Manual de prácticos de Microbiología

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Manual de prácticos de Microbiología-Dra.V.Papone Página 1 
Facultad de Odontología 
Universidad de la República Oriental del Uruguay 
 
CÁTEDRA DE MICROBIOLOGÍA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Dra. Virginia Papone Yorio 
 
Prof. Cátedra de Microbiología 
Directora de Carreras de Asistente e Higienista 
 
 
Actualización 2022 
Integrantes catedra Microbiología 
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Índice 
 
Morfología microscópica…………………..………….3 
 Cocos…………………………………………………….4 
 Bacilos…………………………………………………10 
 BAAR……………………………………………………18 
 Espiroquetas………………………………………..20 
Levaduras……………………………………………22 
 
Medios de cultivo…………………………………..……25 
 Clasificación…………………………………………30 
 Preparación…………………………………………36 
 Crecimiento bacteriano………………………..40 
 
Morfología macroscópica……………………..…….41 
 En placa……………………………………………….42 
 En medio liquido…………………………………..70 
 Morfología fúngica……………………………….75 
 
Pruebas bioquímicas…………………………………..80 
 
Bibliografía……………………………………………….112 
 
 
 
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Facultad de Odontología 
Universidad de la República Oriental del Uruguay 
 
CÁTEDRA DE MICROBIOLOGÍA 
 
 
 
 
 
MORFOLOGÍA 
MICROSCÓPICA 
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Observación de cocos Gram positivos 
 
 
 
 
Coloración de Gram de control 
bacteriológico de conducto radicular 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Pseudohifa 
Observación de cocos Gram positivos 
 
 
 
 
 
 
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Observación de cocos Gram positivos 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Coloración de Gram de un control 
bacteriológica de conducto radicular 
 
diplococo 
 
 
coco aislado 
Observación de cocos Gram positivos 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Observación de cocos Gram negativos 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Observación de cocos Gram negativos 
 
 
 
Coloración de Gram de 
Neisseria sp 
 
 
 
 
 
coco aislado 
diplococo 
 
 
 
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Observación de bacilos Gram positivos 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Observación de bacilos Gram positivos 
 
Coloración de Gram de colonias de 
Lactobacilus aislados de saliva 
(medio de Rogosa) 
Coloración de Gram de colonias de 
Lactobacilus aislados de saliva 
(medio de Rogosa) 
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Observación de bacilos Gram positivos 
 
 
Bacilos Gram positivo 
agrupación tiipo coryne) 
Coloración de Gram de colonias de Corynebacterium sp. 
Coloración de Gram de colonias de 
Lactobacillus aislados de saliva 
(medio de Rogosa) 
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Observación de bacilos Gram positivos 
 
 Coloración de Gram de colonias de 
Lactobacilus aislados de saliva 
(medio de Rogosa) 
 
 
 
 
 
 
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Observación de bacilos Gram positivos 
 
 
 
 
 
 
 
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Observación de bacilos Gram positivos 
 
 
 
 
 
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Bacilos Gram positivos esporulados 
 
 
 
 
 
 
Observación de bacilos Gram negativos 
 
 Cororación de Gram de colonias de 
Pseudomonas aeruginosa 
 
 
 
 
 
 
 
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Observación de bacilos Gram negativos 
 
 
 
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Observación de bacilos ácido alcohol 
resistentes (B.A.A.R) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Técnica de coloración de Ziehl Neelsen 
de una muestra de esputo de un 
paciente con tuberculosis pulmonar 
 
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Observación de bacilos ácido alcohol 
resistentes (B.A.A.R) 
 
 
 
 
Técnica de coloración de Ziehl Neelsen 
de una muestra de esputo de un 
paciente con tuberculosis pulmonar 
 
 
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Observación de espiroquetas 
18 
Observación de espiroquetas 
(en fresco) 
 
Observación de espiroquetas 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Observación de levaduras 
 
 
 
 
Coloración de Gram de colonias de 
levaduras aisladas en medio de Biggy 
 
 
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Coloración de Gram de colonias de 
levaduras aisladas en medio de Biggy 
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Observación de levaduras 
 
 
 
 
Coloración de Gram de muestras 
obtenidas de queilitis angular 
 
 
 
 
 
 
 
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CÁTEDRA DE MICROBIOLOGÍA 
 
 
 
MEDIOS 
DE 
CULTIVO 
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MEDIOS DE CULTIVO. 
 
 
Definición: Un medio de cultivo está formado por un conjunto de 
nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes que crean 
las condiciones necesarias para el crecimiento y la multiplicación de 
los microorganismos en el laboratorio. Son una mezcla de 
nutrientes que, en concentraciones adecuadas y en condiciones 
físicas óptimas, permiten el crecimiento de los microorganismos. 
 
La mayoría de las bacterias patógenas requieren nutrientes 
complejos similares en composición a los líquidos orgánicos del 
cuerpo humano. Se utilizan para aislar las diversas especies, 
proceder a identificarlas o llevar a cabo estudios complementarios. 
 
Hay microorganismos poco exigentes, que pueden crecer en medios 
simples o en cualquier medio; otros necesitan un medio más rico para 
su crecimiento, son los microorganismos exigentes. No existe un 
medio universal para todos los microorganismos. 
 
Los macronutrientes se pueden presentar en forma de cationes: 
potasio (K+) que interviene en la actividad enzimática y en la síntesis 
de proteínas; calcio (Ca++) presente en la endoespora, dándole 
termorresistencia a la misma; hierro (Fe++ y Fe+++) que forma parte 
de los citocromos y es cofactor de enzimas y proteínas 
transportadoras de electrones; magnesio (Mg++), que es cofactor 
enzimático y forma complejos con el ATP, y estabiliza los ribosomas 
y las membranas celulares. 
 
Los macroelementos que son componentes de hidratos de carbono, 
lípidos, proteínas y ácidos nucleicos que necesitan son: carbono (C), 
necesario en la construcción de moléculas orgánicas. Las moléculas 
con carbono, aportan a su vez hidrógeno y oxígeno, utilizadas como 
fuente de energía (en reacciones oxido-reducción); nitrógeno 
(N),necesario para sintetizar aminoácidos, purinas, pirimidinas, 
algunos hidratos de carbono y lípidos, cofactores de enzimas y otras 
sustancias; fósforo (P) ,presente en los ácidos nucleicos, fosfolípidos, 
nucleótidos como el ATP, varios cofactores, algunas proteínas y otros 
componentes celulares. La fuente es el fosfato inorgánico; azufre (S), 
necesario para la síntesis de sustancias como los aminoácidos 
cisteína y metionina, algunos hidratos de carbono, biotina y tiamina. 
La fuente de azufre es el sulfato.Los micronutrientes son necesarios en muy pequeñas cantidades: 
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manganeso, zinc, cobalto, molibdeno, níquel y cobre. Estos son 
parte de enzimas y cofactores, facilitan la catálisis de reacciones y 
ayudan a mantener la estructura de la membrana. 
Los factores de crecimiento son compuestos orgánicos necesarios 
para los componentes celulares, que no pueden ser sintetizados por 
los microorganismos como: los aminoácidos, para síntesis de 
proteínas; las purinas y pirimidinas, para síntesis de ácidos nucleicos 
y las vitaminas, como cofactores enzimáticos. 
 
Condiciones físico químicas: 
 
Para poder estudiar adecuadamente los microorganismos en el 
laboratorio es necesario poder cultivarlos, para ello es necesario 
conocer sus requerimientos nutricionales y condiciones físico 
químicas. 
Los microorganismos requieren para su crecimiento y multiplicación 
determinadas condiciones: 
 
1- Presión osmótica: La mayoría de los microorganismos que se 
desarrollan en soluciones con un contenido de NaCl de 0.1%, son 
denominados no halófilos, los que exigen concentraciones entre 3.5 
y 10% son los denominados halófilos. 
 
2- Temperatura: Dentro del margen en que se desarrollan se 
clasifican en: 
Psicrófilos: mínima 0ºC-----óptima 15ºC ---------- máxima 20ºC 
Psicrótofos: mínima 0ºC-----óptima 20ºC- 30ºC--- máxima 35ºC 
Mesófilos: mínima 15ºC----óptima 20ºC- 45ºC---máxima 45ºC 
Termófilos: mínima 45ºC---óptima 55ºC- 65ºC ------ máxima +65ºC 
Hipertermófilos: mínima 55ºC-- óptima 80º C-113ºC--máxima 113ºC 
 
Las bacterias patógenas para el hombre se encuentran en el grupo 
de los mesófilos. 
. 
3- pH: Los microorganismos tienen un potencial de hidrógeno óptimo 
para el crecimiento, tienen un pH mínimo y máximo para su 
desarrollo. 
 
4- Humedad: Los microorganismos están constituidos por un 80% de 
agua, dependen de ella para el intercambio de nutrientes y 
reacciones metabólicas, eliminación de sustancias de desecho. 
 
 
5- Requerimiento de O2: Los requerimientos de O2 de un grupo 
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determinado de bacterias refleja el mecanismo empleado para su 
obtención de energía. Pueden clasificarse: 
 
Aerobios estrictos: Requieren O2 para su crecimiento siendo inca- 
paces de crecer en su ausencia. 
 
Anaerobios facultativos: Pueden crecer en condiciones donde hay 
ausencia o presencia de O2, en este grupo se encuentran la 
mayoría de los patógenos. 
 
Microaerófilos: Crecen en concentraciones bajas de O2, siendo inhibidos 
en concentraciones de oxígeno normales. Su metabolismo es 
adaptado a condiciones no muy oxidantes. 
 
Anaerobios estrictos: Son aquellos que crecen en condiciones alta- 
mente reducidas, siendo incapaces de desarrollarse en presencia 
de O2. Los anaerobios aerotolerantes pueden tolerar el O2, pero son 
incapaces de utilizarlo metabólicamente. 
 
Los microorganismos para poder desarrollar en el laboratorio en 
condiciones de anaerobiosis se incuban en la jarra de anaerobiosis 
que consiste en una jarra en la cual se abre un sobre que libera al 
CO2 e hidrógeno. El oxígeno se elimina de la jarra por reacción 
catalítica con el hidrógeno liberado por el sobre, se mezcla con el 
oxígeno de la jarra. Se forma agua la cual se condensa en las paredes 
de la jarra. También se utilizan indicadores de óxido reducción que 
viran de color una vez que se ha logrado la anaerobiosis dentro de la 
jarra, verificando el procedimiento. 
 
 
Jarras de anaerobiosis 
 
 
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6- Dióxido de carbono: Casi todas las bacterias lo requieren en 
pequeñas cantidades, siendo suficiente el atmosférico o el obtenido 
como producto de la reacción oxidación fermentación. Las bacterias 
que desarrollan mejor en su presencia se denominan capnófilas. Para 
conseguir una atmósfera de CO2 de aproximadamente 3% a 5% 
colocamos las placas en una campana, prendemos una vela y 
tapamos la misma, una vez apagada la vela se obtiene esa 
concentración. Otra forma de obtener esa atmósfera es utilizando 
generadores de CO2 que al abrirlos liberan el mismo. Para conseguir 
una atmósfera de CO2 de 10% utilizamos la estufa de CO2. 
 
 
Campana de vidrio Jarra con generador de CO2 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Clasificación de los medios de cultivo.- 
 
POR SU ESTADO FÍSICO: 
1) Líquidos: se le denominan caldos, están constituidos por 
nutrientes en solución acuosa. 
2) Sólidos: se los llama agar (1-2 %) se obtiene cuando a un medio 
líquido se le agrega una sustancia gelificante como el agar. Se 
pueden colocar en placas de Petri o en tubos, en estos últimos el 
medio se coloca en el tubo y se lo deja solidificar en forma 
inclinada. En estos medios se siembra habitualmente en 
superficie. 
3) Semisólidos: Tienen un menor contenido de agar (0,3 - 0,5 %).En 
estos medios se siembra en picadura. 
 
 
 
Caldo simple Agar simple inclinado (pico de flauta) 
 
 
Medio semisólido Agar simple en placa de Petri 
 
POR SU ORIGEN: 
1) Naturales: se obtienen de sustancias naturales animales o vegetales, 
su composición no es rigurosamente constante. 
2) Sintéticos o artificiales- su composición es rigurosamente definida. 
3) Semisintéticos o semidefinidos: se obtienen agregándole factores de 
crecimiento a los medios sintéticos. Su composición química no se 
conoce con exactitud. 
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POR SU UTILIDAD: 
1) Simples: permiten el desarrollo de microorganismos no 
exigentes, como el caldo peptonado y el agar peptona. 
 
Caldo peptonado Agar peptona 
 
 
2) Enriquecimiento: favorecen el crecimiento de los 
microorganismos que están en bajo número. Por ejemplo 
el medio utilizado para hemocultivos. 
Medio para hemocultivo 
 
 
Un medio de enriquecimiento es el tioglicolato. Es un caldo muy 
utilizado que contiene cistina, tioglicolato de sodio, peptona, glucosa, 
cloruro de sodio y trazas de agar que le da viscosidad y le dificulta 
las corrientes de convección impidiendo la entrada del oxígeno. Este 
medio antes de sembrar se debe regenerar en baño maría durante 
10 minutos, puede tener un indicador de óxido- reducción que puede 
ser la resarzurina o el azul de metileno. Es un caldo rico que permite 
el desarrollo de microorganismos exigentes: aerobios, anaerobios, 
facultativos y microaerófilos. Por las características de la 
composición del medio y por la forma de distribución se utilizan tubos 
largos y finos. 
Hay también medios de enriquecimiento selectivos como el agua 
peptonada alcalina, por ejemplo para el desarrollo de Vibrio cholerae 
que desarrolla más rápidamente que los otros gérmenes de la flora 
intestinal. 
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3) Selectivos: permiten el crecimiento de un tipo de 
microorganismos determinado, inhibiendo el desarrollo de los 
demás. 
Dentro de los medios selectivos tenemos: 
Medio de Mac Conkey que permite el desarrollo de gran número de 
Enterobacterias y de bacilos Gram negativos. 
Medio de Mitis-salivarius que está compuesto por triptosa, peptona, 
glucosa, fosfato dipotásico, sacarosa (5%),agar e inhibidores como 
tripán azul y cristal violeta que permite el crecimiento solamente de 
cocos gram positivos inhibiendo bacilos gram positivos de la cavidad 
oral. 
Medio de Gold que contiene los mismos componentes que el medio 
mitis-salivarius, pero más cantidad de sacarosa(20%), y otros 
inhibidores que hacen más selectivo el medio para Streptococcus 
Grupo mutans , como es la bacitracina y el telurito de potasio. 
Medio de Rogosa que permite el crecimiento de Lactobacillus, 
contiene triptosa, extracto de levadura, glucosa, fosfato 
monopotásico, citrato amónico, acetato sódico, sulfato de 
manganeso, sulfato ferroso, sulfato manganésico y agar. 
Medio de Biggy es selectivo para el desarrollode levaduras, contiene 
citrato de amonio, bismuto, sulfato de sodio, dextrosa, 
glucosa,extracto de levadura y agar. 
 
4) Diferenciales: ponen en relieve propiedades que un determinado 
grupo de microorganismos posee. Detectan la capacidad de 
utilización o no de diferentes sustratos, por ejemplo la capacidad 
de producir ácido a partir de hidratos de carbono, la producción 
de polímeros a partir de sacarosa, la capacidad de desdoblar la 
esculina, la capacidad de detectar la presencia o no de 
hemolisinas con el agregado de sangre al medio base. 
Medio de Mac Conkey además de ser selectivo es diferencial porque 
permite diferenciar las enterobacterias que fermentan la lactosa 
desarrollando en este medio las colonias de un color rojizo o rosa, en 
contraste con el rosa pálido o translúcido que son las que no la 
fermentan. 
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Medio de lactosa rojo fenol en donde las colonias que fermentan la 
lactosa aparecen amarillas. 
 Medio mitis-salivarius que permite diferenciar las colonias que 
forman polímeros a partir de la sacarosa, desarrollando como 
colonias grandes de superficie brillante como gotas de rocío. 
 Medio de agar sangre que se prepara agregando sangre ovina estéril 
(5%) al medio base (agar), cuando este está fundido a baño María 
pero a una temperatura que no supere los 40ºC. Este medio rico 
permite ver los tipos de hemólisis: beta o total, alfa o parcial y gamma 
o no hemolítica. 
Debemos destacar aquí que si nosotros agregamos la sangre al 
medio cuando este está a una temperatura mayor de 45ºC, 
obtenemos agar chocolate, que es un medio rico ya que al agregar la 
sangre a esa temperatura los glóbulos se lisan, liberándose factores 
V y X. 
 
5) De transporte: asegura la viabilidad de los microorganismos 
desde el momento de la toma hasta su procesamiento en el 
laboratorio. Estos medios no deben potenciar el crecimiento 
microbiano, ejemplo: caldo solución de Ringer, medios de Stuart 
y el medio Cary y Blair. 
 
6) Especiales: restringido a un grupo de microorganismos 
determinados; las características de estos medios no se incluyen 
en esta presentación. Como ejemplo de medio especial citamos 
el medio de Lowenstein Jensen que es un medio que permite el 
desarrollo de Mycobacterium tuberculosis, contiene fosfato 
monopotásico, sulfato de magnesio, citrato de sodio, 
asparragina, glicerina, almidón de papa, huevos y verde de 
malaquita. Se distribuye en tubos inclinados. 
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Medios de cultivo 
Simple: agar peptona (arriba –izquierda) 
Selectivo: medio de Gold (arriba –derecha) 
Rico y diferencial: agar sangre (abajo -izquierda) 
Rico: agar chocolate (abajo-derecha) 
 
 
Selectivo y diferencial: medio mitis-salivarius (arriba –izquierda) 
Selectivo: medio de Rogosa (arriba –derecha) 
Selectivo: medio de Biggy (abajo -izquierda) 
Selectivo: medio de Gold (abajo-derecha) 
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Diferencial: agar lactosa rojo fenol (arriba –izquierda)- 
Selectivo y diferencial: medio de Mac Conkey (arriba –derecha) 
 
 
 
 
 
Medio de cultivo lactosa-rojo-fenol sembrado con 
microorganismos fermentadores de la lactosa y medio sin 
sembrar 
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Medio de cultivo Mac Conkey sembrado y sin sembrar 
 
 
PREPARACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO 
 
En la actualidad, la mayoría de los medios de cultivo se encuentran 
comercializados normalmente bajo la forma de liofilizados que es 
preciso rehidratar. 
En general, la preparación de un medio de cultivo se realiza pesando 
la cantidad deseada del mismo y disolviéndola en agua destilada 
(libre de inhibidores de crecimiento) siguiendo las instrucciones del 
fabricante. 
Antes de su esterilización los medios líquidos, se distribuyen en los 
recipientes adecuados (tubos, matraces o frascos); en ningún caso 
la altura del líquido en el recipiente debe exceder 1/3 del volumen 
total de este. Si es un medio sólido una vez preparado se distribuye 
en caliente en tubos, matraces o frascos. Luego se esterilizan en 
autoclave. 
Finalizada la esterilización en autoclave: 
a-Los medios líquidos se dejarán enfriar a temperatura ambiente 
b-Los medios sólidos contenidos en tubos deben inclinarse para 
que al solidificar adopten la forma de agar inclinado, si tal es su 
finalidad. 
c-Las placas de Petri pueden también ser preparadas ahora, 
vertiendo el medio aún fundido y estéril dentro de ellas en un 
ambiente aséptico (por ejemplo, en la proximidad de la llama de un 
mechero de Bunsen). 
Caldos y medios sólidos pueden conservarse, una vez esterilizados, 
a temperatura ambiente. Sin embargo, para reducir su 
deshidratación y el consiguiente cambio de la concentración de los 
componentes es preferible conservarlos a 4ºC en heladera. 
 
Manual de prácticos de Microbiología-Dra.V.Papone Página 37 
OBTENCIÓN Y MANTENIMIENTO DE CULTIVOS PUROS 
 
Un cultivo puro es aquel que contiene una sola clase de 
microorganismos. Para obtenerlo es necesario recurrir a las llamadas 
técnicas de aislamiento (separación de las bacterias). Normalmente 
el cultivo descendiente de una colonia es un cultivo puro. 
Un cultivo puro es necesario para: 
1- Determinar en forma segura las características morfológicas de 
las colonias. 
2- Reacciones de coloración de las bacterias. 
3- Para poder determinar las propiedades bioquímicas. 
4- Realizar reacciones serológicas, etc. 
 
Técnicas de aislamiento: 
1) Aislamiento por agotamiento por estrías o aislamiento en 
superficie: 
Se trata de un método rápido y simple de agotamiento progresivo y 
continuo del inóculo sobre un medio sólido contenido en una placa 
de Petri. El objetivo es obtener a partir de un elevado nº de bacterias, 
un nº reducido de ellas, distribuidas individualmente sobre la 
superficie de la placa de Petri. 
Al incubar ésta, cada una de las bacterias originará una colonia. Para 
el aislamiento se utiliza una herramienta denominada asa o ansa 
bacteriológica. Consiste en un trozo de alambre de platino o cromo 
níquel terminando en un círculo de aproximadamente 3 mm de 
diámetro sostenido por un mango. 
Debe colocarse la placa en posición invertida sobre la mesa de 
trabajo, tomando la parte que contiene el medio de cultivo, levantarla 
hasta la altura de la llama del mechero, con ella en la posición casi 
vertical, se realizarán las sucesivas tandas de estrías. Se realizan las 
descargas en forma sucesivas en 3 sectores de la placa. 
 
1 2 3
Manual de prácticos de Microbiología-Dra.V.Papone Página 38 
2) Aislamiento en placas incluidas: 
Se usa con distintos fines: 
a- Para determinar el nº aproximadamente de organismos viables 
de una muestra líquida por unidad de volumen (leche, agua, orina). 
b- Para determinar la actividad hemolítica en profundidad de 
algunos microorganismos como los estreptococos. 
c- También es usado para separar colonias en cultivos mixtos. 
Para aislamiento de bacterias anaerobias. 
Se utiliza un tubo conteniendo 20 cc de medio sólido, apropiado para 
el desarrollo de la especie que queremos estudiar. Se funde a baño 
María y se deja enfriar hasta una temperatura entre 40-45ºC. Esta 
temperatura es crítica cuando se hace el inóculo, ya que a 
temperaturas más bajas el agar se solidifica, y si se excede de los 
50º C, se corre el riesgo de destruir el inóculo. Se mezcla 
homogéneamente el inóculo para obtener en el cultivo colonias 
aisladas. El contenido del tubo es vertido en una placa Petri estéril, 
se espera su solidificación y se incuba. La incubación debe ser 
alrededor de los 34ºC a 37ºC durante por lo menos 24 horas, 
extendiendo su lectura según el tipo de microorganismo estudiado. 
 
Diluciones seriadas: 
Frecuentemente las muestras que hay que estudiar tienen un nº 
muy elevado de microorganismos, por lo que se requiere diluirlas 
para poder contarlas (se originan colonias separadas). 
Para ello se realizandiluciones seriadas, que posteriormente se 
siembran en placas con medios de cultivo. 
Esta técnica de recuento nos permite conocer el nº de micro- 
organismos viables en una determinada muestra. Definimos en este 
caso la viabilidad como la capacidad del microorganismo para 
multiplicarse en un medio sólido formando una colonia. 
Ejemplo de técnica: 
Se necesitan 4 tubos con 9 ml de una solución salina estéril. Con una 
pipeta se toma 1ml de la muestra problema, se añade al primer tubo, 
se homogeiniza totalmente la suspensión. De esta forma, hemos 
conseguido diluir la muestra inicial 10 veces (factor de dilución 10-1). 
Repetir la misma operación a partir de esta primera dilución para 
conseguir la dilución 10-2, y así sucesivamente. Se siembran al 
menos 2 placas con 0,1 ml de cada una de las tres últimas diluciones 
realizadas. 
 
Este inóculo debe extenderse de forma homogénea por toda la 
superficie de la placa para lo cual utilizaremos la varilla de vidrio 
acodada. Incubar las placas a 37ºC durante 24 horas. 
Manual de prácticos de Microbiología-Dra.V.Papone Página 39 
Después de la incubación examinar las placas(lectura). Para el 
recuento se procurará utilizar las placas que contienen entre 30 y 
300 colonias (un nº menor puede suponer la presencia de error y un 
nº mayor puede ser excesivo para poder contarlas exactamente). El 
nº de UFC/ml (unidades formadoras de colonias por ml) de la muestra 
original será: 
Nº de UFC/ml = Nº de colonias x Factor de dilución 
 
 
INCUBACIÓN 
 
Todas las placas se deben incubar con la tapa hacia abajo y el medio 
hacia arriba para evitar la condensación del agua y que se moje el cultivo. 
Si no se conoce los requerimientos de atmósfera del microorganismo, éste 
se debe incubar en paralelo en aerobiosis, anaerobiosis y en atmósfera 
enriquecida de CO2.La mayoría de las bacterias patógenas para el hombre 
se incuban a 37ºC .Las jarras de anaerobiosis se dejan incubar como 
mínimo 48 horas. 
Estufa de cultivo 
 
Manual de prácticos de Microbiología-Dra.V.Papone Página 40 
CRECIMIENTO BACTERIANO 
 
El crecimiento bacteriano se caracteriza por aumento del número. 
Este proceso se realiza por fisión simple o binaria. 
El tiempo en el que se produce la duplicación de la célula se conoce 
como tiempo de generación. Este proceso no alcanza la misma 
velocidad en todas las especies sino que es distinto en cada una, 
aunque hay factores estimulantes que pueden influir algo. 
El crecimiento bacteriano tiene distintas fases: 
1- Fase de latencia: reorganización de sistemas enzimáticos, aumento 
de actividad metabólica, incremento de la biosíntesis bacteriana. 
2- Fase exponencial: aumento de número, consumo de nutrientes, 
elevada actividad metabólica. 
3- Fase estacionaria: equilibrio entre el número de células viables y 
no viables, las bacterias reducen su tamaño. 
4- Fase de muerte: acumulación de factores adversos, pérdida de la 
viabilidad. 
 
 
 
 
 
Esquematización de una curva de crecimiento bacteriano. 
A -Logaritmo del nº de células. 
B Tiempo 
1-Fase de latencia 2-Fase de crecimiento exponencial o 
logarítmico 3-Fase estacionaria 4-Fase de declinación o muerte 
 
 
 
 
 
 
 
 
Agradecimiento: a la Dra. Verónica Abella, Dra. Carolina Leal y Sra. Mirta Ruibal 
por su colaboración. 
Manual de prácticos de Microbiología-Dra.V.Papone Página 41 
 
 
Facultad de Odontología 
Universidad de la República Oriental del Uruguay 
 
CÁTEDRA DE MICROBIOLOGÍA 
 
 
 
 
 
MORFOLOGÍA 
MACROSCÓPICA 
Manual de prácticos de Microbiología-Dra.V.Papone Página 42 
ESTUDIO DE LA MORFOLOGÍA 
MACROSCÓPICA DE LAS BACTERIAS 
 
 
En el lugar donde se deposita una bacteria sobre el agar su 
multiplicación se traduce en la formación de una masa 
macroscópicamente visible denominada colonia, que es un clon 
procedente de una misma bacteria. 
El estudio de las características de cada colonia nos sirve para su 
identificación. 
Se estudian los siguientes caracteres: 
 
MORFOLOGÍA MACROSCÓPICA EN PLACA 
 
Para medios sólidos: 
• TAMAÑO 
*Aproximadamente en milímetros 
• FORMA 
*Circular 
 
Manual de prácticos de Microbiología-Dra.V.Papone Página 43 
 
 
 
 
*Irregular 
 
 
 
 
Manual de prácticos de Microbiología-Dra.V.Papone Página 44 
 
*Rizoide 
*Filamentosa 
 
Manual de prácticos de Microbiología-Dra.V.Papone Página 45 
• ELEVACIÓN O CORTE DE COLONIA 
*Plana 
 
*En meseta 
 
*Convexa o semicircular 
 
Manual de prácticos de Microbiología-Dra.V.Papone Página 46 
 
*Mamelonada 
 
Manual de prácticos de Microbiología-Dra.V.Papone Página 47 
 
 
*Umbilicada 
 
Manual de prácticos de Microbiología-Dra.V.Papone Página 48 
• BORDES 
*Regulares y enteros 
 
*Ondulados 
 
*Lobulados 
*Irregulares 
Manual de prácticos de Microbiología-Dra.V.Papone Página 49 
• SUPERFICIE 
*Lisa 
 
 
*Rugosa (colonias centrales) 
 
Manual de prácticos de Microbiología-Dra.V.Papone Página 50 
 
 
*CON CARÁCTERÍSTICAS TÍPICAS (forma de molar, forma de estrella, etc.) 
 
 
 
 
 
 
 
 
Manual de prácticos de Microbiología-Dra.V.Papone Página 51 
 
 
 
 
 
 
 
 
Manual de prácticos de Microbiología-Dra.V.Papone Página 52 
• COMPORTAMIENTO FRENTE A LA LUZ: REFLEJADA 
*Brillante 
 
*Mate 
 
 
• COMPORTAMIENTO FRENTE A LA LUZ: TRANSMITIDA 
*Opaca (no permite el pasaje de la luz a su través) 
*Traslúcida (permite el pasaje de la luz y la visibilidad de cualquier 
objeto a través de la colonia) 
Manual de prácticos de Microbiología-Dra.V.Papone Página 53 
• CONSISTENCIA 
*Butírica (consistencia similar a la manteca) 
*Mucoide (la colonia crecida sigue al asa cuando se toca con ésta, y 
se intenta separarla del medio. Esto es debido a la presencia de una 
voluminosa cápsula o de grandes cantidades de limo extracelular.) 
*Membranosa (crecimiento fino como una membrana, difícil de 
emulsionar) 
*Quebradiza (crecimiento seco, pero quebradizo bajo el asa.) 
 
 
• EMULSIONABILIDAD. Al realizar un frotis (preparado en 
portaobjetos) 
*Fácilmente emulsionable, dando una suspensión homogénea. 
*Granular o membranosa (difícil de emulsionar dando gránulos o 
trozos) 
 
• PIGMENTACION 
*Sin pigmento 
*Distintas variedades de pigmentos: Puede difundir al medio, sólo en la 
colonia, coloreándola. Pueden ser: rojo, negro, verde, naranja, etc. 
 
 
 
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Manual de prácticos de Microbiología-Dra.V.Papone Página 58 
 
• ACCION SOBRE EL MEDIO: 
• El medio puede ser: 
*Coloreado (por difusión de pigmentos al medio) 
*Sin modificaciones 
 
*Con formación de polímeros en medio de mitis-salivarius 
 
Manual de prácticos de Microbiología-Dra.V.Papone Página 59 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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*Con formación de polímeros en medio de Gold. 
 
 
 
 
 
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Manual de prácticos de Microbiología-Dra.V.Papone Página 64 
 
*En agar sangre puede presentar: 
 
 
Beta hemólisis: Hemólisis total. Las colonias están rodeadas por 
una zona de borde bien definido, clara, en la cual no pueden ser 
reconocidos glóbulos rojos, al microscopio óptico. Esta hemólisis no 
aumenta guardando el cultivo en la heladera. 
 
 
 
Manual de prácticos de Microbiología-Dra.V.Papone Página 65 
 
 
 
 
Manual de prácticos de Microbiología-Dra.V.Papone Página 66 
Alfa hemólisis: Hemólisis parcial. Es una decoloración de la sangre 
(queda de color verdoso) que rodea la colonia, de 1 a 3mm de 
diámetro. Los bordes no son nítidos. Al microscopio óptico pueden 
verse grupos de eritrocitos intactos dentro de esta zona. 
 
 
 
Manual de prácticos de Microbiología-Dra.V.Papone Página 67 
 
 
Gamma hemólisis: No hay actividad hemolítica 
 
Manual de prácticos de Microbiología-Dra.V.Papone Página 68 
• OLOR 
 
*Sin olor 
*Olor particular: 
Putrefacto 
Sui Géneris 
*Particular de cada especie. 
 
 
 
MORFOLOGÍA MACROSCÓPICA EN AGAR INCLINADO 
 
• TIPO DE DESARROLLO 
 
• PIGMENTACIÓN 
 
 
 
 
Manual de prácticos de Microbiología-Dra.V.Papone Página 69 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
• SUPERFICIE 
 
• BORDES 
 
• COMPORTAMIENTO FRENTE A LA LUZ: 
 
• TRANSMITIDA 
• REFLEJADA. 
 
 
• EMULSIONABILIDAD 
Manual de prácticos de Microbiología-Dra.V.Papone Página 70 
 
MORFOLOGÍA MACROSCÓPICA EN MEDIO LÍQUIDO 
 
• GRADO DE DESARROLLO, puede ser: 
*Ninguno 
*Ligero o escaso 
*Moderado 
*Denso 
 
 
• ASPECTO, puede dar: 
*Turbidez uniforme 
*Límpido con un depósito en el fondo 
 
Manual de prácticos de Microbiología-Dra.V.Papone Página 71 
 
 
**Filante (al agitarlo se desprende del fondo del tubo un espiral 
compacto, que asciende hacia la superficie.) 
 
Manual de prácticos de Microbiología-Dra.V.Papone Página 72 
• PIGMENTO: 
 
 
 
 
Manual de prácticos de Microbiología-Dra.V.Papone Página 73 
• FORMACIÓN O NO DE PELÍCULA 
*Anillo contra los bordes 
 
 
*Velo en la superficie 
 
Manual de prácticos de Microbiología-Dra.V.Papone Página 74 
 
 
 
 
 
 
 
Manual de prácticos de Microbiología-Dra.V.Papone Página 75 
ESTUDIO DE LA MORFOLOGÍA 
MACROSCÓPICA DE LOS HONGOS 
 
 
LEVADURAS 
 
 
HONGOS 
Micelio 
 
Manual de prácticos de Microbiología-Dra.V.Papone Página 76 
 
 
 
 
 
 
Pigmentos 
 
Manual de prácticos de Microbiología-Dra.V.Papone Página 77 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Manual de prácticos de Microbiología-Dra.V.Papone Página 78 
 
MEDIOS CROMOGÉNICOS PARA CULTIVO DE 
HONGOS 
 
Medio cromogénico que por su color permite 
diferenciar las diferentes especies de Cándida 
 
 
 
 
 
 
 
 
Manual de prácticos de Microbiología-Dra.V.Papone Página 79 
 
 
 
 
 
 
Manual de prácticos de Microbiología-Dra.V.Papone Página 80 
Facultad de Odontología 
Universidad de la República Oriental del Uruguay 
 
CÁTEDRA DE MICROBIOLOGÍA 
 
 
 
 
 
PRUEBAS 
BIOQUÍMICAS 
Manual de prácticos de Microbiología-Dra.V.Papone Página 81 
 
 
 
Pruebas bioquímicas: 
O-F: oxido-fermentación 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Manual de prácticos de Microbiología-Dra.V.Papone Página 82 
 
Pruebas bioquímicas: 
O-F ~ metabolismo oxidativo 
 
 
 
 
 
Manual de prácticos de Microbiología-Dra.V.Papone Página 83 
Pruebas bioquímicas: 
O-F 
Metabolismo fermentativo 
Manual de prácticos de Microbiología-Dra.V.Papone Página 84 
Pruebas bioquímicas: 
Gelatina 
 
 
 
 
 
 
 + 
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Pruebas bioquímicas: 
Movilidad~ positivo 
 
 
 
 
 
Manual de prácticos de Microbiología-Dra.V.Papone Página 86 
Pruebas bioquímicas: 
Test de oxidasa 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Manual de prácticos de Microbiología-Dra.V.Papone Página 87 
Pruebas bioquímicas: 
Test de oxidasa~positivo 
 
Manual de prácticos de Microbiología-Dra.V.Papone Página 88 
 
Pruebas bioquímicas: Medio de 
Mac Conkey~ colonias rosadas 
lactosa positivas 
 
 
 + 
Manual de prácticos de Microbiología-Dra.V.Papone Página 89 
Pruebas bioquímicas: 
Medio de lactosa rojo fenol~ 
 Colonias lactosa positivas 
 
 
 
 
 
 
 
 + 
Manual de prácticos de Microbiología-Dra.V.Papone Página 90 
Pruebas bioquímicas: 
Citrato de Simons~positivo 
 
Este medio indica la capacidad de las bacterias de metabolizar el 
citrato. Contiene citrato como única fuente de carbono, fosfato de 
amonio como única fuente de fosfato y azul de bromotimol como 
como indicador de pH. Únicamente las bacterias capaces de 
metabolizar citrato podrán multiplicarse en este medio, al utilizar los 
fosfatos presentes liberan iones amonio (básicos) que junto con la 
eliminación de citrato (ácido) generará una fuerte basificación del 
medio que será aparente con un cambio de color del indicador de pH 
de verde a azul. 
 
 
 
 + - 
Manual de prácticos de Microbiología-Dra.V.Papone Página 91 
Pruebas bioquímicas: 
Rojo de metilo 
 
Para la realización de estas dos pruebas se cultiva el microorganismo 
en caldo RMVP (medio de Clark y Lubs) y se incuba a 30ºC durante 
un periodo de 3 días como mínimo y 5 como máximo. Al revelar las 
pruebas, se separa el cultivo en dos porciones de unos 2,5ml que 
servirán para cada uno de los ensayos. 
 
Rojo de Metilo: A uno de los tubos se le añade unas gotas (4-5) de 
solución indicadora de Rojo de Metilo. Se agita para homogeneizar 
y se observa la coloración. Se considera positiva si vira al rojo y 
negativa si permanece amarillo. 
PRUEBA DE ROJO DE METILO 
Manual de prácticos de Microbiología-Dra.V.Papone Página 92 
 
 
 
Pruebas bioquímicas: 
Voges-Proskauer~negativo 
 
Las enterobacterias son anaerobios facultativos que utilizarán la 
glucosa en 2 fases: 
1. Metabolismo aeróbico (respiración oxibióntica) consumiendo 
rápidamente el oxígeno del medio 
2. Metabolismo anaeróbico (fermentación) que puede ser de 2 
tipos dependiendo de los productos finales obtenidos: 
2.1 fermentación ácido-mixta: productos finales son ácidos 
orgánicos (fórmico, acético, láctico y succínico) y etanol 
2.2 fermentación butilén glicólica: productos finales son 
compuestos neutros como el butanodiol y el etanol, produciéndose 
acetoína como intermediario. 
 
La liberación de ácidos orgánicos generará un acusado descenso del 
pH que podrá ser detectado añadiendo al medio un indicador de pH 
como el rojo de metilo (rojo a pH 4.0). 
Si la fermentación que se ha llevado a cabo produce acetoína 
puede ser detectada añadiendo al medio KOH y alfa-naftol que 
reaccionarán con este compuesto produciendo rojo característico.
Manual de prácticos de Microbiología-Dra.V.Papone Página 93 
 
 
 
Pruebas bioquímicas: 
Ornitina 
 
Descarboxilasas de aminoácidos (arginina, lisina, ornitina) Los 
aminóacidos al perder el grupo carboxilo se convierten en aminas lo 
que incrementa el pH del medio y el indicador (púrpura del 
bromocresol) vira a violeta. Las descarboxilasas son útiles en la 
diferenciación de enterobacterias. Las bacterias se inoculan en 
medios complejos que contienen lisina, ornitina o arginina al 1% y un 
indicador de pH (púrpura de bromocresol). 
 
 
 
 
 + - 
Manual de prácticos de Microbiología-Dra.V.Papone Página 94 
 
Pruebas bioquímicas: 
 
Fermentación de hidratos de 
carbono 
 
 
 
 
 
 
 - + 
 - - 
Manual de prácticos de Microbiología-Dra.V.Papone Página 95 
 
 
 
 
Pruebas bioquímicas: 
 
Fermentación de manitol 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 - + 
FERMENTACIÓN DE MANITOL EN PLACA 
Manual de prácticos de Microbiología-Dra.V.Papone Página 96 
Pruebas bioquímicas: 
Fermentación de triple azúcar 
(Con formación de gas) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 + 
Manual de prácticos de Microbiología-Dra.V.Papone Página 97 
 
 
 
 
Pruebas bioquímicas: 
Prueba de indol~positiva 
 
Mediante esta prueba se detecta la liberación de indol en un cultivo 
bacteriano. Dicha liberación se debe a la degradación del 
aminoácido triptófano mediante el enzima triptofanasa. 
Para la realización de esta prueba la bacteria se cultiva durante 
24-48 horas en un caldo de triptona con NaCl al 0,5% (la triptona 
presenta abundante triptófano). Para la posterior detección del 
indol se usa el reactivo de Kovacs que se puede preparar con los 
siguientes ingredientes: 
Alcohol amílico o isoamílico (puede sustituirse por alc.butílico)
 ........................................................................................................ 150ml 
p-dimetilamino-benzaldehído............................................... 10g 
HCl (concentrado) ................................................................ 50ml 
Se disuelve primero el aldehído en el alcohol y después se agrega 
lentamente a esta mezcla el ácido. Para el control de calidad del 
reactivo se pueden utilizar cultivos conocidos. Las más 
convenientes son Escherichia coli (indol+) y todas las especies de 
Klebsiella (indol-). 
Manual de prácticos de Microbiología-Dra.V.Papone Página 98 
 
 
 
Pruebas bioquímicas: 
Prueba de indol~positiva 
 
 
 
 
 
 
 
PRUEBA DE INDOL 
Manual de prácticos de Microbiología-Dra.V.Papone Página 99 
 
Pruebas bioquímicas: 
Prueba de 
fenilalanina~positiva 
 
Esta prueba determina la capacidad de un organismo para 
desaminar el aminoácido fenilalanina en ácido fenilpirúvico por su 
actividad enzimática de fenilalanina desaminasa, con la 
consiguiente acidez resultante. 
Se cultiva el microorganismo en agar fenilalanina sembrando la 
superficie con abundante inóculo e incubando durante 12-16 
horas. Seguidamente se añade 0,2ml de una solución de cloruro 
férrico al 10% de manera que inunde todo el crecimiento. La 
presencia de ácido fenilpirúvico (prueba positiva) se manifiesta por 
la aparición de un color característico verde oscuro o verde-
azulado. 
Manual de prácticos de Microbiología-Dra.V.Papone Página 100 
 
Pruebas bioquímicas: 
 
Prueba de fenilalanina 
 
 
 
 
 
 
PRUEBA DE FENILALANINA 
Manual de prácticos de Microbiología-Dra.V.Papone Página 101 
 
Pruebas bioquímicas: 
 
Haemophilus-influenzae Satelitismo 
con Staphilococcus aureus 
 
 
 
 
 
 
Manual de prácticos de Microbiología-Dra.V.Papone Página 102 
 
Pruebas bioquímicas: 
 
Test de catalasa 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 + - 
Manual de prácticos de Microbiología-Dra.V.Papone Página 103 
 
Pruebas bioquímicas: 
Test de catalasa ~ positivo 
 
 
 + 
 + 
Manual de prácticos de Microbiología-Dra.V.Papone Página 104 
 
Pruebas bioquímicas: 
 
Test de coagulasa 
 
 
 
 
 
 
 - + 
+ 
Manual de prácticos de Microbiología-Dra.V.Papone Página 105 
 
 
 
 
Pruebas bioquímicas: 
Prueba de la DNAsa 
 
Se basa en la presencia de la enzima termoestable DNAsa que es 
capaz de clivar los enlaces fosfodiester internos de la molécula de 
DNA. Se utiliza un medio sólido que contiene verde de metilo el cual 
se combina con DNA altamente polimerizado. Cuando la 
combinación no ocurre, por acción de la enzima DNAsa, se produce 
una decoloración del medio. 
 
 
 
Manual de prácticos de Microbiología-Dra.V.Papone Página 106 
 
 
 
 
Pruebas bioquímicas: 
Prueba de optoquina ~ negativo 
 
 
 
 
 
 + - 
Manual de prácticos de Microbiología-Dra.V.Papone Página 107 
 
 
 
 
Pruebas bioquímicas: 
Bilis esculina 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 + - 
Manual de prácticos de Microbiología-Dra.V.Papone Página 108 
 
 
 
 
Pruebas bioquímicas: 
Prueba de bacitracina 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Manual de prácticos de Microbiología-Dra.V.Papone Página 109 
 
 
 
 
 
 
 
Pruebas bioquímicas: 
Prueba de CAMP 
 
Se basa en que los estreptococos (B) producen un factor llamado 
CAMP (factor de mono-fosfato de adenina cíclica) que aumenta la 
zona de hemólisis producida por un estafilococo productor de ß lisina 
 
 
 
Manual de prácticos de Microbiología-Dra.V.Papone Página 110 
 
 
 
 
Pruebas bioquímicas: 
Sal tolerancia 
 
 
 
 
 
 
 
+ 
Manual de prácticos de Microbiología-Dra.V.Papone Página 111 
 
Pruebas bioquímicas: 
Sistemas para identificación de 
bacterias 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Manual de prácticos de Microbiología-Dra.V.Papone Página 112 
BIBLIOGRAFÍA 
 
 
 
• Díaz, R.; Gamazzo, C.;Löpez, L. Manual práctico de Microbiología, 
.Masson S.A. 
• Barcelona, 1995. 
 
• Liebana, J. Microbiología Oral .Ed. Interamericana, México, 2002. 
 
• Montiel, F.; Lam, M. Manual de Microbiología Clínica..Mediterráneo Ltda. 
• Santiago de Chile, 2001 
 
• Murray, P.;Baron E.; Pfaeller,M.Manual of Clinical Microbiology.Press. ASM 
Washington, 1995. 
 
• Negroni, M. Microbiología estomatológica..Ed. Panamericana, Argentina, 2009.