estudio-de-los-mecanismos-de-accion-de-ficotoxinas-marinas--0

Vista previa del material en texto

Universidad de Santiago de Compostela 
 
 
Estudio de los mecanismos de acción 
de ficotoxinas marinas 
 
Laura Alejandra Ardilla De la Rosa Carrillo 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
2001 
 
 
 
Tesis de Doctorado 
 
Facultad: Veterinaria 
 
Director: Dr. Luis M. Botana 
 
 
 
 
 
 
UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA 
 
FACULTAD DE VETERINARIA 
 
DEPARTAMENTO DE FARMACOLOGÍA 
 
 
 
 
 
 
 
 
Estudio de los mecanismos de acción de 
ficotoxinas marinas 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Tesis Doctoral 
Laura A. A. de la Rosa Carrillo 
Lugo, abril de 2001 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Luis Miguel Botana López, Catedrático de Farmacología de la Universidad de 
Santiago de Compostela, 
 
 
 INFORMA: 
 
Que la Tesis Doctoral titulada “Estudio de los mecanismos de acción de 
ficotoxinas marinas”, recogida en la presente memoria, de la que es autor 
la Licenciada en Oceanología, por la Universidad Autónoma de Baja 
California, México, Dña. Laura Alejandra Ardilla de la Rosa Carrillo, ha 
sido realizada bajo su codirección y cumple las condiciones exigidas para 
que su autor pueda optar al grado de Doctor por la Universidad de 
Santiago de Compostela, por lo que da su aprobación para la 
correspondiente lectura y defensa. 
 
Para que conste a los efectos oportunos, firma la presente en Lugo, a 6 de 
febrero de 2001. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Luis M. Botana López Laura A. A. de la Rosa Carrillo 
 Doctor en Farmacia 
 Codirector de Tesis 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Mercedes Rodríguez Vieytes, Profesor Titular de Fisiología de la Universidad de 
Santiago de Compostela, 
 
 
 INFORMA: 
 
Que la Tesis Doctoral titulada “Estudio de los mecanismos de acción de 
ficotoxinas marinas”, recogida en la presente memoria, de la que es autor 
la Licenciada en Oceanología, por la Universidad Autónoma de Baja 
California, México, Dña. Laura Alejandra Ardilla de la Rosa Carrillo, ha 
sido realizada bajo su codirección y cumple las condiciones exigidas para 
que su autor pueda optar al grado de Doctor por la Universidad de 
Santiago de Compostela, por lo que da su aprobación para la 
correspondiente lectura y defensa. 
 
Para que conste a los efectos oportunos, firma la presente en Lugo, a 6 de 
febrero de 2001. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Mercedes Rodríguez Vieytes Laura A. A. de la Rosa Carrillo 
 Doctor en Biología 
 Codirector de Tesis 
 
 
 
 
 
 
 
 
A Emilio 
A Alejo, León Laura y Tito 
A E. 
 
Agradecimientos 
El trabajo expuesto en la presente memoria es el resultado de casi cinco años de 
investigación realizada en el Departamento de Farmacología de la Facultad de 
Veterinaria de la Universidad de Santiago de Compostela, bajo la dirección de los 
profesores Dr. Luis M. Botana López y Dra. Mercedes Rodríguez Vieytes, a quienes 
deseo agradecer la oportunidad que me ofrecieron para iniciarme en la investigación, 
apoyándome con los medios técnicos y materiales, pero sobretodo con su amistad y 
confianza a lo largo de este periodo. 
Igualmente importante ha sido el apoyo, consejo y amistad de los demás miembros del 
Departamento: a las doctoras Natalia, Ana, Amparo y Maricarmen, y a los casi doctores 
Carlos, Jorge, Olga y Yolanda, así como a Maite, Naty y Jaqueline. 
Agradezco también al personal del Centro de Transfusión de Galicia, del Hospital 
Xeral de Lugo por su colaboración a la realización de este trabajo. 
A los Dr. T. Yasumoto y K. J. James por la donación de algunas de las ficotoxinas 
utilizadas en esta investigación. 
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (Conacyt, México) por la concesión de 
una beca para estudios doctorales en el extranjero, que me permitió realizar esta 
investigación. 
A todos aquellos amigos que de una u otra manera han hecho que mi estancia en 
España fuera más agradable (especialmente los fines de semana). 
Por último a Emilio por su constante apoyo (personal y “profesional”), por su amor y 
paciencia que me ayudaron a superar todas esas crisis y malos momentos. 
 
 
ABREVIATURAS: 
AC: Adenilato ciclasa 
AD: Acido Domoico 
ADN: Acido desoxiribonucleico 
ADPRc: Adenosin-5´-difosfato-ribosa cíclica 
AE: Anion Exchanger (Intercambiador aniónico) 
AMPc: Adenosin-3´,5´-monofosfato cíclico 
AO: Acido Ocadaico 
ARN: Acido ribonucleico 
ASP: Amnesic Shellfish Poisoning 
ATP Adenosin-5´-Trifosfato 
AZ: Azaspirácido 
AZP: Azaspiracid Poisoning 
BCECF-AM: 2´,7´-bis(carboxietil)-5(6)-carboxifluoresceína éster acetoximetilo 
BCR: Receptor antigénico de linfocitos B 
Bis-oxonol: bis-(1,3-ácido dietiltiobarbitúrico)trimetina oxonol 
[Ca2+]i: Concentración citosólica de calcio 
CaM: Calcio-calmodulina 
CD: Cluster of Diferentiation 
CFP: Ciguatera Fish Poisoning 
ChC: Cloruro de cheleritrina 
CICR: Calcium Induced Calcium Release (liberación de calcio inducida por calcio) 
Con-A: Concanavalina A 
CRAC: Calcium Release Activated Channels (Canales activados por la liberación de calcio). 
CTX: Ciguatoxina 
DAG: Diacilglicerol 
DIDS: 4,4´-diisotiocianatoestilbeno-2,2´-ácido disulfónico 
DMSO: Dimetilsulfóxido 
DSP: Diarrhetic Shellfish Poisoning 
DTX: Dinofisistoxina 
EDTA: Tetra-acetato de etilendiamina 
EGTA: Tetra-acetato de etilenglicol 
ER: Retículo endoplasmático 
FSK: Forskolina 
GDP: Guanosin-5´-difosfato 
GF109203X: Bisindolilmaleimida 1 
GMP: Guanosin-5´-monofosfato 
GTP: Guanosin-5´-trifosfato 
GTX: Gonyautoxina 
H89 ó H-89: N-[2-(p-bromocinamilamino)etil]-5-isoquinolisulfonamida.2HCl 
HEPES: N-[2-hidroxietil]piperazina-N´-[ácido 2-etanosulfónico] 
IBMX: 3-isobutil,1-metilxantina 
Ig: Inmunoglobulina 
IL-2: Interleucina 2 
IP3: Inositol 1,4,5-trifosfato 
IP3R: Receptor del Inositol 1,4,5-trifosfato 
IP4: Inositol 1,3,4,5-tetrakisfosfato 
MHC: Mayor Histocompatibility Complex (Complejo mayor de histocompatibilidad) 
MTX: Maitotoxina 
NHE: Na+ H+ Exchanger (Intercambiador sodio protones) 
NK: Células agresoras naturales 
NSP: Nerotoxic Shellfish Poisoning 
PbTx: Brevetoxina 
PDE: Fosfodiesterasa 
 
PHA: Fitohemaglutinina 
pHi: pH citosólico 
pHo: pH extracelular 
PI: Fosfatidil Inositol 
PI-3K: Fosfatidil inositol 3-cinasa 
PIP2: Fosfatidil Inositol 4,5-bifosfato 
PKA: Cinasa de proteína dependiente de AMPc 
PKC: Cinasa de proteína C 
PLC: Fosfolipasa C 
PMA: forbol 12-miristato 13-acetato 
PMCA: ATPasa de calcio de la membrana plasmática 
PP: Fosfatasa de proteína 
PSP: Paralytic Shellfish Poisoning 
PTK: Cinasa de tirosina 
PTPasa: Fosfatasa de tirosina 
PTX: Pectenotoxina 
PWM: Mitógeno de la fitolaca 
RyR: Receptor de rianodina 
SEM: Error estándar de la media 
SERCA: ATPasa de calcio del retículo sarco-endoplasmático 
SKF 96365: 1-[β-[3-(4-metoxifenil)propoxil}-4-metoxifenil]-1H-imidazol.HCl 
SOC: Store Operated Channels (Canales operados por reservorios) 
SQ22,536 o SQ: 9-(tetrahidro-2-furanil)-9-H-purina-6-amina 
STX: Saxitoxina 
Tc: Células T citotóxicas 
TCR: Receptor antigénico de linfocitos T 
Tg: Tapsigargina 
Th: Células T colaboradoras 
Tox Col: Toxina colérica 
TPA: forbol 12-miristato 13-acetato 
TRIS: Tris(hidroximetil)amino-metano 
VOC: Voltage Operated Channels (canales operados por voltaje) 
YTX: Yessotoxina 
 
 
INDICE 
 
1 Introducción ................................................................................................................. 3 
1.1 Ficotoxinas marinas.................................................................................................... 5 
1.1.1 Toxinas DSP ....................................................................................................... 5 
1.1.2 Toxinas PSP ....................................................................................................... 9 
1.1.3 Toxinas ASP ..................................................................................................... 10 
1.1.4 Toxinas NSP ..................................................................................................... 11 
1.1.5 Toxinas relacionadascon la ciguatera (CFP) ................................................... 12 
1.1.6 Otras ficotoxinas marinas.................................................................................. 15 
1.2 El linfocito humano como modelo celular para el estudio de los mecanismos de 
acción de toxinas DSP.................................................................................................... 16 
1.2.1 Heterogeneidad de los linfocitos. ...................................................................... 17 
1.2.2 Activación y modulación de la función linfocitaria ............................................. 19 
1.3 Señales de transducción........................................................................................... 21 
1.3.1 Proteínas G....................................................................................................... 21 
1.3.2 Mensajeros intracelulares o segundos mensajeros .......................................... 22 
1.3.2.1 Calcio ........................................................................................................ 22 
1.3.2.2 AMP cíclico................................................................................................ 25 
1.3.3 Cinasas y fosfatasas de proteína...................................................................... 26 
1.3.3.1 Cinasas de tirosina.................................................................................... 26 
1.3.3.2 Cinasas de serina/treonina........................................................................ 27 
1.3.3.3 Fosfatasas de proteína.............................................................................. 28 
1.3.4 Fosfatidil inositol 3-cinasa (PI 3-cinasa, PI 3-K)................................................ 30 
1.4 Transporte de iones a través de las membranas celulares: Mecanismos reguladores 
del pH citosólico..............................................................................................................30 
1.4.1 Intercambiador Na+/H+ ...................................................................................... 31 
1.4.2 Transportadores de HCO3-................................................................................ 32 
1.4.2.1 Intercambiadores Cl-/HCO3- ...................................................................... 33 
1.4.2.2 Cotransportadores Na+-HCO3- .................................................................. 34 
1.4.3 ATPasas de H+.................................................................................................. 35 
2 Objetivo ...................................................................................................................... 37 
3 Material y métodos .................................................................................................... 41 
3.1 Reactivos y medios................................................................................................... 43 
3.2 Células...................................................................................................................... 44 
 
3.2.1 Obtención y purificación de linfocitos humanos ................................................ 44 
3.2.2 Células de neuroblastoma humano................................................................... 45 
3.3 Determinación de la concentración intracelular de iones y del potencial de 
membrana, mediante el uso de indicadores fluorescentes............................................. 46 
3.4 Medición de fluorescencia ........................................................................................ 48 
3.5 Técnicas de acidificación y alcalinización intracelular............................................... 51 
3.6 Determinación de la capacidad tampón del citosol de linfocitos humanos, y cálculo 
del flujo de H+ ................................................................................................................. 52 
3.7 Análisis estadístico ................................................................................................... 54 
4 Resultados y Discusión ............................................................................................ 55 
4.1 Estudio de los mecanismos de acción del ácido ocadaico ....................................... 57 
4.1.1 Caracterización de los mecanismos reguladores del pHi en linfocitos humanos57 
4.1.2. Regulación de la actividad de los transportadores de membrana implicados en 
la alcalinización citosólica, por diferentes rutas de transducción. .............................. 77 
4.1.2.1. Regulación por cinasas ............................................................................ 77 
4.1.2.2. Implicación del citoesqueleto.................................................................... 84 
4.1.3. Efecto del ácido ocadaico sobre la actividad de los mecanismos reguladores 
del pHi en linfocitos humanos .................................................................................... 87 
4.2 Estudio de los mecanismos de acción de la yessotoxina ......................................... 98 
4.2.1 Efecto de la YTX sobre los niveles de [Ca2+]i de linfocitos humanos ................ 98 
4.2.2 Efecto de la YTX sobre el potencial de membrana de linfocitos y células de 
neuroblastoma humanos.......................................................................................... 118 
2.2.3 Interacción Ca2+ AMPc en linfocitos humanos ................................................ 121 
4.3 Estudio de los mecanismos de acción de la maitotoxina........................................ 130 
4.4 Estudio de los mecanismos de acción del azaspirácido ......................................... 140 
5 Conclusiones ........................................................................................................... 149 
6 Bibliografía ............................................................................................................... 153 
 
 
 
 
1 
 
 
 
El presente trabajo de tesis doctoral ha generado las siguientes publicaciones: 
 
Evidence for an electrogenic, negatively protein kinase A-modulated, Na+-dependent 
HCO3- transporter in human lymphocytes. L. A. de la Rosa, A.G. Cabado, M.A. Botana, J.I. 
Vidal, M.R. Vieytes y L.M. Botana Pflügers Archive European Journal of Physiology. 
1999, 437 (6), 935-943. 
Modulation of cytosolic calcium levels of human lymphocytes by yessotoxin, a novel 
marine phycotoxin. L. A. de la Rosa, A. Alfonso, N. Vilariño, M.R. Vieytes y L.M. Botana 
Biochemical Pharmacology. En prensa. 
Maitotoxin-induced Ca2+ entry in human lymphocytes: modulation by kinases, Ca2+ 
channel blockers and yessotoxin. L. A. de la Rosa, A alfonso, N. Vilariño, M.R. Vieytes, T. 
Yasumoto y L.M. Botana. Cellular Signalling. En prensa. 
Modulation of thapsigargin-induced calcium mobilization by cyclic AMP-elevating agents 
in human lymphocytes is insensitive to the protein kinase A inhibitor H-89. L. A. de la Rosa, 
N. Vilariño, M.R. Vieytes y L.M. Botana. Cellular Signalling. En prensa. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Introducción 
Linfocitos cargados con Fura2
λexc 340 nm; λem 520 nm
Línea basal exp. con AZ 
Introducción 
 
5 
Los episodios de intoxicaciones humanas producidas por la ingestión de productos 
marinos contaminados con toxinas de origen fitoplanctónico representan en muchas 
ocasiones un riesgo para la salud pública. El estudio de los múltiples factores implicados en 
estos acontecimientos es, por tanto, de gran importancia. El presente trabajo pretende 
contribuir al conocimiento de los mecanismos mediante los cuales algunas de estas toxinas 
marinas ejercen su acción en células humanas. Para ello, se hará una breve descripción de 
las principales toxinas producidas por microalgas marinas, a continuación, se describirá el 
modelo celular empleado en nuestro estudio, así como las señales y procesos celulares que 
serán estudiados en este trabajo de investigación. 
1.1 Ficotoxinasmarinas 
Las ficotoxinas marinas son metabolitos secundarios producidos por algunas especies 
de microalgas fitoplanctónicas pertenecientes, la mayoría, al grupo de los dinoflagelados. 
Sin embargo, su mayor importancia radica en que estas microalgas tóxicas son consumidas 
y sus toxinas bioacumuladas por otros organismos marinos, como moluscos o peces, que 
luego son utilizados para consumo humano. Debido a sus importantes efectos sobre la 
salud pública, las toxinas marinas se clasifican generalmente según el tipo de intoxicación o 
envenenamiento que producen. 
1.1.1 Toxinas DSP 
Dentro de este grupo se describirán toxinas con efectos patológicos diversos, pero que 
han sido aisladas en asociación con las toxinas productoras del síndrome DSP (de 
Diarrhetic Shellfish Poisoning). Este tipo de intoxicación produce trastornos puramente 
gastrointestinales, como diarrea, náusea, vómito y dolor abdominal, que aparecen de 30 
minutos a unas pocas horas después del consumo de los moluscos. No se ha conocido 
ningún caso de intoxicación mortal. La primera vez que este tipo de alteraciones se 
correlacionó con la existencia de una toxina presente en los tejidos grasos de mejillones fue 
a finales de la década de los 70 en Japón (269), aunque seguramente esta intoxicación era 
conocida desde hacía largo tiempo en este país (267). Actualmente, las toxinas DSP están 
ampliamente distribuidas en todo el mundo, siendo especialmente importantes en Europa y 
Japón, donde aparecen de manera estacional (13, 243). 
 Las toxinas productoras de DSP son el ácido ocadaico (AO) y sus derivados, muchos 
de los cuales son productos del metabolismo de los moluscos. Los derivados del AO son 
llamados dinofisistoxinas (DTXs) por uno de los géneros de dinoflagelados productores: 
Dinophysis y Prorocentrum, 
El AO y las DTXs son poliéteres liposolubles, cuya estructura química se muestra en la 
figura 1.1. Estas toxinas, además de producir diarrea, también poseen efectos como 
promotoras de tumores. 
Introducción 
 
6
Como se mencionó anteriormente, en este grupo se incluyen otras toxinas, de 
naturaleza química más o menos similar al AO, que no producen diarrea y cuyo mecanismo 
de acción es probablemente diferente, pero que se han encontrado en muestras 
contaminadas con DSP. Sin embargo, conviene aclarar que una de ellas, el azaspirácido, 
no puede ser detectada por el método habitual de detección de toxinas DSP, por lo que 
algunos autores han propuesto la creación de un nuevo grupo de toxinas marinas formado 
por el azaspirácido y sus derivados. A continuación se describen las principales ficotoxinas 
marinas asociadas a DSP. 
A) Pectenotoxinas (PTXs) 
Fueron descubiertas en las glándulas digestivas de vieiras Patinopecten yessoensis 
contaminadas con DSP y hasta el momento se han aislado 10 derivados diferentes. Se trata 
de una serie de compuestos poliéteres macrocíclicos con un anillo de lactona (figura 1.2a). 
Al igual que las toxinas productoras de diarrea, son sintetizadas por dinoflagelados del 
género Dinophysis; algunas de las PTXs caracterizadas son productos de la 
biotrasnformación en los moluscos consumidores. Las que se han estudiado hasta el 
momento presentan un efecto hepatotóxico (65). 
B) Yessotoxinas (YTXs) 
La primera de este tipo de toxinas fue aislada de las mismas vieiras que las PTXs; hasta 
la fecha se han identificado otros 6 análogos naturales de este compuesto y se han 
producido 6 derivados de manera experimental. La estructura química de las YTXs, que es 
muy similar a la de las brevetoxinas y ciguatoxinas (descritas más adelante), posee 11 
anillos éter encadenados, con una cadena lateral insaturada; sin embargo, difiere de éstas 
últimas, en que su cadena principal en más larga, posee al menos dos ésteres sulfónicos y 
no presenta grupos carbonilo (figura 1.2b). La YTX y sus análogos han sido detectados en 
diversas partes del mundo (Japón, Italia, Nueva Zelanda y Chile); y son producidas por los 
dinoflagelados Protoceratium reticulatum y Lingulodinium polyedrum (Gonyaulax polyedra) (65). 
La YTX tiene un efecto cardiotóxico en ratón, mientras que un derivado desulfatado de la 
misma presenta un efecto hepatotóxico en los mismos animales. A pesar de que la 
toxicidad de la YTX por vía intraperitoneal es la mayor de las toxinas DSP, por vía oral su 
toxicidad es muy inferior (227). 
HO
O
OH
O
O
OH
O
O
O
OH
HO
O
O
R
Ac. ocadaico R=H 
Dinofisistoxina1 R=Me 
Figura 1.1. Representación esquemática del ácido ocadaico y uno de sus derivados. 
Introducción 
 
7 
C) Azaspirácido 
Esta toxina fue descubierta recientemente, después de una intoxicación ocurrida en 
Holanda en 1995, tras la ingestión de mejillones contaminados, importados de Irlanda. Los 
síntomas de dicha intoxicación fueron parecidos a los del síndrome DSP, aunque se había 
comprobado que los mejillones no contenían cantidades significativas de este tipo de 
toxinas (115). De la carne de estos mejillones se extrajo una nueva toxina denominada 
azaspirácido (AZ) por estar formada por anillos azaspiro de 5 y 6 miembros, uno de ellos 
conteniendo nitrógeno (figura 1.2c). En ratones, esta nueva toxina provocó lesiones en 
páncreas e hígado. Se han encontrado dos análagos del AZ y, debido a que este grupo de 
moléculas es estructural y toxicológicamente distinto de otras toxinas, se ha decidido 
incluirlas en un nuevo grupo (AZP de Azaspiracid Poisoning) (164). Se desconoce el origen 
del AZ y derivados, sin embargo, es probable que estas toxinas sean también producidas 
por dinoflagelados, ya que el patrón de metilaciones de su estructura es típico de 
metabolitos de estas microalgas (115). A pesar de que ha habido casos de envenenamiento 
por AZP en diversos países de Europa, los mejillones contaminados siempre han provenido 
de Irlanda. 
En la figura 1.2 se presentan las estructuras de las toxinas más representativas de cada 
uno de los tres grupos antes descritos. 
Las toxinas DSP productoras de diarrea (AO y derivados), PTXs y YTXs son todas 
detectadas mediante el mismo procedimiento de bioensayo en ratón, por esta razón este 
método de detección es considerado como el más seguro y es el único método oficialmente 
utilizado para el control de la aparición de toxinas DSP en moluscos destinados para el 
consumo humano (246). Con el propósito de reducir o evitar el uso de animales y mejorar la 
sensibilidad, se han desarrollado una gran variedad de métodos alternativos mediante 
técnicas analíticas y bioquímicas: cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) (2, 85, 
Figura 1.2. Representación esquemática de las toxinas asociadas a DSP. (a)
Pectenotoxina1 (b) Yessotoxina (c) Azaspirácido 
(c) 
O O
O
O
O
O
NH
H
OH
HOH
H
H
H
H
H
HO
O
(b) 
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
NaO3SO
NaO3SO
HO
OH
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
OH
OH
OH
O
OH
(a) 
Introducción 
 
8
142), cromatografía líquida con detección mediante espectrometría de masas (LC/MS) 
(173) y espectrometría de masas “tandem” (LC/MS/MS) (64), detección mediante 
anticuerpos (ELISA) (241) y medición de la inhibición de fosfatasas detectada por 
ultravioleta (238) o fluorescencia (247). Sin embargo, estas técnicas son específicas para 
las toxinas OA y algunos de sus derivados, por lo que en muchos casos se aplican en 
conjunción con el bioensayo. Los métodos más apropiados, como alternativa al bioensayo, 
para la detección de PTXs y YTXs son los métodos analíticos HPLC y espectrometría de 
masas (65). Por último, el bioensayo en ratón ha demostrado no ser suficientemente 
sensible para la detección de AZ por lo que se han desarrollando métodos de detección 
para esta toxina mediante las técnicas LC/MS y LC/MS/MS (115). 
Como hemos visto las toxinas que hemos incluido y descrito en el grupo DSP presentan 
una gran heterogeneidad. En la siguiente tabla se resumen algunas de sus características 
principales, para efectos de comparación se muestran sus valores de toxicidad aguda 
mediante inyección intraperitoneal enratones, sin embargo, como se ha mencionado antes 
estos valores no siempre se corresponden con la toxicidad por vía oral. 
TABLA 1.1. Principales características de algunas toxinas DSP o asociadas a DSP 
(modificado de (267)). 
TOXINA Fórmula PM LD50 (µg/kg p.c.) Tejido afectado Origen 
Acido ocadaico C44H68O13 804 200 intestino Dinophysis 
Dinofisistoxina1 C45H70O13 818 160 intestino Dinophysis 
Pectenotoxina1 C47H70O14 874 250 hígado Dinophysis 
Yessotoxina C55H80O21S2Na2 1186 100 corazón Protoceratium 
Azaspirácido C47H71NO12 841 150 hígado-páncreas ? 
 
De todo este grupo, solo se conocen los mecanismos de acción de las toxinas 
productoras de DSP (AO y derivados). Estas toxinas son potentes inhibidoras de las 
fosfatasas de proteína PP1 y PP2A, dos de las principales fosfatasas de proteína que 
existen en el citosol de las células eucariotas (13, 248). El mecanismo de inhibición es a 
través de la unión de las toxinas a la subunidad catalítica de la enzima. Debido a que las 
fosfatasas de proteína son enzimas clave en los mecanismos de señalización celular; están 
involucradas en la regulación de la mayoría de los procesos celulares. Por lo tanto, los 
efectos del AO en células, son muy variados; de hecho, esta toxina se utiliza ampliamente 
como una herramienta farmacológica para estudiar señales de transducción en múltiples 
modelos celulares. Aunque su mecanismo de acción no es selectivo, el AO es ligeramente 
más potente en células neuronales (es tóxico a concentraciones que no afectan a otro tipo 
de células) (70, 224). Por tal motivo se ha sugerido que el efecto diarreogénico del AO 
puede estar regulado por el sistema nervioso, como demostraría la presencia de náusea y 
vómito en pacientes afectados por DSP (248). Sin embargo, también se ha propuesto que 
la diarrea producida por AO puede ser el resultado de la hiperfosforilación de proteínas, que 
controlan la secreción de Na+ en células intestinales; así como de elementos del 
Introducción 
 
9 
citoesqueleto, que influyen en la permeabilidad de las membranas celulares (60, 248). 
Estudios in vivo han demostrado que, a diferencia de otras toxinas diarreicas, como la toxina 
colérica; el AO no aumenta la secreción de Cl- de las células epiteliales intestinales, sino 
que, en su lugar, afecta a la microcirculación intestinal y aumenta la permeabilidad 
paracelular del epitelio (109, 234). 
Los mecanismos de acción de las PTXs y YTXs no se conocen pero de acuerdo a los 
efectos y lesiones que producen en ratones experimentales, y a su estructura química, se 
cree que la primera puede tener un mecanismo similar al de algunos oligopéptidos cíclicos 
(faloidina) mientras que la segunda podría actuar como una neurotoxina del tipo de las 
brevetoxinas o ciguatoxinas (65). 
1.1.2 Toxinas PSP 
Este tipo de intoxicación es, de todas las aquí descritas, la más ampliamente distribuida 
en el ámbito mundial y su existencia ha sido conocida desde hace mucho tiempo. El 
síndrome PSP (de Paralytic Shellfish Poisoning) se caracteriza por una serie de 
alteraciones neuromusculares que aparecen poco después (aproximadamente 1 h) de la 
ingestión de moluscos contaminados. Sus síntomas, dependiendo de la gravedad de la 
intoxicación pueden ser: malestar general, parestesia facial, astenia, distenia, ataxia, 
disnea, hipotensión, taquicardia, disfagia, desórdenes gastrointestinales, cefalea y parada 
cardio-respiratoria (131). Las toxinas responsables de este envenenamiento pertenecen 
todas a un grupo homogéneo de más de 21 compuestos polares, llamados en conjunto 
saxitoxinas, caracterizados por presentar un esqueleto heterocíclico nitrogenado. 
Dependiendo de los sustituyentes en R (figura 1.3) las saxitoxinas se dividen en 4 grupos, 
que en orden descendente de toxicidad son: carbamato, decarbamoilo, sulfocarbamoilo y 
desoxidecarbamoilo (toxicidad no probada). Algunos de estos derivados son productos del 
metabolismo de los bivalvos (243). 
Figura 1.3. Representación esquemática de toxinas PSP. Se muestra una toxina
representativa de cada uno de los cuatro grupos existentes, determinados por el grupo 
funcional R. 
 R 
STX (carbamato) OCONH2 
GTX5 (B1) (sulfocarbamoilo) OCONHSO3- 
dcSTX (decarbamoilo) OH 
doSTX (desoxidecarbamoilo) H 
HN
N NH
H
N
H H
H2N
NH2
OH
OH
R
Introducción 
 
10 
Las saxitoxinas son producidas por dinoflagelados de los géneros Alexandrium, 
Gymnodinium y Pyrodinium; toxinas muy similares son producidas por muchos otros 
organismos procariotas y eucariotas, no relacionados con la intoxicación PSP (208). La 
presencia de toxinas PSP en moluscos bivalvos se determina por medio de bioensayo en 
ratón aunque, como complemento a éste, se aplican otras técnicas analíticas como 
espectrofotometría y HPLC (246). 
Las saxitoxinas producen parálisis del sistema neuromuscular debido a que bloquean la 
propagación de los impulsos nerviosos, al unirse selectivamente al sitio 1 del canal de Na+ 
de la membrana plasmática de células excitables, e impedir su apertura. Por su alta 
polaridad es poco probable que atraviesen la barrera hematoencefálica, por lo que su sitio 
de acción más probable, sería sobre los canales de Na+ de las uniones neuromusculares 
(243). 
1.1.3 Toxinas ASP 
La intoxicación de tipo ASP (de Amnesic Shellfish Poisoning) es una de las últimas que 
se han descrito ya que los primeros casos datan de 1987 y se registraron en Montreal, 
Canadá. Este síndrome se caracteriza por la ocurrencia de trastornos gastrointestinales 
seguidos de alteraciones del sistema nervioso central: náusea, vómito, calambres 
abdominales, diarrea, dolor de cabeza, desorientación, pérdida de la memoria a corto plazo, 
ataques y coma; sin embargo, la aparición de estos síntomas depende de la gravedad de la 
intoxicación, la cual es muy variable entre individuos (158). 
La toxina responsable de este 
envenenamiento es el ácido domoico (AD), un 
pequeño aminoácido tricarboxílico, 
termoestable e hidrosoluble, cuya estructura 
química, que se presenta en la figura 1.4, es 
muy similar a la de los aminoácidos 
neuroexcitadores ácido glutámico y ácido 
kaínico (263). A diferencia de otras ficotoxinas 
marinas, que son producidas por 
dinoflagelados, el ácido domoico es producido 
por microalgas del grupo de las diatomeas. Las 
diatomeas productoras son algunas especies 
pertenecientes a los géneros Nitzschia y 
Pseudonitzschia, sin embargo, la producción de toxina por estas microalgas, depende de 
numerosos factores ambientales que aún no han sido del todo identificados. Se han 
detectado florecimientos de diatomeas productoras de AD en algunos puntos de 
Norteamérica y Europa. El método de detección empleado se basa en HPLC de extractos 
acuosos de mejillón (158). 
El mecanismo de acción del AD coincide con el de otros aminoácidos neuroexcitadores. 
En neuronas de hipocampo de rata se une a los receptores del ácido kaínico, que son 
N
H
COOH
HOOC H
COOH
Figura 1.4. Representación esquemática 
del ácido domoico. 
Introducción 
 
11 
similares, a los receptores del ácido glutámico o glutamato. La activación de estos 
receptores activa a su vez una serie de mecanismos de transducción de señales 
intracelulares, como la elevación de los niveles citosólicos del ion Ca2+ y activación de la 
cinasa de proteína C. Existen muchas otras rutas intracelulares que pueden contribuir a la 
acción de estas sustancias, dependiendo del tipo de receptor que activan y de célula en que 
éste se expresa. Se cree que la alteración en los niveles de Ca2+ intracelular producida por 
la activación de receptores kaínicos de las neuronas puede estar directamente relacionada 
con la actividad neurotóxica del ácido domoico (158). 
1.1.4 Toxinas NSP 
Este grupo está formado por las brevetoxinas (PbTx), las cuales están también 
asociadas con episodios de mortalidad masiva de peces, aves y mamíferos marinos (243, 
268). El síndrome NSP (de Neurotoxic Shellfish Poisoning)se caracteriza por la aparición 
de diversos síntomas de carácter neurológico, de menor severidad que los producidos por 
las toxinas PSP. Sus principales síntomas son: náusea, sensación de hormigueo y 
entumecimiento, pérdida del control motor y dolor muscular severo. Las brevetoxinas 
también pueden entrar en contacto con el ser humano en forma de un aerosol que se inhala 
en la brisa marina cerca de una marea roja de Gymnodinium breve, el dinoflagelado que las 
produce. Este organismo es originario de las costas de Florida y el Golfo de México, sin 
embargo, recientemente se han identificado otras especies fitoplanctónicas (Gymnodinium 
cf. breve, Chatonella spp., Fibrocaspa japonica, etcétera) que producen toxinas similares a las 
PbTx, en las aguas costeras de Japón y Nueva Zelanda (243). 
Existen 10 brevetoxinas naturales, todas ellas derivadas de dos esqueletos básicos, que 
se muestran en la figura 1.5. Se trata de poliéteres liposolubles formados por un anillo de 
lactona y 10 anillos éter, que dan lugar a una estructura en forma de escalera. 
O
O
O
O
O
O O
O
O
O
O
OH
Cabeza
Cola
H
O
Cola 
Cabeza
(b) 
O O
O O
O O
O
O
O
O
O
O
OH
O
H
Cola
Cabeza
(a) 
Cabeza 
Cola 
Figura 1.5. Esqueletos base de brevetoxinas. (a) PbTx-2 o brevetoxina B, representante del 
esqueleto tipo 1. (b) PbTx1 o brevetoxina A, representante del esqueleto tipo 2. 
Introducción 
 
12 
Las PbTx tienen un mecanismo de acción muy bien caracterizado a nivel celular-
molecular. Al igual que las toxinas PSP se unen con gran afinidad y especificidad a los 
canales de Na+ dependientes de voltaje, sin embargo el sitio de unión es distinto (sitio 5) lo 
que hace que su efecto sobre la actividad del canal sea también diferente. De hecho, las 
PbTx provocan la apertura de los canales de Na+ e inhiben su inactivación, con lo cual 
producen una activación transitoria de las células excitables, musculares o nerviosas, 
seguida de un bloqueo de la excitabilidad celular. La afinidad de las PbTx por el canal de 
Na+ depende de la estructura específica de la toxina y está directamente relacionada a la 
toxicidad de la misma, aunque las rutas de transducción que desencadena la unión de la 
toxina al receptor celular siguen siendo estudiadas. Además, las PbTx, junto con las 
ciguatoxinas y muchos derivados sintéticos de ambas se utilizan ampliamente en fisiología 
y biología molecular para caracterizar los mecanismos de acción de los canales de Na+ 
dependientes de voltaje (15). 
Los métodos empleados para la detección de PbTx están basados en el principio de 
unión receptor-ligando. Los receptores utilizados son canales de Na+ o anticuerpos 
específicos y el ligando, es decir la toxina, se cuantifica mediante el desplazamiento 
competitivo que produce de un derivado marcado con moléculas radiactivas o fluorescentes 
(15). 
1.1.5 Toxinas relacionadas con la ciguatera (CFP) 
La ciguatera es una enfermedad conocida en el Caribe desde la época de la conquista 
española. Se trata de una intoxicación debida a la ingestión de peces que han acumulado 
ficotoxinas a través de la cadena alimenticia (de ahí CFP, Ciguatera Fish Poisoning). Este 
tipo de intoxicación es típico de áreas tropicales y subtropicales con arrecifes coralinos, 
donde viven una variedad de dinoflagelados tóxicos que pueden ser consumidos por peces 
herbívoros que bioacumulan las toxinas para luego transmitirlas al ser humano 
directamente o a través de otros peces carnívoros (103). 
La ciguatera provoca una serie de síntomas neurológicos, gastrointestinales y, en menor 
medida, cardiovasculares, siendo los neurológicos los más importantes (103). Las 
afecciones gastrointestinales (náusea, vómito, diarrea) se presentan entre 2 y 6 horas 
después del consumo del pescado, seguidas por los síntomas de tipo neurológico 
(perturbaciones sensoriales, fatiga y debilidad, dolor de cabeza, vértigo, mareos, salivación 
y sudación, parálisis, etc.). La gravedad de la intoxicación es variable, aunque rara vez llega 
a ser mortal; además los síntomas y la gravedad también varían según el tipo de pez 
(carnívoro o herbívoro) y de la localización geográfica (en el Caribe los síntomas 
dominantes son los gastrointestinales, mientras que en el Pacífico dominan los síntomas 
neurológicos). Esto puede deberse a diferencias en la estructura química de las principales 
toxinas implicadas en la ciguatera (las ciguatoxinas) o a variabilidad en el tipo de toxinas 
presentes en los arrecifes (243). 
Como ya se mencionó anteriormente, los arrecifes coralinos son el hábitat de múltiples 
dinoflagelados bentónicos tóxicos, cuyas toxinas pueden tener mecanismos de acción 
Introducción 
 
13 
diversos. En la tabla 2 se resumen algunos de estos organismos y las toxinas que 
producen. 
TABLA 2. Toxinas producidas por dinoflagelados bentónicos asociados a los arrecifes 
coralinos (243). 
Especie Toxina Sitio de acción 
Gambierdiscus 
toxicus Ciguatoxinas Canales de Na
+ dep. de voltaje 
 Maitotoxina ? (dependiente de Ca2+) 
Coolia monotis Cooliatoxina ? 
Ostreopsis spp Ostreocina (palitoxina) ATPasa de Na+ /K+ 
Prorocentrum spp A. ocadaico Fosfatasas de proteína 
Amphidinium spp Anfidinilidas ? (antifúngico) 
 
De todas estas, las únicas toxinas que están directamente implicadas en la ciguatera 
son las ciguatoxinas (CTXs), poliéteres liposolubles cuya estructura química es muy similar 
a la de las brevetoxinas (PbTx), previamente descritas. 
Existen más de 20 CTXs con tres cadenas principales básicas (figura 1.6) los dos 
primeros tipos corresponden a CTXs del Pacífico (P-CTXs), mientras que el tercero ha sido 
Figura 1.6. Representantes de las 3 cadenas principales básicas de CTXs. (a) CTX1 
(P-CTX1). (b) CTX3C. (c) C-CTX1 
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O O O
OH
OH
HO
OHHO
OH
(a)
(b)
O
O
O
O
O
O O O
OH
O
O
O
O
O
HO
OH
(c)
O
O
O
O
O
O O
OH
HO
O
H
OH
O
O
O
O
O
HO
Introducción 
 
14 
aislado en el Caribe (C-CTX). Los derivados más oxigenados de las CTXs con productos 
del metabolismo de los peces (243). 
La palitoxina, o su análogo la ostreocina, son otras toxinas asociadas a los arrecifes 
coralinos que producen una intoxicación con síntomas similares a los de la ciguatera, 
aunque de mucha mayor gravedad y con un alto índice de mortalidad (clupeotoxismo). Por 
otro lado la maitotoxina (MTX), un poliéter con una estructura química extraordinariamente 
grande y compleja (figura 1.7), es la principal toxina producida por Gambierdiscus toxicus (el 
mismo organismo productor de las CTXs), sin embargo, no se bioacumula en los tejidos de 
los peces. Por lo tanto, a pesar de ser por vía intraperitoneal la ficotoxina más potente que 
se conoce, su contribución a los trastornos de la ciguatera no parece significativa. 
El resto de las ficotoxinas asociadas a arrecifes coralinos (incluyendo el AO, que se ha 
descrito previamente como productor de DSP) no se acumulan de manera significativa en 
los tejidos de peces comestibles, por lo que no se ha confirmado su impacto sobre la salud 
humana, por esta vía. 
Como se ha mencionado antes, la estructura de las CTXs es muy parecida a la de las 
PbTx por lo que no es extraño que su mecanismo de acción sea el mismo. Esto es, las 
CTXs se unen al sitio 5 del canal de Na+ de células excitables (principalmente células del 
sistema nervioso), lo que provoca la apertura de dichos canales a potenciales de membrana 
de reposo; la entrada de iones Na+ a su vez activa una serie de señales intracelulares 
(movilización de Ca2+, aumento de volumen celular) que finalmente pueden dar lugar a las 
perturbaciones de la conducción nerviosa, típicas de la ciguatera (139). El mecanismo de 
acción de la palitoxina es diferente; se une también a una proteína de la membrana 
plasmática, pero en este caso es la ATPasa de Na+/K+; una enzima que, a través de la 
hidrólisis de ATP, obtiene la energía necesaria para expulsar iones Na+ e introducir iones K+ 
O
O
O
O
OH
OH
OH
OSO3Na OH
O
O
HO OHOH
HO
OH
O
O
O
O
O
OH
OH
NaO3SO
OH
OH
OH
OH
O
OHO
OH
OH OH OH
O
O
OH
HO
OH
O
O
O
OH
HO
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
OH
OH
HO
Figura 1.7. Representación esquemática de la maitotoxina (MTX), producida por
Gambierdiscus toxicus. 
Introducción 
 
15 
al citosol celular, de esta forma logra mantener el gradiente de ambas especies iónicas, el 
cual es utilizado en numerosas funciones celulares. La unión de la palitoxina inhibe el 
funcionamiento de la ATPasa y produce la formación de un poro, permeable a cationes 
monovalentes, en la membrana citoplasmática. Estas alteraciones de la membrana celular 
desencadenan una serie de señales intracelulares que pueden dar lugar a contracciones de 
músculo liso y esquelético (139). Como la ATPasa de Na+/K+ es una enzima presente en 
células de todos los tejidos, es posible que la acción de la palitoxina no sea tan específica 
como la de las CTXs. 
Por último, el mecanismo de acción de la MTX también ha sido ampliamente estudiado, 
aunque hasta la fecha no se ha podido identificar el sitio específico de acción de esta 
toxina. Básicamente la MTX es un potente activador de canales de Ca2+ de la membrana 
plasmática de gran cantidad de tipos celulares, sin embargo, la identidad de estos canales y 
el mecanismo de activación, no están del todo claros. En ratones de experimentación, 
inyectada por vía intraperitoneal, produce alteraciones patológicas severas en corazón, 
estómago, hígado y timo (67). 
1.1.6 Otras ficotoxinas marinas 
Los avances en el estudio de las intoxicaciones producidas por ficotoxinas son 
constantes, por lo que continuamente se descubren nuevas toxinas o derivados de otras ya 
conocidas. En este apartado se citan brevemente dos grupos de ficotoxinas marinas que 
comienzan a ser caracterizados. 
A) Toxinas producidas por cianobacterias marinas 
Las cianobacterias tóxicas han sido siempre consideradas como un problema propio de 
agua dulce, sin embargo, recientemente se han encontrado toxinas de origen cianobacterial 
también asociadas a casos de intoxicación por alimentos de origen marino. En algunos 
episodios de intoxicación por consumo de macroalgas comestibles se ha identificado a la 
aplisiatoxina como la toxina responsable del incidente; esta toxina es producto de la 
cianobacteria marina Lyngbya majuscula. Esta misma especie de cianobacteria es el origen 
de la Lingbiatoxina-A (figura 1.8a) implicada en una intoxicación mortal por ingestión de 
tortuga marina en la isla de Madagascar (267). 
Por otro lado, la hepatotoxina microcistina ha sido también detectada en aguas marinas 
(10). Esta última toxina es, como el AO, una inhibidora de fosfatasas de proteína PP1 y 
PP2A, aunque su estructura química es muy diferente a la de la toxina DSP, como se 
puede observar en la figura 1.8b. Además, la microcistina se caracteriza por una gran 
selectividad hacia las fosfatasas del tejido hepático; esta selectividad está dada por la 
dificultad que tiene esta toxina para atravesar las membranas celulares, lo cual, en el caso 
de las células hepáticas, consigue mediante el sistema de transporte de los ácidos biliares 
(243). 
Introducción 
 
16 
B) Toxinas de “acción rápida” 
Esta denominación recibe un grupo de compuestos macrocíclicos nitrogenados, (figura 
1.8c y 1.8d). Para dos de estos compuestos (prorocentrólidos y gimnodimina) se ha 
comprobado que su origen biogenético está en dinoflagelados de los géneros Prorocentrum 
y Gymnodinium; debido a su naturaleza polar, estas toxinas no son extraídas junto con las 
toxinas liposolubles características de las microalgas mencionadas. Además de estos dos 
compuestos, se han aislado de tejidos de moluscos bivalvos otras toxinas con una 
estructura química similar: pinatoxina A (1.8c) y espirolidas; ambas activadoras de canales 
de Ca2+. Las toxinas de este grupo se caracterizan por provocar una respuesta muy rápida 
(muerte en pocos minutos) en el bioensayo en ratón, aunque solo la pinatoxina ha estado 
implicada en un episodio de neurotoxicidad en humanos (115). 
1.2 El linfocito humano como modelo celular para el estudio de 
los mecanismos de acción de toxinas DSP 
Los linfocitos son glóbulos blancos especializados en el reconocimiento específico de 
los agentes patógenos, proceso indispensable para llevar a cabo la respuesta inmunitaria. 
Se encuentran en grandes cantidades en la sangre, por lo que su obtención y aislamiento 
resultan relativamente sencillos. Por este motivo se escogió esta célula como modelo de 
O
O
O
O
O
O
O-
+HN
(c) 
O
O
N
O
OH
(d) 
N
H
O
OH
N
H
(a) 
NH
OCH3 O
HN
N
NH
COOH
O
O
O
O
H
N
H
N
OCOOHO
HN
NH
NH2
HN
(b)
Figura 1.8. Toxinas producidas por cianobacterias: (a) Lingbiatoxina A. (b) Microcistina.
Toxinas de “acción rápida”: (c) Pinatoxina A. (d) Gimnodimina. 
Introducción 
 
17 
estudio, ya que es una de las pocas células de origen humano a las que se puede tener 
fácil acceso, sin necesidad de recurrir a las líneas celulares derivadas de células tumorales. 
Por otro lado, se ha decidido estudiar a las toxinas de tipo DSP debido, en parte, a su 
importancia en las costas de Europa y de la Comunidad Autónoma Gallega en particular, 
donde su presencia afecta de manera significativa a las actividades económicas de la 
acuicultura e industria de alimentos (246). Además, como ya se mencionó, el grupo de las 
toxinas tipo DSP engloba sustancias con actividades biológicas muy diversas y cuyos 
mecanismos de acción, en algunos casos, son completamente desconocidos. 
1.2.1 Heterogeneidad de los linfocitos. 
Los linfocitos representan aproximadamente el 20% de los leucocitos totales que 
circulan en el torrente sanguíneo. La mayoría de los linfocitos presentes en la circulación 
son pequeños linfocitos, miden entre 5 y 8 µm y poseen un núcleo muy compacto rodeado 
por un citoplasma escaso; estas células circulantes pueden ser células T o B en reposo, 
células T o B de memoria, o linfocitos T efectores o inmunomoduladores (9). 
Según la forma de reconocer el antígeno (molécula extraña que origina la respuesta 
inmune), el órgano específico donde se desarrollan y sus funciones esenciales, existen dos 
tipos básicos de linfocitos: los linfocitos T, que se desarrollan en el timo y son responsables 
de la respuesta inmunitaria mediada por células y los linfocitos B que en los adultos se 
producen y desarrollan en la médula ósea y que son las células productoras de anticuerpos. 
Entre los linfocitos circulantes, están 
también las células agresoras naturales (NK) 
y los linfocitos granulares grandes, ambos 
son morfológicamente distintos de los 
linfocitos pequeños pues son de mayor 
tamaño (más de 10 µm) y presentan un 
citoplasma más abundante y con gránulos; 
además, las primeras, no expresan 
receptores antigénicos en su superficie (170, 
187). 
A) Linfocitos T 
Estos linfocitos reconocen al antígeno 
solamente cuando fragmentos de éste son 
presentados en la superficie de otras células 
del cuerpo (células diana o células 
presentadoras de antígeno), que han 
ingerido o que han sido infectadas por 
microorganismos. El reconocimiento del antígeno se lleva a cabo mediante la interacción de 
proteínas presentes en la membrana plasmática del linfocito y de la célula diana. Las 
primeras son los receptores antigénicos de células T (TCR, de T-cell Receptor) y las 
Células 
NK 
Células B
Igs 
Células T
CD8
CD4
CD3TCR 
Figura 1.9. Tipos de linfocitos circulantes. 
Introducción 
 
18 
segundas son las moléculas MHC (de Major Histocompatibility Complex). Asimismo, existen 
otras moléculas accesorias al TCR que se expresan en la superficie de los linfocitos T: 
CD3, CD4 y CD8. La molécula CD3 está presente en todos los linfocitos T, mientras que las 
CD4 y CD8 distinguen a las dos clases más conocidas de células T: células T 
colaboradoras (Th), que expresan CD4; y células T citotóxicas (Tc), que expresan CD8. 
Cuando son activadas por un antígeno, la función de las células T colaboradorasconsiste 
en estimular la actividad de otras células del sistema inmunitario (linfocitos B, macrófagos, 
células T citotóxicas), esta función la llevan a cabo mediante la producción de diversos 
mediadores peptídicos, denominados citocinas, linfocinas o interleucinas, que actúan como 
mensajeros intercelulares. Por otro lado, las células T citotóxicas actúan destruyendo 
directamente a la célula presentadora de antígeno (257). 
B) Linfocitos B 
Los linfocitos B son menos abundantes que los T, pues representan entre el 5 y 15 % de 
los linfocitos circulantes. Estas células reconocen antígenos libres, disueltos en la sangre o 
en los órganos linfoides secundarios y sus receptores antigénicos (BCR, de B Cell 
Receptor) son las inmunoglobulinas (Ig), es decir los anticuerpos. Existe cinco isotipos de Ig 
humanas: IgM, IgD, IgG, IgA e IgE. Las dos primeras son las más comúnmente expresadas 
en las membranas celulares de los linfocitos B de la sangre, aunque éstos pueden cambiar 
el isotipo de Ig que producen. Antes de ser activados por un antígeno, los linfocitos B 
solamente producen Ig que permanecen ligadas a la membrana plasmática, pero una vez 
estimulados por el antígeno, y por células T colaboradoras, pasan a producir una gran 
cantidad de anticuerpos solubles que actúan sobre los antígenos de diversas maneras: 
inactivándolos, en el caso de virus y toxinas, o facilitando su destrucción por otros 
mecanismos del sistema inmunitario. Además los anticuerpos también funcionan como 
moléculas señalizadoras entre los diversos tipos celulares del sistema inmune. Por último 
las células B también expresan en su membrana moléculas MHC, por lo que pueden actuar 
como células presentadoras de antígeno para los linfocitos T colaboradores (59). 
C) Células agresoras naturales (NK) 
Representan hasta un 15% de los linfocitos sanguíneos, pero se distinguen de ellos en 
que no reconocen antígenos específicos. En lugar de esto, su función consiste en lisar 
cierto tipo de células sanguíneas, tumorales o infectadas por virus, aunque los receptores y 
mecanismos que determinan que células deben ser atacadas no han sido del todo 
caracterizados. Por el contrario están mejor caracterizados los receptores inhibitorios, 
expresados en las membranas de células NK. Cuando estos receptores interaccionan con 
moléculas de tipo MHC inhiben la función citolítica de la célula NK; en cambio, cuando las 
receptores inhibitorios no son capaces de encontrar una molécula MHC normal, se 
desencadenan los mecanismos de lisis celular (233, 270). La existencia e importancia de 
este tipo de receptores también han sido reconocidas en los otros dos tipos de células 
linfoides (120, 222). En la figura 1.9 se presenta un esquema de los tipos celulares que han 
sido descritos en este apartado. 
Introducción 
 
19 
1.2.2 Activación y modulación de la función linfocitaria 
Los linfocitos T y B se activan cuando un antígeno se une a sus receptores TCR o Ig 
respectivamente. Esta activación está compuesta de varios procesos: en primer lugar los 
antígenos inducen a las células a reproducirse, lo que da lugar a una proliferación de 
células hijas, denominadas clonas, que, al ser descendientes de una sola célula madre, 
expresan exactamente el mismo receptor antigénico de ésta última. A continuación las 
clonas se diferencian y maduran para dar lugar a células de memoria y células efectoras, 
siendo éstas últimas las que llevan a cabo la respuesta inmunitaria, mediante la producción 
de anticuerpos, citocinas o factores citotóxicos. 
Sin embargo todos estos procesos no dependen únicamente de la unión del antígeno, 
sino que son estrictamente modulados y en algunos casos totalmente dependientes de la 
unión de otras moléculas señalizadoras a sus receptores específicos. Las más importantes 
de estas moléculas inmunomoduladoras son las citocinas o interleucinas producidas por 
células T y otros inmunocitos, o las moléculas asociadas a los receptores antigénicos en 
linfocitos T (CD3, CD4, CD8); asimismo, las respuestas inmunitarias también están 
reguladas por una gran variedad de hormonas, neurotransmisores y otros mediadores 
lipídicos como las prostaglandinas. 
Además de todos estos agonistas fisiológicos, existen moléculas que producen 
activación linfocitaria in vitro al unirse de manera inespecífica a diversos receptores de 
membrana, incluido el receptor antigénico. Estas moléculas son proteínas derivadas de 
plantas y bacterias, conocidas colectivamente como lectinas mitogénicas; algunos ejemplos 
son la fitohemaglutinina (PHA), concanavalina A (Con-A) o el mitógeno de la fitolaca 
(PWM). También se utilizan como mitógenos o activadores linfocitarios, anticuerpos 
creados para unirse específicamente con el receptor CD3 de células T. 
La unión de los diversos agonistas (antígenos, mitógenos o inmunomoduladores) con 
sus receptores de membrana, provoca una serie de señales intracelulares de transducción 
que finalmente dan lugar a una respuesta celular determinada. En el caso de antígenos y 
mitógenos, se cree que las señales intracelulares que desencadenan son muy similares, 
por lo que dan lugar a las mismas respuestas, es decir proliferación y maduración celular y 
mecanismos efectores de la respuesta inmune. En la figura 1.10 se presenta un esquema 
de algunas de las señales de transducción que desencadena la unión de un anticuerpo 
antiCD3 a la membrana de un linfocito T (39, 175). 
La unión ligando-receptor (antiCD3-CD3) produce la activación de una (o varias) cinasa 
de proteína que fosforila residuos de tirosina (PTK). La activación de esta cinasa produce 
fosforilación de una forma de la enzima fosfolipasa C (PLCγ1) que se encuentra libre en el 
citosol celular, y de una pequeña proteína (p36) que se asocia a la PLC. La fosforilación de 
la PLC, y su asociación con p36 produce una migración de esta enzima hacia la membrana 
celular donde se encuentra su sustrato, que es un fosfolípido de membrana, el fosfatidil 
inositol 4,5-bifosfato (PIP2). La PLC hidroliza el PIP2 para dar lugar a dos mensajeros 
intracelulares el inositol 1,4,5-trifosfato (IP3) y el diacilglicerol (DAG). El primero provoca una 
liberación de Ca2+ de los reservorios intracelulares del retículo endoplasmático (ER), lo que 
Introducción 
 
20 
a su vez produce una entrada de Ca2+ del exterior celular; el DAG activa a una cinasa de 
proteína de residuos serina/treonina, la cinasa de proteína C (PKC). El aumento de calcio 
citosólico ([Ca2+]i) puede contribuir a la activación de PLC y PKC; además la unión de iones 
Ca2+ a la proteína calmodulina (CaM) activa a su vez otras cinasas como la CaM cinasa IV, 
o fosfatasas como la calcineurina (también llamada PP2B). 
PKC, CaM cinasa IV y calcineurina pueden activar a numerosas enzimas y factores de 
transcripción genética, que finalmente darán lugar a la producción de la interleucina-2 (IL-2). 
La importancia de la activación de la PKC y del aumento de Ca2+ citosólico en la producción 
IL-2 se ha demostrado mediante el empleo de herramientas farmacológicas que activan 
directamente a la PKC o producen un aumento de Ca2+ por mecanismos no fisiológicos, 
estas dos acciones pueden dar lugar a la producción de IL-2 en ausencia de estimulación 
antigénica o mitogénica (195); sin embargo, estudios más recientes han demostrado que 
los ésteres de forbol, utilizados para activar la PKC también son capaces de activar a la 
proteína p21ras (39), una GTPasa implicada en la transducción de señales desde receptores 
de membrana hasta el núcleo celular, en muchos tipos de células (87, 145). 
Aunque hasta el momento se ha descrito la descripción de los mecanismos de 
transducción de señales intracelulares de linfocitos T, diversos estudios en células B han 
demostrado que las señales básicas de la activación linfocitaria (activación de PTKs, 
aumento de [Ca2+]i y activación de p21ras), son comunes a ambos tipos de células (59). 
El siguiente paso para la activación linfocitaria consiste en la expresión delreceptor 
específico para la IL-2 (IL-2R) en la membrana celular de las células activadas. Cuando el 
IL-2R se expresa en la membrana de linfocitos y es ocupado por la citocina correspondiente 
Figura 1.10. Activación de linfocitos T. Algunos mecanismos de transducción de señales
que se desencadenan tras la unión de un ligando al receptor CD3. 
TCR CD3
PIP2
PTK p36
PLC 1
DAG
IP3 [Ca2+]i ∩∩∩∩
Ca2+
ER
Ca2+
CaM
PKC
Calcineurina CaM
cinasa IV
γ
Introducción 
 
21 
(IL-2), se desencadenan otras señales de transducción intracelulares que finalmente dan 
lugar a la proliferación, diferenciación celular y desarrollo de la respuesta inmunitaria que 
corresponda al tipo de linfocito activado. Una descripción más detallada de algunos 
mecanismos de transducción de señales intracelulares se presenta a continuación. 
1.3 Señales de transducción 
Cuando los receptores de membrana son ocupados por moléculas extracelulares 
específicas (ligandos o agonistas) se vuelven activos, de forma que generan una cascada 
de señales intracelulares que alteran el comportamiento de las células. Las señales se 
transmiten desde el receptor hacia el interior celular generalmente mediante dos tipos de 
proteínas: las proteínas G heterotriméricas o las cinasas de tirosina; ambas, a su vez, 
pueden activar enzimas ligadas a la membrana que producen pequeñas moléculas solubles 
que actúan como mensajeros intracelulares y que pueden estimular diversos procesos de 
fosforilación-desfosforilación de proteínas intracelulares. 
1.3.1 Proteínas G 
Se llaman así las proteínas que ligan e hidrolizan GTP. Existen dos grandes grupos de 
proteínas G las proteínas G heterotriméricas, formadas por tres subunidades y que sirven 
de enlace entre los receptores de membrana y otras moléculas intracelulares; y las 
proteínas G monoméricas de bajo peso molecular, o GTPasas; que participan en diversos 
procesos celulares como el transporte de vesículas de exocitosis, además de actuar como 
mecanismos de transducción de señales. La proteína p21ras es un ejemplo de proteína G 
monomérica, que participa en la transducción de señales relacionadas con la iniciación de 
la proliferación celular en muchos modelos celulares, incluyendo los linfocitos. Ambos tipos 
de proteínas G se activan al unirse al GTP; la hidrólisis de esta molécula, para dar lugar a 
GDP, provoca la inactivación de la proteína GTPasa. 
Las proteínas G heterotriméricas (83) se localizan junto a la membrana plasmática, 
asociadas a una gran variedad de receptores para muy diversos estímulos extracelulares, 
por ejemplo, luz, hormonas, neurotransmisores o factores quimiotácticos (157). Están 
formadas por tres subunidades: α, con actividad GTPasa, y β y γ que funcionalmente 
actúan como una sola unidad. La unión del ligando al receptor hace que la subunidad α se 
una a GTP con lo cual se activa y disocia de las subunidades βγ. Una vez disociadas, tanto 
la unidad α como el dímero βγ pueden interaccionar con otras proteínas de membrana, 
como PLC, adenilato ciclasa (AC) o canales iónicos, y modificar su actividad. 
Existen por lo menos 12 tipos de subunidades α, con funciones más o menos 
específicas, algunas de las cuales se expresan en unos tipos celulares muy limitados (217). 
Generalmente se clasifican de acuerdo a su sensibilidad a dos toxinas bacterianas: la toxina 
colérica, que inhibe la actividad GTPasa, y la toxina pertusis, que inhibe la unión del 
complejo αβγ al receptor de membrana. Por lo tanto, la toxina colérica actúa como un 
activador de proteína G, pues evita que la hidrólisis de GTP provoque la inactivación de α y 
Introducción 
 
22 
su unión con βγ; mientras que la toxina pertusis actúa como un inhibidor puesto que impide 
que el receptor de membrana active a la proteína G. 
Las proteínas G con subunidades αs, αi y αq se expresan en casi todos los modelos 
celulares estudiados. La primera es sensible solamente a la toxina colérica y su principal 
sustrato es la enzima adenilato ciclasa (AC), que sintetiza AMP cíclico; αi es sensible a 
toxina pertusis y también puede interaccionar con la AC, aunque inhibiéndola; αi y αs 
también activan canales iónicos (157). En la figura 1.11 se presenta un esquema que ilustra 
la doble regulación de la AC por proteínas G heterotriméricas. Por último, Gαq activa a la 
isoforma β de la PLC y es insensible a la toxina pertusis (68). 
Las proteínas G se pueden activar mediante herramientas farmacológicas como el 
análogo de GTP, GTPγS o por el ion AlF4-. 
1.3.2 Mensajeros intracelulares o segundos mensajeros 
Son moléculas pequeñas que se difunden fácilmente a través del citosol y modifican la 
actividad de enzimas intracelulares o de canales iónicos, generalmente a través de su unión 
con cinasas o fosfatasas de proteína. El ion Ca2+ y el AMP cíclico son mensajeros ubicuos 
que regulan gran cantidad de procesos biológicos, como replicación o proliferación celular, 
secreción, contracción y relajación muscular, percepción de olores, memoria y aprendizaje, 
etcétera. Existen muchas otras moléculas que pueden actuar como segundos mensajeros: 
IP3, DAG, IP4 (inositol 1,3,4,5-tetrakisfosfato), GMP cíclico, ADP-ribosa cíclica (ADPRc). 
1.3.2.1 Calcio 
La activación de la enzima fosfolipasa C (PLC) ya sea a través de proteínas G (PLCβ) o 
de cinasas de tirosina (PLCγ), produce una hidrólisis de PIP2 que da lugar a dos segundos 
mensajeros: el DAG activa la cinasa C mientras que el IP3 se une a un receptor intracelular 
Figura 1.11. Modulación de la actividad de la adenilato ciclasa (AC) por la activación de
receptores (R1 y R2) asociados a proteínas G. El R1, activado por un agonista (Ag1)
estimula a la AC a través de la subunidad αs de la proteína G; mientras que la activación de 
R2, activa a la proteína Gαi, la cual inhibe la actividad de AC. 
Gαs βγ Gαiβγ
AC
Ag1
R1
Ag2
R2
GTP Gαs
+
GTP
Estimulación
ATP AMPc
Gαi
+
GTP
GTP
Inhibición
Introducción 
 
23 
(IP3R) del retículo endoplasmático (ER). El IP3R es a su vez un canal de calcio por el que se 
libera Ca2+ de los reservorios intracelulares donde se acumula este ion. El vaciamiento de 
los reservorios de Ca2+ del ER genera, por un mecanismo aún desconocido, la apertura de 
otros canales permeables a Ca2+ localizados en la membrana plasmática, por los que entra 
Ca2+ desde el exterior celular, donde la concentración de este ion es también mucho mayor 
que en el citosol. A la entrada de calcio activada por el vaciamiento de reservorios se le 
denomina entrada capacitativa (178) y a los canales por los que entra el Ca2+ se les llama 
CRAC (de Calcium Release Activated Channels, canales activados por la liberación de 
calcio) (110) o SOC (de Store Operated Channels, canales operados por reservorios), 
aunque aún se desconoce su identidad molecular. El Ca2+ liberado de los reservorios 
también puede activar o sensibilizar otros IP3R para que liberen más Ca2+. Todo este 
proceso representa el mecanismo más común mediante el cual las células no excitables 
elevan sus niveles de Ca2+ citosólico ([Ca2+]i) en respuesta a un estímulo extracelular. 
El aumento de [Ca2+]i puede a continuación activar a varias cinasas y fosfatasas o 
modificar la actividad de diversos canales iónicos, para llevar a cabo alguna respuesta 
celular determinada. Para finalizar la señal de Ca2+, este ha de volver a sus niveles basales, 
que son muy bajos en el citosol gracias a la actividad de diversas enzimas transportadoras 
de iones. Las ATPasas de Ca2+, presentes en la membrana del ER (SERCAs por 
Sarco(Endo)plasmic Reticulum Calcium ATPase), bombean Ca2+ hacia el interior de los 
reservorios, mientras que las ATPasas de la membrana plasmática (PMCAs por Plasma 
Membrane Calcium ATPase) y el intercambiador Na+/Ca2+ llevan el Ca2+ hacia el exterior 
celular. Algunas de las herramientas farmacológicas más utilizadas para estudiar los 
mecanismos de la entrada capacitativa, son los fármacos inhibidores de las SERCAs como 
la tapsigargina (Tg) o el ácido ciclopiazónicoque producen un vaciamiento de reservorios 
del ER por salida pasiva de Ca2+ a favor de gradiente. También se utilizan ionóforos de 
Ca2+, como la ionomicina, que pueden producir vaciamiento de reservorios o entrada no 
capacitativa al crear un entorno lipídico que permite el paso al ion en las membranas 
celulares. 
Existen otros mecanismos de elevación de [Ca2+]i que han sido descritos en células 
eléctricamente excitables como fibras musculares y neuronas, algunos de los cuales 
también pueden ser importantes en células no excitables. Uno de estos mecanismos en la 
entrada de Ca2+ extracelular a través de canales de Ca2+ dependientes de voltaje (VOC, de 
Voltage Operated Channels), que se abren en respuesta a una despolarización de la 
membrana, como la que ocurre cuando se transmite un impulso nervioso, por la apertura de 
canales de Na+. Aunque se sabe que estos canales VOC son molecularmente distintos a 
los canales SOC de células no excitables, algunas de éstas últimas células, dentro de las 
que se incluyen los linfocitos B y T, expresan canales iónicos que presentan cierta similitud 
farmacológica y funcional con los VOCs (3, 61, 74, 141). 
Existen también canales de Ca2+ intracelulares, muy similares a los IP3R; los receptores 
de rianodina (RyRs) descritos por primera vez en el retículo sarcoplasmático del músculo 
esquelético. Pueden ser activados en respuesta a una despolarización de la membrana 
Introducción 
 
24 
plasmática, o a través de un nuevo segundo mensajero, la ADP-ribosa cíclica (ADPRc) (79). 
Se ha detectado la existencia de RyRs en células T humanas derivadas de una línea 
tumoral (células Jurkat). También se ha comprobado que la ADPRc puede producir 
liberación de Ca2+ de reservorios intracelulares, y que la activación del TCR puede generar 
un aumento de los niveles citosólicos de ADPRc en éstas células (99, 100). Los mismos 
autores han sugerido que la señal de Ca2+ generada por el segundo mensajero ADPRc 
puede también estar constituida por un componente dependiente de la entrada de Ca2+ 
extracelular, análogo a la entrada capacitativa, pero a través de canales diferentes (98). En 
la figura 1.12 se presenta un esquema de los dos mecanismos, antes descritos, que pueden 
estar involucrados en la elevación del [Ca2+]i que ocurre en linfocitos, en respuesta a un 
estímulo externo: vaciamiento de reservorios sensibles a IP3 y entrada capacitativa; y 
aumento de Ca2+ mediado por ADPRc. 
Otra característica de los RyRs es que, al igual que los IP3Rs pueden ser activados por 
el Ca2+ liberado desde canales cercanos, a este proceso se le denomina CICR (de Calcium 
Induced-Calcium Release, es decir, liberación de calcio inducida por calcio) (23). 
Por último, dependiendo de la intensidad del estímulo empleado para producir una 
elevación de [Ca2+]i, ésta puede ocurrir en forma de oscilaciones. Una respuesta oscilatoria 
es común en células excitables, donde las oscilaciones están generadas por fluctuaciones 
rápidas del potencial de membrana. Sin embargo, en células no excitables los mecanismos 
que las producen aún no han sido bien caracterizados. Se ha propuesto que, al menos en 
ciertos modelos celulares, las oscilaciones de Ca2+ de células no excitables pueden ser 
producidas por entrada no capacitativa, dependiente de otro segundo mensajero, el ácido 
araquidónico (210, 211). La existencia de oscilaciones plantea la posibilidad de que algunas 
Figura 1.12. Mecanismos propuestos para explicar la elevación de [Ca2+]i producida en
linfocitos T, en respuesta a la activación del TCR. (a) Vaciamiento de reservorios sensibles
a IP3 y entrada capacitaitva. (b) Aumento de [Ca2+]i dependiente de ADP-ribosa cíclica. 
(a) (b) 
Ca2+
SOC
IP3
IP3R
ER
Ca2+
Ca2+ SERCA
[Ca2+]i ∩∩∩∩
PIP2 DAGTCR
PTK
p36
PLC
?
Ca2+
?
[Ca2+]i ∩∩∩∩ ADPRc
?
RyR
Ca2+
?
Introducción 
 
25 
respuestas a la señal de Ca2+ puedan ser dependientes de la frecuencia, y no sólo de la 
amplitud de la elevación (74). En linfocitos T se ha observado un comportamiento oscilatorio 
de la señal de Ca2+ en respuesta a la activación del TCR; y estas oscilaciones dependen de 
la entrada de Ca2+ extracelular (98). 
1.3.2.2 AMP cíclico 
Como ya se mencionó antes, la activación de proteínas G puede estimular (Gαs) o 
inhibir (Gαi) la actividad de la adenilato ciclasa (AC). Esta enzima sintetiza AMP cíclico 
(AMPc) a partir de ATP. El AMPc como mensajero intracelular, activa la cinasa de proteína 
dependiente de AMPc (PKA) la cual media casi todos los efectos de un aumento de los 
niveles citosólicos de AMPc ([AMPc]i), aunque se han descrito canales iónicos que pueden 
ser activados directamente por la unión de este segundo mensajero (62). El [AMPc]i se 
reduce gracias a la acción de las fosfodiesterasas (PDEs), una familia de enzimas que 
hidrolizan el AMPc transformándolo en 5’-AMP. Una representación esquemática de la ruta 
de síntesis y degradación de AMPc se muestra en la figura 1.13. 
En linfocitos humanos el [AMPc]i se eleva en respuesta a ciertos agonistas no 
antigénicos, por ejemplo el isoproterenol, que se une a los receptores beta adrenérgicos 
(221), o la prostaglandina E2 (46). El aumento de AMPc generalmente produce una 
inhibición de la función y proliferación linfocitaria, a través de mecanismos que pueden 
involucrar interferencia con la señal de Ca2+ (118). Existen multitud de herramientas 
farmacológicas que se utilizan para modular los niveles citosólicos de AMPc. Los 
estimuladores de la AC, como la forskolina (FSK), e inhibidores de PDEs como IBMX, 
rolipram, milrinona o econazol, aumentan al [AMPc]i por mecanismos encontrados: 
aumento de su síntesis o disminución de su degradación. La inhibición de la AC con 
SQ22,526, por ejemplo, disminuye los niveles de AMPc. Existen también análogos del 
AMPc capaces de atravesar las membranas celulares. Por último, se puede modificar la 
actividad de la PKA, como se describirá más adelante. 
N
NN
N
NH2
O
OHOH
H
OPO
O-
O
POP-O
O-
O
O-
O
ATP
N
NN
N
NH2
O
OHOH
H
P-O
O
O
O- 5’-AMP
AC
PDEs
N
NN
N
NH2
O
OHO
H
P
-O
OO AMPc
PKA
Figura 1.13. Síntesis y degradación del AMPc y activación de la cinasa de proteína
dependiente de AMPc. 
Introducción 
 
26 
1.3.3 Cinasas y fosfatasas de proteína 
La modificación covalente de las enzimas, mediante la adición de un grupo fosfato a un 
residuo determinado de serina, treonina o tirosina puede alterar la conformación de la 
proteína, aumentando o inhibiendo su actividad; estos procesos de fosforilación son 
catalizados por enzimas denominadas cinasas de proteína. La eliminación posterior del 
grupo fosfato revierte eficientemente el efecto de la fosforilación y se consigue mediante 
una segunda enzima denominada fosfatasa de proteína. No es de extrañar, por tanto, que 
los procesos de fosforilación-desfosforilación estén involucrados en la regulación de casi 
todas las funciones celulares, y que todas las rutas de transducción de señales incidan en 
al menos una cinasa o fosfatasa de proteína (87). 
1.3.3.1 Cinasas de tirosina 
Aunque la mayoría de las fosforilaciones de proteínas ocurre sobre residuos de los 
aminoácidos serina o treonina, la fosforilación sobre residuos de tirosina es especialmente 
importante en la transducción de señales relacionadas con la proliferación celular. La 
mayoría de las proteínas con actividad tirosina-cinasa (PTKs) se encuentran asociadas a 
receptores de membrana que se activan por factores de crecimiento, es decir, señales que 
inducen la proliferación celular. Además existen algunas cinasas de tirosina que se 
localizan en el núcleo celular, donde desempeñan diversas funciones biológicas, como 
participación en los procesos de activación de la transcripción genética (253). 
Las tirosina-cinasas asociadas a receptores de membrana a su vez se pueden dividir en 
dos grupos: las que forman parte integral del receptor, es decir, el dominio intracelular del 
receptor tiene actividad tirosina-cinasa; y las cinasas citoplasmáticasque se asocian de 
manera no covalente al receptor cuando este es activado (145). Los receptores para el 
factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) o para la insulina son algunos 
ejemplos del primer grupo de tirosina-cinasas. Las tirosina-cinasas asociadas no 
covalentemente a receptores de membrana pertenecen a diversas familias de proteínas 
codificadas por oncogenes (Src, Syk, JAK/Tyk) (253). Las tirosina-cinasas p59fyn, p56lck (de 
la familia Src) y ZAP-70 (de la familia Syk) están implicadas en la activación linfocitaria en 
respuesta a mitógenos. La unión del ligando al receptor TCR produce una activación de las 
cinasas Src que fosforilan al TCR, éste se une a la proteína ZAP-70 que también es 
fosforilada (42). Más recientemente se ha descrito una nueva familia de PTKs, las cinasas 
Tec, que son esenciales en los procesos de activación de linfocitos T y B (120, 129). 
Las proteínas fosforiladas en residuos de tirosina se unen fácilmente y activan a otras 
proteínas citoplasmáticas con funciones muy diversas (figura 1.14), por ejemplo la PLC, de 
la que hemos hablado anteriormente, la fosfatidil inositol 3-cinasa (PI-3K), que se describirá 
más adelante o las proteínas activadoras de la GTPasa p21ras (Grb2 y Sos) (39, 87, 145). 
Introducción 
 
27 
Los fármacos utilizados para inhibir tirosina-cinasas, como genisteína o lavendustina A 
tienen un efecto inespecífico sobre todas las PTKs. 
1.3.3.2 Cinasas de serina/treonina 
Hay un gran número de proteínas con actividad cinasa en residuos de serina/treonina y 
a su vez, este tipo de fosforilaciones afectan numerosas funciones celulares que van desde 
la proliferación y diferenciación celular hasta la muerte celular programada (apoptosis) (87). 
Las serina/treonina-cinasas son activadas por señales intracelulares diversas, como 
segundos mensajeros (Ca2+, DAG, AMPc, GMPc) o fosforilaciones en residuos 
serina/treonina y tirosina. En este apartado describiremos unas cuantas cinasas que han 
sido mencionadas previamente y que están involucradas en múltiples rutas celulares de 
transducción. 
A) PKC 
Se ha descrito ya que la producción de DAG por la PLC activa la cinasa de proteína C 
(PKC), la cual puede ser también activada por un aumento de Ca2+ citosólico. Aunque 
originalmente se pensaba que esta enzima era siempre activada por Ca2+, en la actualidad 
se sabe que hay al menos 9 isoformas de PKC, de las cuales sólo 3 son dependientes de 
este ion, mientras que otras 2 tampoco son activadas por DAG. Las isoformas α, β, γ δ, ε, η 
y σ son dependientes de DAG y también pueden ser activadas por los ésteres de forbol, de 
éstas, las tres primeras también son dependientes de Ca2+. Las isoformas atípicas ζ y λ son 
insensibles al DAG. La mayoría de las células expresan varias isoformas de PKC y cada 
una de ellas puede fosforilar substratos muy diversos, probablemente dependiendo de su 
localización en compartimentos intracelulares (114). En linfocitos, las PKC dependientes de 
Ca2+ y DAG están involucradas en la trasducción de señales a través del TCR. Debido a 
que la mayoría de las isoformas de la PKC se activan con ésteres de forbol, como el 
R
PTK
P PLC
P
PI 3-cinasa
P
Grb2
SOSp21ras
Figura 1.14. Activación de diversas enzimas implicadas en la transducción de señales
intracelulares, mediante su interacción con un receptor de membrana con actividad tirosina-
cinasa. 
Introducción 
 
28 
acetato de forbol-miristato (PMA o TPA), para distinguir la función de cada isoenzima es 
necesaria la utilización de inhibidores específicos para una u otra isoforma. 
B) PKA 
La cinasa activada por AMP cíclico (PKA) es un tetrámero compuesto por dos 
subunidades catalíticas y dos subunidades reguladoras, cada una de las cuales se liga a 
dos moléculas de nucleótido. Cuando esto ocurre, la holoenzima se disocia, dando lugar a 
la actividad cinasa de las dos subunidades catalíticas. Existen al menos dos isoformas de 
subunidad reguladora (RI y RII) y tres isoformas de subunidad catalítica (Cα, Cβ y Cγ) (75). 
Igual que la PKC, la PKA fosforila multitud de substratos. Como se mencionó antes, en 
linfocitos la PKA está relacionada con la inhibición de la respuesta celular a mitógenos; la 
isoenzima más importante en estas células es la PKARI (213, 233). Existen diversos 
fármacos que inhiben a la PKA mediante la interacción con cualquiera de sus subunidades, 
también se han sintetizado análogos del AMPc que activan específicamente a alguna 
isoforma de la PKA. 
C) Cinasas dependientes de Ca2+/Calmodulina (CaM cinasas) 
Como se mencionó antes, el ion Ca2+ generalmente participa en los mecanismos de 
transducción de señales que regulan las funciones celulares, mediante la activación de 
diversas cinasas. Esta activación se lleva a cabo mediante la unión no covalente de iones 
Ca2+ a una proteína citoplasmática llamada calmodulina, el complejo formado por la unión 
de Ca2+-calmodulina (CaM) se une a diversas cinasas (o fosfatasas) activándolas. Algunas 
CaM cinasas tienen una actividad muy específica como la cinasa de la cadena ligera de la 
miosina (MLCK) que se expresa exclusivamente en el músculo liso. Otras CaM cinasas, sin 
embargo, están presentes en numerosos tipos celulares y, como las cinasas PKA y PKC, 
participan en múltiples procesos; estas cinasas son CaM cinasas Ia, Ib, II y IV (201). En 
células T, la CaM cinasa IV se activa en respuesta al aumento de [Ca2+]i producido por la 
unión de un ligando al TCR; esta cinasa fosforila una proteína nuclear, contribuyendo a la 
transcripción del gen de la IL-2 (18). 
1.3.3.3 Fosfatasas de proteína 
El estado de fosforilación de las proteínas citosólicas esta regulado por la actividad tanto 
de las cinasas como de las fosfatasas, por lo que muchas rutas de transducción pueden ser 
dependientes de estas últimas. Existen fosfatasas que actúan sobre residuos de tirosina, 
fosfatasas que actúan sobre residuos serina o treonina y también fosfatasas que pueden 
desfosforilar ambos substratos (252). 
A) Fosfatasas de tirosina 
El estudio de las fosfatasas de tirosina es un área relativamente nueva, ya que la 
identidad molecular de la primera enzima perteneciente a esta familia no se identificó sino 
hasta 1988. Existen dos clases de tirosina-fosfatasas (PTPasas): las citoplasmáticas y las 
que están asociadas a receptores de membrana (252). Una de estas últimas PTPasas, la 
Introducción 
 
29 
proteína de membrana CD45, es muy importante en la activación de linfocitos T. La 
fosfatasa CD45 desfosforila a las tirosina-cinasas Lyn y Lck (ver sección 1.3.3.1), en un 
residuo de tirosina que, cuando está fosforilado, puede inhibir la actividad cinasa de ambas 
proteínas (42). De esta forma, la PTPasa CD45 tiene un efecto estimulante sobre la 
proliferación celular y función efectora de las células T. Existen muchas otras PTPasas 
importantes en la transducción de señales en linfocitos, por ejemplo, la fosfatasa 
citoplasmática SHP-1 de linfocitos B, que se asocia a los receptores inhibitorios de estas 
células (222). 
B) Fosfatasas de serina/treonina 
Existen 4 enzimas que se cree catalizan la mayoría de las reacciones de 
desfosforilación de proteínas en residuos serina/treonina, aunque recientemente se han 
caracterizado nuevas ser/tre-fosfatas cuya importancia en los procesos de señalización 
intracelular aún no se ha estudiado. Las 4 principales ser/tre-fosfatasas están codificadas 
por 2 familias de genes. PP1, PP2A y PP2B (o calcineurina) pertenecen a la familia PPP, 
son multiméricas y es posible que las proteínas accesorias sean las que confieren la 
especificidad por ciertos substratos a las subunidades catalíticas. La PP2C es un 
monómero de la familia PPM y su actividad es dependiente de Mg2+ (106). La toxina marina 
ácido ocadaico (AO), que será estudiada en esta tesis, es un potente inhibidor de fosfatasas 
de la familia PPP especialmente de la PP2A y en menor medida de la PP1. La PP2B puede 
ser inhibida por concentraciones mucho mayores de AO (25). 
La fosfatasa