Método de Flotación de Sulfato de Zinc
1. Mezcle 1 parte de heces en 15 ml de
H2O en un tubo de centrífuga de 15 ml.
2. Centrifugar durante 1 minuto a 2.500
rpm; decantar el material flotante.
3. Añada la solución de sulfato de zinc
(densidad 1.18) hasta que el tubo esté
medio lleno y poner nuevamente en
suspensión el sedimento con una varilla
de aplicación de madera.
4. Llene el tubo hasta la parte superior con
más solución de sulfato de zinc.
5. Centrifugar la suspensión durante 1
minuto a 2.500 rpm. No aplique el fre-
no a la centrífuga o el frasco del tubo,
ya que cualquiera de las maniobras
hace que los huevos o quistes acumula-
dos en la superficie de la superficie del
líquido se hundan.
6. Utilizando un bucle bacteriológico,
retire dos partes de la superficie y
colóquelas en un portaobjetos de vidrio
limpio.
7. Examinar microscópicamente. Se puede
añadir una pequeña gota de solución de
yodo de Lugol para proporcionar con-
traste.
Método de flotación de azúcar 
(Sheather).
La recuperación de los oocistos de 
Cryptosporidium parvum es facilitada por 
este método.
1. Filtrar las heces a través de tres pedazos
de gasa.
2. Coloque 2 ml de filtrado de heces en un
tubo cónico.
3. Llene el tubo hasta la parte superior con
solución de sacarosa.
4. Coloque un cubreobjetos en la parte su-
perior del tubo.
5. Centrifugar a 1.000 rpm durante 5
minutos. Si la muestra de heces es ac-
uosa, no es necesario centrifugar. Deje
reposar el cubreobjetos en la parte
superior de la solución de sacarosa du-
rante 20 minutos.
6. Examine el cubreobjetos microscópica-
mente a 400 X. El plano focal es impor-
tante, ya que los oocistos están situados
en la superficie interna del cubreobje-
tos, y no en el propio portaobjetos. Los
ooquistes aparecen ligeramente de color
rosa sin la adición de alguna mancha.
Son entre ovales a esféricos, varían en
tamaño de 5 a 6 μm de diámetro y no
suelen ser esporulados.
Sangre
Las muestras de sangre fresca, 
heparinizada o citratada son las mejores 
para el examen. Las demoras reducen las 
posibilidades de encontrar los parásitos.
Coloque una gota de sangre en 
una diapositiva, se superponen 
con un cubreobjetos y examine 
microscópicamente las microfilarias o 
tripanosomas vivos. Ambos grupos de 
parásitos son móviles y pueden verse 
nadando entre los elementos sanguíneos 
formados. La motilidad disminuye 
significativamente si la muestra de 
sangre es refrigerada. Si se observa un 
organismo, los frotis deben prepararse y 
teñirse, preferiblemente con solución de 
Giemsa.
Orina
Examen en bruto
Observe y registre el grado de turbidez y 
el color de la muestra.
Examinación microscópica
1. Tomar una gota de orina con una pipeta
Pasteur, preferiblemente desde el fondo
del recipiente, y transferirla a un por-
taobjetos de vidrio.
2. Examinar microscópicamente.
Si se sospecha Trichomonas vaginalis,
la muestra debe estar fresca (<1 hora de 
edad), ya que los trofozoítos pierden rápi-
damente su morfología y motilidad carac-
terísticas.
Sedimentación por centrifugación
1. Divida toda la muestra de orina en tubos
de centrifugación de vidrio cónico de
15 ml.
2. Sedimento a 1.000 rpm durante 5 minu-
tos.
3. Deseche el material flotante.
4. Vuelva a suspender los gránulos con una
pipeta Pasteur y examine microscópica-
mente.
Esputo
Examen en bruto
Observe y registre la apariencia de la 
muestra.
Examinación microscópica
1. Transferir una pequeña cantidad de
esputo con una varilla de aplicación
de madera a un portaobjetos de vidrio
limpio.
2. Añadir una gota de solución salina nor-
mal.
3. Examinar microscópicamente.
Sedimentación por Centrifugación
1. Mezclar el esputo con partes iguales de
NaOH al 3%.
2. Dejar reposar 5 minutos.
3. Sedimento a 1.000 rpm durante 5 minu-
tos y examinar microscópicamente.
Tejidos
Coloque un pequeño trozo de tejido 
entre dos diapositivas de vidrio limpio con 
una pinza, presione para aplastar, luego 
examine bajo un microscopio.
Para examinar los raspados de piel:
1. Coloque las raspaduras en un portaobje-
tos de vidrio limpio.
2. Añadir una gota de solución salina nor-
mal y cubrir con un cubreobjetos.
3. Dejar reposar 30 minutos.
4. Presione el cubreobjetos suavemente
para romper las piezas de la piel y lu-
ego examinar microscópicamente.
Las tenias enteras se deben examinar
cuidadosamente por la presencia de un 
escólex. Se encuentra en el extremo más 
estrecho de la estrobila. Si sólo se dispone 
de proglótides para su observación, prim-
ero deben conservarse en formaldehído al 
10%. Luego, el útero central se inyecta con 
tinta India utilizando una aguja de calibre 
25. Luego se coloca entre dos diapositi-
vas de vidrio, se comprime y se examina
con ayuda de un microscopio de disección.
Con los segmentos de la tenia, se cuentan
las ramas laterales de un lado del tronco
uterino principal (ver Taenia saginata y T.
solium).
Los artrópodos preservados se identifi-
can mejor. La muestra debe colocarse en 
etanol al 70% y transferirse a una placa de 
Petri para su examen cuando deje de ser 
móvil. 
Líquidos Aspirados
Sedimentación por Centrifugación
1. Centrifugue líquido aspirado claro a
1.000 rpm durante 5 minutos en un tubo
de centrífuga cónico.
2. Decantar el material flotante.
3. Examinar microscópicamente el gránulo.
4. Teñir por el procedimiento tricrómico de
Wheatly-Gomori.
Pruebas diversas
Prueba de cinta para Enterobius 
vermicularis (Lombriz intestinal)
Las preparaciones de cinta adhesiva de 
diversos tipos, disponibles comercialmente, 
se usan rutinariamente en el diagnóstico de 
infección por oxiuros. La cinta se coloca 
con el lado pegajoso hacia abajo en el 
perineo, y los huevos o gusanos adultos se 
adhieren a ella. La cinta se examina enton-
ces microscópicamente. Los gusanos adul-
tos también se encuentran ocasionalmente 
en la superficie de las muestras de heces 
formadas. Ocasionalmente, los huevos de 
Taenia spp. se ven en las pruebas de cinta 
adhesiva.
Muestras conservadas
Siempre que se anticipa una demora de 
24 horas o más, se debe conservar la mues-
tra. El conservante a emplear depende del 
tipo de ensayo seleccionado.
Heces: Tinción directa
Método mertiolato-yodo-formaldehído 
(MIF). Una solución de mertiolato, yodo y 
formaldehído (MIF) conserva y tiñe trofo-
zoítos y quistes. Los organismos desarrol-
lan un color naranja, pero estamancha no 
dura. Por lo tanto, una mancha permanente 
también debe hacerse en la misma muestra 
de heces. El MIF no es aceptable para otros 
procedimientos de tinción, tales como la 
tinción tricrómica de WheatlyGomori.
1. Emulsionar 1 g de muestra de heces en
10 ml de solución de MIF.
2. Coloque una gota de heces-MIF- en
emulsión en un portaobjetos de cristal
limpio y examine microscópicamente.
Las heces conservadas en MIF se pueden
concentrar por sedimentación utilizando el 
método formaldehído-acetato de etilo.
Tinte tricrómico Wheatly-Gomori para 
heces conservadas en PVA
Las muestras de heces conservadas en 
alcohol polivinílico (PVA) pueden ser teñi-
das por el tricromo de Wheatly-Gomori, 
que es el mismo que para las heces no 
conservadas, excepto que el fijador de 
Schaudinn no es necesario y el tiempo de 
tinción difiere.
Solución Tiempo 
Etanol-yodo 70% 10 - 20 minutos 
Etanol 70% 3-5 minutos
Etanol 70% 3-5 minutos
Tinción con tricrómico 8-10 minutos
Etanol 90% 1-10 segundos
(Acidificado) 
Sumerja la cubreobjetos en la solución 
de decoloración una o dos veces. Enjuague 
con alcohol al 95% para detener el proceso. 
Los frotis finos se descomponen rápidam-
ente; los frotis más gruesos requieren de 
tres a cinco inmersiones.
Solución Tiempo 
Etanol 95% Enjuague
Etanol 95% 5 minutos
Xylol 10 minutos
Montar el cubreobjetos manchado y 
examinar microscópicamente.
Sangre
Examen microscópico
Un frotis espeso consiste en varias gotas 
de sangre en un portaobjetos, se seca al aire 
y se hemoliza por inmersión en una solu-
ción hipotónica. Este proceso concentra los 
parásitos. Un frotis fino se prepara haci-
endo una película de sangre análoga a la 
utilizada para un recuento diferencial de los 
glóbulos blancos. Se recomienda la tinción 
con Giemsa para ambos preparados.
1. Sumerja la lámina en etanol al 100% o
metanol durante 2-3 minutos.
2. Hacer una solución consistente en 1 gota
de tinción Giemsa concentrada por 1 ml
de agua destilada (pH 7,4) y llenar una
Jarra de Copeland con 50 ml de la mez-
cla.
3. Teñir durante 10-30 minutos.
4. Lavar en agua destilada.
5. Secar al aire la diapositiva.
6. Examinar microscópicamente bajo in-
mersión en aceite. Vista 100 campos
contiguos de un frotis fino.
Concentración por sedimentación: 
Knott Test
La técnica de Knott concentra y con-
serva las microfilarias filarias, que pueden 
ser teñidas por la solución Giemsa e identi-
ficadas morfológicamente.
1. Mezclar 1 ml de sangre heparinizada con
9 ml de formaldehído al 2%.
2. Centrifugar a 2.000 rpm durante 10
minutos.
3. Decantar el material flotante.
4. Examinar microscópicamente el sedi-
mento.
Si las microfilarias están presentes, se
tiñen como sigue.
1. Separe el sedimento sobre un portaobje-
tos de vidrio limpio.
2. Secar durante la noche.
3. Teñir con solución de Giemsa (1 ml de
tinción concentrada de Giemsa en 50 ml 
de agua destilada a pH 7,4).
4. Desmanchar 10-15 minutos en H2O.
5. Secar al aire.
6. Examinar microscópicamente.
Soluciones
Fijador de Schaudinn
• HgCl2, solución acuosa saturada: 666
ml (añadir 80 g de HgCl2 a 1 litro de H2O
desionizada, agitar 3-4 horas y luego filtrar)
• Alcohol etílico 95%: 333 ml
• Solución etanol-yodo al 70%. Añadir
suficiente yodo cristalino a 70% de etanol
para convertir la solución de color ámbar-
marrón; Filtrar antes de usar.
Tinción Tricrómico Wheatly-Gomori
Cromotropo 2R 0,6 g
Verde claro SF 0,3 g
Ácido fosfotúngstico 0,7 g
Mezclar con 1 ml de ácido acético glacial 
y agitar suavemente durante 20 minutos. 
Añadir 100 ml de H2O destilada, luego 
almacenar en botella de color marrón 
oscuro.
Formaldehído tamponado
Solución de formaldehído 37-40% 100 
ml de fosfato sódico (monobásico, 4,0 g 
anhidro)
Fosfato sódico (dibásico, 6,5 g anhidro)
H2O 900 ml
Ajustar el pH de la solución a 7,0
Sulfato de cinc
Sulfato de cinc 333 g
Agua (50˚-55˚C) 1.000 ml
Ajuste el peso específico a 1,18 añadi-
endo más H2O o más cristales de sulfato de 
cinc.
Solución de azúcar (método de Sheather)
Sacarosa 500 g
Agua 320 ml
This Week in Parasitism
Fenol 6,5 g
Solución de mertiolato de yodo 
formaldehído
Tintura de Mertiolato No. 99 (Lilly)
1: 1.000 100 ml
Solución de formaldehído 37-40% 
25 ml
Glicerol 5 ml
H2O 250 ml
Almacene la solución en una botella 
oscura.
Solución de yodo de Lugol
Yodo 5 g
Yoduro de potasio 10 g
H2O 100 ml
Alcohol de polivinilo
El alcohol polivinílico es comercialmente 
disponible.
Fijador de Schaudinn 935 ml
Glicerol 15 ml
Ácido acético glacial 50 ml
Alcohol Polivinílico (polvo) 50 g
H2O 1000 ml
 (TWiP) es un podcast sobre parásitos eucarióticos ini-ciado por Vincent Racaniello y 
Dick Despommier. Daniel Griffin, MD se unió al equipo en enero de 2015 y agregó no 
sólo su experiencia en enfermedades infecciosas, sino que comenzó una nueva 
característica de TWiP, el estudio de caso. Cada semana Daniel pre-senta los síntomas y 
signos de un caso interesante que ha investigado durante su trabajo, sin identificar el 
agente infeccioso. Se anima a los oyentes a enviar sus conjeturas a este misterio 
semanal de la enfermedad infecciosa. Llamamos a este nuevo cambio ‘TWiP reboot’.
El trio TWiP se esfuerza por una conversación informal e informativa sobre los 
parási-tos que es accesible a todos, sin importar cuál sea su origen científico. Como 
profesores de ciencias en la Universidad de Columbia, Dickson y Vincent han dirigido 
laboratorios de investigación enfocados en parásitos y virus. Su entusiasmo por la 
enseñanza les impulsó a ir más allá del aula con los nuevos medios de comunicación. 
TWiP es para todos los que quieran aprender acerca de los parásitos de una manera 
relajada.
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