TFG SAnchez Puerto Daniel

Vista previa del material en texto

1 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
F
a
c
u
lt
a
d
 d
e
 C
ie
n
c
ia
s
 E
x
p
e
ri
m
e
n
ta
le
s
 
UNIVERSIDAD DE JAÉN 
Facultad de Ciencias Experimentales 
 
 
 
 
 
Trabajo Fin de Grado 
Alumno: Daniel Sánchez Puerto 
 
 
 
 
 
 
 
 
Julio, 2020 
Sistema CRISPR/Cas9 y 
su aplicación a la edición 
dirigida de genomas 
2 
 
 
 
 
 
 
 
 
UNIVERSIDAD DE 
JAÉN 
Facultad de Ciencias Experimentales 
 
 
 
 
Trabajo Fin de Grado 
 
 
 
 
 
 
 
 
F
a
c
u
lt
a
d
 d
e
 C
ie
n
c
ia
s
 E
x
p
e
ri
m
e
n
ta
le
s
 
Sistema CRISPR/Cas9 y 
su aplicación a la edición 
dirigida de genomas 
Alumno: Daniel Sánchez Puerto 
 
 
 
 
 
 
 
 
Julio, 2020 
3 
 
RESUMEN 
 
CRISPR/Cas9 es un sistema que forma parte de la defensa 
inmunitaria de bacterias y arqueas frente a las infecciones víricas. Está 
compuesto por una proteína específica denominada Cas9 y un ARN 
guía que, al ser combinados, son capaces de identificar, cortar y 
destruir una secuencia de ADN vírico. Debido a esta capacidad y a su 
sencillez es actualmente uno de los más importantes avances en la 
edición genómica, teniendo sus aplicaciones gran utilidad en el ámbito 
de la terapia génica. 
En esta revisión, además de lo descrito anteriormente, 
hablaremos del funcionamiento de este sistema, de su estructura y 
composición, así como de los inconvenientes que presenta y de las 
implicaciones éticas existentes alrededor de sus posibles aplicaciones. 
 Palabras clave: CRISPR/Cas, secuencias CRISPR, Cas9, ARN guía, 
edición genómica, terapia génica. 
 
ABSTRACT 
CRISPR / Cas9 is a system that forms part of the immune 
defense of bacteria and archaea against viral infections. It is made up 
of a specific protein called Cas9 and a guide RNA that, when combined, 
are capable of identifying, cutting and destroying a viral DNA sequence. 
Due to this capacity and its simplicity, it is currently one of the most 
important advances in genomic editing, having its applications great 
utility in the area of gene therapy. 
In this review, in addition to what is described above, we will talk 
about the operation of this system, its structure and composition, as well 
as the drawbacks it presents and the ethical implications existing 
around its possible applications. 
Key words: CRISPR/Cas, CRISPR sequences, Cas9, guide ARN, 
genomic edition, gene therapy. 
4 
 
ÍNDICE 
1. INTRODUCCIÓN ....................................................................................... 5 
2. OBJETIVO ................................................................................................. 6 
3. ANTECEDENTES ...................................................................................... 7 
3.1 Recombinación homóloga (Homology directed repair, HDR) .............. 7 
3.2 Nucleasas con dedos de Zinc (Zinc Fingers Nuclease, ZFN) .............. 9 
3.3 TALEN (Transcription activator-like effector nucleases) .................... 10 
4. El sistema CRISPR/Cas ......................................................................... 12 
4.1 Origen y descubrimiento del sistema ................................................. 12 
4.2 Funcionamiento ................................................................................. 13 
4.3 Tipologías .......................................................................................... 15 
4.4 Composición y estructura .................................................................. 17 
5. EL SISTEMA CRISPR/CAS9 EN LA EDICIÓN DIRIGIDA DE 
GENOMAS............................................................................................... 19 
5.1 Funcionamiento de la técnica ............................................................ 19 
5.2 Aplicaciones ...................................................................................... 20 
5.2.1 Inserciones, deleciones e inversiones ............................................ 20 
5.2.2 Terapia génica ............................................................................... 22 
5.2.3 Imaging .......................................................................................... 24 
5.2.4 Edición múltiple .............................................................................. 25 
5.2.5 Cáncer ............................................................................................ 25 
5.2.6 Activación y suscripción transcripcional ......................................... 26 
5.2.7 Coronavirus .................................................................................... 27 
5.3 Posibles problemas ........................................................................... 30 
5.3.1 Cortes Off-Target ........................................................................... 30 
5.3.2 Autoinmunidad ............................................................................... 30 
6. IMPLICACIONES ÉTICAS DEL SISTEMA CRISPR/Cas........................ 31 
7. DISCUSIONES ........................................................................................ 32 
8. CONCLUSIONES .................................................................................... 32 
9. REFERENCIAS ....................................................................................... 33 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
5 
 
 
1. INTRODUCCIÓN 
 La comunidad científica ha experimentado un aumento 
exponencial en su interés por la edición genómica en las últimas 
décadas. Sin duda, el descubrimiento de la estructura del ADN en 1953 
por James Watson y Francis Crikc marca el inicio del cambio 
experimentado en ciertas áreas de la ciencia, especialmente la 
genética (Watson, J.D., & Crick, 1953). 
 Este creciente interés, acaba derivando en la aparición de 
nuevas disciplinas, como puede ser la ingeniería genómica. Esta 
disciplina debe ser entendida como un tipo de ingeniería genética 
en la que el ADN es insertado, eliminado o reemplazado en el 
genoma de un organismo utilizando enzimas del tipo nucleasas, que 
son denominadas “tijeras moleculares” (Lacadena, J.R, 2017). 
 La ingeniería genómica nos ha proporcionado numerosa 
información sobre los genes, cuya identificación, añadida al 
conocimiento de sus estructuras y funciones, han posibilitado la 
identificación de muchas enfermedades ligadas a ellos y, por lo tanto, 
la aparición de tratamientos efectivos que revirtieran sus efectos. 
 Uno de los momentos más importantes en la búsqueda de 
información sobre la secuencia de genes y genomas llegaría con el 
Proyecto Genoma Humano (PGH), que buscaba la obtención de un 
mapa físico y funcional de nuestro genoma, siendo la primera gran 
incursión de las comunidades de investigación biológica y médica en 
la "gran ciencia" (Collins, Morgan & Patrinos, 2003). 
 Esta información, unido al uso de las enzimas tipo nucleasas 
(tijeras moleculares) comentado con anterioridad, ha derivado en la 
aparición de diversos métodos de edición genómica basados en el 
corte del genoma mediado por estas enzimas, como pueden ser las 
nucleasas de dedos de zinc (ZFN) o las nucleasas efectoras de tipo 
activador de la transcripción (TALEN), o mediado por ARN, como 
ocurre en el sistema CRISPR/Cas9, del cual tratará este trabajo. 
6 
 
 CRISPR/Cas9 ha sido la técnica de ingeniería genética que ha 
tenido un desarrollo más rápido en los últimos años. Se basa en la 
Cas9, una endonucleasa guiada por ARN que, a su vez, tiene su 
fundamento en el sistema inmune bacteriano CRISPR, acrónimo del 
inglés “Clustered regularly interspaced short palindromic repeats”, es 
decir, repeticiones palindrómicas cortas, agrupadas y regularmente 
interespaciadas. 
 El uso de esta técnica ha redefinido, de manera radical, el 
panorama de la edición genómica. Ello sedebe, principalmente, a 
cuatro características fundamentales que posee el sistema 
CRISPR/Cas9: especificidad, eficiencia, accesibilidad y versatilidad 
(Santaló-Pedro J., 2017). Además, debemos destacar que, a diferencia 
de ZFN y TALEN, las nucleasas guiadas por ARN están basadas en 
un apareamiento entre un ARN artificial y su diana específica en el ADN 
(Sander & Joung, 2014). 
 Por lo expuesto anteriormente, podemos afirmar sin miedo a 
equivocarnos que una tecnología como CRISPR/Cas9 está llamada a 
revolucionar diversos campos de la ciencia y la tecnología, gracias 
principalmente a sus aplicaciones en terapia génica, en la activación y 
suspensión transcripcional o en la edición múltiple. En definitiva, y 
gracias a este sistema, las secuencias de ADN dentro del genoma 
endógeno y sus salidas funcionales ahora se editan o modulan 
fácilmente en prácticamente cualquier organismo de elección (Hsu, 
Lander & Zhang, 2014). 
 
2. OBJETIVOS 
El principal objetivo de esta revisión bibliográfica es analizar el 
estado en el que se encuentra actualmente el sistema CRISPR/Cas9 
y, por ende, sus aplicaciones en la ingeniería genética, desde las más 
conocidas, como la terapia génica, a las más recientes, como su uso 
en la detección del Sars-CoV-2. De igual manera, trataremos su 
funcionamiento y los inconvenientes que presenta. Además, no 
7 
 
pasaremos por alto el debate ético que existe sobre el uso de esta 
técnica. 
 
3. ANTECEDENTES 
La primera técnica de manipulación genética, nacida en los años 
70, fue la recombinación homóloga directa (HDR por sus siglas en 
inglés). Una técnica cuyo principal problema fue su baja eficacia en 
organismos eucariotas, por lo que no es una buena opción si queremos 
modificar de forma rápida el genoma de alguna especie animal o 
vegetal, necesitando además unos procedimientos especialmente 
largos y no precisamente sencillos (Kim, 2016). Es por ello, que 
surgieron nuevas técnicas que vinieron a paliar las carencias que 
presentaba la recombinación homóloga directa, fueron principalmente 
las nucleasas de dedos de zinc (ZFN) y las TALEN, nucleasas 
efectoras de tipo activador de las transcripción. 
 
Figura 1. Técnicas de edición genómica a lo largo del tiempo (Kim, 2016). 
 
3.1 RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA (Homology directed repair, 
HDR). 
Fue una de las primeras técnicas utilizadas en la edición 
genómica. Podríamos definir la recombinación homóloga como un 
proceso metabólico del ADN, encontrado en todas las formas de vida, 
que proporciona reparación o tolerancia en los daños complejos del 
ADN (huecos de ADN, roturas de doble cadena de ADN (DSB) o 
8 
 
enlaces cruzados entre cadenas (ICL), entre otros). Además de su 
papel en la preservación del genoma, la recombinación homóloga 
desempeña un papel destacado en la duplicación fiel del genoma, 
proporcionando un soporte crítico para la replicación del ADN y el 
mantenimiento de los telómeros (Li & Heyer, 2008). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 2. Modelo de recombinación homóloga (Santoyo, 2008). 
 
La manipulación genética mediante el mecanismo de 
recombinación homóloga directa es una técnica que podemos dividir 
en tres fases. 
En la primera de ellas, una recombinasa específica del sitio se 
expresa a través de un transgén. Posteriormente, es una 
endonucleasa, también específica del sitio, la que se expresa. Y 
finalmente, nos encontramos un constructo donante transgénico 
(portador de sitios de reconocimiento para la endonucleasa) homólogo 
al ADN del lugar al que se va a dirigir. Mediante esta técnica podemos 
seleccionar, y mutar, genes identificados solo por secuencia, cuyas 
funciones serán estudiadas con posterioridad (Rong et al.,2002). 
9 
 
3.2 NUCLEASAS DE DEDOS DE ZINC (Zinc Fingers Nucleases, 
ZFN). 
La existencia de los dedos de zinc fue descubierta en 
numerosas proteínas de organismos eucariotas a principios de los 
años 80 (J. Miller, Mclachlan & Klug, 1985). Un dedo de zinc tiene una 
longitud aproximada de 30 aminoácidos, encontrándose los átomos de 
zinc en unos 12 de ellos. Existen muchas variantes y también son los 
responsables de diversas funciones, como puede ser dar estabilidad a 
la estructura de las proteínas o interaccionar, de manera específica, 
con ADN y ARN. 
Las nucleasas de dedos de zinc (ZFN) están formadas debido a 
la fusión que se produce entre varios dedos de zinc y el dominio de 
rotura del ADN no específico de la endonucleasa de restricción Fokl. 
Su estructura modular las ha convertido en un atractivo para el 
diseño de proteínas personalizadas de unión a ADN. La clave para la 
aplicación de proteínas de dedos de zinc en el reconocimiento 
específico de ADN viene dada por el desarrollo de matrices no 
naturales en las que podemos encontrar más de tres dominios de 
dedos de zinc. Gracias a ello, secuencias específicas pudieron dirigirse 
al genoma humano por primera vez (Gaj, Gersbach & Barbas, 2013). 
Figura 3. Estructura de los efectores tipo dedo de zinc. 
 
 
10 
 
3.3 TALEN (Transcription activator-like effector nucleases). 
Se trata de una técnica de ingeniería genética basada en las 
enzimas nucleasas efectoras de tipo activador de transcripción, TALEN 
por sus siglas en inglés. Estas enzimas pueden ser diseñadas para 
cortar, en el genoma, secuencias específicas de ADN. 
Las nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción 
(TALEN), consisten en un dominio de unión de ADN específico 
diseñado (efectores TALE) y un dominio de escisión FokI. Debido a la 
simplicidad del código de reconocimiento de ADN y su ensamblaje 
modular, los TALEN pueden actuar como tijeras de ADN molecular 
personalizables que inducen roturas de doble cadena (DSB) en una 
ubicación genómica dada. Por lo tanto, proporcionan un enfoque 
valioso para modificaciones específicas del genoma (Chen & Gao, 
2013). 
 
Figura 4. Representación del mecanismo de acción de TALEN (Angaji & Beikzadeh, 
2019). 
11 
 
Los efectores TAL son proteínas que se secretan, al infectar 
plantas, por parte del género de bacterias Xanthomonas, 
especializadas en el uso de esta estrategia (Li et al., 2012). Se 
introducen en el citoplasma celular y, desde ahí, transportadas al 
núcleo de la célula vegetal. 
El dominio mediante el cual se unen al ADN está formado por 
una secuencia repetida que contiene de 33 a 34 aminoácidos, 
presentando variaciones en los aminoácidos 12 y 13. Serán estos 
aminoácidos los que determinen que en la secuencia de ADN se 
reconozcan los nucleótidos específicos. Son conocidos como 
diresiduos de repetición variable, o RVD por sus siglas en inglés (Lau 
et al., 2014). 
 
Para efectuar la técnica, y una vez que los dominios de corte y 
de unión han sido ensamblados a una secuencia específica de ADN, 
se insertan en plásmidos que, habiendo seleccionado previamente las 
células de interés, son transfectados a ellas. TALEN su puede utilizar 
también en la edición de genes a través de inducción de cortes de 
doble hebra, respondiendo las células a ellos mediante mecanismos 
de reparación. 
El mecanismo de reparación de la unión de extremos no 
homólogos (NHEJ, por sus siglas en inglés) actúa uniendo 
directamente el ADN sin necesidad de que haya superposición de 
secuencias para el reconocimiento. Este mecanismo de reparación 
provoca cambios aleatorios en el sitio de corte mediante inserciones 
y/o deleciones, o reordenamiento cromosómico. Estos cambios 
producidos por el NEHJ conducen, a menudo, a mutaciones de 
desplazamiento de cuadros que pueden dar lugar a codones de parada 
prematuros, lo que hace que los genes no funcionen (Malzahn, Lowder, 
& Qi, 2017). 
 
12 
 
4. EL SISTEMA CRISPR/Cas 
4.1 ORIGEN Y DESCUBRIMIENTO DEL SISTEMA 
CRISPR es el acrónimo de Clustered Regurarly Interspaced 
Short Palindromic Repeats, lo que en español podríamos traducir como 
repeticiones palindrómicas cortas,agrupadas y regularmente 
interespaciadas. La otra parte del nombre de este sistema, Cas, hace 
referencia a un grupo de proteínas nucleasas, es decir, que forman 
parte del núcleo celular. Fueron nombradas así debido a su asociación 
a CRISPR (CRISPR associated system). 
Podemos situar el origen de este sistema en la defensa 
inmunitaria ante los virus que presentan las bacterias y las arqueas, 
quienes incorporan ADN de patógenos, como bacteriófagos, entre 
secuencias palindrómicas repetidas y, posteriormente, generan un 
ARN llamado «ARNcr» al transcribirse (Lammoglia-Cobo et al., 2016). 
Para ello, las bacterias poseen una proteína específica denominada 
Cas9 que, junto con un ARN guía, identifica, corta y destruye la 
secuencia de AND vírico (Vetcher, 2017). 
 
En cuanto a su descubrimiento, debemos señalar que ya en el 
año 1.987 se publica un artículo que habla por primera vez de unas 
secuencias repetidas que se encontraban en el genoma de Escherchia 
coli, si bien se consideró que no poseían ninguna función (Ishino et al., 
1987). 
Años más tarde, en 1993, sería el científico español Francisco 
Martínez Mojica, quien describiría la misma secuencia en otro tipo de 
bacterias que habitaban en las salinas de Santa Pola (Alicante), 
Haloferax mediterranei (Martinez Mojica, Juez & Rodriguez-Valera, 
1993). Y, posteriormente, en el año 2000, tras descubrir la misma 
secuencia en otro grupo de bacterias, las denominó como “short 
regurarly spaced” (Martinez Mojica, Diez-Villaseñor, Soria & Juez, 
2000). 
13 
 
Tan solo dos años después, y contando con el beneplácito de 
Francisco Martínez Mojica, el científico Ruud Jansen descubre unos 
genes asociados a las secuencias repetidas descritas por Martínez 
Mojica y le da un nuevo nombre, pasando a denominarse “clustered 
regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) (Jansen, van 
Embden, Gaastra & Schouls, 2002). 
De nuevo sería Martínez Mojica, en el año 2005, quien identifica 
una similitud entre los espaciadores asociados a CRISPR, que 
describió en el año 2002 Ruud Jansen, y el material genético que 
poseían ciertos virus patógenos de bacterias (Gómez-Tatay & Mejías 
Rodríguez, 2017). En ese momento se define a CRISPR como un 
sistema que presentan las bacterias como defensa ante los virus, 
siendo, además, heredable a las siguientes generaciones de bacterias 
(Martinez Mojica, Diez-Villaseñor, Garcia-Martinez & Soria, 2005). 
Finalmente, en el año 2012, con la realización, en un tubo de 
ensayo, del primer “corte” gracias al sistema CRISPR/Cas9, nación la 
posibilidad de poder realizar esto mismo en otro tipo de células, por 
ejemplo eucariotas. Posteriormente, ese mismo año, Feng Zhang logró 
realizar el primer corte utilizando CRISPR/Cas9 sobre el genoma de 
una célula viva de mamífero (Cong et al., 2013). 
 
4.2 FUNCIONAMIENTO 
El funcionamiento del sistema CRISPR/Cas comenzó a 
conocerse a finales de los años 2000, dividiéndose en 3 fases distintas: 
 Fase de adaptación. 
 Fase de expresión. 
 Fase de interferencia. 
 
En la primera fase, o fase de adaptación, existe una parte del 
ácido nucleico extraño que es incorporado al locus, concretamente a 
la zona de espaciadores. De esta manera, el proceso es memorizado 
14 
 
para responder de manera eficaz ante futuras infecciones. En la 
incorporación intervienen, degradando el ADN extraño, las propias 
proteínas Cas, que reconocen la secuencia diana en el ácido nucleico 
invasivo mediante el emparejamiento de bases con la cadena 
complementaria de ADN bicatenario o ARN monocatenario, e induce 
la secuencia escisión específica, evitando así la proliferación y 
propagación de elementos genéticos extraños (Gasiunas et al., 2013). 
En la segunda fase, o fase de expresión, tiene lugar las 
transcripción de CRISPR/Cas. Este proceso da lugar a un precursor, 
denominado CRISPR-ARN o pre-crARN, desembocando finalmente en 
crARNs de reducido tamaño que complementan la secuencia de ADN 
extraño. 
En último lugar, la tercera fase o fase de interferencia, en la que 
las proteínas Cas, usando como guía los crARNs obtenidos en la fase 
de expresión, detectan las secuencias intrusas y las degradan 
(Chylinski et al., 2013), realizando un corte específico que evita un 
nuevo ataque del agente externo (Gasiunas, Barrangou, Horvath, & 
Siksnys, 2012). 
 
 
 
 
Figura 5. Ilustración dónde se reflejan las tres fases del mecanismo de defensa 
de microorganismos llevado a cabo por CRISPR-Cas (Bhaya et al. 2011). 
 
 
15 
 
4.3 TIPOLOGÍAS 
Basándonos en características como la organización de locus y 
su contenido, la filogenia o la conservación de los genes, los sistemas 
CRISPR/Cas pueden clasificarse en tres tipos diferentes (I, II y III), 
conteniendo todos ellos los genes Cas1 y Cas2 (Makarova, Brouns, et 
al. 2011) 
Inicialmente se pensaba que los genes Cas 1 y Cas2 se 
encontraban distribuidos universalmente. Sin embargo, fue Francisco 
Martínez Mojica el encargado de señalar que el gen Cas2 no se 
encuentra presente en algunos microorganismos. En estos casos, su 
función la asume otra biomolécula. Cuando en el sistema CRISPR/Cas 
encontramos presencia de ambos genes, Cas1 codifica para una 
ADNasa mientras que Cas2 hace lo propio con una endorribonucleasa 
(Yosef et al. 2012). 
Además, cada tipo de sistema CRISPR/Cas, presenta una 
secuencia específica de Cas (Barrangou & van der Oost, 2013). El 
sistema CRISPR/Cas tipo I tendría una secuencia específica de Cas3, 
el tipo II de Cas9 y el tipo III de Cas10. De igual modo, es posible 
identificar subclases dentro de cada tipo de sistema CRISPR/Cas, 
siendo la diferencia principal ciertos aspectos relacionados con el gen 
que codifica para Cas1 (Makarova, Brouns, et al. 2011). 
 
Para hablar de cada uno de los tipos de sistema CRISPR/Cas, 
podríamos situar por un lado los tipo I y III, dadas sus similitudes tanto 
de carácter bioquímico como estructural, generando una respuesta con 
una presencia de proteínas Cas similar, a través de la cual se 
desencadena un mecanismo de acción que incluye actividad ARNasa. 
En otro lado, tendríamos el tipo II. Este sistema ha desarrollado una 
respuesta frente a los elementos que llevan el material genético que 
sigue la estructura descrita anteriormente (fase de adquisición, 
expresión e interferencia), pero lo hace de manera muy diferente a la 
presente en los tipo I y III. 
16 
 
En el sistema CRISPR/Cas de tipo II nos encontramos una 
molécula de ARN transactivador, la cual mediante su unión al pre-
ARNcr, y posterior corte, deriva a ARN dúplex. Será este ARN dúplex 
el que, mediante unión a Cas9, produzca un doble corte (DSB por sus 
siglas en inglés) en las dos hebras del ADN intruso y produzca la 
destrucción del patógeno (Barrangou & Marraffini, 2014). 
Finalmente, debemos destacar que el sistema CRISPR/Cas de 
tipo II tiene presencia exclusiva en bacterias, mientras que el sistema 
tipo III se encuentra de manera más común en arqueas. Es el sistema 
tipo I el que tiene presencia tanto en bacterias como en arqueas (Liu & 
Fan, 2014). 
 
 
Figura 6. Fases de los tipos I-III de CRISPR y sus diferencias (Rath, Amlinger, 
Rath, & Lundgren, 2015b) 
17 
 
4.4 COMPOSICIÓN Y ESTRUCTURA 
El sistema CRISPR/Cas se divide en dos obvios componentes, 
la secuencia CRISPR y las proteínas Cas. 
En cuanto a las secuencias CRISPR, ya hemos señalado en 
apartados anteriores que son secuencias de ADN presentes en el 
genoma bacteriano. Las bacterias, una vez infectadas, incorporan el 
ADN de la secuencia CRISPR a su propio genoma para generar una 
respuesta inmunológica que le permita defenderse ante una nueva 
infección (Lander, 2016). 
Si hablamos de las proteínas Cas, debemos señalar que son 
enzimas producidas tras la expresión de los genes que llevan el mismo 
nombre. Normalmente su principal función es la de cortar el ADN, 
guiadas por el ARNguía, de manera eficaz. 
 
Figura 7. Estructura y función del sistema CRISPR/Cas (Sorek et al., 2008). 
 
 
18 
 
Existen varios tipos de proteínas Cas que participan en el 
sistema junto a CRISPR. Podríamos hablar de cuatro grupos 
principales, proteínas Cas adaptativas, de expresión, de interferencia 
y, finalmente, existe un grupo que presenta también funciones ligadas 
al sistema CRISPR, son las proteínas Cas de función auxiliar. 
Dentro de las proteínas Cas adaptativas encontramos Cas1 y 
Cas2, si bien Cas4 también puede estar involucrada en algunas 
ocasiones. E incluso en los sistemas CRISPR de tipo II también 
podríamos encontrarnos con la proteína Cas9 (Makarova et al., 2015). 
En las proteínas Cas de expresión y de interferencia, podremos 
encontrar Cas6 para los sistemas tipo I y II (siendo la encargada de 
que madure el ARNcr) y Cas9 para los sistemas tipo II. Finalmente, las 
proteínas de función auxiliar suelen resultar una combinación de 
proteínas y dominios menos comunes que las proteínas Cas 
encontradas en los casos anteriores. Son un caso tan particular que 
sus funciones aún no han sido definidas con claridad (Makarova et al., 
2017). 
 
 
Figura 7. Clasificación de las proteínas Cas (Makarova et al., 2015). 
 
 
19 
 
 
5. EL SISTEMA CRISPR/Cas EN LA EDICIÓN DIRIGIDA DE 
GENOMAS 
5.1 FUNCIONAMIENTO DE LA TÉCNICA 
Como se ha comentado con anterioridad, para activar la 
proteína Cas9 es necesaria la presencia del ARNcr. También es 
necesaria la presencia de ARNtracr. Ambos tipos de ARN pueden dar 
lugar a un ARN guía sintético, ARNsg según sus siglas en inglés. Este 
ARNsg puede dirigir a Cas9 contra una secuencia genómica de 
cualquier organismo y, por lo tanto, Cas9 puede convertirse en una 
nucleasa programable (Valor, 2018). Será esta utilidad de Cas9 la que 
convierta al sistema CRISPR/Cas en una gran herramienta para la 
edición dirigida de genomas. 
Una vez que el complejo formado por Cas9 y el ARNsg produce 
un corte en el ADN del organismo diana, la reparación del mismo puede 
tener lugar mediante dos mecanismos: 
 NHEJ (Non-Homologous End Joining) 
Estamos ante una vía rápida pero, a su vez, con gran tendencia 
al error. Su mayor problema radica en la generación de inserciones y 
deleciones en la región de genoma que sufre el corte. La consecuencia 
inmediata es el desorden de la secuencia y, por ende, la posible 
aparición de mutaciones que haga al gen perder su función (Lin, 
Staahl, Alla, & Doudna, 2014). 
 HDR (Homology directed repair) 
Se trata de una vía menos eficaz e incluso inactiva en la gran 
mayoría del tiempo pero, a su vez, también es una vía conservadora 
en comparación a la unión de extremos no homólogos. Como requisito, 
precisa de un ADN molde (Luo, 2016) que acabará siendo incorporado 
al genoma gracias a la recombinación homóloga. 
 
 
20 
 
 
Figura 8. Reparación por NHEJ o HDR de un corte de doble cadena (Adhikari & 
Poudel, 2020). 
 
5.2 APLICACIONES 
 
5.2.1 INSERCIONES, DELECIONES E INVERSIONES 
 
 Inserciones y deleciones 
Como hemos comentado en el anterior apartado, existen dos 
mecanismos, la unión de extremos no homólogos (NHEJ) y la 
reparación directa por homología (HDR), para reparar un corte de 
doble cadena (Adhikari & Poudel, 2020). También señalábamos que la 
diferencia entre ambos radicaba en la mayor actividad pero también 
mayor número de errores cometidos por NHEJ, frente a la técnica más 
conservadora y eficaz de HDR, aunque esta última presentaba menor 
actividad. 
Debido a los errores que comete NHEJ, en el corte de doble 
cadena se generan tanto inserciones como deleciones de nucleótidos, 
lo que puede generar la aparición de mutaciones al cambiarse la 
lectura en la secuencia de nucleótidos. 
21 
 
Es en este momento en el que aparece la primera de las 
aplicaciones del sistema CRISPR/Cas que comentaremos en esta 
revisión. Las mutaciones generadas debido a los errores de NHEJ 
pueden usarse en nuestro beneficio si conseguimos su eliminación en 
el gen diana. El problema radica en la aleatoriedad y poca predicción 
que nos ofrece NHEJ, lo que la hace poco adecuada en la generación 
de ediciones de una sola base o en la inserción de secuencias 
específicas (Chandrasegaran & Carroll, 2016). Por lo tanto, debemos 
reafirmarnos en el uso de HDR para asegurarnos el éxito en la 
aplicación de este sistema, si bien, debido a la prevalencia natural de 
NHEJ, debemos asegurar el correcto aislamiento de la secuencia diana 
para que la eficacia de HDR sea mejorada (Li et al., 2014). 
 
 
Figura 9. A) Generación de knockout por reparación de corte de doble cadena por 
NHEJ. B) Inserciones con CRISPR/Cas y mecanismo de reparación HDR. (Dow, 
2015). 
22 
 
 Inversiones 
También existen otra serie de modificaciones que generan 
mutaciones de mayor entidad en los cromosomas, como podrían ser 
las inversiones. Fueron observadas sobre modificaciones off-target y 
brindaban la posibilidad de dejar atrás la edición en genes individuales 
y hacerlo en cromosomas completos. 
Este puede ser el caso de enfermedades como la hemofilia A, 
siendo la mayoría de los casos producidos por dos grandes inversiones 
en cromosomas que producen la alteración del gen F8. Por ello, se 
intervino con el sistema CRISPR/Cas9 para anular la inversión 
cromosómica y, de esta manera, eliminar la enfermedad (Graw et al., 
2005). También es posible realizar correcciones, ejecutando una 
modificación cromosómica dirigida, en las mutaciones genéticas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 10. Proceso de inversión cromosómica (Kim & Kim, 2014). 
 
5.2.2 TERAPIA GÉNICA 
La terapia génica es, sin duda, de las aplicaciones de 
CRISPR/Cas en las que más esperanzas hay depositadas. A día de 
hoy, CRISPR/Cas ya ha sido aplicada como terapia génica, con 
interesantes resultados, en varias enfermedades en modelos animales 
(Cruz & Freedman, 2018). 
23 
 
Otra de las utilidades del sistema CRISPR/Cas9, en el ámbito 
de la edición genómica, es la introducción de mutaciones que actúen 
como protectoras y combatan las enfermedades no genéticas o 
complejas desde los tejidos somáticos. 
También podría ser utilizado fuera del tejido somático. Un 
ejemplo de ello es la ingeniería de células terapéuticas, las cuales 
pueden modificarse ex vivo para realizar una posterior reinfusión en el 
paciente (Hsu, Lander & Zhang, 2014). 
 
Figura 11. Aplicaciones de Cas9 en la ingeniería genómica (Hsu, Lander & Zhang, 
2014). 
24 
 
5.2.3 IMAGING 
Las imágenes basadas en Cas9 constituyen otra de las 
aplicaciones del sistema CRISPR. En los estudios preliminares 
puestos en marcha para evaluar esta aplicación se usó la GFP, una 
proteína fluorescente que fue fusionada con Sp dCas9 para observar 
la dinámica, durante el ciclo celular, de los loci repetitivos del genoma. 
Una vez analizados los primeros estudios en los que se 
implementó esta técnica, se han introducido mejoras que potenciaran 
esta aplicación del sistema CRISPR. Algunas de ellas han sido la unión 
de las imágenes que proporcionaba Cas9 del genoma con la matriz de 
péptidos SunTag (Tanenbaum, Gilbert, Qi, Weissman & Vale, 2014) o 
el uso de dCas9 ortogonales previamente marcados con proteínas que 
emitieran fluorescencia para desarrollar imágenes multicolor (Ma et al., 
2015). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 12. Representación gráfica general de las imágenes CRISPR (Chen et al., 
2013). 
 
 
25 
 
5.2.4 EDICIÓN MÚLTIPLE 
Otra de las aplicaciones del sistema CRISPR/Cas radica en la 
introducción simultánea de varios ARNsg. Con ello podríamos 
modificar varios genes al mismo tiempo. Para ello, y con la intención 
de reducir al mínimo las limitaciones que puede presentar este 
mecanismo a la hora de su aplicación, se han diseñado varios sistemas 
basados en la generación, partiendo de un único plásmido, de múltiples 
ARNsg (Cao,Xiao & Yan, 2018). 
Centrándonos en las utilidades de esta técnica podríamos 
señalar el estrés metabólico, generando la edición múltiple una mejora 
de la tolerancia celular a este mecanismo. Para ello, se actúa de 
manera directa sobre los reguladores que confieren la tolerancia y se 
les manipula genéticamente para que la mejoren de manera 
significativa (Chen, Stabryla & Wei, 2016). De igual modo, gracias a 
esta aplicación del sistema CRISPR podríamos conseguir un mayor 
control del genoma, con las posibilidades en el ámbito de la medicina 
que ello generaría. Por supuesto, esta capacidad de control del 
genoma genera también muchos debates, de carácter ético, sobre los 
límites de actuación que se deben establecer. 
 
5.2.5 CÁNCER 
Sin duda el uso del sistema CRISPR en el tratamiento del cáncer 
es la aplicación que más impacto mediático genera, debido a que una 
gran parte de la población se encuentra sensibilizada ante esta 
enfermedad. 
Recientemente, en el mes de febrero de este año 2020, 
investigadores de la Universidad de Pensilvania han demostrado que 
células editadas genéticamente con el sistema CRISPR/Cas9 
prosperan tras ser reintroducidas en pacientes de cáncer (Stadtmauer 
et al., 2020). 
 
26 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 13. Ingeniería CRISPR/Cas9 de células T en pacientes con cáncer (Stadtmauer 
et al., 2020). 
 
 
5.2.6 ACTIVACIÓN Y SUPRESIÓN TRANSCRIPCIONAL 
CRISPR/Cas9 no solo es capaz de realizar cambios a nivel 
genómico, también es un sistema capaz de activar o inhibir la 
transcripción. 
En este caso, Cas9 no necesita realizar un corte en el ADN. 
Cas9 actuará como una proteína programable que se una al ADN. 
(Barrangou & Doudna, 2016). A una versión de Cas9 inactiva, que 
presenta una serie de mutaciones (principalmente en los sitios activos 
RuvC y NHN), se le unen activadores o inhibidores de la actividad 
transcripcional y modificadores epigenéticos. Esta unión se produce 
mediante fusiones génicas o aptámeros ligados al ARNsg. 
 
 
 
 
27 
 
 
5.2.7 CORONAVIRUS 
Aunque el sistema CRIPSR/Cas se relacione principalmente 
con aplicaciones relacionadas con la edición genómica, no es su única 
utilidad. Es por ello que, debido a la pandemia provocada por la Covid-
19, muchos investigadores comenzaron a centrar sus esfuerzos en 
combatir al SARS-CoV-2, también mediante la adaptación de 
herramientas CRIPSR que pudieran ofrecer alternativas a nivel de 
diagnóstico pero también como estrategia terapéutica. 
Podemos, por lo tanto, dividir las aportaciones del sistema 
CRISPR a la lucha frente a la Covid-19 en dos grupos diferentes: 
detección del virus y desarrollo de terapias frente a Sars-CoV-2. 
 
 DETECCIÓN DEL VIRUS 
Existen dos vías, basadas en la detección específica de 
moléculas de ARN y ADN, para aprovechar la tecnología CRISPR en 
el diagnóstico de Sars-CoV-2. Fueron desarrolladas con anterioridad, 
pero han sido adaptadas recientemente una vez que el genoma de este 
coronavirus fue descrito. 
La primera vía, descubierta en el Instituto Broad, es conocida 
como SHERLOCK (Kellner et al., 2019). La técnica utiliza la proteína 
Cas13a como elemento funcional, y su mecánica es simple. El ARN 
guía activa a Cas13a tras unirse a su secuencia diana y, gracias a ello, 
se consigue degradar el ARN de la reacción. Esta función de Cas13a 
es aprovechada por los investigadores para introducir fragmentos de 
ARN, marcados previamente, que al degradarse pueden ser 
detectados con fluorescencia o colorimetría. Con ello podremos 
detectar si el ARN del virus está o no presente. 
El inconveniente de esta técnica radica en que su uso está 
limitado a la investigación, ya que aún no se ha validado en pacientes, 
por lo que no puede usarse en un contexto clínico. 
28 
 
A pesar de ello, se han realizado avances en el uso de 
SHERLOCK. Gracias a su combinación con una plataforma de análisis 
basada en chips ha nacido CARMEN (Combinatorial Arrayed 
Reactions for Multiplexed Evaluation of Nucleic acids), una tecnología 
que es capaz de analizar más de 1.000 muestras de manera 
simultánea (Ackerman et al., 2020). 
La segunda vía, desarrollada en la Universidad de California, se 
denomina DETECTR (Chen et al., 2018). Se trata de un sistema 
diseñado para detectar ADN a través del uso de la enzima Cas12a. El 
mecanismo funciona de la misma manera que en la técnica 
SHERLOCK, cambiando el ARN por ADN. 
La técnica ha sido adaptada en los últimos meses para colaborar 
en la detección de Sars-CoV-2. Para ello, al tratarse de una técnica 
que detecta ADN, tras la extracción de ARN de la muestra se debe 
copiar a ADN y, posteriormente, amplificarlo. Con este proceso 
podemos detectar dos genes, N y E, de este coronavirus. 
A diferencia del anterior, el método DETECTR sí ha sido testado 
con éxito en pacientes positivos por COVID-19. A pesar de ello, aún no 
puede usarse en el diagnóstico clínico de la enfermedad. 
 DESARROLLO DE TERAPIAS 
El sistema CRISPR fue descubierto como un sistema que 
defiende a las bacterias frente a las infecciones víricas. Partiendo de 
esa base, podríamos deducir que CRISPR puede ser útil en la 
detección y destrucción del coronavirus SARS-CoV-2. 
Precisamente en el año 2019, y nuevamente investigadores del 
Instituto Broad, se desarrolló una estrategia que usa el sistema 
CRISPR para atacar virus de ARN mediante el uso de la enzima 
Cas13. Posteriormente, se combinó esta estrategia con la mencionada 
anteriormente SHERLOCK, dando como resultado CARVER (Cas13-
Assisted Restriction of Viral Expression and Readout), una herramienta 
especializada en detectar y eliminar virus (Freije et al., 2019). 
29 
 
Aunque CARVER fue la primera herramienta que demostró el 
éxito del sistema CRISPR en la detección de los virus de ARN, no ha 
sido el primer método testado para utilizar esa aplicación frente al 
coronavirus causante de la pandemia de la Covid-19. En este caso, los 
honores corresponden a un grupo de investigadores de la Universidad 
de Stanford, que han diseñado PAC-MAN (Prophylactic Antiviral 
CRISPR in huMAN cells) (Abbott et al., 2020). 
El trabajo, que ha sido publicado como preprint, se basa en el 
uso de la enzima Cas13d, pequeña, específica y con elevada actividad 
de catálisis. Para realizar la investigación, se simuló la infección por 
SARS-CoV-2 con partículas de lentivirus que contenían el genoma de 
este coronavirus, obteniendo resultados que avalaban el éxito de PAC-
MAN frente al virus. Aunque los propios investigadores saben que aún 
es necesario realizar nuevos experimentos en los que se use de 
manera directa SARS-CoV-2, se muestran ilusionados con las 
posibilidades reales de lucha frente a la Covid-19 que presenta esta 
técnica. 
Figura 14. Nuevas aplicaciones para las herramientas CRISPR en diagnóstico (Chen 
et al., 2018; Gootenberg et al., 2018). 
 
30 
 
5.3 POSIBLES PROBLEMAS 
5.3.1 CORTES OFF-TARGET 
Los cortes off-target son la principal limitación que tiene en la 
actualidad el sistema CRISPR/Cas (Tian et al., 2017). Este 
inconveniente se basa en la producción de cortes no específicos en el 
ADN debido a la unión de Cas9 con sitios no diana del genoma. De 
hecho, hay estudios que señalan que solo un 1,6% de las moléculas 
de ARN guía de Cas9, dirigidas a las regiones exónicas de los genes 
o al promotor, presentan una coincidencia perfecta (Bolukbasi, Gupta, 
& Wolfe, 2016). 
Como posible solución a este problema, se están creando 
modelos modificados, presentando mayor especificidad, de la enzima 
Cas9. Con ello se pretende reducir los errores que se producen al 
editar el genoma. Mientras tanto podemos afirmar que, a día de hoy, 
no es posible evitar que los cortes off-target hagan presencia. La 
inespecificidad de CRISPR/Cas9 continúa siendo su principal factor 
limitante. 
 
5.3.2 AUTOINMUNIDAD 
La autoinmunidad es otro de los inconvenientesque lastra la 
aplicación del sistema CRISPR/Cas9 en el ámbito sanitario. Se 
produce concretamente cuando se usa el sistema “in vivo” en 
organismos eucariotas. Esto es debido a que la enzima Cas9 es 
atacada por anticuerpos de determinadas bacterias que están 
presentes en el suero de adultos, pero también de recién nacidos. Los 
estudios llevados a cabo sobre este aspecto destacan que es la 
exposición habitual a géneros bacterianos como Staphylococcus o 
Stretptococcus la que ha hecho que desarrollemos anticuerpos frente 
al sistema CRISPR/Cas9 (Charlesworth et al., 2018). 
 
 
31 
 
6. IMPLICACIONES ÉTICAS DEL SISTEMA CRISPR/CAS 
 
Desde que, en 1993, el científico español Francisco Martínez 
Mojica describiera CRISPR/Cas, una técnica sencilla, rápida y barata 
para la modificación del genoma de los seres vivos, ha experimentado 
un desarrollo acelerado, siendo considerada una de las herramientas 
más revolucionarias de nuestros días. A pesar de ello, aún queda 
mucho por hacer y saber de ella. La mayoría de los retos pendientes 
con el sistema CRISPR/Cas son de corte científico, si bien últimamente 
los retos en el ámbito ético y jurídico han tomado protagonismo, y son 
tan importantes o más que los primeros. 
Podríamos dividir los retos éticos de CRISPR/Cas en dos 
vertientes: la necesidad de tener control absoluto de la técnica antes 
de usarla en humanos y la opinión existente que sostiene que el 
desarrollo de CRISPR/Cas nos hará una especie de dioses, que su uso 
atenta contra la dignidad o que su extensión nos conduce a un mundo 
basado en el perfeccionamiento (De Miguel, 2018). 
Estas cuestiones no son ajenas a la comunidad científica, que 
ya en el año 2015 afrontó las implicaciones éticas del sistema 
CRISPR/Cas en una reunión en la que se debatió el uso de esta técnica 
en humanos (Baltimore et al., 2015). 
En el año 2018, en el marco de la segunda cumbre internacional 
sobre la edición del genoma, el debate ético de la aplicación de 
CRISPR/Cas alcanzó su punto álgido. El investigador chino He JianKui 
anunció que había usado la técnica para tratar los embriones de dos 
gemelas para hacerlas inmunes frente al virus del SIDA del que era 
portador su padre. Esta noticia horrorizó a la comunidad científica, 
surgiendo voces que pedían detener este tipo de pruebas tras 
comprobar que CRISPR/Cas podría convertirse en un juguete en 
manos de cualquier investigador (Villanueva-Cañadas, 2019). 
32 
 
A día de hoy, aún no está claro donde situar los límites en la 
edición genómica y en las posibles aplicaciones que nos ofrece 
CRISPR/Cas. 
 
7. DISCUSIONES 
 
CRISPR/Cas, si bien tiene su origen en la defensa bacteriana 
frente a infecciones víricas, se ha situado como una de las técnicas 
más importantes en el ámbito de la ingeniería genética debido a su 
sencillez y bajo coste. De igual manera, ha conseguido desbancar a 
otros métodos como las nucleasas de dedos de zinc (ZFN) o las 
enzimas nucleasas efectoras de tipo activador de transcripción 
(TALEN) gracias a su eficacia. 
Además, el sistema CRISPR/Cas cuenta con la ventaja de que 
la propia proteína Cas9 es susceptible de ser modificada, lo que 
posibilita la generación de nuevas aplicaciones creando nuevas 
proteínas alternativas. Esto ha hecho que, en la actualidad, la mayoría 
de investigadores que trabajaban en la edición dirigida del genoma 
hayan ligado sus últimos avances al uso de este sistema, lo que ha 
generado a su vez la aparición de inconvenientes (cortes off-target, 
autoinmunidad…) que limitan a CRISPR/Cas. A pesar de ello, mucha 
de la esperanza de la comunidad científica está depositada en los 
avances y descubrimientos que el uso de esta técnica pueda generar. 
 
8. CONCLUSIONES 
 
CRISPR/Cas ha conseguido, en un breve espacio de tiempo, 
situarse en la vanguardia de la ingeniería genética. Este sistema 
representa una herramienta sencilla, eficaz y barata que, además, 
puede ser manipulada con facilidad. Todo ello, unido al amplio espectro 
de posibles aplicaciones que presenta, la han convertido en la 
esperanza para revertir enfermedades de las que hace unos años 
veíamos lejano encontrar un posible tratamiento. 
33 
 
No debemos olvidar que, a pesar de todas sus ventajas, 
CRISPR/Cas también presenta una serie de inconvenientes que aún 
la hacen tener limitaciones importantes. Además, el debate en el 
contexto ético y jurídico es demasiado denso para pasarlo por alto. 
A pesar de todo ello, podemos señalar sin miedo a equivocarnos 
que estamos ante el sistema en el que, tras superar sus barreras 
limitantes, más podemos confiar para ser convertido en la mejor 
herramienta para la edición dirigida del genoma. 
 
 
9. REFERENCIAS 
 
Abbott, T. R., Dhamdhere, G., Liu, Y., Lin, X., Goudy, L., Zeng, L., ... 
& Pande, T. (2020). Development of CRISPR as an antiviral 
strategy to combat SARS-CoV-2 and influenza. Cell. 
Ackerman, C. M., Myhrvold, C., Thakku, S. G., Freije, C. A., Metsky, 
H. C., Yang, D. K., ... & Nguyen, T. G. (2020). Massively 
multiplexed nucleic acid detection with Cas13. Nature, 1-6. 
Adhikari, P., & Poudel, M. (2020). CRISPR-Cas9 in agriculture: 
Approaches, applications, future perspectives, and associated 
challenges. Malaysian Journal of Halal Research, 3(1), 6-16. 
Angaji, S., Beikzadeh, B. (2019). TALEN: una herramienta para la 
edición del genoma. Biomacromolecular Journal , 5 (1), 1-11. 
Baltimore, D. et al. (2015) ‘A prudent path forward for genomic 
engineering and germline gene modification’, Science, 
348(6230), pp. 36–38. 
Barrangou, R. y Marraffini, L.A., 2014. CRISPR-cas systems: 
Prokaryotes upgrade to adaptive immunity. Molecular Cell, 54(2), 
pp.234–244. 
Barrangou, R. y van der Oost, J., 2013. CRISPR-Cas Systems RNA-
Mediated Adaptative Immunity in Bacteria and Archaea, 
Springer. 
34 
 
Bhaya, D., Davison, M., & Barrangou, R. (2011). CRISPR-Cas 
systems in bacteria and archaea: versatile small RNAs for 
adaptive defense and regulation. Annual review of genetics, 45, 
273-297. 
Bolukbasi, M. F., Gupta, A., & Wolfe, S. A. (2016). Creating and 
evaluating accurate CRISPR-Cas9 scalpels for genomic surgery. 
Nature Methods, 13(1), 41–50. 
Canet López, D. (2017). CRISPR-Cas9: Técnicas y aplicaciones. 
Cao, J., Xiao, Q. & Yan, Q. (2018) ‘The multiplexed CRISPR targeting 
platforms’, Drug Discovery Today: Technologies. Elsevier Ltd, 
xxx(xx), pp. 1–9. 
Chandrasegaran, S., & Carroll, D. (2016). Origins of Programmable 
Nucleases for Genome Engineering. Journal of Molecular 
Biology, 428(5), 963–989. 
Charlesworth, C. T., Deshpande, P. S., Dever, D. P., Dejene, B., 
GomezOspina, N., Mantri, S., … Porteus, M. H. (2018). 
Identification of PreExisting Adaptive Immunity to Cas9 Proteins 
in Humans. BioRxiv. 
Chen, B., Gilbert, L. A., Cimini, B. A., Schnitzbauer, J., Zhang, W., Li, 
G. W., ... & Huang, B. (2013). Dynamic imaging of genomic loci 
in living human cells by an optimized CRISPR/Cas system. Cell, 
155(7), 1479-1491. 
Chen, J. S., Ma, E., Harrington, L. B., Da Costa, M., Tian, X., Palefsky, 
J. M., & Doudna, J. A. (2018). CRISPR-Cas12a target binding 
unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. 
Science, 360(6387), 436-439. 
Chen, K., & Gao, C. (2013). TALENs: customizable molecular DNA 
scissors for genome engineering of plants. Journal of Genetics 
and Genomics, 40(6), 271-279. 
35 
 
Chylinski, K., Le Rhun, A., & Charpentier, E. (2013). The tracrRNA 
and Cas9 families of type II CRISPR-Cas immunity systems. 
RNA Biology, 10(5), 726-737. 
Collins, F. S., Morgan, M., & Patrinos, A. (2003). The Human Genome 
Project: lessons from large-scale biology. Science, 300(5617), 
286-290. 
Cong L, Ran FA, Cox D, Lin S, Barretto R, Habib N, et al. Multiplex 
genome engineering using CRISPR/Cas systems. 2013 Febrero 
15; 339(6121): p. 819-823. 
Cruz, N. M. and Freedman, B. S. (2018) ‘CRISPR Gene Editing inthe 
Kidney’, American Journal of Kidney Diseases. Elsevier Inc, 20, 
pp. 1–10. 
De Miguel Beriain, Í. (2018). Problemas éticos y jurídicos que plantea 
la edición genética mediante CRISPR-Cas: un breve 
comentario. Genética médica y genómica, 1-3. 
Dow, L. E. (2015). Modeling disease in vivo with CRISPR/Cas9. 
Trends in molecular medicine, 21(10), 609-621. 
Freije, C. A., Myhrvold, C., Boehm, C. K., Lin, A. E., Welch, N. L., 
Carter, A., ... & Yozwiak, N. L. (2019). Programmable inhibition 
and detection of RNA viruses using Cas13. Molecular cell, 76(5), 
826-837. 
Gaj, T., Gersbach, C. A., & Barbas III, C. F. (2013). ZFN, TALEN, and 
CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in 
biotechnology, 31(7), 397-405. 
Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., & Siksnys, V. (2012). Cas9 
crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA 
cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proceedings of the 
National Academy of Sciences, 109(39), E2579–E2586. 
Gasiunas, G., Sinkunas, T., & Siksnys, V. (2014). Molecular 
mechanisms of CRISPR-mediated microbial immunity. Cellular 
and molecular life sciences, 71(3), 449-465. 
36 
 
Gómez-Tatay, L., & Mejías Rodríguez, I. (2017). Con el 
descubrimiento de CRISPR/Cas9, la edición genética ha llegado 
para quedarse. Observatorio de Bioética. 
Gootenberg, J. S., Abudayyeh, O. O., Kellner, M. J., Joung, J., 
Collins, J. J., & Zhang, F. (2018). Multiplexed and portable 
nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. 
Science, 360(6387), 439-444. 
Graw, J., Brackmann, H. H., Oldenburg, J., Schneppenheim, R., 
Spannagl, M., & Schwaab, R. (2005). Haemophilia A: from 
mutation analysis to new therapies. Nature Reviews Genetics, 
6(6), 488-501. 
Hsu, P. D., Lander, E. S., & Zhang, F. (2014). Development and 
applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell, 
157(6), 1262-1278. 
Ishino Y, Shinagawa H, Makino K, Amemura M, Nakata A. Nucleotide 
sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase 
isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the 
gene product. Journal of Bacteriology. 1987 Diciembre; 169(12). 
Jansen R, van Embden JDA, Gaastra W, Schouls LM. Identification 
of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes. 
Molecular microbiology. 2002 Marzo; 43(6). 
Kellner, M. J., Koob, J. G., Gootenberg, J. S., Abudayyeh, O. O., & 
Zhang, F. (2019). SHERLOCK: nucleic acid detection with 
CRISPR nucleases. Nature protocols, 14(10), 2986-3012. 
Kim, H., & Kim, J. S. (2014). A guide to genome engineering with 
programmable nucleases. Nature Reviews Genetics, 15(5), 321-
334. 
Kim, J. S. (2016). Genome editing comes of age. Nature protocols, 
11(9), 1573-1578. 
 
37 
 
Lacadena, J. R. (2017). Edición genómica: ciencia y ética. Revista 
Iberoamericana de Bioética, (3), 1-16. 
Lammoglia-Cobo, M. F., Lozano-Reyes, R., García-Sandoval, C. D., 
Avilez-Bahena, C. M., Trejo-Reveles, V., Muñoz-Soto, R. B., & 
López-Camacho, C. (2016). La revolución en ingeniería 
genética: sistema CRISPR/Cas. Investigación en Discapacidad, 
5(2), 116-128. 
Lander, E. S. (2016). The Heroes of CRISPR. Cell, 164(1–2), 18–28. 
Lau, C. H., Zhu, H., Tay, J. C. K., Li, Z., Tay, F. C., Chen, C., & Tang, 
S. Y. (2014). Genetic rearrangements of variable di-residue 
(RVD)-containing repeat arrays in a baculoviral TALEN system. 
Molecular Therapy-Methods & Clinical Development, 1, 14050. 
Li, K., Wang, G., Andersen, T., Zhou, P., & Pu, W. T. (2014). 
Optimization of genome engineering approaches with the 
CRISPR/Cas9 system. PloS one, 9(8), e105779. 
Li, T., Liu, B., Spalding, M. H., Weeks, D. P., & Yang, B. (2012). High-
efficiency TALEN-based gene editing produces disease-resistant 
rice. Nature biotechnology, 30(5), 390. 
Li, X. y Heyer, WD (2008). La recombinación homóloga en la 
reparación del ADN y la tolerancia al daño del ADN. Cell 
research , 18 (1), 99-113. 
Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., & Doudna, J. A. (2014). Enhanced 
homologydirected human genome engineering by controlled 
timing of CRISPR/Cas9 delivery. ELife, 3. 
Liu, L. y Fan, X.D., 2014. CRISPR-Cas system: A powerful tool for 
genome engineering. Plant Molecular Biology, 85, pp.209–218. 
Ma, H., Naseri, A., Reyes-Gutierrez, P., Wolfe, S. A., Zhang, S., & 
Pederson, T. (2015). Multicolor CRISPR labeling of 
chromosomal loci in human cells. Proceedings of the National 
Academy of Sciences, 112(10), 3002–3007. 
38 
 
Makarova, K. S. et al. (2006) ‘A putative RNA-interference-based 
immune system in prokaryotes: Computational analysis of the 
predicted enzymatic machinery, functional analogies with 
eukaryotic RNAi, and hypothetical mechanisms of action’, 
Biology Direct, 1, pp. 1–26. 
Makarova, K. S. et al. (2015) ‘An updated evolutionary classification 
of CRISPR-Cas systems’, Nature Reviews Microbiology, 13(11), 
pp. 722–36. 
Makarova, K. S. et al. (2017) ‘HHS Public Access’, 13(11), pp. 722–
36. 
Makarova, K.S., Brouns, S.J.J., et al., 2011. Evolution and 
classification of the CRISPRCas Systems. Nature reviews. 
Microbiology, 9(6), pp.467–477. 
Malzahn, A., Lowder, L., & Qi, Y. (2017). Plant genome editing with 
TALEN and CRISPR. Cell & bioscience, 7(1), 21. 
Martinez Mojica F, Diez-Villaseñor C, Garcia-Martinez J, Soria E. 
Intervening Sequences of Regularly Spaced Prokaryotic Repeats 
Derive from Foreign Genetic Elements. Molecular Evolution. 
2005 Febrero; 60(2). 
Martinez Mojica FJ, Diez-Villaseñor C, Soria E, Juez G. Biological 
significance of a family of regularly spaced repeats in the 
genomes of Archaea, Bateria and mitochondria. Molecular 
microbiology. 2000 Abril; 36(1). 
Martinez Mojica FJ, Juez G, Rodriguez-Valera F. Transcription at 
different salinities of Haloferax mediterranei sequences adjacent 
to partially modified PstI sites. Molecular microbiology. 1993 
Agosto; 9(3). 
Miller, J., Mclachlan, A. D., & Klug, A. (1985). Repetitive zinc-binding 
domains in the protein transcription factor. 4(6), 1609–1614. 
 
39 
 
R Barrangou & J Doudna. Applications of CRISPR technologies in 
research and beyond. Nat Biotechnol, 34(9), 933-941 (2016). 
Rath, D., Amlinger, L., Rath, A., & Lundgren, M. (2015b, October 15). 
The CRISPR-Cas immune system: Biology, mechanisms and 
applications. Biochimie, Vol. 117, pp. 119–128. 
Rong, Y. S., Titen, S. W., Xie, H. B., Golic, M. M., Bastiani, M., 
Bandyopadhyay, P., ... & Golic, K. G. (2002). Targeted 
mutagenesis by homologous recombination in D. melanogaster. 
Genes & development, 16(12), 1568-1581. 
Sander, J. D., & Joung, J. K. (2014). CRISPR-Cas systems for 
genome editing, regulation and targeting. Nature biotechnology, 
32(4), 347. 
Santaló-Pedro, J. (2017). Edición genómica. La hora de la reflexión. 
Revista de Bioética y derecho, (40), 157-165. 
Santoyo, G. (2008). Recombinería en bacterias: ingeniería del ADN 
usando recombinación homóloga. Revista Latinoamericana de 
Microbiología, 50(1-2), 38-47. 
Sorek, R., Kunin, V., & Hugenholtz, P. (2008). CRISPR—a 
widespread system thai provides acquired resistance against 
phages in bacteria and archaea. Nature Reviews Microbiology, 
6(3), 181-186. 
Stadtmauer, E. A., Fraietta, J. A., Davis, M. M., Cohen, A. D., Weber, 
K. L., Lancaster, E., ... & Tian, L. (2020). CRISPR-engineered T 
cells in patients with refractory cancer. Science, 367(6481). 
Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., & Vale, 
R. D. (2014). A Protein-Tagging System for Signal Amplification 
in Gene Expression and Fluorescence Imaging. Cell, 159(3), 
635–646. 
 
40 
 
Tian, P. et al. (2017) ‘Fundamental CRISPR-Cas9 tools and current 
applications in microbial systems’, Synthetic and Systems 
Biotechnology. Elsevier Ltd, pp. 6– 12. 
Valor, J. V. (2018). De verdugo a cirujano del genoma (Doctoral 
dissertation, Universidad Complutense). 
Vetcher, D. (2017). Impacto y oportunidad de CRISPR-Cas9 en 
Cardiología.Revista Argentina de Cardioangiología 
Intervencionista, 8(2), 62-66. 
Villanueva-Cañadas, E. (2019). La ética del CRISPR. ACTUALIDAD 
MÉDICA, 151. 
Watson, J. D., & Crick, F. H. (1953, January). The structure of DNA. 
In Cold Spring Harbor symposia on quantitative biology (Vol. 18, 
pp. 123-131). Cold Spring Harbor Laboratory Press. 
Yosef, I., Goren, M.G. y Qimron, U., 2012. Proteins and DNA 
elements essential for the CRISPR adaptation process in 
Escherichia coli. Nucleic Acids Research, 40(12), pp.5569–5576.