Biologia de los microorganismos-1068 (1267)

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M É T O D O S D E E S T U D I O E N E C O L O G Í A M I C R O B I A N A 623
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N
ID
A
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separar y se miden en un secuenciador automatizado de DNA 
que detecta fragmentos fluorescentes. Por tanto, solo los frag-
mentos terminales marcados con fluorescencia son detectados. 
El patrón obtenido muestra la variación de secuencias de rRNA 
en la comunidad microbiana de la que se ha extraído la mues-
tra (Figura 18.13).
Tanto la DGGE como el T-RFLP miden la diversidad de genes 
individuales, pero de forma diferente. El patrón de bandas en 
un gel de DGGE refleja el número de variantes de secuencias 
de la misma longitud de un solo gen (Figura 18.14), mientras 
que el patrón de bandas de un gel de T-RFLP refleja las varian-
tes que difieren en la secuencia del DNA según las diferencias 
en los sitios de corte de las enzimas de restricción. La infor-
mación que se obtiene a partir de un análisis de T-RFLP, ade-
más de aportar datos sobre la diversidad y la abundancia de 
restricción terminales (T-RFLP, del inglés terminal restriction 
fragment length polymorphism). En este método se amplifica un 
gen diana (normalmente un gen de rRNA) por PCR a partir del 
DNA de la comunidad usando un conjunto de cebadores en el 
que uno de ellos está marcado en un extremo con un colorante 
fluorescente. Los productos de la PCR se tratan con una enzima 
de restricción ( Sección 11.1) que corta el DNA en secuen-
cias específicas. Se suelen usar enzimas de restricción con sitios 
de reconocimiento de solo cuatro pares de bases porque cor-
tan frecuentemente dentro de un producto de la PCR relativa-
mente corto. Esto genera una serie de fragmentos de DNA de 
longitud variable cuya cantidad depende del número de sitios 
de restricción presentes en el DNA. A continuación, los frag-
mentos terminales marcados con fluorescencia se separan por 
electroforesis en gel y los productos de digestión se vuelven a 
Comunidad
microbiana
Secuencia Secuencia
Muestra
Muestra
Muestra
DNA
Bacillus subtilis
Bacillus cereus
Bacillus megaterium
Env 2
Clostridium histolyticum
Env 3
Env 1
PCR
Todos
los genes 
de rRNA
16S
Gel de
T-RFLP
Gel
Diferentes
genes de
rRNA 16S
Gel DGGE
1 2 3 4
1 2 3 4
1 2 3 4
+
–
Extracción del DNA
total de la comunidad
Amplificación mediante
PCR utilizando
cebadores marcados
con fluorescencia
Digestión con
enzima de
restricción
y migración
en gel
Escisión de
las bandas
Generación 
del árbol 
a partir de los
resultados
usando cebadores
específicos
de endosporas
Generación 
del árbol 
a partir de los
resultados
usando cebadores
específicos
de endosporas
Amplificación de los genes 
de rRNA 16S usando 
cebadores generales (por 
ejemplo, específicos de 
bacterias) o más 
restrictivos (dirigidos a 
bacterias formadoras de 
endosporas)
Se corren en 
DGGE los genes 
de rRNA 16S de 
cada muestra
Se escinden las bandas y se 
secuencian directamente 
con un secuenciador de 
última generación o se 
clonan antes de secuenciar 
los genes de rRNA16S
Figura 18.13 Etapas en un análisis de biodiversidad de un único gen en una comunidad microbiana. A partir del DNA total de la comunidad, se amplifican
genes de rRNA 16S usando, en el ejemplo de la DGGE, cebadores específicos de Firmicutes, un grupo de bacterias grampositivas que incluye los géneros formadores de 
endosporas Bacillus y Clostridium. Las bandas de PCR se cortan y los diferentes genes de rRNA 16S se separan por clonación o por DGGE. Después de la secuenciación 
se genera un árbol filogenético. «Env» indica una secuencia medioambiental (filotipo). En los análisis de T-RFLP, el número de bandas indica el número de filotipos.
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