Dialnet-ColeccionVitrificacionYTransferenciaPostcalentamie-8826176

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ABANICO VETERINARIO E-ISSN 2448-6132 abanicoveterinario@gmail.com 
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Creative Commons (CC BY-NC 4.0) 
 
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Abanico Veterinario. Enero-Diciembre 2022; 12:1-21. http://dx.doi.org/10.21929/abavet2022.18 
Revisión de Literatura. Recibido: 22/12/2021. Aceptado:11/06/2022. Publicado:01/08/2022. Clave:e2021-88. 
https://www.youtube.com/watch?v=GEqdYYBdL7M 
 
Colección, vitrificación y transferencia post-calentamiento de 
embriones equinos producidos in vivo: una revisión de literatura 
Collection, vitrification and post-warming transfer of equine embryos 
produced in vivo: a literature review 
Christian Urías-Castro*1ID, Myriam Boeta-Acosta2 ID 
1Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Autónoma de Sinaloa. Culiacán, Sinaloa, 
México. 2Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional Autónoma de México. 
Ciudad de México. México. *Autor de correspondencia: Christian Urías-Castro, Facultad de Medicina 
Veterinaria y Zootecnia, Universidad Autónoma de Sinaloa. Boulevard San Ángel S/N, Fraccionamiento 
San Benito, Predio Las Coloradas, Culiacán, Sinaloa, México. Email: cesar.urias@uas.edu.mx, 
amyriam@unam.mx 
 Resumen 
Embriones equinos pequeños, iguales o menores a trescientos micrómetros de diámetro (≤ 300 µmØ) 
son obtenidos antes del día siete post ovulación (PO). Embriones grandes, mayores a trescientos 
micrómetros de diámetro (>300 µmØ) son recuperados durante o después del día siete PO. No existen 
experimentos que prueben hasta qué punto los medios de lavado y de colección embrionaria influencian 
la sobrevivencia post vitrificación. Mas conocimiento es necesario acerca de las mezclas de 
criopreservadores; penetrantes o no penetrantes y el efecto que ejercen sobre el índice de 
sobrevivencia embrionaria post vitrificación y el índice de gestación (ISEPVIG). El tipo de porta embrión, 
el tamaño del embrión y el volumen de la solución vitrificante varían entre embriones pequeños y 
grandes. Un índice de transferencia de temperatura (ITT) elevado optimiza en ISEPVIG. El tipo de 
soluciones de mantenimiento y transferencia utilizadas durante la post-vitrificación es un área 
escasamente explorada. El propósito de este estudio es proveer información para ayudar en la 
adaptación de protocolos de vitrificación dependiendo en el tamaño del embrión. Un objetivo adicional 
es facilitar el acceso a información acerca de soluciones empleadas antes y durante la vitrificación; así 
como las soluciones usadas durante las etapas de calentamiento y transferencia embrionaria. 
Palabras Clave: soluciones liquidas, colección de embriones, vitrificación, calentamiento, transferencia 
embrionaria, yeguas, burras. 
Abstract 
Small equine embryos, equal or smaller than three hundred micrometers in diameter (≤ 300 µmØ) are 
collected before the seventh post ovulation (PO) day. Big embryos, larger than three hundred 
micrometers (>300 µmØ) are recovered during or after the seventh PO day. No experiments test the 
type of holding and washing solutions and to what extent they influence the embryo post vitrification 
survival. Further knowledge is needed about the mixture of cryoprotectants; either penetrating or non 
penetrating and the effect they exert over the embryos post vitrification survival and pregnancy rate 
(PVSPR). The type of embryo carrier, the size of the embryo and the volume of the vitrification solution 
vary between small and large embryos. A high temperature transfer index (TTI) optimizes the embryo 
PVSPR. In equids, the type of holding and transfer solutions used during the post vitrification step is an 
area scarcely explored. This study endeavors to provide information to help in the adaptation of 
vitrification protocols depending on the embryo size. An additional objective is to ease the access to 
data about the solutions employed before and during the vitrification; as well as the solutions used during 
the embryo warming and transfer steps. 
Keywords: liquid solutions, embryo collection, vitrification, warming, embryo transfer, mares, jennies. 
 
mailto:abanicoveterinario@gmail.com
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http://dx.doi.org/10.21929/abavet2022.18
https://www.youtube.com/watch?v=GEqdYYBdL7M
https://orcid.org/0000-0001-8812-2683
https://orcid.org/0000-0002-6937-6984
mailto:cesar.urias@uas.edu.mx
ABANICO VETERINARIO E-ISSN 2448-6132 abanicoveterinario@gmail.com 
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INTRODUCCIÓN 
Múltiples factores pueden ser tomados en consideración para establecer programas 
de vitrificación exitosos y obtener altos ISEPVIG. En yeguas/burras una determinación 
exacta de la ovulación es crítica ya que esto permite la recuperación de embriones 
con el tamaño esperado. Si son pequeños, no requerirán la perforación de su cápsula 
embrionaria (Panzani et al., 2012a; Fanelli et al., 2020). Sin embargo, si son grandes 
requerirán preferentemente ser puncionados antes de su vitrificación (Hochi et al., 
1995; Eldridge-Panuska et al., 2005; Scherzer et al., 2011; Wilsher et al., 2019; Fanelli 
et al., 2020; Wilsher et al., 2021). En general, el día PO seleccionado para intentar 
recuperar el embrión repercute en el porcentaje de embriones colectados. La 
recuperación exitosa de embriones equinos es influenciada por múltiples factores: 
edad, número de ciclos de la donadora (Dorado et al., 2020), si el semen usado es 
fresco, refrigerado, o congelado (Meadows et al., 2000), tiempo de inseminación 
relativo a la ovulación (Eldridge-Panuska et al., 2005), época del año; en yeguas, pero 
no en burras (Peréz-Marín et al., 2017; Dorado et al., 2020), numero de ovulaciones 
por ciclo; individual o múltiple (Squires et al., 1985), fertilidad del caballo o burro 
(Peréz-Marín et al., 2017; Dorado et al., 2020) y otros factores (Allen et al., 1985). En 
la mayoría de los casos el promedio de recuperación embrionaria es mayor de 
cincuenta por ciento; sin importar si su intento de colección se realiza ya sea el día 
sexto, séptimo, octavo, o noveno PO (Allen et al., 1985; Freeman et al., 1991; 
Hinrichs, 1990; Eldridge-Panuska et al., 2005). 
Sin embargo, la visualización y manipulación del embrión equino son más fácil 
después del día séptimo PO; debido a su mayor tamaño cuando se compara con 
embriones colectados ya sea durante los días seis, o seis y medio PO. Un número 
pequeño de estudios comparan el porcentaje de preñez obtenidos con embriones 
cuando se usan distintos medios líquidos de colección (Oguri & Tsutsumi, 1974), 
lavado, mantenimiento (Oguri & Tsutsumi, 1974), y transferencia (Carnavale et al., 
2000; Eldridge-Panuska et al., 2005). La información también es escasa cuando se 
compara las distintas soluciones vitrificantes y el porcentaje de preñez logrado 
cuando se emplean cada una de ellas. Hay muchas opciones que pueden ser 
seleccionadas como porta embriones entre ellas están el open pulled straw o OPS 
(Guignot et al., 2015); la micro-pipeta de diámetro fino (Choi et al., 2011); el cryolock 
(Díaz et al., 2016; Ferris et al., 2016; Wilsher et al., 2019); hemi straw (Sanchez et al., 
2017), el Fibreplug-solid surface (Pérez-Marín et al., 2018) y el cryotop (Bottrel et al., 
2019; Bottrel et al., 2020a; Bottrel et al., 2020b). Los embriones equinos pequeños no 
requieren contacto directo con el nitrógeno líquido para sobrevivir el proceso de 
criopreservación aun si se vitrifican en un volumen grande de solución p.ej. 30 micro 
litros (uL) (Eldridge-Panuska et al., 2005; Fanelli et al., 2020). Por otro lado, si los 
embriones equinos son grandes, aparte de la perforación de su capsula (Wilsher et 
al., 2021) y la extracción de su líquido blastocélico (Sanchez et al., 2017; Herrera,2021) preferentemente requerirán contacto directo con el nitrógeno líquido (Díaz et al., 
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https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2011.08.032
https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2020.05.020
https://doi.org/10.1071/RD9950113
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https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2004.06.015
https://doi.org/10.1111/j.1439-0531.2011.01795.x
https://doi.org/10.1111/evj.13039
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https://doi.org/10.3390/ani10111967
http://www.havemeyerfoundation.org/images/monograph1.pdf#page=72
https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2004.06.015
https://doi.org/10.1016/j.livsci.2017.10.011
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https://doi.org/10.1111/j.2042-3306.1985.tb04604.x
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https://doi.org/10.3390/ani10111967
https://doi.org/10.1111/j.2042-3306.1985.tb04594.x
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https://doi.org/10.1016/0093-691X(91)90348-H
https://doi.org/10.1016/0093-691X(90)90056-Y
https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2004.06.015
https://doi.org/10.1530/jrf.0.0410313
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https://doi.org/10.1016/S0093-691X(00)00405-2
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https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2004.06.015
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https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2015.10.039
https://doi.org/10.1016/j.jevs.2016.04.047
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https://doi.org/10.1111/evj.12777
https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2018.11.011
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https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2019.11.013
https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2020.04.026
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https://doi.org/10.1111/evj.13400
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https://doi.org/10.1016/j.jevs.2016.10.004
https://doi.org/10.1007/978-1-0716-0783-1
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https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2015.10.039
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2016; Sanchez et al., 2017; Herrera, 2021). Al parecer cuando se trabaja con 
embriones equinos grandes (aparte de la perforación de su cápsula y la extracción de 
su líquido blastocélico), cuando se compara entre los sistemas abiertos y cerrados 
los cuales permiten el contacto directo e indirecto con el nitrógeno líquido durante la 
etapa de vitrificación; que los sistemas abiertos permiten un ITT mayor por lo que se 
aumenta el ISEPVIG (Sanchez et al., 2017). Además, el volumen de líquido usado 
para mantener embriones grandes durante la etapa de vitrificación debe 
preferentemente ser pequeño (usualmente < 1 uL) para incrementar el ITT (Díaz et 
al., 2016; Sanchez et al., 2017). Otro factor que debe influenciar la sobrevivencia 
embrionaria es el diámetro de la micro pipeta empleada para perforar su cápsula; sin 
embargo, existen datos limitados y no claros acerca de este tema (Choi et al., 2010; 
Díaz et al., 2016; Ferris et al., 2016; Sanchez et al., 2017; Wilsher et al., 2021). 
Finalmente, las soluciones líquidas seleccionadas para transferir el embrión al útero 
de la yegua o burra deben ser analizado de manera cuidadosa. Mas investigación es 
requerida en el área de reproducción y criobiología donde los embriones equinos son 
un modelo fácil para trabajar; ya que estos se pueden colectar de manera fácil, 
manipularse y transferirse de regreso al útero de yeguas, burras, mulas y/o 
burdéganas. El objetivo del presente estudio es proveer una guía fácil acerca de los 
factores relevantes asociados con la vitrificación embrionaria, ambos: en yeguas y 
burras, establecer áreas donde existe información limitada o es ausente, y promover 
ideas que ayuden a realizar investigaciones futuras en el área de criobiología y 
reproducción equina. 
Porcentaje de embriones recuperados en yeguas y burras en relación al día de 
ovulación 
Existe mucha variación en el porcentaje de embriones colectados en yeguas cuando 
se toma como consideración el día en el cual se intenta recuperarlos. Por ejemplo; en 
el sexto, séptimo, u octavo día PO el porcentaje de recuperación reportado varía de 
cero (Battut et al., 1997), sesenta y dos (Camillo et al., 2003), a cien por ciento (Hochi 
et al., 1995) respectivamente. Sin embargo, porcentajes de recuperación cercanos o 
mayores a cincuenta por ciento son indicados por la mayoría de los estudios (Allen et 
al., 1985; Iuliano et al., 1985; Squires et al., 1985; Hinrichs, 1990; Freeman et al., 1991; 
Hochi et al., 1995; Maclellan et al., 2002; Eldridge-Panuska et al., 2005; Moussa et al., 
2005; Derbala & Abdou, 2017; Silva et al., 2018; Roser et al., 2020). Cuando la 
colección embrionaria se intenta temprano (día sexto PO), el porcentaje de 
recuperación varía de cero (Battut et al., 1997) a ochenta y dos por ciento (Hochi et 
al., 1995). La dramática diferencia previa entre reportes podría ser parcialmente 
atribuida a la experiencia del personal ya que la búsqueda y observación embrionaria 
son más difíciles durante la etapa de desarrollo temprano (día sexto PO) cuando el 
tamaño del embrión es usualmente ≤ 300 µmØ. Aunque no es posible hacer 
comparaciones directas en el porcentaje de recuperación promedio debido a la 
diferencia de metodología y número de animales usados en cada estudio, en general; 
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https://doi.org/10.1007/978-1-0716-0783-1
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https://doi.org/10.1530/REP-10-0141
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https://doi.org/10.1016/j.jevs.2016.04.047
https://doi.org/10.1016/j.jevs.2016.10.004
https://doi.org/10.1111/evj.13400
https://doi.org/10.1111/j.2042-3306.1997.tb05102.x
https://doi.org/10.1046/j.1439-0531.2003.00444.x
https://doi.org/10.1071/RD9950113
https://doi.org/10.1071/RD9950113
https://doi.org/10.1111/j.2042-3306.1985.tb04594.x
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https://doi.org/10.2527/jas1985.601258x
https://doi.org/10.1111/j.2042-3306.1985.tb04604.x
https://doi.org/10.1016/0093-691X(90)90056-Y
https://doi.org/10.1016/0093-691X(91)90348-H
https://doi.org/10.1071/RD9950113
https://doi.org/10.1016/S0093-691X(02)00766-5
https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2004.06.015
https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2005.04.001
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http://dx.doi.org/10.20431/2455-2518.0304003
https://doi.org/10.1590/1678-5150-PVB-4651
https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2019.10.030
https://doi.org/10.1111/j.2042-3306.1997.tb05102.x
https://doi.org/10.1071/RD9950113
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se muestra que el porcentaje de colección exitoso tiende a ser menor cuando se 
intenta temprano (día sexto PO comparado con días posteriores). Interesantemente, 
ha sido posible incrementar el porcentaje de recuperación embrionaria mediante 
modificaciones en la técnica decolección; por ejemplo, permitiendo que la solución 
líquida de flushing o recuperación permanezca unos minutos más dentro del útero 
(Hinrichs, 1990; Alvarenga et al., 1993). 
Aparte de mostrar un alto grado de variación, los datos relacionados con el porcentaje 
de recuperación embrionaria por día son muy limitados en burras (Allen et al., 1985; 
Vendramini et al., 1997; Camillo et al., 2010; Peña-Alfaro et al., 2014; Bottrel et al., 
2017; Pérez- Marín et al., 2017; Ottmann et al., 2018; Dorado et al., 2020). Durante el 
día sexto PO, el porcentaje de recuperación embrionaria varía de cuarenta y tres 
(Vendramini et al., 1997) a setenta y cinco (Dorado et al., 2020). En el día siete PO, la 
recuperación reportada va del doce (Camillo et al., 2010) a ochenta por ciento (Dorado 
et al., 2020). Alternativamente, si se intenta recuperar el embrión ya sea el día ocho o 
el día nueve PO, el porcentaje de recuperación embrionaria es por lo general superior 
al cincuenta por ciento (Camillo et al., 2010; Peña-Alfaro et al., 2014; Dorado et al., 
2020). Como se mencionó previamente, el porcentaje de recuperación embrionaria en 
équidos puede ser influenciado por muchos factores tales como el número de ciclos 
estrales de la donadora (Dorado et al., 2020), el tipo de semen utilizado para inseminar 
a la hembra (Meadows et al., 2000), la relación entre el tiempo de inseminación y el 
tiempo de ovulación (Eldridge-Panuska et al., 2005), la época del año en yeguas pero 
no en burras (Peréz-Marín et al., 2017; Dorado et al., 2020), el número de ovulaciones 
por ciclo estral (Squires et al., 1985), la fertilidad de los machos utilizados (Peréz-
Marín et al., 2017; Dorado et al., 2020) entre otros (Allen et al., 1985). 
La relación entre el día de recuperación y el tamaño del embrión 
En yeguas, el tamaño del embrión es influenciado de manera dramática por el día PO 
seleccionado para implementar su recuperación (Betteridge et al., 1982; Hochi et al., 
1995; Eldridge-Panuska et al., 2005; Choi et al., 2010; McCue et al., 2010; Díaz et al., 
2016; Guignot et al., 2016; Wilsher et al., 2019). Por lo general, si el embrión es 
colectado ya sea durante el día sexto o sexto y medio PO, este será ≤ 300 µmØ 
(Iuliano et al., 1985; Freeman et al., 1991; Eldridge-Panuska et al., 2005; Hudson et 
al., 2006; Choi et al., 2010; Guignot et al., 2015; Pérez- Marín et al., 2017; Pérez-Marín 
et al., 2018; Silva et al., 2018). Por el contrario, cuando la recuperación embrionaria 
se realiza durante el día siete, siete y medio; ocho, ocho y medio; o nueve, estos por 
lo general serán >300 µmØ (Hochi et al., 1995; McCue et al., 2010; Díaz et al., 2016; 
Pérez- Marín et al., 2017; Wilsher et al., 2019). 
Estudios en burras que describan la relación entre el tamaño del embrión y el día 
durante el cual fueron colectados son escasos. Sin embargo, parece que contrario a 
lo reportado en yeguas un alto porcentaje de los embriones colectados durante el día 
séptimo, o séptimo y medio PO son todavía < 300 µmØ (Vendramini et al., 1997; 
Panzani et al., 2012b; Bottrel et al., 2017; Pérez- Marín et al., 2017; Pérez-Marín et 
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https://doi.org/10.1016/0093-691X(90)90056-Y
https://doi.org/10.1111/j.2042-3306.1993.tb04841.x
https://doi.org/10.1111/j.2042-3306.1985.tb04594.x
https://doi.org/10.1016/S0093-691X(97)82536-8
https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2009.11.024
https://doi.org/10.1016/j.jevs.2013.10.135
https://dialnet.unirioja.es/servlet/articulo?codigo=6326854
https://dialnet.unirioja.es/servlet/articulo?codigo=6326854
https://doi.org/10.1016/j.livsci.2017.10.011
https://doi.org/10.1016/j.jevs.2018.05.085
https://doi.org/10.3390/ani10111967
https://doi.org/10.1016/S0093-691X(97)82536-8
https://doi.org/10.3390/ani10111967
https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2009.11.024
https://doi.org/10.3390/ani10111967
https://doi.org/10.3390/ani10111967
https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2009.11.024
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al., 2018; Bottrel et al., 2019; Bottrel et al., 2020b; Dorado et al., 2020; Fanelli et al., 
2020). Cuando la colección del embrión burro es intentada ya sea el día ocho PO o 
posteriormente, su diámetro es usualmente cercano a o mayor a 500 µmØ (Panzani 
et al., 2012a; Pérez- Marín et al., 2017; Bottrel et al., 2019; Dorado et al., 2020). 
Protocolos que incluyen o excluyen la punción de la cápsula embrionaria (CE) 
antes de la vitrificación 
La cápsula no requiere ser puncionada antes del proceso de vitrificación si el tamaño 
del embrión caballo es ≤300 µmØ, y el ISEPVIG obtenido con estos embriones es 
usualmente superior al treinta por ciento (Eldridge-Panuska et al., 2005; Hudson et al., 
2006; Choi et al., 2011; Analizado previamente por Urías-Castro & Boeta, 2020). La 
mayoría de los reportes acerca de la vitrificación de embriones equinos indican que 
cuando el embrión caballo es ˃300 µmØ este deberá ser puncionado para perforar 
su CE y además su liquido blastocélico extraído para optimizar el ISEPVIG (Choi et 
al., 2011; Guignot et al., 2015; Díaz et al., 2016; Ferris et al., 2016; Sánchez et al., 
2017; Wilsher et al., 2019; Analizado previamente por Urías-Castro & Boeta, 2020). 
Sin embargo, cuando se toman en consideración más categorías en términos de 
tamaño embrionario; se observa que la vitrificación de embriones equinos de entre 
300 y 550 µmØ de tamaño (≤ 550 µmØ); la perforación de la CE sin aspiración de su 
líquido blastocélico resulta en porcentajes de gestación superiores al 75% (Wilsher et 
al., 2021). 
Estudios que reporten el ISEPVIG cuando se usan embriones burro son escasos. El 
trabajo disponible muestra que la vitrificación de embriones burro ≤300 µmØ resultaen porcentajes de gestación que varían de treinta y seis por ciento al día catorce de 
gestación (D14), a veintisiete por ciento al día veinticinco de gestación (D25); lo que 
sugiere que si el embrión burro es ≤300 µmØ, la punción de la CE y la extracción del 
líquido blastocélico no son esenciales (Panzani et al., 2012b). Proyectos de 
investigación que describan la punción de la CE de embriones burro y la extracción 
de su líquido blastocélico son limitados (Ottmann et al., 2018). La pregunta de si los 
embriones burro ˃300 µmØ requieren la punción de la CE y extracción del líquido 
blastocélico para incrementar el ISEPVIG ha sido contestada de manera indirecta 
solamente, ya que la punción de la CE y la extracción del líquido blastocélico 
resultaron en un porcentaje alto de sobrevivencia embrionaria en vitro (Ottmann et al., 
2018; previamente analizado por Urías-Castro & Boeta, 2020). 
Infusión intrauterina de soluciones líquidas para colectar embriones equinos 
Algunos de los primeros estudios en describir la colección de embriones equinos 
reportaban el uso de solución salina fisiológica, esta última contenía dos por ciento de 
polvo de gelatina (Oguri & Tsutsumi, 1974). Hoy en día, el uso de lactato de Ringer 
(Alvarenga et al., 1993; Barfield et al., 2008; Sánchez et al., 2017; Wilsher et al., 2019); 
cuya composición es cercana a la solución Hartmann también ha sido descrita 
(Guignot et al., 2015). Otra solución líquida empleada para recuperar embriones 
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equinos es la solución salina buferada con fosfato Dulbeccos o DPBS/PBS (Alvarenga 
et al., 1993; Landim E Alvarenga et al., 1993). Una solución salina buferada con fosfato 
Dulbeccos modificada (DMPBS) combinada con suero fetal de Becerra (FCS) ha sido 
reportada por Hinrichs (1990). La DMPBS puede ser suplementada con suero 
inactivado por calor de torete castrado (McKinnon & Squires, 1988); o albumina de 
suero bovino (BSA) más antibióticos (Battut et al., 1997). La DMPBS mezclada ya sea 
con uno por ciento de FCS o suero de becerra más glucosa y piruvato, ha sido descrita 
también como una solución líquida para recuperar embriones equinos (Carnavale et 
al., 2000). La solución flushing de tipo comercial Emcare® (Eldridge-Panuska et al., 
2005) y la solución flushing Vigro® (Hudson et al., 2006) son otras alternativas 
reportadas como soluciones líquidas para recuperar embriones. 
En burras, la solución de lactato de Ringer es la reportada más frecuentemente como 
solución de recuperación embrionaria (Panzani et al., 2012a; Peña-Alfaro et al., 2014; 
Panzani et al., 2016; Pérez-Marín et al., 2018; Bottrel et al., 2019; Bottrel et al., 2020a; 
Bottrel et al., 2020b). Otra alternativa reportada es la DPBS (Camillo et al., 2010). 
Soluciones líquidas usadas para mantener los embriones equinos recuperados 
Los soluciones de mantenimiento más simples en términos de composición son ya 
sea la solución salina con dos por ciento de polvo de gelatina, o la solución de lactato 
de Ringer con suero de yegua (1:1, v/v) y con mil unidades internacionales de 
penicilina por mililitro (Oguri & Tsutsumi, 1974). Una alternativa más completa en 
términos de composición es el medio de Ham F10, este último es complementado con 
diez por ciento de FCS mas uno porciento de penicilina/estreptomicina; este medio 
es gasificado con cinco por ciento de dióxido de carbono, oxigeno, y noventa por ciento 
de nitrógeno (Carnavale et al., 2000). Los medios de mantenimiento comercial Vigro® 
(Hudson et al., 2006) y Syngro® (Barfield et al., 2009) también han sido descritos. 
Investigadores franceses han trabajado con el medio EHM, el cual es una solución 
liquida a base de PBS que contiene cuatro gramos de BSA por litro (Guignot et al., 
2015). Investigadores de la Universidad del estado de Colorado han reportado la 
utilización del medio DMEM/F12 (sales inorgánicas, aminoácidos, vitaminas, 
antibióticos y otros) suplementado con veinte por ciento de suero fetal bovino – 
DMEM/F12/FBS (Ferris et al., 2016). El DMPBS sin calcio y magnesio, 
complementado con diez por ciento de FBS y cincuenta microgramos de gentamicina 
por mililitro ha sido empleado por Sánchez et al. (2017). Alternativamente, el medio 
M-199 Hepes suplementado con diez por ciento de FBS mas uno por ciento de 
antibióticos (100 U/mL de penicilina y 100 µg/mL de estreptomicina) ha sido descrito 
como una solución líquida para mantener embriones (Wilsher et al., 2019). 
El PBS y el lactado de Ringer han sido reportados como medios de mantenimiento 
para embriones burro (Camillo et al., 2010). El uso de la solución comercial Emcare 
Holding Solution® está documentada también por varios investigadores como solución 
de mantenimiento para embriones burro (Camillo et al., 2010; Panzani et al., 2012a). 
Otra alternativa usada como solución de mantenimiento con embriones burro es la 
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Vitrocell®, la cual contiene cero punto cuatro por ciento de BSA (Peña-Alfaro et al., 
2014). El medio de mantenimiento Syngro® ha sido empleado con embriones burro 
antes de transferirlos al útero de mulas (Bottrel et al., 2017). El uso de un medio de 
mantenimiento isotónico (IVM-Technologies) ha sido reportado por Pérez-Marín et al. 
(2018). Recientemente, Bottrell y su equipo ha reportado el uso de TCM-199 HEPES 
complementado con veinte por ciento de FCS como un medio de mantenimiento para 
embriones burro (Bottrel et al., 2019). 
Medio para el lavado y manipulación embrionaria 
Una solución líquida que ha sido empleada en yeguas para lavar y manipular los 
embriones colectados es la PBS; esta es usualmente suplementada con suero de 
origen animal como el suero fetal de becerra FCS (Alvarenga et al., 1993). El uso de 
PBS sin calcio y magnesio, suplementada con piruvato de sodio, glucosa, y FCS ha 
sido documentada por Eldridge-Panuska et al. (2005). Una solución de PBS que 
contiene albumina de suero bovino (BSA) también es reportada como un medio para 
lavar/manipular embriones (Guignot et al., 2015). Otras opciones para el lavado de 
embriones son la solución Vigro® (Hudson et al., 2006; Barfield et al., 2008) y el medio 
Syngro® (Barfield et al., 2009). El uso de DMEM/F12 suplementado con veinte por 
ciento de suero fetal bovino (FBS) ha sido reportado por Ferris et al. (2016). Una 
solución denominada Dulbecco’s PBS (DPBS) con diez por ciento de FCS ha sido 
empleada para lavar embriones equinos por los investigadores de la universidad del 
estado de Colorado (Carnavale et al., 2000). Otro medio para lavar embriones que ha 
sido documentado es el M-199 HEPES, este último conteniendo diez por ciento de 
FBS, penicilina y estreptomicina (Wilsher et al., 2019). 
Para embriones de asnos, la Emcare Holding Solution® ha sido descrita de manera 
frecuente para lavar/manipular embriones (Camillo et al., 2010; Panzani et al., 2012a; 
Panzani et al., 2012b; Panzani et al., 2016). El medio de mantenimiento Syngro® es 
empleado como solución de lavado embrionario por varios investigadores (Bottrel et 
al., 2017; Pérez- Marín et al., 2017; Bottrel et al., 2019; Bottrel et al., 2020a; Bottrel et 
al., 2020b). Alternativamente, el PBS (Camillo et al., 2010), el lactato de Ringer 
(Camillo et al., 2010), y el medio de mantenimiento isotónico han sido descritos 
también como soluciones para el lavado embrionario en asnos (Pérez-Marín et al., 
2018). 
Tamaño de la micro-pipeta y punción de la cápsula embrionaria (CE) 
No hay estudios que de manera formal correlacionen en tamaño de la punta de la 
micro-pipeta usada para perforar la CE y su asociación con el ISEPVIG. La mayoría 
de los experimentos donde se punciona la CE son diseñados con puntas de micro-
pipeta iguales o menores a los dieciséis micrómetros de diámetro (umØ); tal como ha 
sido descrito en distintos estudios (Choi et al., 2010; Choi et al., 2011; Hinrichs & Choi, 
2012; Guignot et al., 2015; Díaz et al., 2016; Sánchez et al., 2017). Solo un par de 
investigadores han demostrado la sobrevivencia embrionaria como reflejo de los 
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https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2015.10.039
https://doi.org/10.1016/j.jevs.2016.10.004
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porcentajes de gestación, después de puncionar la CE con puntas de micro-pipetas 
mayores a los dieciséis umØ (Wilsher et al., 2019). Se han reportado gestaciones aún 
después de puncionar le CE con agujas calibre veinticinco (Ferris et al., 2016). Por 
otro lado; cuando se trabaja con embriones de burra, estos generalmente son 
vitrificados en una etapa de desarrollo en la cual son ≤ 300 umØ, y por ende no se 
requiere ni la punción ni la reducción de tamaño (Panzani et al., 2012b; Pérez-Marín 
et al., 2018; Bottrel et al., 2019). El sistema de micro manipulación Piezo drill ha sido 
descrito en un estudio donde se emplearon embriones fenotipo burro grandes >300 
µmØ (Ottmann et al., 2018), y este sistema por lo general emplea micro-pipetas con 
una punta de entre 7-15 umØ (Choi et al., 2011; Hinrichs & Choi, 2012; Hiraoka & 
Kitamura, 2015). Sin embargo, en el estudio hecho por Ottman y sus colaboradores, 
los embriones no fueron transferidos al útero de hembras después de ser calentados 
y solo la sobrevivencia in vitro fue reportada (Ottmann et al., 2018). Un estudio reciente 
ha reporto la punción de blastocitos equinos con aguja (punta < 1µm) ultra fina 
(Wilsher et al., 2021). 
 
Soluciones criopreservadoras empleadas para vitrificar embriones equinos 
La mayoría de los protocolos empleados para vitrificar embriones caballo utilizan una 
mezcla de criopreservadores penetrantes tales como el dimetil sulfoxido (DMSO), 
etilen glicol y glicerol. Otros protocolos incluyen la colocación del embrión en una 
mezcla de criopreservadores penetrantes tales como el etilen glicol, o etilen glicol y 
DMSO; los cuales son mezclados con criopreservadores no penetrantes tales como 
la galactosa o la sucrosa. Por ejemplo, el embrión es puesto en una primera solución 
que contiene una baja concentración de glicerol, y después es removido de esta última 
solución y puesto de manera sucesiva en soluciones que contienen concentraciones 
mayores de glicerol y etilen glicol (Eldridge-Panuska et al., 2005; Díaz et al., 2016; 
Sánchez et al., 2017; Pérez-Marín et al., 2018). Por otra parte, la vitrificación de 
embrionescaballo con una solución que contiene etilen glicol y DMSO también ha sido 
descrita (Choi et al., 2011; Sánchez et al., 2017; Wilsher et al., 2019). En estos últimos 
protocolos se empieza poniendo el embrión en una solución con una concentración 
baja de etilen glicol y DMSO. Posterior al paso inicial, el embrión es colocado de 
manera secuencial en soluciones con una concentración mayor de los 
criopreservadores. Otras soluciones criopreservadoras utilizadas para vitrificar 
embriones caballo contienen una baja concentración de etilen glicol (solución inicial), 
y posterior a esto usan otra solución final denominada solución vitrificante. La solución 
final es compuesta de galactosa y es adicionada con altas concentraciones de etilen 
glicol (Choi et al., 2011; Guignot et al., 2015; Ferris et al., 2016; Guignot et al., 2016). 
Para la vitrificación de embriones fenotipo burro, un protocolo ha sido adaptado a partir 
de los estudios iniciales hechos para vitrificar embriones fenotipo caballo por parte de 
Eldridge-Panuska et al. (2005); este protocolo consiste típicamente de tres etapas o 
pasos, con una solución específica para cada paso. Por ejemplo, la solución uno 
contiene solamente glicerol; la solución dos tiene una mezcla de glicerol y etilen glicol; 
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https://doi.org/10.1016/j.jevs.2012.05.047
https://doi.org/10.1111/evj.12777
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https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2018.11.011
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https://dx.doi.org/10.1007%2Fs10815-015-0597-9
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https://doi.org/10.1016/j.jevs.2018.05.085
https://doi.org/10.1111/evj.13400
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https://doi.org/10.1016/j.jevs.2016.10.004
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y la solución tres contiene concentraciones mayores tanto de glicerol como de etilen 
glicol (Panzani et al., 2012b; Panzani et al., 2016; Pérez-Marín et al., 2018). Otros 
estudios donde se vitrificaron embriones fenotipo burro fueron diseñados al tomar en 
cuenta la investigación hecha por Campos-Chillon et al. (2009). Estos utilizaron 
soluciones que contenían etilen glicol, y etilen glicol complementado con galactosa 
(Ottmann et al., 2018; Pérez-Marín et al., 2018). Otros han usado una solución inicial 
que contiene una mezcla de etilen glicol y DMSO; después de usar esta última, una 
segunda solución que contiene etilen glicol, DMSO, y sucrosa es empleada (Bottrel et 
al., 2019; Bottrel et al., 2020a; Bottrel et al., 2020b). 
Porta embriones y volúmenes de carga empleados durante el proceso de 
vitrificación 
Popotes no irradiados de cloruro de polivinilo con capacidad de cero punto veinticinco 
mililitros (mL) fueron uno de los primeros porta embriones descritos en especies 
equinas y han sido usados de manera frecuente a partir de entonces (Oberstein et al., 
2001; Eldridge-Panuska et al., 2005; Hudson et al., 2006; Hendriks & Stout, 2010; Choi 
et al., 2011; Hendriks et al., 2015; Sánchez et al., 2017). Opuesto a los popotes de 
polivinilo los cuales emplean un volumen grande de solución durante el paso final de 
vitrificación; el sistema cryolock permitió a los investigadores vitrificar embriones 
fenotipo caballo en un volumen líquido pequeño (Díaz et al., 2016; Ferris et al., 2016; 
Wilsher et al., 2019). La vitrificación de embriones equinos usando volúmenes líquidos 
pequeños es conseguida con porta embriones tales como el open pulled straw 
(Oberstein et al., 2001; Moussa et al., 2005; Guignot et al., 2015; Guignot et al., 2016), 
el fibreplug (Pérez-Marín et al., 2018), el cryoloop (Oberstein et al., 2001), la punta de 
micro-pipeta de micro carga de diámetro fino o fine diameter microloader pipette tip 
(Choi et al., 2011), el cryoleaf (Scherzer et al., 2011), el hemi straw (Sánchez et al., 
2017) y el stripper tip (Sánchez et al., 2017). 
Los embriones fenotipo caballo pueden ser vitrificados utilizando diferentes volúmenes 
de soluciones líquidas. Los volúmenes usados para cargar el embrión en el porta 
embriones varían desde cincuenta (Oberstein et al., 2001) a treinta uL (Eldridge-
Panuska et al., 2005; Hudson et al., 2006; Hendriks & Stout, 2010; Choi et al., 2011; 
Hendriks et al., 2015). Volúmenes de carga cercanos a los tres o dos uL han sido 
reportados (Moussa et al., 2005; Guignot et al., 2015; Sánchez et al., 2017; Pérez-
Marín et al., 2018; Wilsher et al., 2019). Volúmenes para cargar embriones cercanos 
o menores a un uL son descritos también (Oberstein et al., 2001; Díaz et al., 2016; 
Sánchez et al., 2017). 
Cuando se trabaja con embriones fenotipo burro, el popote de cloruro de polivinilo no 
irradiado con capacidad de cero punto veinticinco mL ha sido reportado como porta 
embrión (Panzani et al., 2012b; Fanelli et al., 2020). Distintos porta embriones con 
capacidad de volumen pequeño han sido descritos de manera reciente para la 
vitrificación de embriones fenotipo burro; estos incluyen el cryotop (Bottrel et al., 2019; 
Bottrel et al., 2020a; Bottrel et al., 2020b), el open pulled straw (Ottmann et al., 2018) 
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y el fibreplug (Pérez-Marín et al., 2018). Un volumen de solución líquida de treinta uL 
ha sido usado para vitrificar embriones fenotipo burro (Panzani et al., 2012b); pero 
porta embriones de bajo volumen de carga, empleando volúmenes que van de tres a 
menos de un uL han sido utilizados también (Pérez-Marín et al., 2018; Bottrel et al., 
2019; Bottrel et al., 2020a; Bottrel et al., 2020b). 
Soluciones líquidas usadas para calendar embriones 
Con poca variación entre protocolos, el medio líquido usado para calendar embriones 
caballo usualmente contiene una concentración igual o menor a cero punto tres molar 
de sucrosa. Los embriones caballo son calentados y mantenidos por alrededor de un 
minuto en el medio líquido anteriormente mencionado. Después de lo anterior, los 
embriones son puestos en un segundo medio; este último tiene una concentración 
cercana o menor a cero punto quince molar de sucrosa; finalmente, el embrión es 
puesto en un medio líquido el cual no contiene sucrosa durante el paso final del 
proceso de calentamiento (Choi et al., 2011; Guignot et al., 2015; Ferris et al., 2016; 
Guignot et al., 2016; Wilsher et al., 2019). Un protocolo de calentamiento de un solo 
paso fue reportado por Eldridge-Panuska et al. (2005) en este se utilizaba una solución 
de galactosa de cero punto cinco molar. El protocolo de calentamiento de un solo paso 
ha sido implementado también en otros estudios (Choi et al., 2011; Díaz et al., 2016; 
Sánchez et al., 2017). Algunos investigadores calientan el embrión equino usando un 
protocolo de tres pasos; en el primer paso, el embrión es colocado en una solución 
uno molar de galactosa; en el segundo paso, el embrión permanece en una solución 
cero punto cinco molar de galactosa; y durante el tercer paso, el embrión es colocado 
en una solución líquida de cero punto veinticinco molar de galactosa (Campos-Chillon 
et al., 2009; Choi et al., 2011). 
Así como se ha descrito para embriones fenotipo caballo (Eldridge-Panuska et al., 
2005), el calentamiento de embriones fenotipo burro se lleva a cabo con un medio o 
solución de cero punto cinco molar de galactosa en lo que se denomina protocolo de 
calentamiento directo de un solo paso (Panzani et al., 2012b; Panzani et al., 2016). 
Otros protocolos emplean una solución de calentamiento de cero punto veinticinco 
molar de galactosa (Pérez-Marín et al., 2018). En algunos protocolos de 
calentamiento, el embrión fenotipo burro es colocado de manera secuencial en 
soluciones líquidas las cuales tienen concentraciones decrecientes de sucrosa 
(Ottmann et al., 2018; Pérez-Marín et al., 2018; Bottrel et al., 2019; Bottrel et al., 
2020a). Un estudio reciente ha comparado la calidad post vitrificación (calentados) de 
los embriones fenotipo burro cuando se emplea ya sea el protocolo de tres pasos con 
diluciones de sucrosa o cuando se usa el protocolo de un solo paso con solución de 
sucrosa (Bottrel et al., 2020b). 
Medios líquidos utilizados para la transferencia intrauterina de embriones 
equinos 
Algunos componentes de las soluciones líquidas usadas para transferir embriones 
equinos fueron descritos por primera vez durante la década de los setenta por Oguri 
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& Tsutsumi (1974). En este estudio, se reportaron dos soluciones de transferencia 
diferentes: una solución salina que contenía dos por ciento de polvo de gelatina y una 
solución de lactato de Ringer suplementada con suero de yegua y antibióticos. Hay 
dos técnicas de transferencia embrionaria post calentamiento reportadas por 
Eldridge-Panuska et al. (2005). La primera emplea PBS mas diez por ciento de FCS 
como un medio de transferencia, una vez que se remueve el embrión de la solución 
con galactosa que se empleó durante el calentamiento. La segunda es una técnica de 
transferencia directa post calentamiento. Esta última técnica consiste en mezclar la 
solución vitrificante que contiene el embrión (treinta micro litros de tres punto cuatro 
molar de glicerol y cuatro punto seis molar de etilen glicol) con dos columnas de líquido 
(de cero punto cinco molar de galactosa en PBS) de noventa micro litros cada una 
(Eldridge-Panuska et al., 2005). En la técnica anterior, tanto la solución vitrificante 
como la de calentamiento son mezcladas en la pajilla o popote durante el proceso de 
calentamiento, formando una solución diluida que contiene el embrión el cual es 
posteriormente transferida al útero de la yegua (Hudson et al., 2006). El medio de 
mantenimiento Syngro® ha sido reportado como una solución de transferencia para 
embriones también (Barfield et al., 2008; Sánchez et al., 2017). Investigadores 
franceses experimentaron con un medio de cultivo sintético modificado de fluido de 
oviducto y lo usaron como un medio de transferencia para embriones (Guignot et al., 
2015). 
La solución de mantenimiento EmCare® ha sido empleada para transferir embriones 
fenotipo burro por investigadores italianos y españoles (Panzani et al., 2006; Panzani 
et al., 2012a; Camillo et al., 2010). Otros reportan como medios de transferencia ya 
sea el PBS o el lactato de Ringer (Camillo et al., 2003; Camillo et al., 2010). El medio 
de mantenimiento Vitrocell® con cero punto cuatro por ciento de BSA ha sido usado 
como mediode transferencia con embriones fenotipo burro por Peña-Alfaro et al. 
(2014). Un medio de mantenimiento isotónico (IMV technologies, L’Aigle, France) ha 
sido reportado como solución de transferencia para embriones burro también (Pérez-
Marín et al., 2018). 
DISCUSIÓN 
En años recientes, la vitrificación embrionaria en especies equinas no convencionales 
se ha vuelto frecuente (Bottrel et al., 2019; Bottrel et al., 2020a; Bottrel et al., 2020b; 
Fanelli et al., 2020). Aun, la vitrificación, la transferencia embrionaria post vitrificación, 
y los índices de gestación son áreas que permanecen escasamente exploradas en 
embriones obtenidos a partir de burras (Ottmann et al., 2018; Pérez-Marín et al., 2018; 
Bottrel et al., 2019) y no se ha hecho investigación con embriones de fenotipo mula, 
burdégano u otros híbridos equinos. Estudios iniciales en yeguas permitieron obtener 
conocimiento acerca del tiempo al cual el embrión descendía al útero, fue entonces 
descrito que el embrión entraba al útero tan temprano como a las 120 horas (cinco 
días) PO (Freeman et al., 1991). La limitada disposición de burras y el número elevado 
que se ocupa para hacer investigación ha hecho difícil establecer de manera 
adecuada el tiempo de entrada por parte del embrión con fenotipo burro al útero de la 
burra. Es lógico pensar que el embrión con fenotipo burro desciende al útero de la 
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https://doi.org/10.1530/jrf.0.0410313
https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2004.06.015
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burra alrededor o pronto después del día sexto PO (Allen et al., 1985; Vendramini et 
al., 1997; Pérez-Marín et al., 2017). Sin embargo, parece que en burras como ocurre 
en yeguas, la colección embrionaria es más exitosa si se practica más tarde en vez 
de más temprano en relación al día de ovulación. Además, el desarrollo temprano del 
embrión con fenotipo caballo parece ser más rápido cuando se compara con el 
embrión con fenotipo burro. Por ejemplo, cuando se colectan embriones al día séptimo 
o séptimo y medio PO, la mayoría de los embriones con fenotipo caballo son ≥ 300 
µmØ (Hochi et al., 1995; McCue et al., 2010; Guignot et al., 2015; Wilsher et al., 2019), 
mientras que la mayoría de los embriones con fenotipo burro son ≤ 300 µmØ cuando 
se colectan durante los mismos días (Vendramini et al., 1997; Panzani et al., 2012b; 
Bottrel et al., 2017; Pérez- Marín et al., 2017; Pérez-Marín et al., 2018; Dorado et al., 
2020). 
Los embriones de las especies equinas desarrollan una cápsula glico-proteica (Stout 
et al., 2005) que cuando está más formada tiene una baja permeabilidad a los 
criopreservadores (Kingma et al., 2011; Scott et al., 2012). Estos cambios en la 
permeabilidad de la CE pueden ser asumidos también de manera indirecta al analizar 
los estudios de vitrificación de embriones equinos ≤ 300 µmØ donde se reportan los 
ISEPVIG (Eldridge-Panuska et al., 2005; Hudson et al., 2006; Choi et al., 2011). Es 
probable que el alto ISEPVIG obtenido cuando se vitrifican embriones pequeños sea 
consecuencia de la naturaleza de estos embriones; los cuales tienen una cápsula 
menos desarrollada y son más permeables a los criopreservadores, por lo tanto, estos 
últimos pueden vitrificarse de manera fácil y obtener con ellos unos ISEPVIGs 
normales o altos. Por otro lado, los embriones con fenotipo caballo grandes >300 µmØ 
tienen una cápsula con una permeabilidad menor a los criopreservadores. Estos 
cambios en la permeabilidad de la CE puede ser corroborada cuando se analizan los 
datos obtenidos por Legrand et al. (2001). En el estudio previo se observó que los 
embriones equinos que contaban con una cápsula más gruesa o desarrollada, la 
entrada al embrión por parte de los criopreservadores tales como el glicerol era 
limitada (Legrand et al., 2001). Entonces, dependiendo de las subcategorías con 
respecto al tamaño de embrión solo la punción (Wilsher et al., 2021) o la punción y la 
aspiración del líquido blastocélico serán necesarias para obtener un alto ISEPVIG 
(Díaz et al., 2016; Sánchez et al., 2017). La pregunta acerca de cuáles subcategorías 
de embriones con fenotipo burro (en términos de tamaño: ≤ 300 µmØ, > 300 ≤ 500 
µmØ, > 500 ≤ 1200 µmØ) requieren su cápsula puncionada y su líquido blastocélico 
aspirado antes de la etapa de vitrificación no ha sido investigada de manera completa 
todavía. Basado en estudios en caballos, y en limitados estudios en asnos (mirar 
sección previa de esta revisión); se puede inferir que los embriones de fenotipo burro 
requieren no solo de ser puncionados y su líquido blastocélico aspirado, pero también 
vitrificados, posteriormente calentados, y transferidos al útero de burras para calcular 
su ISEPVIG (Análisis de revisión hecho por Urías-Castro & Boeta, 2020). 
En las especies equinas, los constituyentes de las soluciones líquidas para colectar 
embriones (SLPCE) fueron descritas por los estudios iniciales de Oguri (Oguri & 
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https://doi.org/10.3390/ani10111967
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https://doi.org/10.1016/j.anireprosci.2004.11.009
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https://doi.org/10.1016/j.jevs.2005.11.012
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http://www.havemeyerfoundation.org/PDFfiles/monograph3.pdf#page=73
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https://doi.org/10.1111/evj.13400
https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2015.10.039
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Tsutsumi, 1974). Estos eran medios isotónicos conteniendo suero de origen animal, y 
en algunos casos eran suplementados con glucosa, piruvato, y antibióticos. Algunas 
SLPCE contienen carbohidratos y antibióticos; la decisión acerca de agregar estos 
últimos será tomada basado en distintos factores tales como la cantidad de tiempo 
que se empleara manipulando o manteniendo el embrión y si las instalaciones y el 
equipo usado son limpios o estériles. Al analizar los estudios que reportan el uso de 
distintos SLPCEs, es aparente que en yeguas (Guignot et al., 2015; Sánchez et al., 
2017; Wilsher et al., 2019) y burras (Pérez-Marín et al., 2018; Bottrel et al., 2019) 
soluciones líquidas simples como el lactado de Ringer o la solución de Harman 
podrían ser buenas alternativas (lo cual tiene relevancia económica y práctica; ya que 
tanto el lactato de Ringer como la solución de Harman son por lo general más baratas 
y fáciles de obtener). 
Existen muchas soluciones líquidas que pueden utilizarse para mantener embriones 
equinos. Algunos investigadores han empleado solución salina o lactato de Ringer. 
Existen soluciones más complejas tales como la Vigro® y la Syngro®, mientras que las 
más completas en términos de los requerimientos de nutrición embrionaria parecen 
ser la Ham’s F10 y la TCM-199. Sin embargo, pocos estudios han comparado los 
diferentes tipos de soluciones de mantenimiento y los efectos de emplear cada una 
de ellas sobre la sobrevivencia embrionaria, desarrollo, y/o porcentajes de gestación 
(Oguri & Tsutsumi, 1974; Alvarenga et al., 1993). El tipo de solución seleccionada 
dependerá de las circunstancias que prevalezcan durante los procesos de colección 
y mantenimiento, y de si el embrión será refrigerado, almacenado por horas, o 
procesado (transferido al útero) inmediatamente después de ser manipulado. Las 
soluciones líquidas utilizadas para lavar el embrión equino guardan una estrecha 
relación con las soluciones utilizadas como soluciones de mantenimiento. Sin 
embargo, cuando los medios de mantenimiento son usados como soluciones para 
lavar embriones a estas últimas soluciones usualmente se les agregan antibióticos. 
La relación entre el diámetro de la punta de la micro-pipeta empleada para puncionar 
la CE y el efecto de esta sobre el ISEPVIG es un área que no ha sido investigada de 
manera completa en especies equinas, especialmente usando embriones con fenotipo 
burro o con fenotipo mula. Existe una variación dramática en el diámetro de la punta 
de la micro-pipeta usada para puncionar embriones grandes de equinos (> 300 µmØ) 
(Choi et al., 2011; Guignot et al., 2015; Díaz et al., 2016; Ferris et al., 2016; Sánchez 
et al., 2017; Wilsher et al., 2019; Wilsher et al., 2021). 
Existen múltiples protocolos para vitrificar embriones equinos; sin embargo, los datos 
son limitados cuando se compara el ISEPVIG obtenido cuando se emplean cada uno 
de ellos (Choi et al., 2010; Pérez-Marín et al., 2018). Será interesante investigar más 
a fondo diferentes categorías en términos de tamaño embrionario (≤ 300 µmØ, > 300 
≤ 500 µmØ, > 500 ≤ 1200 µmØ) y la susceptibilidad de cada grupo a un protocolo de 
vitrificación especifico. La vulnerabilidad del embrión a un solo criopreservador como 
el glicerol (Scott et al., 2012), o a diferentes combinaciones: etilen glicol y glicerol 
(Kingma et al., 2011); etilen glicol y DMSO – etilen glicol y galactosa (Campos-Chillon 
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https://doi.org/10.2527/jas.2015-9469
https://doi.org/10.1016/j.jevs.2016.10.004
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https://doi.org/10.1111/evj.13039
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https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2018.11.011
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https://doi.org/10.1111/j.2042-3306.1993.tb04841.x
https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2011.01.028
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https://doi.org/10.1016/j.jevs.2016.04.047
https://doi.org/10.1016/j.jevs.2016.10.004
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https://doi.org/10.1111/evj.13400
https://doi.org/10.1530/REP-10-0141
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https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2011.06.026
https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2008.08.001
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et al., 2009), es un área en la que se espera una investigación más a fondo usando 
asnos, mulas, burdéganos y otros embriones híbridos. La permeabilidad embrionaria 
y la sobrevivencia embrionaria post vitrificación es un tema que ha sido parcialmente 
descrito antes, tanto para embriones producidos en vivo (Kingma et al., 2011; Scott et 
al., 2012) como para embriones fenotipo caballo producidos en vitro (Campos-Chillon 
et al., 2009). 
En términos generales, cuando el embrión es reducido de tamaño (ya sea porque es 
pequeño al momento de ser colectado; o porque es reducido de tamaño mediante la 
punción de la CE y aspiración del líquido blastocélico) y cuando se utiliza un volumen 
pequeño de solución líquida con el (menos de un micro litro) durante la etapa de 
vitrificación la probabilidad de la formación de hielo es disminuida ya que un alto TTI 
es inducido al sumergir el embrión de manera directa con el nitrógeno líquido 
(Analizado previamente por Urías-Castro & Boeta, 2020). Interesantemente, en los 
reportes iniciales que describen la vitrificación exitosa de embriones equinos 
pequeños los cuales resultaron en índices normales o altos de gestación, se utilizaron 
porta embriones con volúmenes grandes de carga, en estos casos los embriones eran 
criopreservados usando un volumen de treinta micro litros de solución vitrificante 
(Eldridge-Panuska et al., 2005). Entre más pequeño es el embrión menor es el 
volumen de carga que el investigador puede usar durante el proceso de vitrificación. 
Sin embargo, la problemática está presente cuando el embrión es >300 µmØ. Lo 
anterior es debido a que entre más grande es el embrión mayor es el volumen 
necesario para cargar el embrión en el porta embrión durante el proceso de 
vitrificación. La problemática mencionada previamente hace más difícil el alcanzar un 
alto ITT, lo que a su vez evita poder reducir la formación de hielo y puede también dar 
como resultado una disminución en el porcentaje de sobrevivencia embrionaria 
durante las etapas de vitrificación y calentamiento. La dificultad de lograr un alto 
ISEPVIG en embriones >300 µmØ esta aun presente después de practicarles la 
punción de la CE y la aspiración del líquido blastocélico, especialmente con embriones 
>800 µmØ los cuales son difíciles de cargar en el porta embriones usando un volumen 
pequeño de solución líquida para vitrificarlos (experiencia personal). 
El proceso de calentamiento o desvitrificación embrionaria usualmente se inicia con 
soluciones líquidas de galactosa o sucrosa las cuales varían en su molaridad de cero 
punto dos a cero punto tres, cero punto cinco, o incluso concentraciones uno molar. 
Una vez calentado, el embrión es puesto de manera secuencial en soluciones con una 
molaridad cada vez menor de galactosa/sucrosa. En las etapas finales del proceso de 
calentamiento, el embrión es puesto en soluciones que no contienen 
galactosa/sucrosa. Otros protocolos emplean una técnica denominada transferencia 
directa post calentamiento, la cual consiste en colocar el embrión en una solución cero 
punto cinco molar de sucrosa (el uso de este último protocolo tiene implicaciones 
prácticas ya que permite la transferencia directadel embrión una vez que este fue 
calentado). En este último protocolo el embrión es calentado en la solución final y es 
transferido directamente al útero de la yegua. Pocos estudios han investigado la 
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relación entre el tamaño del embrión (≤ 300 µmØ or >300 µmØ) y la susceptibilidad 
de cada uno de ellos a soluciones con molaridades específicas de sucrosa/galactosa 
(Choi et al., 2011; Bottrel et al., 2019; Bottrel et al., 2020a; Bottrel et al., 2020b). Por 
ejemplo, embriones grandes (>300 µmØ) podrían requerir más tiempo para alcanzar 
un equilibrio osmótico durante el proceso de calentamiento; debido lo anterior a la 
presencia de una capsula embrionaria más desarrollada la cual probablemente tenga 
menor permeabilidad. Es necesario investigar más a fondo las diferentes molaridades 
de las soluciones de calentamiento empleadas con embriones grandes de equinos. 
Ajustar las molaridades por subcategorías de tamaño embrionario (>600 ≤ 900 µmØ; 
>900 ≤ 1200; >1200 ≤ 1500 µmØ) podría mejorar los protocolos de calentamiento y el 
ISEPVIG. Un alto rango de variabilidad en la susceptibilidad embrionaria puede 
esperarse en base a las molaridades de las soluciones de calentamiento (basado en 
el grado de desarrollo y permeabilidad de la CE). No se ha establecido de manera 
clara si los embriones con fenotipo burro/caballo tienen diferentes susceptibilidades a 
los procesos de vitrificación y/o calentamiento (Bottrel et al., 2020a; Bottrel et al., 
2020b). Por ejemplo, los embriones fenotipo burro parecen ser menos proclives al 
daño ocasionado por la vitrificación (Pérez-Marín et al., 2018; Bottrel et al., 2020a; 
Bottrel et al., 2020b). La diferencia previa en términos de susceptibilidad entre 
embriones fenotipo caballo o fenotipo burro podría explicarse de manera parcial por 
diferencias en términos de permeabilidad hacia las sustancias criopreservadoras. Si 
la menor susceptibilidad que parecen presentar los embriones fenotipo burro a la 
vitrificación también se refleja en una menor susceptibilidad al calentamiento, es un 
tema que requiere más investigación. 
Existen muchas alternativas de soluciones líquidas que pueden ser usadas para 
depositar intrauterinamente los embriones de équidos. La solución y el volumen para 
cargar y transferir el embrión dependerán del tamaño de este último. En general, una 
pipeta de inseminación puede ser usada si el embrión es grande (>300 µmØ). Una 
pajilla o popote de cero punto cinco o cero punto veinticinco mL pueden emplearse si 
el embrión es pequeño (≤ 300 µmØ). Soluciones líquidas simples como la salina 
fisiológica y/o lactato de Ringer (las cuales son baratas y fáciles de obtener) 
suplementadas con polvo de gelatina son alternativas que pueden usarse para 
transferir embriones de fenotipo caballo, burro, mula o burdégano. La PBS y los 
medios comerciales como el Syngro son otras opciones que pueden ser usadas como 
soluciones de transferencia embrionaria (sin embargo, son más difíciles de obtener y 
usualmente más caras). Otras alternativas pudieran proveer condiciones más estables 
para la nutrición y el desarrollo de los embriones equinos. Estas últimas pueden incluir 
los medios de cultivo suplementado con fluido sintético de oviducto o la PBS 
modificada de Dulbeccos. En asnos, las soluciones para transferencia embrionaria 
reportados de manera frecuente son el Emcare, la PBS, y la solución de 
mantenimiento Vitrocell®. No hay estudios que de manera metódica investiguen la 
relevancia del tipo de solución liquida utilizada para transferir embriones equinos sobre 
el impacto que pudieran tener sobre el ISEPVIG. No es sabido si soluciones simples 
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https://doi.org/10.1111/evj.12777
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tales como la salina fisiológica o el lactato de Ringer son buenas alternativas como 
medios de transferencia embrionaria. No se ha investigado si el uso de solución salina 
o de lactado de Ringer por si solos o combinados con antibióticos resultan en ISEPVIG 
aceptables cuando se trabaja con embriones fenotipo burro o mula. Comparar el 
ISEPVIG obtenido cuando se transfieren embriones equinos usando soluciones 
liquidas simples y fáciles de obtener tales como la salina fisiológica o el lactato de 
Ringer; o más complejas tales como los medios de cultivo suplementado con suero 
de origen animal y/o fluido sintético de oviducto requiere más investigación. La 
investigación en el área de criopreservación utilizando embriones de fenotipo burro o 
embriones híbridos tales como mulas y burdéganos son modelos que pueden ayudar 
a desarrollar alternativas que resulten en una mejora de la sobrevivencia post 
vitrificación (calentamiento), resultando en un alto porcentaje de gestaciones post 
transferencia. Mas investigación es necesaria en yeguas y burras para mejorar los 
protocolos de vitrificación y por ende incrementar el ISEPVIG especialmente con 
embriones fenotipo burro y mula >300 µmØ. 
 
Conflicto de intereses 
Los autores declaran que no existe conflicto de intereses. 
Agradecimientos 
Los autores quieren agradecer la ayuda financiera recibida a través del Proyecto: PROFAPI2015/287 
que hizo posible la publicación de este artículo. 
 
LITERATURA CITADA 
 ALLEN WR, Kydd J, Boyle MS, Antczak DF. 1985. Between‐species transfer of horse 
and donkey embryos: A valuable research tool. Equine Veterinary Journal. 17(S3):53-
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ALVARENGA MA, Alvarenga FC, Meira C. 1993. Modifications in the technique used 
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