Biologia de los microorganismos-1068 (1265)

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622 E C O L O G Í A M I C R O B I A N A Y M I C R O B I O L O G Í A A M B I E N T A L
En un experimento de análisis de comunidad típico se aísla 
el DNA completo de un hábitat microbiano (Figura 18.13). Para 
ello existen kits comerciales que ofrecen la posibilidad de obte-
ner DNA de gran pureza del suelo y otros hábitats complejos. 
El DNA obtenido es una mezcla de DNA genómico de todos los 
microorganismos presentes en la muestra (Figura 18.13). A partir 
de esta mezcla se usa la PCR para amplificar el gen diana y obtener 
muchas copias de cada variante (filotipo) de dicho gen. Si en lugar 
de DNA se aísla RNA (para detectar los genes que se están trans-
cribiendo), el RNA se puede convertir en DNA complementario 
(cDNA) por acción de la enzima transcriptasa inversa (  Sec-
ciones 9.11 y 27.10), y el cDNA se somete a PCR al igual que se 
hace con el DNA aislado. No obstante, independientemente de 
si se aísla DNA o RNA, después de la PCR es necesario clasificar 
los diferentes filotipos antes de secuenciarlos. Esta clasificación se 
puede realizar usando cualquiera de estos tres métodos diferen-
tes: (1) separación f ísica por electroforesis en gel; (2) construcción 
de una genoteca, y (3) por tecnología de secuenciación de última 
generación. A continuación examinaremos estos métodos.
Electroforesis en gel en gradiente desnaturalizante: 
separación de genes muy similares
Un método para resolver filotipos es la electroforesis en gel en 
gradiente desnaturalizante (DGGE, del inglés denaturing gra-
dient gel electrophoresis), que separa genes del mismo tamaño 
cuyo perfil de fusión (desnaturalización) varía por diferencias 
en su secuencia de bases (Figura 18.14a, b). La DGGE utiliza un 
gradiente de una sustancia desnaturalizante de DNA, normal-
mente una mezcla de urea y formamida. Cuando un fragmento 
de DNA bicatenario que se está moviendo a través del gel llega 
a una región que contiene el suficiente agente desnaturalizante, 
las cadenas empiezan a «fundirse»; en este momento su migra-
ción se detiene (Figuras 18.13 y 18.14b). Las diferencias en la 
secuencia de bases provoca diferencias en las propiedades de 
fusión del DNA. Así, las distintas bandas observadas en un gel 
de DGGE son filotipos cuyas secuencias de bases pueden dife-
rir significativamente o tan solo en una base.
Cuando se ha realizado la DGGE, las bandas se cortan y se 
secuencian de forma individual (Figura 18.13). Con el rRNA 
16S como gen diana, por ejemplo, el patrón de DGGE revela 
inmediatamente el número de filotipos (genes de rRNA 16S 
distintos) presentes en un hábitat (Figura 18.14c). El método 
proporciona un mecanismo excelente para evaluar con rapidez 
cambios temporales y espaciales en la estructura de la comuni-
dad microbiana (Figura 18.14c). Tras la secuenciación de cada 
banda de la DGGE se pueden determinar las especies presen-
tes en la comunidad por análisis filogenético ( Secciones 12.4 
y 12.5; Figura 18.13). Si se usan cebadores de PCR específicos 
para genes diferentes de los rRNA 16S, como algún gen meta-
bólico (Tabla 18.3), se puede evaluar también las variantes de 
este gen específico que existen en la muestra. Así, aunque el 
número de bandas de un gel DGGE nos ofrece un panorama 
general de la biodiversidad en un hábitat (Figura 18.14c), sigue 
siendo necesario el análisis de las secuencias para la identifica-
ción y para inferir las relaciones filogenéticas.
T-RFLP y ARISA
Otro método rápido de análisis de las comunidades micro-
bianas es el polimorfismo en la longitud de los fragmentos de 
ácidos nucleicos a una secuencia complementaria en un gen 
diana; (2) la DNA-polimerasa copia el gen diana; y (3) se sinteti-
zan muchas copias del gen diana mediante la fusión repetida de 
las cadenas complementarias, la hibridación de los cebadores y 
la nueva síntesis ( Figura 11.5). A partir de una sola copia del 
gen se pueden crear varios millones de copias.
¿Qué genes son adecuados como diana para los análisis de 
las comunidades microbianas? Como los genes que codifican 
los rRNA de las subunidades ribosómicas pequeñas (SSU) pro-
porcionan información filogenética y las técnicas para su análi-
sis están bien desarrolladas ( Secciones 12.4 y 12.5), son muy 
utilizados en los análisis de las comunidades. Además, como 
los genes del rRNA son universales y contienen varias regio-
nes muy conservadas, es posible amplificarlos a partir de cual-
quier organismo usando solo unos pocos cebadores diferentes, 
aunque los organismos puedan estar lejanamente emparenta-
dos filogenéticamente. Además de los genes de rRNA, también 
pueden ser genes diana los que codifican enzimas para funcio-
nes metabólicas exclusivas de un organismo específico o de un 
grupo de organismos relacionados (Tabla 18.3).
Los genes cuya secuencia ha ido cambiando con el tiempo a 
medida que las especies divergían, como los que codifican los 
rRNA, reciben el nombre de genes ortólogos ( Secciones 6.11 
y 12.5). Los organismos que comparten los mismos genes ortó-
logos, o muy similares, forman un filotipo. En ecología micro-
biana, el concepto de filotipo se usa principalmente para aportar 
un marco natural (filogenético) para describir la diversidad 
microbiana de un hábitat determinado, independientemente 
de si los filotipos identificados son organismos cultivados o no. 
Así, la palabra filotipo se usa mucho para describir la diversidad 
microbiana de un hábitat basándose únicamente en las secuen-
cias de ácidos nucleicos. Solo cuando se dispone de información 
fisiológica y genética adicional, normalmente cuando se ha con-
seguido cultivar el organismo en el laboratorio, es posible pro-
poner el nombre de género y especie para un filotipo.
Tabla 18.3 Genes de uso frecuente para evaluar procesos 
microbianos específicos en el medio usando PCR
Proceso metabólicoa Gen diana Enzima codificada
Desnitrificación narG
nirK, nirS
norB
nosZ
Nitrato-reductasa
Nitrito-reductasa
Óxido nítrico-reductasa
Óxido nitroso-reductasa
Fijación de nitrógeno nifH Nitrogenasa
Nitrificación amoA Amoniaco-monooxigenasa
Oxidación de metano pmoA Metano-monooxigenasa
Reducción de sulfato apsA
dsrAB
Fosfosulfato de adenosina-
reductasa
Sulfito-reductasa
Producción de metano mcrA Metilcoenzima M-reductasa
Degradación 
de compuestos 
de petróleo
nahA
alkB
Naftaleno-dioxigenasa
Alcano-hidroxilasa
Fotosíntesis 
anoxigénica
pufM Subunidad M del centro de 
reacción fotosintético
aTodos estos procesos metabólicos se tratan en el Capítulo 13 y en la 
Sección 3.17.
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