Secuenciación del ADN

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Secuenciación del ADN
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Método químico 
Es un método de secuenciación que depende de la degradación química específica del ADN que describieron Maxam y Gilbert, en 1977.
 Tiene la ventaja de que puede emplear ADN de doble hebra.
La fragmentación específica del ADN es la base de este método
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Consiste en 5 pasos... 
El marcaje radiactivo del extremo 5’ 
La modificación de una base
La eliminación de la base modificada
Rotura de la cadena de ADN en la desoxirribosa modificada 
El análisis de la secuencia fragmentada por electroforesis en gel de poliacrilamida
Nota: El método está limitado por el poder de resolución del gel de poliacrilamida que, en el contexto histórico de la época, permitía secuenciar aproximadamente 100 bases a partir del punto de marcaje.
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La electroforesis
 Técnica para la separación de moléculas según su movilidad en un campo eléctrico a través de una matriz porosa, la cual finalmente las separa por tamaños moleculares y carga eléctrica, según la técnica que se use.
En el gel sirve para purificar parcialmente moléculas antes de aplicar espectrometría de masas, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), clonación o secuenciación de ADN.
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Antes del tratamiento quimico que genera el corte...
Se marca un fragmento de doble hebra producido por digestión con una enzima de restricción de determinada longitud (ambos extremos)
 Se trata con fosfatasa alcalina para eliminar el fosfato terminal en su extremo 5’.
Se añade un fosfato marcado con 32P para producir una hebra marcada de forma terminal.
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 La fragmentación selectiva de una cadena de ADN marcada se consigue con el uso de cuatro tratamientos químicos independientes.
Para producir patrones específicos de rotura y observación mediante autorradiografía.
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Procedimiento:
“atacar” químicamente al ADN con reactivos que primero dañan y después eliminan una base del nucleótido---> desoxirribosa es un punto debil
Se llevan a cabo reacciones químicas para desprender completamente la desoxirribosa de los enlaces 5’ y 3’ de sus fosfatos.
Reactivos específicos:
 Purinas es el dimetilsulfato.
 Pirimidinas es la hidracina.
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Procedimiento:
Enlace glucosidico de las purina metilada
->inestable y se rompe facil 
Se calienta a pH neutro -> desorribosa libre .
Residuos guanílicos --> alcali suave a 90°C (NaOH)
Libera completamenta la desorribosa de sus enlaces 5' y 3'
Ácidos formico -> bases puricas indiferenciados (A+G)
Residuos adenílicos -> condiciones ligeramente acidas a 0°C (HCl)
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Procedimiento:
Cuando los fragmentos marcados en su extremo se resuelven en gel de poliacrilamida, la autorradiografía contiene un patrón de bandas oscuras y clara. 
 Las bandas oscuras se generan del rompimiento de guaninas (5 veces más rapido)
 guanina/fuerte y adenina/ débil --> la mitad de la información (pero puede haber ambiguedades )
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Determinar las bases de forma diferencial...
Se compara la información que contiene esta columna del gel con una en paralelo en la cual se suprime el rompimiento de guaninas, lo que permite que las adeninas se evidencien.
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La evidencia de corte de adeninas se basa en que los enlaces glucosúricos de las adenosinas metiladas son menos estables que las de las guanosinas.
Se liberan con un tratamiento suave de acido diluido … Esto producirá un patrón de bandas oscuras correspondiente a las adeninas y con bandas claras para las guaninas.
Detección de pirimidinas 
Reacción con hidracina -> roturas en posiciones ocupadas por citosina y timina .
La reaccion se repite con NaCl : la sal suprime la reaccion de la hidracina con la T--> en la autorradiografia solo detecta fragmentos cortados por posiciones ocupadas por C 
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Comparación entre C y C+T
La banda oscura que aparece en ambas radiografias son las roturas en las C
Un enlace presente solo en C + T representa la rotura de T
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Corte en timinas y citocinas
La hidracina reacciona y corta las bases dejando ribosilurea.
 Después de una lisis de hidracina parcial en solución acuosa de hidracina 15 a 18 M a 20°C, el ADN se corta con piperidina 0.5 M.
La amina secundaria y la base libre desplaza todo el producto de la reacción de la hidracina y cataliza la reaccion de B-fosfato 
Patrón final: cortes similares a los de la C y T
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Ventajas:
 Los tratamientos químicos son sencillos de controlar; el ataque químico ideal, una base eliminada por hebra, produce una buena distribución de materiales marcados a través de la secuencia.
Cada base es atacada, tal que en un corrimiento se desplegará cada base individual. La distinción química entre cada base es clara y la secuencia de ambas hebras permite un chequeo más adecuado.
 Es óptimo para ADN que no puede secuenciarse de forma adecuada mediante otros métodos.
 Puede usarse para mapear modificaciones de ADN, como alquilaciones y roturas producidas por carcinógenos, antineoplásicos y otros agentes que tienen como blanco el ADN. 
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Método “didesoxi” de Sanger  
Sanger desarrolló otro método, el cual emplea análogos de dNTP específicos de terminación de cadena. 
Los análogos más utilizados son los didesoxinucleótidos trifosfatados (ddNTP), iguales que los dNTP pero sin el grupo hidroxilo en el carbono 3’ de la desoxirribosa. 
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Estos pueden incorporarse a una cadena de ADN en crecimiento por medio de la ADN polimerasa, pero actúan como terminadores porque, una vez incorporados a la cadena, y al no contar con el OH en el extremo 3’, no permiten que se una otro nucleótido. 
Este método es más rápido y acertado que el método químico de Maxam y Gilbert, por lo que es el utilizado en la actualidad de manera rutinaria en los laboratorios. 
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El proceso consiste en: 
Encontrar diferentes cadenas, tantas como número de bases tenga el fragmento que son copias de la cadena de ADN que se va a secuenciar, cada uno de un tamaño diferente y terminado con la incorporación de un 2’ 3’ didesoxinucleótido. 
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Principio del método “didesoxi”: 
Se aísla y se clona el ADN que se desea secuenciar.
Este ADN se desnaturaliza y se emplea una sola hebra en la secuenciación. 
En la secuenciación se utiliza un iniciador o primer marcado radiactivamente, el cual usualmente es un fragmento de restricción, que suministra el extremo 3’ OH que necesita la ADN polimerasa para continuar la adición de nucleótidos. 
El iniciador y el molde de ADN se alinean para formar un complejo iniciador-molde y la mezcla resultante se divide en cuatro partes. 
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Con 
C
C
C
Con estas mezclas se preparan cuatro tubos de reacción, cada uno con el ADN molde de hebra sencilla que se desea secuenciar, la ADN polimerasa, el iniciador marcado radiactivamente y los cuatro dNTP. 
A cada tubo se le añade uno de los ddNTP en exceso, es decir, en mayor proporción respecto a su dNTP convencional (10:1). 
En cada uno de estos tubos se producirán cadenas de ADN de distintas longitudes, terminando todas en el lugar en el que se incorporó el “didesoxi” correspondiente (ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP) añadido al tubo. 
Continuación... 
Método de Sanger
La reacción requiere la hebra molde de ADN de cadena sencilla marcada radiactivamente, un iniciador, ADN polimerasa y cuatro dNTP. 
La reacción es dividida en cuatro alícuotas, uno para cada base, cada tubo contendrá uno solo de los ddNTP marcados y los otros tres dNTP. 
Se continúa con la polimerización incorporando los nucleótidos en sentido 5’ → 3’. 
Cuando se marcan con flurocromos la reacción total se puede hacer en un solo tubo, ya que el color emitido servirá para diferenciar las cadenas.
En la actualidad, se emplean marcas quimioluminiscentes (fluorescentes) para evitar el manejo de radiactividad. 
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En este caso el marcaje es con fluorocromos en el extremo 5’ del iniciador y la identificación se hace separando los diferentes fragmentos por medio de electroforesis en gel de poliacrilamida, para que, de esta manera, la secuencia pueda leerse directamente sobre el gel, de acuerdo con el patrón de bandas. 
En general, secuencias de entre 15 a 200 nucleótidos desde el sitio del iniciadorpueden determinarse con precisión mediante un solo iniciador e inclusive es posible leer hasta 300 nucleótidos. 
El problema más grave es el apilamiento de bandas, causado por las asas de apareamiento de bases que se forman en el ADN en las condiciones de la electroforesis del gel de acrilamida y que se observan como un número de bandas en la misma posición o inusualmente muy cercanas unas a otras en la electroforesis.
Métodos automatizados
En la actualidad los procedimientos de secuenciación automatizada están basados en el método de Sanger, que suple el marcaje radiacctivo con métodos luminicentes con el uso de fluorocromos.
Se logra un método más directo, fácil, rápido y seguro.
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Microarreglos
Constituyen una distribución ordenada de más de 10 mil genes por cm2 en una pequeña superficie.
Pueden estudiarse simultáneamente mediante hibridación y puede obtenerse una interpretación instantánea de la expresión de múltiples genes.
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¿Qué se necesita?
Un soporte o matriz sólida donde se inmovilicen las sondas de unos cuantos pares de bases de longitud, para su exposición a la muestra que se pretende analizar.
¿En qué se basa?
El fundamento de la técnica se basa en la hibridación de ácidos nucleicos y su detección por fluorescencia mediante análisis de imagen.
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Interpretación de resultados
Debe existir previamente una cédula de identificación (o plantilla) que defina la codificación que se esté manejando de acuerdo con la base de datos que se trabaje.
Para poder identificar los puntos que emiten fluorescencia y poder relacionarlos con el gen correspondiente deben determinarse diferencias significativas que muestren datos relevantes del estudio
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Ensayos de microarreglos
El tipo de ensayo depende de la sonda utilizada.
Los más comunes son los empleados para determinar cambios en los niveles de expresión de genes o análisis de mutaciones o poliformismos.
En las sondas, los oligonucleótidos son ADN sintético de cadena sencilla (15 a 25 o 50 a 120 nucleótidos).
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Bioarreglos
Tienen genes preseleccionados para diagnóstico de enfermedades precisas. 
Su aplicación está dirigida al desarrollo de fármacos, terapias, respuestas a medicamentos y asesoramiento de riesgos de enfermedades o progresión.
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Hibridación Genómica Comparativa (CGH)
Método citogenético molecular basado en la hibridación competitiva por coloración diferencial entre el tejido con la anomalía y sin ella, a partir del análisis de metafases o de ADN genómico. 
Presenta la ventaja de poder analizar muestras de archivo, incluso embebidas en parafina.
La aplicación del ensayo es útil para la clasificación de tumores, el asesoramiento de riesgos y la predicción de la evolución clínica.
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Elementos para un buen ensayo de microarreglos
Se debe contemplar:
El diseño experimental.
El diseño del arreglo que se utilizará y la localización de cada punto en el arreglo.
Las muestras utilizadas y su marcaje.
Los controles.
La hibridación.
Datos generados.
Análisis e interpretación.
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Proceso
1.- Preparar el soporte con los ADN elegidos.
2.- Incubar e hibridar con el ADNc y las marcas fluorescentes.​
3.- Detectar la unión de ADNc mediante tecnología láser.​
4.- Almacenar los datos y analizar las imágenes con métodos estadísticos adecuados.
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Interpretación de los marcajes
Indicará un patrón de colores, en el que de manera general un color A representaría al ADN control, uno B al ADN de la muestra de análisis, uno C indicaría una doble hibridación y el negro, o sin color, la no hibridación.
Según el tipo de arreglo, la localización, así como la intensidad de color, se obtendrá información acerca del estado del gen y de su nivel de expresión.
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Nuevas tecnologías
Esta tecnología revolucionó el área por su aplicación en el entendimiento de las enfermedades complejas y de la medicina personalizada. 
Actualmente, su uso se ha diseminado a campos de la biología básica, estudio del cáncer, diagnósticos de enfermedades, guías de tratamiento e investigación de nuevos fármacos.
Sin embargo, la gran cantidad de información que se genera se vuelve un problema más que una ayuda. No hay un consenso definitivo sobre cómo analizar e interpretar esta información.
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