Biologia de los microorganismos-1068 (81)

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30 L O S F U N D A M E N T O S D E L A M I C R O B I O L O G Í A
de fases llamado anillo de fases, que genera una imagen oscura 
sobre un fondo claro (Figura 2.5b; véase también la inserción de 
la Figura 2.1). El anillo consiste en una placa de fases que ampli-
fica las variaciones de fase y produce una imagen de mayor con-
traste.
En el microscopio de campo oscuro, la luz llega a la muestra 
únicamente desde los lados. La única luz que recibe la lente es 
la que dispersa la muestra, de modo que esta aparece clara en un 
fondo oscuro (Figura 2.5c). La resolución en la microscopía de 
campo oscuro suele ser mejor que la de la microscopía óptica, 
y algunos objetos que no se pueden distinguir en un microsco-
pio de campo claro o incluso en uno de contraste de fase tie-
nen buena resolución en los microscopios de campo oscuro. Es 
un método excelente para observar la motilidad microbiana, ya 
realizamos una tinción de contraste con un colorante diferente, 
normalmente la safranina, de color rojo, se pueden distinguir 
los dos tipos de células al microscopio por su color (Figura 2.4b).
La tinción de Gram es el procedimiento más habitual de tin-
ción en microbiología, y normalmente se usa como primer paso 
para la caracterización de bacterias recién aisladas. Si se dis-
pone de un microscopio de fluorescencia, la tinción de Gram 
se puede reducir a un solo paso, porque las células grampositi-
vas y las gramnegativas emiten fluorescencia de distinto color 
cuando se tratan con una sustancia especial (Figura 2.4c).
Microscopía de contraste de fases y de campo oscuro
Aunque los colorantes se usan mucho en microscopía óptica, la 
tinción mata las células y puede alterar sus características. Hay 
dos formas de microscopía óptica que mejoran el contraste de 
la imagen de células sin teñir (y, por tanto, vivas). Se trata de la 
microscopía de contraste de fases y la microscopía de campo 
oscuro (Figura 2.5). En concreto, el microscopio de contraste de 
fases se usa mucho en docencia y en investigación para la obser-
vación de preparaciones vivas.
La microscopía de contraste de fases se basa en el principio 
según el cual las células tienen un índice de refracción (un factor 
por el cual la luz es más lenta cuando pasa a través de un mate-
rial) diferente al del medio que la rodea. Así pues, la luz que 
atraviesa una célula tiene una fase distinta de la que atraviesa 
el líquido circundante. Esta sutil diferencia es amplificada colo-
cando un dispositivo en el objetivo del microscopio de contraste 
Extender una fina capa del 
cultivo sobre el portaobjetos
Secar al aire
Pasar el portaobjetos 
por una llama para 
fijar por calor
Verter colorante en el 
portaobjetos: enjuagar
y secar
Depositar una gota de aceite
en el portaobjetos; examinar
con un objetivo de 100 aumentos
Portaobjetos
100×
Aceite
1. Preparación de un frotis
2. Fijación mediante calor y tinción
3. Microscopía
Figura 2.3 Tinción de células para su observación microscópica.
Los colorantes mejoran el contraste entre las células y su entorno. Centro: 
las mismas células que en la inserción de la Figura 2.1 pero teñidas con un 
colorante básico.
(a)
1. Verter cristal violeta
durante 1 minuto en
el frotis fijado por calor
Todas las células 
moradas
2. Añadir solución
de yodo durante
1 minuto
Todas las células siguen 
siendo moradas
3. Decolorar brevemente
con alcohol (unos
20 segundos)
Las células grampositivas 
son moradas; las 
gramnegativas, incoloras
4. Realizar tinción de
contraste con
safranina durante
1 a 2 minutos
Las células grampositivas 
(G+) son moradas; las 
gramnegativas (G–) son 
rosa
G–
G+
(b) (c)
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ResultadoProcedimiento
Figura 2.4 Tinción de Gram. (a) Pasos de la tinción. (b) Observación
al microscopio de bacterias grampositivas (moradas) y gramnegativas 
(rosa); son Staphylococcus aureus y Escherichia coli, respectivamente. 
(c) Células de Pseudomonas aeruginosa (gramnegativa, verde) y Bacillus
cereus (grampositiva, naranja) teñidas con un método fluorescente de un
solo paso. Este método permite diferenciar las células grampositivas de las
gramnegativas en un solo paso.
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