Biologia de los microorganismos-1068 (411)

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G E N Ó M I C A M I C R O B I A N A 195
U
N
ID
A
D
 2
secuenciación actuales utilizan la secuenciación al azar. El aná-
lisis de un genoma comienza usualmente con la construcción de 
una biblioteca genómica, que es la clonación molecular de frag-
mentos de DNA que cubren todo el genoma ( Sección 11.4). 
En la secuenciación al azar, se corta el genoma en fragmen-
tos que son clonados, y estos fragmentos son secuenciados. En 
este punto no se conoce el orden ni la orientación de estos frag-
mentos de DNA. Los fragmentos son analizados por un ordena-
dor que busca secuencias solapadas y ensambla los fragmentos 
secuenciados en el orden correcto. Por su propia naturaleza, en el 
método al azar muchas secuencias son redundantes. Para asegu-
rar una cobertura completa del genoma es necesario secuenciar 
un gran número de clones, muchos de los cuales son idénticos o 
casi idénticos. Usualmente, para un fragmento dado del genoma 
se obtienen de 7 a 10 réplicas de esa secuencia (conocido como 
cobertura de 7 a 10 veces). Esta cobertura reduce en gran parte 
los errores en la secuencia porque la redundancia en la secuen-
ciación permite seleccionar un nucleótido consenso en cualquier 
punto de la secuencia en el que pueda existir ambigüedad.
Para que una secuenciación al azar tenga éxito, el proceso de 
clonación tiene que ser eficaz (se necesitan muchos clones) y, en 
la medida de lo posible, los fragmentos de DNA clonados debe-
rían generarse aleatoriamente. Esto se puede hacer mediante 
digestión enzimática del DNA o por métodos f ísicos. Los frag-
mentos de DNA pueden ser purificados de acuerdo a su tamaño 
mediante electroforesis en gel ( Sección 11.1) antes de ser 
clonados y secuenciados.
Secuenciación del DNA de segunda generación
La palabra «generación» en la secuenciación del DNA indica 
los cambios tecnológicos principales que han brindado un 
aumento significativo de la velocidad de análisis, combinado 
con un descenso en el coste de secuenciar. La característica que 
define a la secuenciación de segunda generación es el uso de 
métodos masivos en paralelo. En otras palabras, un gran número 
de muestras son secuenciadas juntas en la misma máquina. Para 
esto se necesitaron dos requisitos fundamentales: miniaturiza-
ción y aumento del poder de los ordenadores. Los métodos de 
segunda generación generan datos de secuencia 100 veces más 
rápidamente que los métodos anteriores. Los tres métodos de 
segunda generación más usados son la pirosecuenciación 454 
de Life Sciences, secuenciación de Illumina/Solexa, y el método 
SOLiD de Applied Biosystems.
En el sistema 454 se corta el DNA en segmentos de cadena 
sencilla de unos cuantos cientos de bases y se une cada frag-
mento a una pequeña esfera. El DNA se amplifica por la reac-
ción en cadena de la polimerasa (PCR, Sección 11.3) y al 
final cada esfera contiene varias copias idénticas del DNA. 
Usando robots se colocan las esferas en unas placas de fibra 
óptica que contiene más de un millón de pocillos, cada uno de 
los cuales contiene justo una esfera.
La pirosecuenciación emplea la síntesis de una cadena comple-
mentaria de DNA por la DNA polimerasa, como en la secuencia-
ción de Sanger (Sección 6.2) (Figura 6.3). Pero en lugar de ocurrir 
la terminación de la cadena, cada vez que se incorpora una molé-
cula de ribonucleótido, se libera una molécula de pirofosfato. 
Esto proporciona la energía necesaria para activar la enzima 
luciferasa, emisora de luz, que está presente en cada pocillo. Los 
cuatro nucleótidos fluyen secuencialmente sobre la placa en un 
Secuenciación al azar 
La secuenciación al azar (shotgun sequencing) hace referen-
cia al proceso de preparación del DNA para la secuenciación y 
no a la secuenciación como tal. La mayoría de los proyectos de 
Cadena de DNA que se
quiere secuenciar
C G A C T C G A T T C
G C T G
3′
3′5′
5′
Cebador 
radiactivo
de DNA
Adición de DNA-polimerasa y una 
mezcla de los cuatro trifosfatos de 
desoxirribonucleótido; separación 
en cuatro tubos de reacción.
Adición de una pequeña cantidad de un solo trifosfato 
de didesoxirribonucleótido (ddGTP, ddATP, ddTTP o 
ddCTP) a cada tubo e inicio de la reacción.
ddGTP
A -G (2)
A G C T A A -G (7)
ddATP
A G C T -A (5)
A G C -T (4) A G -C (3)
A G C T A -A (6)
-A (1)
ddTTP ddCTP
La secuencia se lee desde abajo del gel como 
A G C T A A G. La secuencia del fragmento 
desconocido es 3′ T C G A T T C 5′
G A T C
Separación de los 
productos de 
reacción por 
electroforesis en gel 
e identificación por 
autorradiografía.
En la 
secuenciación 
automática cada 
base tiene su 
propio marcador 
fluorescente.
7
6
5
4
3
2
1
(a)
(b)
(c)
Productos de la reacción
A AG A GC T
Fragmento
más grande 
Fragmento
más pequeño
Figura 6.2 Secuenciación de DNA por el método de Sanger.
(a) Obsérvese que se deben realizar cuatro reacciones diferentes, una con
cada didesoxinucleótido. Como estas reacciones se realizan in vitro, el cebador
para la síntesis de DNA puede ser DNA. (b) Porción de un gel que contiene los
productos de reacción de (a). (c) Resultados de la secuenciación del mismo
DNA mostrado en (a) y (b), pero usando un secuenciador automatizado y
marcas fluorescentes. Los fragmentos de DNA se separan por su tamaño
en una única columna capilar y cada didesoxirribonucleótido marcado
fluorescentemente es detectado con un detector laser.
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